Einfluss von Transitpeptiden und internen Signalen auf den Proteinimport in
Hydrogenosomen von Trichomonas vaginalis
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
vorgelegt von
Peter Andreas Major aus Warschau
Düsseldorf, Februar 2013
II
aus dem Institut für Molekulare Evolution der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Gedruckt mit der Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Referent: Prof. Dr. William Martin Korreferent: PD Dr. Katrin Henze Tag der mündlichen Prüfung: 20.03.2013
III
Publikationen:
Burstein D, Gould SB, Zimorski V, Kloesges T, Kiosse F, Major P, Martin WF, Pupko T, Dagan T (2012). A machine-learning approach to identify hydrogenosomal proteins in Trichomonas vaginalis. Eukaryotic Cell 11, 217–228.
Major P, Zimorski V, Hoffmann K, Pereira Brás X, Martin WF, Gould SB (2013). The N-terminal sequences of four major hydrogenosomal proteins are not essential for import into hydrogenosomes of Trichomonas vaginalis. Journal of Eukaryotic Microbiology 60, 89–97.
Dagan T, Roettger M, Stucken K, Landan G, Koch R, Major P, Gould SB, Goremykin VV, Rippka R, Tandeau de Marsac N, Gugger M, Lockhart PJ, Allen JF, Brune I, Maus I, Pühler A, Martin WF (2013). Genomes of stigonematalean cyanobacteria (subsection V) and the evolution of oxygenic photosynthesis from prokaryotes to plastids. Genome Biology and Evolution 5, 31–44.
Zimorski V, Major P, Yu R-Y, Hoffmann K, Pereira Brás X, Tucci S, Mentel M, Gould SB, Henze K, Martin WF (2012). Evolutionary significance of anaerobic energy metabolism in eukaryotes. Journal of Endocytobiosis and Cell Research 23, 64–68.
Tagungsbeiträge:
Martin W, Henze K, Zimorski V, Major P (2009) N‐terminal targeting signals in hydrogenosomal matrix proteins. SFB TR1, Marburg, Deutschland. Poster-präsentation.
Mentel M, Zimorski V, Major P, Hoffmann K, Haferkamp P, Martin W, Henze K (2009) Protein import into hydrogenosomes of Trichomonas vaginalis involves both N‐terminal and internal targeting signals – a case study of thioredoxin reductases. XIII International Congress of Protistology, Armação dos Búzios, Rio de Janeiro, Brasilien. Posterpräsentation.
Zimorski V, Major P, Hoffmann K, Pereira Brás X, Gould SB, Martin W (2011) Internal targeting motifs of hydrogenosomal Trichomonas proteins. VI European Congress of Protistology, DGP, Berlin, Deutschland. Posterpräsentation.
IV
Major P, Zimorski V, Hoffmann K, Pereira Brás X, Martin WF, Gould SB (2012) Targeting into Trichomonas vaginalis hydrogenosomes is evolving towards a mechanism independent of cleavable N-terminal targeting sequences. 35th Annual Meeting of the German Society for Cell Biology, DGZ, Dresden, Deutschland. Posterpräsentation, Vortrag.
Burstein D, Gould SB, Zimorski V, Kloesges T, Kiosse F, Major P, Martin W, Pupko T, Dagan T (2012) Computational prediction and experimental validation of hydrogenosomal proteins coded in the nuclear genome of Trichomonas vaginalis. Society for Molecular Biology & Evolution, Dublin, Irland. Posterpräsentation.
Major P, Zimorski V, Hoffmann K, Pereira Brás X, Martin WF, Gould SB (2012) The N-terminal sequences of four major hydrogenosomal proteins are not essential for import into hydrogenosomes of Trichomonas vaginalis. Endosymbiosis from prokaryotes to eukaryotic organelles, München, Deutschland. Posterpräsentation.
Roettger M, Dagan T, Stucken K, Landan G, Koch R, Major P, Gould SB, Goremykin VV, Rippka R, Tandeau de Marsac N, Gugger M, Lockhart P, Allen JF, Brune I, Maus I, Pühler A, Martin WF (2012) Evidence for the origin of photosynthesis and plastids in large cyanobacterial genomes. Endosymbiosis from prokaryotes to eukaryotic organelles, München, Deutschland. Posterpräsentation.
Inhaltsverzeichnis
V
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ........................................................................................................... V Abstract ............................................................................................................................... 1 Zusammenfassung ........................................................................................................... 2 1 Einleitung ..................................................................................................................... 3 1.1 Trichomonas vaginalis ................................................................................................. 3 1.2 Das Hydrogenosom ....................................................................................................... 5 1.3 Proteinimport in Mitochondrien .............................................................................. 8 1.4 Proteinimport in Hydrogenosomen und Importsignale ............................... 12 1.5 Ziele dieser Doktorarbeit ......................................................................................... 14
2 Material und Methoden ........................................................................................ 16 2.1 Abkürzungen ................................................................................................................ 16 2.2 Enzyme ........................................................................................................................... 18 2.3 Antikörper ..................................................................................................................... 18 2.4 Antibiotika .................................................................................................................... 19 2.5 Oligonukleotide ........................................................................................................... 19 2.6 Vektoren ........................................................................................................................ 20 2.7 Kulturen ......................................................................................................................... 20 2.8 Medien ............................................................................................................................ 21 2.9 Arbeiten mit Zellkulturen ........................................................................................ 21 2.9.1 Kultivierung von Trichomonas vaginalis .................................................................... 22 2.9.2 Transfektion durch Elektroporation ........................................................................... 22 2.9.3 Isolation von Hydrogenosomen .................................................................................... 23 2.9.4 Proteasebehandlung der Hydrogenosomen ............................................................ 24 2.9.5 Dephosphorylierung hydrogenosomaler Proteine ............................................... 24 2.9.6 Isolation hydrogenosomaler Membranen und Matrix ......................................... 24 2.9.7 Kultivierung von Escherichia coli .................................................................................. 24 2.9.8 Anlegen von Stammkulturen .......................................................................................... 25 2.9.9 Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen .................................................. 25 2.9.10 Transformation durch Hitzeschock .......................................................................... 25
2.10 Arbeiten mit Nukleinsäuren ................................................................................. 25 2.10.1 Silanisieren von Glasgefäßen ....................................................................................... 25 2.10.2 Isolation genomischer DNA aus Cyanobakterien ................................................ 26 2.10.3 Reinigung isolierter DNA aus Cyanobakterien ..................................................... 26 2.10.4 Isolation genomischer DNA und RNA aus T. vaginalis ...................................... 27 2.10.5 Synthese von cDNA ........................................................................................................... 27 2.10.6 Polymerasekettenreaktion (PCR) .............................................................................. 27 2.10.7 Agarose Gelelektrophorese ........................................................................................... 28 2.10.8 DNA-‐Elution aus Agarosegelen ................................................................................... 29 2.10.9 DNA-‐Konzentrationsbestimmung .............................................................................. 29 2.10.10 Klonierung über Restriktionsschnittstellen ....................................................... 30 2.10.11 Klonierung mit dem Gateway System ................................................................... 30 2.10.12 Isolation von zirkulären Plasmiden ........................................................................ 32 2.10.13 Sequenzierung ................................................................................................................. 32
2.11 Arbeiten mit Proteinen .......................................................................................... 33 2.11.1 Präzipitation von Proteinen mit Aceton/TCA ....................................................... 33 2.11.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen .......................................................... 33 2.11.3 SDS-‐PAGE .............................................................................................................................. 33 2.11.4 Isoelektrische Fokussierung ........................................................................................ 34
Inhaltsverzeichnis
VI
2.11.5 Coomassie Färbung von Polyacrylamidgelen ....................................................... 34 2.11.6 Silberfärbung von Polyacrylamidgelen ................................................................... 35 2.11.7 Tryptischer Verdau von Proteinen ............................................................................ 35 2.11.8 Western Blot ........................................................................................................................ 36 2.11.9 Proteinfärbung mit Ponceau S ..................................................................................... 37 2.11.10 Immunodetektion ........................................................................................................... 37 2.11.11 Strippen der Nitrocellulosemembran .................................................................... 37 2.11.12 Zellfixierung und Immunofluoreszenzmikroskopie ........................................ 38
2.12 Bioinformatische Methoden ................................................................................. 38 3 Ergebnisse ................................................................................................................ 40 3.1 Lokalisation von Proteinen mit entfernten Transitpeptiden ...................... 40 3.2 Lokalisation von separaten Proteindomänen .................................................. 41 3.3 2D-‐Trennung von TvSCSα Block 2 Hydrogenosomen ..................................... 45 3.4 Immunofluoreszenzlokalisation ........................................................................... 46 3.5 Experimentelle Verifikation vorhergesagter Lokalisation .......................... 47 3.6 Transkriptionsanalyse von Ferredoxin und IscA ............................................ 49 3.7 Isolation genomischer DNA aus Cyanobakterien ............................................ 52
4 Diskussion ................................................................................................................ 56 4.1 Transitpeptide und interne Signale ..................................................................... 56 4.2 Migrationsdifferenzen in der SDS-‐PAGE ............................................................. 64 4.3 Cyanobakterielle Genome ........................................................................................ 68 4.4 Fazit und Ausblick ...................................................................................................... 69
5 Anhang ....................................................................................................................... 71 5.1 Vektorkarten ................................................................................................................ 71 5.2 Kontrollen ..................................................................................................................... 74 5.3 Alignments .................................................................................................................... 74 5.4 Sequenzen ..................................................................................................................... 75
6 Literaturverzeichnis ............................................................................................. 77
Abstract
1
Abstract The human pathogen Trichomonas vaginalis possesses hydrogenosomes –
organelles of mitochondrial origin that produce hydrogen and ATP. These
organelles lack a genome, but harbour about 500 proteins that are imported
into the organelle from the cytosol. In mitochondria the import of proteins into
the matrix is dependent on N-terminal transit peptides. However, in
hydrogenosomes only half the proteins are predicted to encode canonical
transit peptides, and these are not always obligatory for import, as recent
studies indicate. In the present work, the significance of transit peptides for
import of several hydrogenosomal proteins was examined and alternative
internal signals were explored. Hemagglutinin tagged fusion proteins were
overexpressed after transfection of T. vaginalis cells with plasmid DNA, and
the proteins were detected through cell fractionation and immunoblotting. In
addition, images of fixed cells were obtained by immunofluorescence
microscopy. The results show that transit peptides have little, if any, influence
upon the correct hydrogenosomal localization of the proteins analyzed and
that internal targeting signals can be present in multiple parts of a protein, so
that individual blocks of a split protein can be directed independently to the
organelles. As the main result, it was shown that internal signals have a
stronger emphasis on the protein import in T. vaginalis hydrogenosomes
than previously thought.
Zusammenfassung
2
Zusammenfassung Der Humanparasit Trichomonas vaginalis besitzt Hydrogenosomen –
Wasserstoff und ATP generierende Organellen mitochondrialen Ursprungs.
Diesen Organellen fehlt ein eigenes Genom, es sind aber voraussichtlich
etwa 500 Proteine dort lokalisiert. Sie werden aus dem Cytosol importiert.
Bei Mitochondrien ist der Import von Proteinen in die mitochondriale Matrix
abhängig von N-terminalen Transitpeptiden. Bei Hydrogenosomen haben
jedoch nur die Hälfte der Proteine klassische N-terminale Transitpeptide, die
nach aktuellen Erkenntnissen nicht immer notwendig sind. In dieser
Doktorarbeit wurde der Einfluss der Transitpeptide auf den Import an
mehreren hydrogenosomalen Proteinen untersucht und es wurden
alternative, interne Importsignale erforscht. Hierbei wurden Hämagglutinin
markierte Fusionsproteine erzeugt, die nach einer Transfektion von
T. vaginalis Zellen exprimiert wurden. Die Lokalisation der HA-markierten
Proteine wurde durch subzelluläre Fraktionierung und Immunodetektion
determiniert. Zusätzlich wurden mikroskopische Immunofluoreszenz-
aufnahmen fixierter Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass
Transitpeptide wenig bzw. keinen Einfluss auf die korrekte Lokalisation der
überexprimierten Proteine in die hydrogenosomale Matrix haben und interne
Signale in mehreren Teilen eines Proteins vorliegen, so dass einzelne Blöcke
eines dreigeteilten Proteins individuell zu den Organellen transportiert
werden können. Generell wurde gezeigt, dass interne Signale eine stärkere
Gewichtung bei dem Proteinimport in T. vaginalis Hydrogenosomen haben
als bisher angenommen wurde.
Einleitung
3
1 Einleitung
1.1 Trichomonas vaginalis
Der Humanparasit Trichomonas vaginalis löst beim Menschen
Trichomoniasis aus und ist einer der häufigsten durch Geschlechtsverkehr
übertragenen, nicht viralen Krankheitserreger mit weltweit über 160 Millionen
Neuinfektionen jährlich (Harp & Chowdhury, 2011; Petrin et al., 1998;
Schwebke & Burgess, 2004). Behandelt wird die Krankheit mit Metronidazol
(Freeman et al., 1997), das durch hydrogenosomale Enzyme zu freien,
zellschädigenden Radikalen zersetzt wird (Pal et al., 2009). Die Behandlung
resistenter Stämme erfolgt mit anderen 5-Nitroimidazolen (Cudmore et al.,
2004), jedoch besteht weiterhin Forschungsbedarf zur Entwicklung neuer
Medikamente. Es existieren zwei verschiedene T. vaginalis Typen. Sie
unterscheiden sich unter anderem in der Sensitivität gegenüber Metronidazol
und im Auftreten des T. vaginalis Virus (TVV), außerdem ist der Organismus
zu genetischem Austausch innerhalb der Population fähig, wie in einer
globalen Analyse ermittelt wurde (Conrad et al., 2011; Conrad et al., 2012;
Goodman et al., 2011). Kandidaten vom Typ 1 wurden hierbei durch eine
Konzentration von 76,6 µg/ml Metronidazol abgetötet, während bei Typ 2
228,4 µg/ml benötigt wurden. Der TVV wurde häufiger in Typ 1 (112 von 154
Isolationen) als in Typ 2 (42 von 154 Isolationen) identifiziert. Die häufig
verwendeten Laborstämme C1:NIH (Bradley et al., 1997), G3 (Carlton et al.,
2007) und T1 (Tai et al., 1993), welcher in dieser Studie eingesetzt wurde,
gehören nach dieser Klassifizierung zu Typ 1.
Bei einer Zellgröße von 10 bis 20 µm können T. vaginalis Zellen unter
dem Lichtmikroskop beobachtet werden. Zellkompartimente können durch
elektronenmikroskopische Aufnahmen gut identifiziert werden (Abb. 1.1). Bei
37 °C beträgt die Generationszeit des Organismus etwa acht Stunden. Die
Zellen können in drei verschiedenen Stadien auftreten: a) im pyriformen
Zustand bei Kultivierung im Medium, b) in der amoeboiden Form bei der
Infektion von Wirtsgewebe und c) als Pseudozysten unter
Extrembedingungen (Yeh et al., 2012).
Einleitung
4
Abb. 1.1: Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Trichomonas vaginalis Zelle (aus Burstein et al., 2012). Nuc: Zellkern, ER: Endoplasmatisches Retikulum, V: Vakuole, Lys: Lysosomen, Hyd: Hydrogenosomen, Fl: Flagellum.
Seit 2007 ist die Genomsequenz des Trichomonas vaginalis G3 Stammes
bekannt. Das Genom besteht aus sechs Chromosomen (Yuh et al., 1997)
und kodiert potentiell für fast 60.000 Proteine (Carlton et al., 2007; Huang et
al., 2009). Mit 160 Mb ist das Genom für einzellige Parasiten sehr groß –
noch größer geschätzt wird bisher nur das Genom des Rinderparasiten
Tritrichomonas foetus mit 177 Mb (Zubáčová et al., 2008). Vergleichsweise
klein sind die Genome von Giardia intestinalis mit 11,7 Mb (Franzén et al.,
2009; Jerlström-Hultqvist et al., 2010; McArthur et al., 2000; Morrison et al.,
2007) und Mikrosporidien wie Encephalitozoon cuniculi mit 2,9 Mb (Katinka
et al., 2001) oder Trachipleistophora hominis mit 8,5 Mb (Heinz et al., 2012).
In seinem anaeroben Lebensraum erzeugt der Protist Trichomonas
vaginalis Energie durch Wasserstoff produzierende Fermentation (Müller,
1988, 1993) und alternativ mit dem Arginin Dihydrolase Stoffwechselweg
(Yarlett et al., 1996; Yarlett et al., 1994). Mikrosporidien haben als
intrazelluläre Parasiten dagegen die Fähigkeit, ATP von ihren Wirtszellen zu
importieren (Tsaousis et al., 2008).
Einleitung
5
1.2 Das Hydrogenosom
Hydrogenosomen unterscheiden sich von aeroben Mitochondrien vor allem
durch ihren anaeroben Stoffwechsel und das Fehlen eines eigenen Genoms.
Charakteristisch für Hydrogenosomen ist die Produktion des
namensgebenden Wasserstoffs, der bei dem Energiestoffwechsel durch
Substratkettenphosphorylierung entsteht (Abb. 1.2). Hydrogenosomen
wurden erstmalig im Rinderparasiten Tritrichomonas foetus beschrieben
(Lindmark & Müller, 1973) und kommen in einer Vielzahl von Organismen vor
(Tab. 1.1; van der Giezen, 2009).
Tab. 1.1: Auswahl einiger Eukaryoten mit Hydrogenosomen
Organismus Referenz
Breviata anathema Minge et al., 2009
Dasytricha ruminantium Yarlett et al., 1981
Histomonas meleagridis Mazet et al., 2008
Isotricha prostoma / Isotricha intestinalis Yarlett et al., 1983
Mastigamoeba balamuthi Gill et al., 2007
Neocallimastix patriciarum Yarlett et al., 1986
Plagiopyla nasuta Zwart et al., 1988
Polyplastron multivesiculatum Paul et al., 1990
Psalteriomonas lanterna Broers et al., 1990; de Graaf et al., 2009
Trichomonas vaginalis Lindmark et al., 1975
Trimastix pyriformis Hampl et al., 2008
Trimyema compressum Zwart et al., 1988
Tritrichomonas foetus Lindmark & Müller, 1973
Sawyeria marylandensis Barberà et al., 2010
weitere Yarlett et al., 1984
Heute werden Organellen protomitochondrialen Ursprungs in fünf Klassen
unterteilt: 1) aerobe Mitochondrien, 2) anaerobe Mitochondrien, 3)
Wasserstoff produzierende Mitochondrien, 4) Hydrogenosomen und 5)
Mitosomen (Müller et al., 2012). Nyctotherus ovalis (Akhmanova et al., 1998;
Boxma et al., 2005) und Blastocystis hominis (Stechmann et al., 2008) haben
ebenfalls Hydrogenosomen, jedoch ist bei diesen Organismen auch ein
Einleitung
6
eigenes Genom vorhanden. Somit stellen deren Organellen einen
Übergangszustand zwischen Mitochondrien und Hydrogenosomen dar und
werden als Wasserstoff produzierende Mitochondrien klassifiziert (Müller et
al., 2012).
Abb. 1.2: Schematische Darstellung der hydrogenosomalen Energiegewinnung durch Substratkettenphosphorylierung, (aus Müller et al., 2012). [1] PFO, [2] ASCT, [3] SCS, [4] Hydrogenase, [5] malic enzyme (Malatenzym)
Einheitlich ist ihr evolutionärer Ursprung, da diese Organellen von einem
gemeinsamen Vorgänger abstammen, der durch Endosymbiose aus einem
freilebenden α-Proteobakterium entstanden ist (Martin & Müller, 1998). Sie
sind von einer aus Phospho- und Glycolipiden bestehenden Doppelmembran
umgeben. Im Gegensatz zu aeroben Mitochondrien hat die innere Membran
der Hydrogenosomen jedoch keine Cristae. Die beiden Membranen grenzen
die Matrix von dem Rest der Zelle räumlich ab, so dass die Organellen ein
eigenes Kompartiment in der eukaryotischen Zelle bilden. Die am stärksten
reduzierten Organellen mitochondrialen Ursprungs sind die Mitosomen. Sie
kommen beispielsweise in Giardia intestinalis und Mikrosporidien vor, ihre
Funktion beschränkt sich auf die Eisen-Schwefel-Cluster Biosynthese
(Goldberg et al., 2008; Henze & Martin, 2003; Tovar et al., 1999; Tovar et al.,
2003; Williams et al., 2002).
Einleitung
7
Hydrogenosomen beinhalten laut Vorhersagen etwa 500 Proteine, die
kernkodiert sind und zum Organell transportiert werden müssen (Rada et al.,
2011; Schneider et al., 2011). Bei Mitochondrien der Hefe sind es dagegen
ca. 1000 und bei denen des Menschen ca. 1500 Proteine (Chacinska et al.,
2009). Davon werden ca. 0,1 bis 1 % von mitochondrialen Ribosomen im
Organell synthetisiert, der Rest ist ebenfalls kernkodiert und wird in das
Organell importiert (Doležal et al., 2006). Verglichen mit dem Proteinimport in
Mitochondrien ist bisher sehr wenig über die Translokation von Proteinen
durch beide Membranen bei Hydrogenosomen bekannt. Ebenso wenig ist im
Detail über die beteiligten Komponenten bekannt (Rada et al., 2011), wie das
Beispiel des TOM Komplexes verdeutlicht (translocase of the outer
mitochondrial membrane; Abb. 1.3). So wurde bei Trichomonas
Hydrogenosomen bisher nur TOM40 identifiziert, TOM20, TOM22 und
TOM70, die an der Erkennung und Weiterleitung von N-terminalen und
internen Signalen beteiligt sind, sowie die kleinen TOMs TOM5, TOM6 und
TOM7 hingegen nicht. Bei Mitosomen sind oft auch nur die
Kernkomponenten der Maschinerie bekannt (Lithgow & Schneider, 2010).
Entweder sind die nicht identifizierten Komponenten in ihrer Sequenz zu
unterschiedlich, um als Homologe identifiziert werden zu können, oder sie
gingen im Laufe der Entwicklung dieser Organellen durch reduktive Evolution
verloren (Hjort et al., 2010).
Abb. 1.3: Schematische Darstellung der Importmaschinerie der äußeren Membran, verändert nach Rada et al., 2011. Links: Trichomonas Hydrogenosomen mit TOM40. Rechts: Saccharomyces Mitochondrien mit TOM5, TOM6, TOM7, TOM20, TOM22, TOM40 und TOM70.
Einleitung
8
1.3 Proteinimport in Mitochondrien
Am besten untersucht ist der Proteinimport in die Mitochondrien der
Backhefe Saccharomyces cerevisiae. Bisher sind fünf Mechanismen bekannt,
nach denen die Translokation abläuft (Becker et al., 2012). Das
Zielkompartiment ist hierbei ein wichtiger Aspekt: Soll das Protein in die
äußere Membran, den Intermembranraum, die innere Membran oder die
Matrix importiert werden? Für jeden Ort existieren unterschiedliche
Mechanismen und Signale, an denen verschiedene Komplexe der
Importmaschinerie beteiligt sind (Abb. 1.4). Zum Organell geleitet werden die
Vorläuferproteine im Cytosol durch die Chaperone HSP70 und HSP90
(Young et al., 2003) sowie das aryl hydrocarbon receptor interacting protein
AIP (Yano et al., 2003). Bei Matrixproteinen sind Transitpeptide, die am N-
Terminus α-Helices ausbilden und eine positive Nettoladung aufweisen,
vorhanden (Pfanner & Geissler, 2001; Roise & Schatz, 1988). Die Signale
werden von TOM20 erkannt (Abe et al., 2000; Saitoh et al., 2007) und die
Proteine über TOM22 (Shiota et al., 2011; van Wilpe et al., 1999) zu dem
Importkanal TOM40 geleitet (Ahting et al., 2001; Hill et al., 1998), um diesen
in linearer Konformation zu passieren. Im Gegensatz hierzu erfolgt der
Import von Membranproteinen mit internen Signalen in Loop Konformation
(Wiedemann et al., 2001). Stabilisiert wird der TOM Komplex von den kleinen
TOMs TOM5, TOM6 und TOM7 (Alconada et al., 1995; Dietmeier et al.,
1997; Hönlinger et al., 1996).
Der Import über die innere Membran erfolgt durch den TIM23 Kanal
(translocase of the inner mitochondrial membrane; Marom et al., 2011),
welcher durch das Membranpotential ΔΨ aktiviert wird. Im
Intermembranraum wird das Matrixprotein von TIM50 erkannt, das mit TIM21
und TIM17 den Import durchführt, wobei MGR2 (mitochondrial genome
required) das Vorläuferprotein von TIM21 zu TIM23 leitet (Gebert et al.,
2012). Auf der Matrixseite sind der ATP-abhängige PAM Komplex
(presequence translocase-associated motor; Li et al., 2004), HSP70 (Mapa
et al., 2010; Schneider et al., 1994) und der Nukleotidaustauschfaktor MGE1
am Import beteiligt (mitochondrial GrpE; Laloraya et al., 1994).
Einleitung
9
Verbindungsstelle zu TIM23 ist hierbei TIM44. In der Matrix wird
abschließend das Transitpeptid von der MPP entfernt (mitochondrial
processing peptidase; Taylor et al., 2001). Zur Proteinstabilisierung werden
in einigen Fällen durch weitere Peptidasen Teile des Proteins abgeschnitten,
z.B. acht Aminosäuren durch OCT1 (octapeptidyl aminopeptidase) oder eine
Aminosäure durch ICP55 (intermediate cleaving peptidase; Naamati et al.,
2009; Vögtle et al., 2011; Vögtle et al., 2009).
Proteinprozessierung im Intermembranraum hingegen erfolgt durch
die IMP (inner membrane protease; Nunnari et al., 1993). Weitere
Peptidasen existieren ebenfalls, wie z.B. m-AAA (matrix-ATPase associated
with a variety of cellular activities), die Rhomboid-Protease PCP1
(processing of cytochrome c peroxidase) oder die Metalloprotease ATP23
(ATP synthase; Koppen & Langer, 2007; Mossmann et al., 2012). Sie sind an
der Prozessierung von Transitpeptiden bestimmter Proteine beteiligt: m-AAA
und PCP1 z.B. bei CCP1 (cytochrome c peroxidase; Esser et al., 2002). Ein
weiteres Substrat der m-AAA ist MRPL32 (mitochondrial ribosomal protein
L32; Nolden et al., 2005). PCP1 prozessiert zudem MGM1, nachdem das
MGM1 Transitpeptid von der MPP entfernt wurde (Herlan et al., 2003;
McQuibban et al., 2003). ATP23 entfernt zehn Aminosäuren am N-Terminus
von ATP6, wobei ATP6 das einzige bekannte Substrat für ATP23 ist (Michon
et al., 1988; Osman et al., 2007; Zeng et al., 2007). Rhomboid-Proteasen
wurden auch für Parasiten vorhergesagt, darunter neun für Trichomonas
(Santos et al., 2012), bekannt für hydrogenosomale N-terminale
Proteinprozessierung ist aber bisher ausschließlich die HPP
(hydrogenosomal processing peptidase; Brown et al., 2007; Šmíd et al.,
2008).
Einleitung
10
Abb. 1.4: Konsensus Schema der Proteinimportmaschinerie von Mitochondrien. Die wesentlichen, bisher bekannten Komplexe sind dargestellt. HSP: Heat shock protein, TOM: Translocase of the outer mitochondrial membrane, SAM: Sorting and assembly machinery, MDM: Mitochondrial distribution and morphology, MIM: Mitochondrial import protein, TIM: Translocase of the inner mitochondrial membrane, PAM: Presequence translocase-associated motor, MIA: Mitochondrial intermembrane space assembly, ERV: Essential for respiration and viability, HOT: Helper of TIM, CYT. C: Cytochrome c, COX: Cytochrome c oxidase, MGE: Mitochondrial GrpE, MPP: Mitochondrial processing peptidase, OCT: Octapeptidyl aminopeptidase, ICP: Intermediate cleaving peptidase, IMP: Inner membrane peptidase, ΔΨ: Membranpotential.
Für die Insertion von Proteinen in die äußere mitochondriale Membran sind
zwei Mechanismen bekannt. Bei Proteinen, welche über β-Faltblätter
importiert werden, wird erst das Transitpeptid durch den TOM Komplex
erkannt und das Protein in den Intermembranraum transportiert. Von dort
aus wird es mit Hilfe der kleinen TIMs zum SAM Komplex geleitet, durch den
die Integration ausgeführt wird (Pfanner et al., 2004). Bei Proteinen mit
Einleitung
11
Importsignalen in α-Helices hingegen erkennt TOM70 den Vorläufer und
leitet ihn zu MIM1 (mitochondrial import protein), durch das der Einbau
gewährleistet wird (Becker et al., 2011; Waizenegger et al., 2005).
Proteine der inneren Membran passieren ebenfalls zuerst den TOM40
Kanal und werden dann durch die kleinen TIM Chaperone TIM9-10 und
TIM9-10-12 zu TIM22 geleitet (Rehling et al., 2003). Beteiligt sind auch
TIM54 und TIM18 sowie die Energiequelle ΔΨ. Neuere Studien implizieren
auch eine Beteiligung von SDH3 (succinate dehydrogenase subunit 3) beim
Import des TIM22 Komplex (Gebert et al., 2011).
Bei einem Import von Proteinen in den Intermembranraum ist MIA40
beteiligt (mitochondrial intermembrane space assembly). Durch Ausbildung
von Disulfidbrücken wird das zu importierende Protein durch den TOM
Komplex erkannt (Mesecke et al., 2005). Reoxidiert wird MIA40 durch die
Sulfhydryloxidase ERV1 (essential for respiration and viability; Allen et al.,
2005) und HOT13 (helper of TIM; Mesecke et al., 2008). Der Elektronenfluss
läuft dabei über Cytochrom c und die Cytochrom c Oxidase zum
Endakzeptor Sauerstoff ab (Bihlmaier et al., 2007; Dabir et al., 2007).
Weitere Regulationsmechanismen zur Effizienz des Imports sind
bekannt. So inhibieren cytosolische Proteinkinasen den Import durch
Phosphorylierung des TOM Komplexes und MIM1 (Rao et al., 2012; Schmidt
et al., 2011). Trotz des eingehend erforschten Modellsystems der
Hefemitochondrien ist noch von weiteren, bisher unbekannten Wegen des
Proteinimports auszugehen (Becker et al., 2012; Stojanovski et al., 2012).
Außer den Mitochondrien gibt es auch noch ein weiteres Zellorganell,
welches durch Endosymbiose vor etwa 1 bis 1,5 Milliarden Jahren
entstanden ist, der Chloroplast (Archibald 2009; Parfrey et al., 2011). Die
Chloroplasten stammen von einst freilebenden Cyanobakterien ab und
weisen ähnliche evolutive Charakteristika auf wie ihre mitochondrialen
Nachbarn: Gentransfer in den Nukleus, Umgebung durch eine
Doppelmembran, die eine Proteinimportmaschinerie enthält und zu
importierende Proteine, die anhand ihrer Signale erkannt werden (Gould et
al., 2008).
Einleitung
12
1.4 Proteinimport in Hydrogenosomen und Importsignale
Bei Hydrogenosomen ist die Importmaschinerie deutlich weniger erforscht.
Im Gegensatz zu Mitochondrien sind dort nur TOM40, SAM50. TIM17-22-23,
TIM44, TIM9-10 und der PAM Komplex bekannt (Rada et al., 2011; Shiflett &
Johnson, 2010). Somit ist es sehr wahrscheinlich, dass es in diesem System
noch weitere Importmechanismen bzw. Komponenten zu entdecken gibt,
was auch Ergebnisse aus dieser Arbeit vermuten lassen. Kürzlich wurde
beispielsweise von der Entdeckung von pATOM36 berichtet (archaic
translocase of the outer mitochondrial membrane), einem Protein der
äußeren Membran von Mitochondrien in Trypanosoma (Pusnik et al., 2012a).
Die Ähnlichkeit und evolutionäre Beziehung von ATOM zu TOM40 wird
jedoch noch diskutiert (Pusnik et al., 2012b; Žárský et al., 2012). Ansonsten
wird die Hypothese der Endosymbiose und die Entstehung der
Zellorganellen aus einst freilebenden Organismen durch die Ähnlichkeit der
mitochondrialen Maschinerie zu bakteriellen Kanälen gestützt (Hewitt et al.,
2011).
Die mitochondriale Proteinimportmaschinerie erkennt Signale, die bei
den zu importierenden Proteinen vorhanden sind und im Zuge der
Endosymbiose zusammen mit der Maschinerie koevolviert sind (Dyall et al.,
2004). Diese können am N-Terminus oder intern im Protein vorhanden sein
(Chacinska et al., 2009). Auch eine Kombination aus beidem ist möglich und
die internen Signale können mehrfach im Protein vorhanden sein (Chacinska
et al., 2009). Für Hefemitochondrien ist beschrieben, dass Matrixproteine N-
terminale Importsignale besitzen, die amphipatische α-Helices ausbilden,
serin-reich und positiv geladen sind und aus bis zu etwa 100 Aminosäuren
bestehen können, während Membranproteine und Proteine des
Intermembranraums interne Signale aufweisen. Interne Signale können
ebenfalls Eigenschaften der N-terminalen Transitpeptide haben. Oft haben
sie allerdings keine Ähnlichkeiten zu Transitpeptiden und sind nicht genau
beschrieben. Proteine des Intermembranraumes haben Cystein beinhaltende
interne Signale zur Ausbildung von Disulfidbrücken (Banci et al., 2009).
Einleitung
13
Interne Signale hydrogenosomaler Membranproteine wurden in Trichomonas
auch gefunden (Dyall et al., 2000; Dyall et al., 2003; Tjaden et al., 2004). N-
terminale Transitpeptide von Matrixproteinen sind ähnlich im Vergleich mit
jenen mitochondrialer Proteine der Hefe, jedoch kürzer. Bisher wurde davon
ausgegangen, dass Transitpeptide eine äquivalente Rolle bei Trichomonas
einnehmen. Bekannt ist bis heute jedoch nur ein Fall von einer
hydrogenosomalen Thioredoxin Reduktase, bei dem der Import in
Hydrogenosomen von diesem Signal obligat abhängig ist (Mentel et al.,
2008; Zimorski et al., 2012).
Ob ein Protein in ein Organell importiert wird oder nicht, kann durch
verschiedene Ansätze überprüft werden. Bei unbekannten oder
hypothetischen Proteinen kann unter Berücksichtigung diverser Parameter
von bereits bekannten Proteinen und deren Charakteristika eine
bioinformatische Vorhersage gemacht werden. Zu den Charakteristika
gehören der phylogenetische Ursprung, die Aminosäurezusammensetzung
oder das Vorhandensein von Importsignalen (Burstein et al., 2012; Claros &
Vincens, 1996). Das Programm berechnet Wahrscheinlichkeiten, mit denen
die Kandidaten im entsprechenden Zellkompartiment voraussichtlich
lokalisieren. Um die Vorhersage experimentell zu überprüfen, können diese
Kandidaten direkt mit fluoreszierenden Antikörpern gegen sie detektiert
werden, wobei als Positivkontrolle Antikörper gegen ein bekanntes Protein
des Zellkompartiments eingesetzt und unter einem Fluoreszenzmikroskop
Aufnahmen der Zellen gemacht werden. Kolokalisiert der Kandidat mit der
Kontrolle bei Überlagerung der Bilder, so ist die Lokalisation in der
gegebenen Fraktion bestätigt. Alternativ können Fusionsproteine aus den
Kandidaten und bekannten Tags hergestellt und nach einer Transfektion in
den Zellen homolog exprimiert werden. Die Detektion erfolgt dann entweder
ebenfalls durch Zellfixierung und Immunofluoreszenz oder durch
Zellfraktionierung, SDS-PAGE, Western Blot und Immunodetektion der
einzelnen Fraktionen.
Einleitung
14
1.5 Ziele dieser Doktorarbeit
Mitochondrien und Hydrogenosomen sind Zellorganellen gemeinsamen
Ursprungs. Im Vergleich zu Mitochondrien aus dem Modellorganismus
Saccharomyces cerevisiae ist der Proteinimport in Hydrogenosomen jedoch
nur marginal erforscht. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Gemeinsamkeiten
und Unterschiede der Proteinimportsignale in Hydrogenosomen näher zu
charakterisieren. Durch Expression geeigneter Genkonstrukte in
transfizierten T. vaginalis Zellen, Zellfraktionierung und Immunodetektion,
sollte die Signifikanz des N-terminalen Importsignals hydrogenosomaler
Matrixproteine untersucht werden. Im Zuge dessen sollten interne
Importsignale durch Untersuchung einzelner Proteindomänen gezielt
charakterisiert werden. Im Verlauf der Arbeit beobachtete, unerwartete und
wiederholt auftretende Migrationsdifferenzen von exprimierten
Importsubstraten in SDS Polyacrylamidgelen sollten ebenfalls aufgeklärt
werden.
Für die Lokalisationsstudien wurden bekannte hochexprimierte
hydrogenosomale Proteine ausgewählt: Ferredoxin 1 (TvFd; TVAG_003900)
aus der Klasse der [2Fe-2S] Ferredoxine (Gorrell et al., 1984; Johnson et al.,
1990; Vidakovic et al., 1996; Weksberg et al., 2007), das am
Elektronentransport beteiligt ist (Abb. 1.2), TvIscA (TVAG_456770) – ein iron
sulfur cluster assembly protein, malic enzyme (TvME; TVAG_267870) – eine
hydrogenosomale Malatdehydrogenase (Brugerolle et al., 2000; Doležal et
al., 2004; Hrdý & Müller, 1995b), die an der Bereitstellung von Pyruvat
beteiligt ist (Abb. 1.2), die α-Untereinheit der Succinyl CoA Synthetase
(TVAG_165340), auch bekannt als Succinat Thiokinase (Brugerolle et al.,
2000; Jenkins et al., 1991; Lahti et al., 1994; Mentel et al., 2008), welche die
ATP Produktion katalysiert (Abb. 1.2) und die hydrogenosomale Thioredoxin
Reduktase TrxRh2 (TVAG_125360), die an der Sauerstoffdetoxifizierung
beteiligt ist (Hirt et al., 2002; Mentel et al., 2008).
Zusätzlich sollten zum Verständnis des Vorläufers der Chloroplasten
die Genome von Sektion V Cyanobakterien sequenziert werden. Diese
zeichnen sich durch Filamentbildung und echte Verzweigungen in den
Einleitung
15
Filamenten aus und gehören somit zu den komplexesten Prokaryoten
(Dagan et al., 2013). Ausgewählt für die Analysen wurden Chlorogloeopsis
fritschii PCC 6912, C. fritschii PCC 9212, Fischerella muscicola PCC 73103,
F. muscicola PCC 7414 und F. thermalis PCC 7521 sowie zum Vergleich ein
Kandidat aus Sektion IV – Scytonema hofmanni PCC 7110 (Rippka et al.,
1979). Zur Ermöglichung von Sequenzanalysen sollte genomische DNA aus
den jeweiligen Stämmen isoliert und in ausreichender Qualität und Quantität
zur Verfügung gestellt werden. Bisher waren sequenzierte Genome nur von
Kandidaten der Sektionen I bis IV verfügbar.
Material und Methoden
16
2 Material und Methoden
2.1 Abkürzungen
Abb. Abbildung
ASCT Acetat:Succinat-CoA Transferase
AIP aryl hydrocarbon receptor interacting protein
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
bp Basenpaare
BSA Bovine Serum Albumine
°C Grad Celsius
ca. circa
CaCl2 Kalciumchlorid
CCl4 Tetrachlormethan
cDNA komplementäre DNA
CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat
(CH3)2SiCl2 Dichlordimethylsilan
cm Zentimeter
CoA Coenzym A
COX cytochrome c oxidase
CsCl Cäsiumchlorid
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid
CYT. C cytochrome c
Δ Delta, deletiert
ΔΨ Membranpotential
DAPI 4’,6-Diamidin-2-phenylindol
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EMBOSS european molecular biology open software suite
ER Endoplasmatisches Retikulum
ERV essential for respiration and viability
et al. et alii, et aliae, et alia
Fd Ferredoxin
Fe(NH4)2(SO4)2 Eisen(II)-Ammoniumsulfat
g Gramm
g Gravitation
GPI Glycosylphosphatidylinositol
G418 Geneticin
h Stunde
HA Hämagglutinin
H2O Wasser
HCl Salzsäure
HOT helper of Tim
HPP hydrogenosomal processing peptidase
HSP heat shock protein
Material und Methoden
17
ICP intermediate cleaving peptidase
IMP inner membrane peptidase
KCl Kaliumchlorid
kb Kilobase
KCl Kaliumchlorid
kDa Kilodalton
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
KOH Kaliumhydroxid
l Liter
IscA iron sulfur cluster assembly
IgG Immunglobulin G
LB lysogeny broth
µ Mikro
M Molar
MDM mitochondrial distribution and morphology
ME malic enzyme
MGE mitochondrial GrpE
MIA mitochondrial intermembrane space assembly
MIM mitochondrial import protein
min Minute
ml Milliliter
mM Millimolar
MOPS 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure
MPP mitochondrial processing peptidase
mRNA messenger-RNA
NaCl Natriumchlorid
Na2CO3 Natriumcarbonat
Na2HPO4 Natriumhydrogenphosphat
Na2S2O3 Natriumthiosulfat
NCBI National Center for Biotechnology Information
OCT octapeptidyl aminopeptidase
OD optische Dichte
ORF open reading frame
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PAM presequence translocase-associated motor
PBS phosphate buffered saline
PCC Pasteur Culture Collection
PCR polymerase chain reaction
PFO Pyruvat:Ferredoxin Oxidoreduktase
pH potentia Hydrogenii, pondus Hydrogenii
RNA Ribonukleinsäure
rpm revolutions per minute
RT Reverse Transkriptase
SAM sorting and assembly machinery
SCS Succinyl-CoA Synthetase
SDS sodium dodecyl sulfate
SM Saccharose MOPS
SMB Saccharose MOPS β-Mercaptoethanol
SMDI Saccharose MOPS DTT Inhibitoren
Tab. Tabelle
TAE Tris Acetat EDTA
Material und Methoden
18
TBS tris buffered saline
TBST TBS Tween 20
TCA Trichloressigsäure
TE Tris EDTA
TLCK N-α-Tosyl-L-Lysinchloromethylketon-Hydrochlorid
Tim translocase of the inner mitochondrial membrane
Tom translocase of the outer mitochondrial membrane
TP Transitpeptid
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
TrxR Thioredoxin-Reduktase
Tween 20 Polysorbat 20
U Enzymaktivität in Units
UTR untranslated region
UV Ultraviolett
V Volt
v Volumen
w Gewicht
2.2 Enzyme
Restriktionsenzyme Fermentas/NEB
BP / LR Clonase II enzyme mix Invitrogen
Proteinase K Roth
Quick T4 DNA Ligase NEB
Taq-Polymerase Metabion
Pfu-Polymerase Stratagene
Velocity-Polymerase Bioline
Phusion-Polymerase Finnzymes
2.3 Antikörper
Mouse anti-HA monoclonal antibody Sigma
Rabbit anti-ASCT polyclonal antibody Eurogentec
Rabbit anti-SCS polyclonal antibody Eurogentec
ImmunoPure goat anti-mouse Pierce/Thermo Scientific
ImmunoPure goat anti-rabbit Pierce/Thermo Scientific
Alexa fluor 488 donkey anti-mouse Invitrogen
Alexa fluor 633 goat anti-rabbit Invitrogen
Material und Methoden
19
2.4 Antibiotika
Ampicillin Sigma
Kanamycin Sigma
Penicillin/Streptomycin Biomedicals LLC
G418 Roth
2.5 Oligonukleotide
Die in dieser Arbeit eingesetzten Oligonukleotidsequenzen (Primer) wurden
von den Firmen Metabion und Eurofins synthetisiert.
Folgende Primer wurden zur Klonierung mit dem Gateway System
verwendet.
Fd_WT_B1_F 5’-AAA AAG CAG GCT ATG CTC TCT CAA GTT TGC C-3’
Fd_Δ7_B1_F 5’-AAA AAG CAG GCT ATG GGA ACA ATC ACA GCC GTC-3’
Fd_B5r_R 5’-TAT ACA AAG TTG GAG CTC GAA AAC AGC ACC-3’
HA_B2_R 5’-AGA AAG CTG GGT TTA AGC GTA ATC TGG AAC A-3’
IscA_B1_F 5’-AAA AAG CAG GCT ATG CTT TCC TCC ATT ATC C-3’
IscA_B5r_R 5’-TAT ACA AAG TTG ATG GAG GCA AGC ACC TGG-3’
SCSα_WT_B1_F 5’-AAA AAG CAG GCT ATG CTC TCC TCT TCC TTC-3’
SCSα_1st_B1_F 5’-AAA AAG CAG GCT ATG CTC CAC CAA CCA CTC-3’
SCSα_1st_B5r_R 5’-TAT ACA AAG TTG TTC TGT GAT GCA GAC-3’
SCSα_2nd_B1_F 5’-AAA AAG CAG GCT ATG CAC ATC CCA CAG CAC-3’
SCSα_2nd_B5r_R 5’-TAT ACA AAG TTG TGC AGC GAA GCG CTT-3’
SCSα_3rd_B1_F 5’-AAA AAG CAG GCT ATG GAC CCA CAG ACC GAG-3’
SCSα_3rd_B5r_R 5’-TAT ACA AAG TTG GAT CTT GCC CAT TCT-3’
TrxRh2_1st_B1_F 5’-AAA AAG CAG GCT ATG TCG GGT GAC ATT GAT-3’
TrxRh2_1st_B5r_R 5’-TAT ACA AAG TTG AAC GAT AAC AGA GCG-3’
TrxRh2_2nd_B1_F 5’-AAA AAG CAG GCT ATG GCA ACA GGT GCT AAG-3’
TrxRh2_2nd_B5r_R 5’-TAT ACA AAG TTG GTT TGT GAC AAC ATT-3’
TrxRh2_3rd_B1_F 5’-AAA AAG CAG GCT ATG GAA GTC AGC GAA ATC-3’
TrxRh2_3rd_B5r_R 5’-TAT ACA AAG TTG GTC CGT TAA ATA TTT-3’
1_B1_Adapter 5’-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CT-3’
1_B5r_Adapter 5’-GGG GAC AAC TTT TGT ATA CAA AGT TG-3’
Material und Methoden
20
Folgende Primer wurden zur Klonierung über Restriktion verwendet.
Eingefügte Restriktionsschnittstellen sind unterstrichen.
Fd_NdeI_F 5’-CTG ACG CAT ATG CTC TCT CAA GTT TGC CGC-3’
Fd_BamHI_R 5’-GAC GTG GAT CCG AGC TCG AAA ACA GCA CC-3’
IscA_NdeI_F 5’-CTG ACG CAT ATG CTT TCC TCC ATT ATC CGC-3’
IscA_Δ8_NdeI_F 5’-CTG ACG CAT ATG GCA AAA GCA AGA CCA GCA-3’
IscA_BamHI_R 5’-GAC GTG GAT CCA TGG AGG CAA GCA CCT GG-3’
ME_NdeI_F 5’-CTG ACG CAT ATG CTC ACA TCT TCA GTC TCT-3’
ME_Δ11_NdeI_F 5’-CTG ACG CAT ATG ATC TGC AGG GCT AAG GTC-3’
ME_BamHI_R 5’-GAC GTG GAT CCA TAG AGT TGC TCG TAT TC-3’
Folgende Primer wurden für Sequenzierungen verwendet.
M13_F 5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’
M13_R 5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3’
pJET_F 5’-CGA CTC ACT ATA GGG AGA GCG GC-3’
pJET_R 5’-AAG AAC ATC GAT TTT CCA TGG CAG-3’
pTagvag2_F 5’-CGG CCA CTT ACG CTT CAA TTA AGG GG-3’
2.6 Vektoren
pDONRTM221 P1-P5r Invitrogen
pDONRTM221 P5-P2 Invitrogen
pJET1.2/blunt Fermentas
pTagvag2 (Hrdý et al., 2004)
pStreptag Dr. Sven B. Gould
2.7 Kulturen
Escherichia coli Kulturen wurden zu Klonierungszwecken käuflich erworben.
Trichomonas vaginalis war der Modellorganismus für zell- und
molekularbiologische Experimente. Cyanobakterien der Sektionen IV und V
(Rippka et al., 1979) wurden zur Genomanalyse eingesetzt.
Material und Methoden
21
Name Genotyp
Escherichia coli XL1-Blue MRF’ (Stratagene) Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1
supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F’ proAB
lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]
DH5α (Bethesda Research Laboratories) F- endA1 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 ϕ80lacZΔM15
Δ(lacZYA-argF) U169 hsdR17 (rK- mK
+) phoA
supE44 λ-
One Shot® ccdB Survival™ 2 T1R
(Invitrogen)
F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80lacZΔM15
ΔlacX74 recA1 araΔ139 Δ(ara-leu)7697 galU galK
rpsL (StrR) endA1 nupG fhuA::IS2
Name Bezug
Trichomonas vaginalis J.-H. Tai, Institute of Biomedical Sciences,
Taipei, Taiwan
Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912 R. Rippka, Institut Pasteur, Paris
Chlorogloeopsis fritschii PCC 9212 R. Rippka, Institut Pasteur, Paris
Fischerella muscicola PCC 73103 R. Rippka, Institut Pasteur, Paris
Fischerella muscicola PCC 7414 R. Rippka, Institut Pasteur, Paris
Fischerella thermalis PCC 7521 R. Rippka, Institut Pasteur, Paris
Scytonema hofmanni PCC 7110 R. Rippka, Institut Pasteur, Paris
2.8 Medien
TYM (Diamond, 1957)
LB (Bertani, 1951)
2.9 Arbeiten mit Zellkulturen
Für sämtliche durchgeführten Experimente wurde der Trichomonas vaginalis
T1 Stamm verwendet.
Material und Methoden
22
2.9.1 Kultivierung von Trichomonas vaginalis Die Zellkulturen von Trichomonas vaginalis wurden in tryptose-yeast extract-
maltose Medium (TYM) pH 6,2 (2,22 % (w/v) Tryptose; 1,11 % (w/v)
Hefeextrakt; 5,55 % (w/v) Maltose; 1,11 % (w/v) L-Cystein; 0,22 % (w/v) L-
(+)Ascorbinsäure; 0,88 % (w/v) Kaliumdihydrogenphosphat; 0,88 % (w/v)
Dikaliumhydrogenphosphat; nach Autoklavierung 10 % (v/v) hitzeinaktiviertes
Pferdeserum (PAN Biotech); 0,71 % (v/v) Eisenlösung (1 % (w/v)
Fe(NH4)2(SO4)2 × 6H2O; 0,1 % (w/v) 5-Sulfosalicylsäure)) in 15 ml Röhrchen
kultiviert (Clark & Diamond, 2002; Diamond, 1957). Zellen aus den Kulturen
wurden mindestens alle zwei Tage in frisches Medium überführt. Für
Experimente in dieser Arbeit wurden Kulturen in Volumina bis zu 2 l
angezogen.
Zur langzeit Lagerung wurden Dauerkulturen angelegt. Verwendet
wurde stets eine dicht angewachsene Kultur, die in Cryo-Röhrchen mit
frischem TYM Medium zu 50 % verdünnt wurde. Zu den Dauerkulturen
wurde zusätzlich 10 % (v/v) DMSO zugegeben. Es folgte 1 h Inkubation auf
Eis und 1 h bei -20 °C. Anschließend wurden sie bei -80 °C aufbewahrt.
TYM Medium wurde zur Vermeidung von bakteriellen
Kontaminationen stets mit 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin (MP Biomedicals)
versetzt. Zur Selektion von transfizierten Trichomonas Zellen wurde
100 µg/ml G418 (Roth) verwendet.
2.9.2 Transfektion durch Elektroporation T. vaginalis Zellen wurden durch Elektroporation transfiziert (Delgadillo et al.,
1997; Land et al., 2004). Es wurde stets 50 µg Plasmid in 0,4 cm
Elektroporationsküvetten (Molecular BioProducts bzw. Bio-Rad) verwendet.
Hinzugegeben wurden ca. 2,5 × 108 in 300 µl frischem TYM Medium
resuspendierte und viermal durch eine 23G-Nadel gezogene T. vaginalis
Zellen. Die Küvette wurde in die Schockkammer des Gene Pulser (Bio-Rad)
inseriert, der elektrische Puls erfolgte bei 350 V und 960 µFd. Anschließend
wurden die Zellen für 10 min auf Eis gekühlt und in frisches TYM Medium
Material und Methoden
23
überführt. Die Selektion erfolgte mit G418 [100 µg/ml] nach einer Inkubation
von 4 h bei 37 °C.
Der Transfektionserfolg wurde mit einer PCR überprüft. Nach drei
Waschschritten mit sterilem H2O wurden die transfizierten Zellen in einem
Thermocycler (Eppendorf) durch wiederholtes Erhitzen und Abkühlen
aufgeschlossen. Die Zellsuspension diente als Ausgangsmaterial für die
PCR, die unter Verwendung spezifischer Primer gegen das entsprechende
Konstrukt durchgeführt wurde.
2.9.3 Isolation von Hydrogenosomen Intakte Hydrogenosomen wurden aus dicht angewachsenen 2 l T. vaginalis
Kulturen isoliert (Bradley et al., 1997; Pütz et al., 2005). Die Zellen wurden
bei 1000 g pelletiert und zweimal mit SMB (250 mM Saccharose; 10 mM
MOPS/KOH pH 7,2; 10 mM β-Mercaptoethanol) gewaschen. Danach wurden
sie in SMDI (250 mM Saccharose; 10 mM MOPS/KOH pH 7,2; 10 mM DTT;
10 µg/ml Leupeptin; 50 µg/ml TLCK) resuspendiert und mit Mörser und Pistill
unter Zugabe von ∅ 0,4 bis 0.6 mm Glasperlen (Sartorius) aufgeschlossen.
Die Glasperlen und Zelltrümmer wurden bei 755 g abzentrifugiert und der
Überstand als Gesamtzellextrakt aufbewahrt. Durch einen weiteren
Zentrifugationsschritt bei 7500 g wurde das Cytosol von den Organellen
getrennt. Die Organellen wurden in SMDI resuspendiert, mit 90 % Percoll
(90 % (v/v) Percoll, GE Healthcare; 10 % (v/v) isotonische Saccharose
(2,5 M Saccharose; 100 mM MOPS/KOH pH 7,2); 10 mM DTT; 50 µg/ml
TLCK; 10 µg/ml Leupeptin) im Verhältnis 1 : 1 verdünnt und in einem
Vertikalrotor bei 87000 g bis zur Einstellung eines Dichtegradienten
zentrifugiert. Es entstanden zwei distinkte Banden, Lysosomen und
Hydrogenosomen, sowie eine Polysaccharidschicht als Sediment am
Zentrifugenröhrchen. Die Hydrogenosomen wurden zweimal mit SMDI
gewaschen und anschließend aufbewahrt.
Material und Methoden
24
2.9.4 Proteasebehandlung der Hydrogenosomen Isolierte Hydrogenosomen wurden zur Determination des Proteinimports mit
Proteinase K behandelt (Dyall et al., 2003). 200 µg Hydrogenosomen wurden
in SM Puffer (250 mM Saccharose; 10 mM MOPS/KOH pH 8,0; 10 mM
EDTA pH 8,0) resuspendiert, mit 50 bzw. 100 µg/ml Proteinase K versetzt
und bei 37 °C für 30 min inkubiert. Als Positivkontrolle wurde bei jedem
Ansatz eine Probe mit 1 % (v/v) Triton X-100 verwendet. Ebenfalls wurde
stets eine Negativkontrolle, ohne Zugabe von Proteinase K, angesetzt. Die
Proteolyse wurde durch das Hinzufügen von Aceton/Trichloressigsäure
(1 : 7,5) beendet.
2.9.5 Dephosphorylierung hydrogenosomaler Proteine Hydrogenosomale Proteine wurden durch Einsatz von alkalischer
Phosphatase (CIP) dephosphoryliert. 50 µg Hydrogenosomen wurden mit
5 U CIP (Fermentas), CIP Puffer (Fermentas) und 1 % (v/v) Triton X-100 für
60 min bei 37 °C inkubiert. Als Negativkontrollen wurden Proben ohne CIP
bzw. ohne Triton X-100 verwendet.
2.9.6 Isolation hydrogenosomaler Membranen und Matrix Hydrogenosomale Proteine wurden durch Ultrazentrifugation in Membran-
und Matrixproteine getrennt. Die Hydrogenosomen wurden für 45 min in
0,1 M Na2CO3 inkubiert (Fujiki et al., 1982) und anschließend bei 208000 g
zentrifugiert. Die Membranproteine sedimentierten am Boden des
Zentrifugenröhrchens, während die Matrixproteine in der gelösten Fraktion
verblieben.
2.9.7 Kultivierung von Escherichia coli Escherichia coli XL1-Blue und DH5α Kulturen wurden bei 37 °C in LB
Medium bzw. auf LB Agarplatten angezogen (Bertani, 1951; Sambrook et al.,
1989).
Material und Methoden
25
2.9.8 Anlegen von Stammkulturen Die Kulturen wurden in LB Medium bis zu einer OD600 von 0,6 bis 0,8
angezogen und nach Zugabe von sterilem Glycerin aliquotiert und in
flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Stammkulturen (Glycerolstocks)
wurden bei -80 °C aufbewahrt.
2.9.9 Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen Die chemische Kompetenz von E. coli Zellen wurde durch die Behandlung
mit Kalziumsalz erreicht (Mandel & Higa, 1970). Eine 250 ml E. coli Kultur
wurde bis zu einer OD550 von 0,4 bis 0,6 angezogen. Dann wurde sie für 15
min bei 1300 g pelletiert und in 80 ml Freezing Buffer gewaschen (100 mM
KCl; 50 mM CaCl2 × 2H2O; 10 mM Kaliumacetat; 10 % (v/v) Glycerin; pH 6,4).
Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt wurden die Zellen in 20 ml
Freezing Buffer resuspendiert, in 1,5 ml Reaktionsgefäße aliquotiert und in
flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung erfolgte bei -80 °C.
2.9.10 Transformation durch Hitzeschock Chemisch kompetente Zellen wurden durch Hitzeschock mit Plasmid DNA
transformiert (Hanahan, 1983). Der Hitzeschock erfolgte bei 42 °C nach einer
Inkubation der Zellen auf Eis. Die Zellen wurden wieder abgekühlt und in LB
Medium bei 37 °C bei 200 rpm angezogen. Danach wurden sie auf einer LB
Platte mit entsprechendem Antibiotikum auf positive Klone selektiert.
2.10 Arbeiten mit Nukleinsäuren
2.10.1 Silanisieren von Glasgefäßen Corex® Zentrifugationsröhrchen und Pasteurpipetten wurden mit 5 %
(CH3)2SiCl2 in CCl4 zur Hydrophobierung silanisiert. Hierbei entstand an der
Glasoberfläche eine Silanschicht durch chemische Anlagerung. Somit wurde
die Adherenz durch Wasserstoffbrücken von Flüssigkeitsresten an der
Material und Methoden
26
Glasoberfläche unterbunden. Die silanisierten Gefäße wurden mit Ethanol
und Wasser gespült und zum Trocknen ausgeheizt.
2.10.2 Isolation genomischer DNA aus Cyanobakterien Cyanobakterielle DNA wurde mit der Phenol/Chloroform Extraktion isoliert,
da andere Methoden wie die Isolation mit DNAzol® (Invitrogen) oder CTAB
(Roth) keinen Erfolg zeigten. Pelletierte Kulturen wurden hierbei in TES
Puffer (25 % (w/v) Saccharose; 50 mM Tris-HCl pH 8,0; 100 mM EDTA pH
8,0) resuspendiert und die Zellen durch Inkubation mit Lysozym [5 mg/ml]
bei 37 °C für 1 h aufgeschlossen. Zum Entfernen der Exopolysacharidschicht
wurde 0,1 bis 1 % Sarkosyl hinzugefügt (Wu et al., 2000). Anschließend
erfolgte die Zugabe von Proteinase K [100 µg/ml] sowie 2 % (v/v) SDS und
eine Inkubation bei 60 °C für 2h. Proteine und DNA wurden zweimal durch
Zugabe von 1 Volumen Phenol/Chloroform voneinander getrennt.
Anschließend wurde 1 Volumen reines Chloroform verwendet. Die DNA
wurde mit 0,7 Volumen Isopropanol gefällt, das Pellet mit 70 % Ethanol
gewaschen und in H2O bei 4 °C über Nacht resuspendiert.
2.10.3 Reinigung isolierter DNA aus Cyanobakterien Die mit Phenol/Chloroform extrahierte DNA enthielt noch RNA und
Polysaccharide. Diese wurden durch Dichtegradientenzentrifugation entfernt.
Es wurde 1 g CsCl pro ml TE Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA
pH 8,0) verwendet. Hinzugegeben wurde die isolierte DNA Probe und circa
0,01 % (v/v) Ethidiumbromid. Der Ansatz wurde mit silanisierten
Pasteurpipetten in Beckmann Polyallomer Zentrifugenröhrchen überführt und
mit 1 µl Isoamylalkohol versetzt. Die Röhrchen wurden verschweißt und bei
150000 g und 20 °C für 40 h zentrifugiert. Unter UV Licht wurde die DNA
Bande sichtbar. RNA und Polysaccharide sedimentierten am
Zentrifugenröhrchen. Das Röhrchen wurde mit einer 23G-Nadel
durchstochen und die DNA abgenommen. Eine weitere Nadel wurde für den
Druckausgleich verwendet. Das Ethidiumbromid wurde mit in CsCl
gesättigtem Isoamylalkohol entfernt. Die DNA wurde durch Zugabe von 70%
Material und Methoden
27
Ethanol in TE Puffer und 0,1 M Natriumacetat pH 6,5 bei -20 °C über Nacht
in silanisierten Corex® Röhrchen gefällt. Dann wurden die Proben bei 7500 g
und 4 °C für 30 min zentrifugiert und die DNA in TE Puffer resuspendiert.
Zur Erstellung von Fosmid Bibliotheken von Chlorogloeopsis fritschii
PCC 6912 zum Schließen des Genoms wurde auf den Schritt verzichtet, um
Scherkräfte zu vermeiden und zur Gewährleistung von DNA Fragmenten mit
hohem Molekulargewicht. RNA wurde hierbei durch Inkubation in RNase
entfernt und die DNA in H2O resuspendiert.
2.10.4 Isolation genomischer DNA und RNA aus T. vaginalis Genomische DNA aus T. vaginalis wurde mit DNAzol® (Invitrogen) isoliert.
Hierbei wurde eine 50 ml Zellkultur in der logarithmischen Wachstumsphase
verwendet und die Zellen bei 1000 g pelletiert. Das verbliebene Medium
wurde verworfen und die Isolation nach Herstellerprotokoll durchgeführt.
Gesamt RNA wurde mit TRIzol® (Invitrogen) nach Angaben des
Herstellers isoliert.
2.10.5 Synthese von cDNA Aus isolierter Gesamt RNA wurde mit dem SuperScript® III First-Strand
Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) cDNA nach dem
Herstellerprotokoll synthetisiert. Für die Synthese wurde die reverse
Transkriptase SuperScript III RT eingesetzt.
2.10.6 Polymerasekettenreaktion (PCR) Zur Amplifikation von Genen wurde eine Polymerasekettenreaktion (PCR)
durchgeführt (Saiki et al., 1988). Mit dieser Methode wurden die
gewünschten Gene durch wiederholtes Erhitzen und Abkühlen vervielfältigt.
Im ersten Schritt wurde die doppelsträngige DNA bei 95 °C in ihre
Einzelstränge denaturiert. Der zweite Schritt war die Anlagerungsphase, bei
der die Primer an die DNA banden, und fand bei 50 bis 60 °C statt. Da die
Material und Methoden
28
optimalen Anlagerungstemperaturen bei verschiedenen Primern variieren
wurde hier oft ein Temperaturgradient eingesetzt, um ein optimales Ergebnis
zu erzielen. Der dritte Schritt war die Elongationsphase und fand bei 72 °C,
dem Temperaturoptimum der DNA Polymerase, statt. Hierbei wurde der
komplementäre DNA Strang neu synthetisiert. Diese drei Schritte stellten
einen Zyklus der PCR dar, welcher 30 mal wiederholt wurde. Somit stieg die
Zahl der Genkopien logarithmisch an.
Als Ausgangsmaterial wurde isolierte genomische DNA oder
gereinigtes Plasmid mit dem gewünschten Zielgen verwendet. Sämtliche
Primer wurden zuvor konstruiert und von den Firmen Metabion bzw. Eurofins
synthetisiert. Jeder Ansatz enthielt zusätzlich dNTPs und eine DNA
Polymerase mit entsprechendem Puffer. In dieser Arbeit wurden die
Proofreading Polymerasen Pfu (Fermentas), Phusion (Finnzymes/NEB) und
Velocity (Bioline) verwendet. Bereits vorhandene Konstrukte wurden mit der
Taq Polymerase (Metabion) getestet.
Falls die Überhänge für die Primer zu lang waren, wurde die PCR in
zwei Teilen durchgeführt. Die erste PCR erfolgte wie oben beschrieben. Die
zweite PCR wurde als Nested-PCR bezeichnet. Hierbei diente als
Ausgangssubstrat das Produkt der ersten PCR. Ziel dieser PCR war die
Verlängerung der Überhänge an den 5’ und 3’ Enden des entsprechenden
Gens.
2.10.7 Agarose Gelelektrophorese Mit der Gelelektrophorese wurde DNA und RNA in einem Agarosegel bei
einer angesetzten Spannung getrennt. Um eine optimale Trennung zu
gewährleisten wurden je nach Gengröße 0,7 bis 2 %ige (w/v) Agarosegele in
TAE Puffer (40 mM Tris; 20 mM Essigsäure; 1 mM EDTA pH 8,0) angesetzt.
Das Gel wurde in der Mikrowelle Quick Cookmate (Daewoo) aufgekocht und
in einen Gelträger gegossen. Zum Erzeugen von Geltaschen wurde ein
entsprechender Kamm verwendet. Nachdem das Gel ausgehärtet war,
konnte es in eine Elektrophoresekammer der Serie Sub-Cell® GT (Bio-Rad)
eingesetzt werden und mit Proben beladen werden. Die Proben wurden stets
Material und Methoden
29
mit Ladepuffer (2,5 % (w/v) Ficoll 400; 5 % (v/v) EDTA pH 8,0; 0,0125 %
(w/v) Bromphenolblau; 0,0125 % (w/v) Xylencyanolblau) versetzt. Zur
Visualisierung der DNA Banden wurde Ethidiumbromid verwendet. Zur
Determination der Bandengröße wurden stets Marker verwendet. Eingesetzt
wurden die Marker Hyperladder I, II und IV (Bioline). Analysiert wurden die
Gele in der Geldokumentationsanlage GelDoc-IT™ (UVP) oder auf einem
UV-Tisch (LTF Labortechnik) unter Bestrahlung mit UV-Licht. Durch
Interkalierung des Ethidiumbromids mit den Nukleinsäuren wurden die
spezifischen Banden durch Fluoreszenz sichtbar. Anhand der
Leuchtintensität des Markers konnte zudem eine Konzentrationsbestimmung
durchgeführt werden, da die Konzentrationen der einzelnen Markerbanden
bekannt waren. Durch die Gelmigration wurde die DNA-Probe auch von
anderen Inhaltsstoffen, wie z.B. Puffern oder Restriktionsenzymen, gereinigt.
Die Bande konnte dann mit einem Skalpell ausgeschnitten und aus dem Gel
eluiert werden.
2.10.8 DNA-Elution aus Agarosegelen Durch Elektrophorese getrennte und ausgeschnittene DNA wurde nach dem
Prinzip der DNA-Bindung an Silikamembranen aus Agarosegelen eluiert
(Vogelstein & Gillespie, 1979). Verwendet wurden hierfür das QIAquick Gel
Extraction Kit (Quiagen) bzw. MinElute® Gel Extraction Kit (Quiagen) und es
wurde nach Protokoll des Herstellers weiter verfahren.
2.10.9 DNA-Konzentrationsbestimmung Die DNA-Konzentrationsbestimmung erfolgte photometrisch bei 260 nm.
Alternativ wurde sie mit Qbit (Invitrogen) nach Herstellerprotokoll bestimmt
oder bei der Gelelektrophorese durch Abgleich der DNA Leuchtintensität mit
Banden bekannter Konzentration des Markers HyperLadder I (Bioline).
Material und Methoden
30
2.10.10 Klonierung über Restriktionsschnittstellen Amplifizierte Gene wurden durch Klonierung in Escherichia coli vermehrt. Es
wurden Klonierungen mit glatten Enden (blunt ends) und mit klebrigen Enden
(sticky ends) durchgeführt.
Die blunt end Ligation wurde mit dem CloneJET™ PCR Cloning Kit
(Fermentas) durchgeführt. PCR Produkte wurden hierbei in den bereits
linearisiert vorliegenden pJET1.2/blunt Vektor mit einer T4 DNA Ligase ligiert.
Die Ligation erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers. Anschließend
erfolgte zur Vermehrung des Plasmids eine Transformation mit E. coli XL1-
Blue Zellen und eine Selektion mit Ampicillin auf positive Transformanten.
Zellen, die ein mit sich selbst religiertes Plasmid aufgenommen hatten,
wurden durch ein letales Gen im Vektor am Wachstum gehindert. Plasmide
wurden aus den positiven Klonen isoliert und die Gene durch Sequenzierung
überprüft.
Die Fragmente wurden mit Restriktionsenzymen aus dem Plasmid
rausgeschnitten. Typischerweise wurden hier die Enzyme NdeI und BamHI
eingesetzt, so dass sticky ends entstanden. Der Zielvektor wurde stets mit
den gleichen Restriktionsenzymen behandelt, um eine Ligation zu
ermöglichen. In diesem Fall wurde für die Ligation der Expressionsvektor
pTagvag2 und eine Quick T4 DNA Ligase (NEB) verwendet. Danach folgte
wieder eine Transformation mit E. coli XL1-Blue Zellen, die Selektion mit
Ampicillin und eine Plasmidisolation. Der Expressionsvektor mit dem
gewünschten Zielgen konnte anschließend für die Transfektion von T.
vaginalis Zellen verwendet werden.
2.10.11 Klonierung mit dem Gateway System Alternativ wurde die Klonierung mit dem Gateway System (Invitrogen)
durchgeführt (Katzen, 2007). Diese Methode basiert auf der Rekombination
von Erkennungsstellen (attachment sites) der Phage λ bei der Insertion
seines Genoms in das Genom des Wirtsbakteriums (Hartley et al., 2000;
Landy, 1989; Sasaki et al., 2004; Sasaki et al., 2008). Die Klonierung wird in
zwei Stufen unterteilt: die BP Rekombination und die LR Rekombination.
Material und Methoden
31
Bei der BP Rekombination wurde das Amplifikat in einen Klonierungsvektor
inseriert. Amplifizierte Genfragmente enthielten hierbei attB sites, welche
Äquivalente der bakteriellen Rekombinationssequenzen darstellen. Die
Klonierungsvektoren hingegen enthielten attP sites, die den
Phagenrekombinationsstellen entsprachen. Die BP Rekombination wurde mit
dem attB PCR Produkt, dem entsprechenden attP pDONR™221
Klonierungsvektor und dem BP Clonase II enzyme mix nach Protokoll des
Herstellers durchgeführt. Der pDONR™221 P1-P5r wurde stets für die
Klonierung von Zielgenen aus T. vaginalis verwendet. Der pDONR™221
P5P2 Vektor hingegen wurde ausschließlich für die Klonierung eines Di-
Hämagglutinin Tags, der für die spätere Immunodetektion relevant war,
verwendet und wurde freundlicherweise von Dr. Verena Zimorski (Institut für
Molekulare Evolution, HHU Düsseldorf) zur Verfügung gestellt. Nach
abgeschlossener Rekombination entstanden attL und attR sites. Darauf
folgte eine Transformation von E. coli DH5α, die Selektion mit Kanamycin,
Plasmidisolation und Sequenzierung. Ein letales Gen in den pDONR™221
Vektoren verhinderte das Wachstum von Transformanten mit nicht
rekombinierten Plasmiden.
Bei der LR Rekombination wurden die Fragmente aus den
pDONR™221 Vektoren in einen Expressionsvektor in vordefinierter
Reihenfolge inseriert. Die linken attL sites rekombinierten hierbei mit den
rechten attR sites. Für die Reaktion wurden stets die beiden rekombinierten
pDONR™221 Vektoren, der mit attachment sites modifizierte
Expressionsvektor pTagvag2 (freundlicherweise von Dr. Verena Zimorski
(Institut für Molekulare Evolution, HHU Düsseldorf) zur Verfügung gestellt)
sowie der LR Clonase II Plus enzyme mix nach Protokoll des Herstellers
durchgeführt. Danach erfolgte eine Transformation von E. coli DH5α, die
Selektion mit Ampicillin und die Plasmidisolation. Das fertige Konstrukt
konnte anschließend für die Transfektion von T. vaginalis verwendet werden.
Zur Vervielfältigung des nicht rekombinierten pDONR™221 P1-P5r
Plasmids wurden One Shot® ccdB Survival™ 2 T1R kompetente E. coli Zellen
(Invitrogen) für die Transformation verwendet. Diese Zellen werden nicht von
Material und Methoden
32
den Effekten des letalen Gens des Vektors abgetötet. Die Transformation
wurde nach Protokoll des Herstellers durchgeführt.
Abb. 2.1: Schematische Darstellung des Klonierungsprinzips mit dem Gateway System aus dem Protokoll von Invitrogen.
2.10.12 Isolation von zirkulären Plasmiden Plasmid DNA aus E. coli wurde nach dem Prinzip der alkalischen Lyse
bakterieller Zellen isoliert (Birnboim & Doly, 1979). Dafür verwendet wurden
die Kits NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel) bzw. GeneJET™ Plasmid
Miniprep Kit (Fermentas).
2.10.13 Sequenzierung Plasmide wurden mit dem Kettenabbruchverfahren sequenziert (Sanger et
al., 1977). Die Sequenzierungen wurden von der Firma GATC durchgeführt
und die Ergebnisse wurden durch die Internetpräsenz zur Verfügung gestellt.
Material und Methoden
33
2.11 Arbeiten mit Proteinen
2.11.1 Präzipitation von Proteinen mit Aceton/TCA Aceton und Trichloressigsäure (TCA) wurden im Verhältnis 1 : 7,5 eingesetzt.
Hydrogenosomale Proteine wurden auf diese Weise über Nacht bei -20 °C
gefällt. Danach wurden sie drei mal mit Aceton bei 500 rpm gewaschen und
anschließend in Rehydratisierungspuffer (7 M Harnstoff; 2 M Thioharnstoff;
4 % (w/v) CHAPS) bei 600 rpm resuspendiert. Für die Proteintrennung durch
eine SDS-PAGE wurde konzentriertes Tris und Laemmlipuffer hinzugefügt.
2.11.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen Die Konzentration von Proteinen wurde photometrisch bei 595 nm unter
Verwendung eines Bradford-Reagenz für Protein Assays (Bio-Rad) bestimmt
(Bradford, 1976). Um die Proteinkonzentrationen ermitteln zu können wurde
zuerst eine Kalibrierungsgerade mit bekannten Rinderserumalbumin (BSA)
Proteinkonzentrationen erstellt.
2.11.3 SDS-PAGE Die Trennung von Proteinen erfolgte durch denaturierende SDS
Polyacrylamid Gelelektrophorese (Laemmli, 1970). Mit dieser Methode
wurden Proteine nach ihrem Molekulargewicht getrennt. Verwendet wurden
Mini-PROTEAN® TGX™ Stainfree Precast Gele (Bio-Rad) oder selbst
angefertigte 12 bis 15 %ige (v/v) Gele. Sie bestanden aus einem Sammelgel
und einem Trenngel. Als Proteinmarker wurde stets der PageRuler™ Plus
Prestained Protein Ladder (Fermentas) verwendet. Proteine in Precast Gelen
wurden in der Mini-PROTEAN® Tetra Cell (Bio-Rad) getrennt. Die Trennung
mit selbst hergestellten Gelen erfolgte in den Gelkammern P8DS, P9DS oder
P10DS (OWL Separation Systems/Thermo Scientific) bzw. Hoefer SE600
(Hoefer). Die Proteine wurden stets vor der Trennung für 10 min bei 95 °C
denaturiert und mit 1 × Lämmli Puffer (10 mM Tris; 1 mM EDTA; 1 % (w/v)
SDS; 5 % (v/v) β-Mercaptoethanol; 10 % (v/v) Glycerin; 0,05 % (w/v)
Material und Methoden
34
Bromphenolblau) versetzt. Die Kammern wurden mit 1 × Tris-Glycin
Laufpuffer befüllt.
2.11.4 Isoelektrische Fokussierung Zur zweidimensionalen Trennung wurde vor der SDS-PAGE eine
isoelektrische Fokussierung durchgeführt. Hierbei wurden Proteine nach
ihrem pH Wert getrennt und lagerten sich an ihrem isoelektrischen Punkt an.
1 mg Hydrogenosomen wurden in Lysispuffer (7 M Harnstoff, 2 M
Thioharnstoff, 40 mM Tris-HCl pH 9.0, 2 % (w/v) CHAPS, 2 % (w/v) ASB14)
mit 1 % (w/v) DTT inkubiert mit einem 2-D Clean-Up Kit (GE Healthcare)
nach Herstellerprotokoll behandelt und anschließend in
Rehydratisierungspuffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 2 % (w/v) CHAPS,
2 % (w/v) ASB14, 0,5 % (v/v) IPG-Puffer pH 6-11, spurweise
Bromphenolblau) mit 1 % (w/v) DTT resuspendiert. Mit den Proteinen wurde
dann ein IPG-Strip (immobilised pH gradient) pH 6-11 in einem Keramik
Stripholder beladen und mit cover fluid (Mineralöl) überschichtet. Die
Fokussierung erfolgte im Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare) bei 20 °C und 50
µA/Strip. Folgendes Programm wurde verwendet: 10 h Rehydratisierung, 1 h
step ‘n hold 100 V, 1 h step ‘n hold 200 V, 1 h step ‘n hold 500 V, 1 h step ‘n
hold 1000 V, 1 h Gradient 1000 bis 8000 V, 4 h step ‘n hold 8000 V. Darauf
folgte die Trennung nach der zweiten Dimension. Hierzu wurde der IPG-Strip
in Äquilibrierungslösung (50 mM Tris-HCl pH 8,8, 6 M Harnstoff, 30 % (v/v)
Glycerin, 2 % (w/v) SDS, Spurweise Bromphenolblau) und 1 % (w/v) DTT
inkubiert, beim zweiten Äquilibrierungsschritt zusätzlich mit 2,5 % (w/v)
Iodacetamid, auf ein SDS-Gel geladen und mit Agarose Sealing solution (1 ×
Tris-Glycin Puffer, 0,5 % (w/v) M-Agarose, spurweise Bromphenolblau) fixiert.
2.11.5 Coomassie Färbung von Polyacrylamidgelen Proteingele wurden mit Coomassie Brilliant Blau angefärbt (Heukeshoven &
Dernick, 1988; Neuhoff et al., 1985). Dazu wurde eine Tablette
PhastGel™Blue R-350 (GE Healthcare) in 40 % Wasser und 60 % (v/v)
Material und Methoden
35
Methanol (Endvolumen: 200 ml) gelöst. Anschließend wurde die Lösung
1 : 10 mit 10% (v/v) Essigsäure verdünnt.
Alternativ wurde die Sensitive Coomassie Färbung eingesetzt (Kang
et al., 2002). Die angesetzte Färbelösung bestand aus 0,02 % (w/v)
Coomassie Brilliant Blau G250; 2 % (w/v) Phosphorsäure; 5 % (w/v)
Aluminiumsulfat; 10 % (v/v) Ethanol.
2.11.6 Silberfärbung von Polyacrylamidgelen Die Silberfärbung wurde zur Visualisierung von zweidimensional getrennten
Proteinen in SDS Gelen durchgeführt (Blum et al., 1987). Hierzu wurde das
Gel in Lösung 1 (30 % (v/v) Methanol; 12 % (v/v) Essigsäure) für 1 h
inkubiert und danach unter Schütteln in H2O über Nacht. Anschließend
wurde dreimal für 20 min in 30 % (v/v) Ethanol geschüttelt und für 1 min in
0,02 % (w/v) Na2S2O3 inkubiert. Danach folgten drei Waschschritte mit H2O
und Inkubation in Lösung 2 (0,2 % (w/v) Silbernitrat, 0,075 % (v/v)
Formaldehyd). Es wurde zweimal in H2O gewaschen und in Lösung 3 (6 %
(w/v) Natriumcarbonat; 0,0004 % (v/v) Natriumthiosulfat; 0,00005 % (v/v)
Formaldehyd) inkubiert. Die Färbung wurde mit Lösung 4 (50 % (v/v)
Methanol; 12 % (v/v) Essigsäure) gestoppt.
2.11.7 Tryptischer Verdau von Proteinen Zur Proteinsequenzierung wurden die Proteine mit Trypsin behandelt. Die
entsprechenden Proteine wurden aus dem Gel ausgeschnitten und die
Gelstücke in ca. 1 mm3 große Stücke zerkleinert. Um Verluste möglichst
gering zu halten wurden LoRetention Reaktionsgefäße (Eppendorf) und
LoRetention Pipettenspitzen (Eppendorf) verwendet. Salze und störende
Agentien wurden aus dem Gel zweimal mit 50 % (v/v) Acetonitril
ausgewaschen. Danach wurde mit 100 % Acetonitril gewaschen und
anschließend mit 100 mM Ammoniumhydrogencarbonat (Bicarbonat). Dann
wurde 100 mM Bicarbonat zugegeben und dazu 1 Volumen Acetonitril.
Danach wurde 1 Volumen 100 % Acetonitril hinzugefügt. Anschließend
Material und Methoden
36
wurde die Lösung abgenommen und die Probe in der Vakuum-Zentrifuge
Concentrator 5301 (Eppendorf) getrocknet. Als nächstes wurden die Peptide
durch Zugabe von 10 mM DTT in 100 mM Bicarbonat reduziert. Cystein-
Reste wurden durch 55 mM Iodacetamid in 100 mM Bicarbonat alkyliert.
Nach Abnehmen der Lösung wurde dann in 100 mM Bicarbonat inkubiert
und 1 Volumen Acetonitril hinzugefügt. Nachfolgend wurde in der
Vakuumzentrifuge getrocknet. Die Gelstücke wurden dann in 0,1 mg/ml
Trypsinlösung in 50 mM Bicarbonat rehydratisiert. Im Anschluss wurden die
Gelstücke in 25 mM Bicarbonat resuspendiert und über Nacht bei 37 °C
inkubiert. Während der Inkubationszeit eluierten die Peptide aus den
Gelstücken. Diese wurden abzentrifugiert und der Überstand aufbewahrt. Zur
Extraktion der verbleibenden Peptide wurden die Gelstücke mit 25 mM
Bicarbonat, mit Bicarbonat/Acetonitril und mit Elutionslösung (50 % (v/v)
Acetonitril, 5 % (v/v) Ameisensäure) gewaschen. Die Überstände wurden
vereint und die Peptide in der Vakuumzentrifuge getrocknet. Anschließend
wurden sie bei -20 °C aufbewahrt.
2.11.8 Western Blot Durch SDS-PAGE getrennte Proteine wurden auf eine
Nitrocellulosemembran transferiert (Gershoni & Palade, 1983). Verwendet
wurden die Membranen Hybond™-C Extra (GE Healthcare) bzw. porablot
NCP (Macherry-Nagel). Hierbei wurden drei Stücke Whatman 3 MM Papier
nach den Gelmaßen zurechtgeschnitten, mit Transferpuffer (40 mM Glycin;
50 mM Tris, 1 mM SDS, 20 % (v/v) Methanol) befeuchtet und auf die Anode
der Western Blot Apparatur Multiphor II (GE Healthcare) aufgelegt. Darauf
wurde die in Wasser getränkte Membran und das Gel gelegt und von drei
weiteren Stücken Whatman Papier bedeckt. Anschließend wurde die
Kathode aufgelegt und der Transfer für 1 h bei 0,82 mA/cm2 gestartet.
Alternativ wurde die Trans Blot® Turbo™ Transfer System (Bio-Rad)
Apparatur verwendet. Hierbei dauerte der Transfer bei selbst hergestellten
Gelen 30 min und bei Mini-PROTEAN® TGX™ Stainfree Precast Gelen 7
min.
Material und Methoden
37
2.11.9 Proteinfärbung mit Ponceau S Optional wurden Proteine auf der Nitrocellulosemembran mit Ponceau S
(0,5 % (w/v) Ponceau S; 1 % (v/v) Essigsäure) gefärbt. Die Färbung wurde
anschließend mit H2O differenziert. Hiermit konnte direkt die Qualität des
Proteintransfers überprüft werden.
2.11.10 Immunodetektion Proteine auf Nitrocellulosemembranen wurden durch Antikörperbehandlung
detektiert. Zuerst wurde die Membran mit Blocking Puffer (5 % (w/v)
Magermilchpulver in TBS (20 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl)) für 1 h
behandelt. Dann wurde sie zweimal für 5 min in TBS gewaschen.
Anschließend wurde sie mit dem ersten Antikörper Maus Anti-HA monoclonal
antibody (Sigma) 1 : 1000 bis 1 : 5000 verdünnt in Blocking Puffer und in
Folie eingeschweißt und für 1 h auf dem 3D Schüttler PS-M3D (Grant-bio)
inkubiert. Darauf folgten drei Waschschritte in TBS für 10 min und die
Inkubation mit dem Zweitantikörper ImmunoPure Goat Anti-Mouse IgG,
Peroxidase Conjugated (Pierce) 1 : 10000 verdünnt in Blocking Puffer für 1 h.
Dann wurde die Membran erneut dreimal für 10 min in TBS gewaschen. Zur
Detektion wurde sie in einer Detektionslösung inkubiert, bestehend aus
Lösung A (0,1 M Tris-HCl pH 8,6; 1,25 mM Luminol (Sigma)), Lösung B (6
mM para-Hydroxycoumarinsäure (Sigma) in DMSO) und 0,01 % (v/v)
Wasserstoffperoxid. Alternativ wurde hierfür das SuperSignal® West Pico
Chemiluminescent Substrate Kit (Pierce/Thermo Scientific) nach
Herstellerprotokoll eingesetzt. Die Filmexposition wurde im Fotolabor durch
Auflegen eines Lumi-Film Chemilumineszent Detection Films (Roche)
durchgeführt. Der Film wurde nach der Expositionszeit entwickelt und fixiert.
Alternativ dazu wurde die Exposition im ChemiDoc™ MP (Bio-Rad)
durchgeführt.
2.11.11 Strippen der Nitrocellulosemembran Antikörper wurden von einer Nitrocellulosemembran durch Inkubation in mild
stripping buffer (Glycin; SDS; Tween 20; pH 2,2) für 5 bis 10 min entfernt.
Material und Methoden
38
Die Membran wurde anschließend zweimal in PBS (8 % (w/v) NaCl: 0,2 %
(w/v) KCl; 1,44 % (w/v) Na2HPO4; 0,24 % (w/v) KH2PO4; pH 7,4) und
zweimal in TBST (20 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,1 % (v/v) Tween
20) gewaschen. Anschließend konnte mit dem Blocken fortgefahren werden.
2.11.12 Zellfixierung und Immunofluoreszenzmikroskopie Für die Zellfixierung wurden T. vaginalis Kulturen in der logarithmischen
Wachstumsphase verwendet. Dazu wurden sie in einer anaeroben Kammer
15 min bei 37 °C inkubiert. Die Kammer bestand aus einem silanisierten
Objektträger, an den sich die Zellen anhaften konnten, einer Gummidichtung
und einem Standardobjektträger. Die Kulturen wurden durch die
Gummidichtung mit einer 23G-Nadel in die Kammer injiziert. Nach der
Inkubationszeit wurde die Kammer geöffnet und das überschüssige Medium
entfernt. Der silanisierte Objektträger mit den daran haftenden Zellen wurde
für 5 min in Methanol und 5 min in Aceton bei -20 °C fixiert. Danach wurden
die Objektträger zum Trocknen liegen gelassen. Anschließend wurden die
Zellen für 1 h in Blocking PBS (0,25 % (w/v) BSA; 0,25 % (v/v) Gelatine in
PBS) inkubiert. Dann folgte eine Inkubation mit den ersten Antikörpern Anti-
HA (mouse) und Anti-ASCT (rabbit) bzw. Anti-SCS (rabbit) 1 : 500 verdünnt
in Blocking PBS für 1 h. Es folgten drei Waschschritte für 10 min mit PBS,
dann wurde für 1 h mit Zweitantikörpern (Alexa fluor 488 anti-mouse; Alexa
flour 633 anti-rabbit) 1 : 1000 verdünnt im Dunkeln inkubiert. Danach wurde
dreimal mit PBS im Dunkeln gewaschen. Der Objektträger wurde zum
Trocknen liegen gelassen und mit einem Tropfen Vectashield mit DAPI
(Vector Laboratories) bzw. Fluoroshield™ mit DAPI (Sigma) versetzt und mit
einem Deckglas luftblasenfrei abgedichtet. Das Präparat wurde mit Glycerol
Gelatine (Sigma) versiegelt.
2.12 Bioinformatische Methoden
Sequenzen aus dem Trichomonas vaginalis Genom wurden von der
Datenbank TrichDB (Aurrecoechea et al., 2009) bezogen. Die Datenbank
Material und Methoden
39
war auf der Internetpräsenz unter der Adresse www.trichdb.org abrufbar.
Sequenzidentitäten wurden mit BLAST (Altschul et al., 1990; Altschul et al.,
1997) auf der gleichen Seite oder bei NCBI durchgeführt. Weiterführende
Sequenzanalysen wurden mit Programmen des EMBOSS Pakets (Rice et al.,
2000) durchgeführt. Die Bildbearbeitung erfolgte mit den Programmen
Photoshop Elements (Adobe) und ImageJ (Collins, 2007). Sequenzanalysen
erfolgten mit Sequencher (Gene Codes). Plasmidkarten wurden mit Vector
NTI® Express (Invirtogen) erstelt (Lu & Moriyama, 2004). Alignments wurden
mit ClustalW erstellt (Thompson et al., 1994) und mit BoxShade überarbeitet
(Gaskell, 2000).
Ergebnisse
40
3 Ergebnisse
3.1 Lokalisation von Proteinen mit entfernten Transitpeptiden
Der Einfluss von Transitpeptiden auf den Proteinimport in Hydrogenosomen
von Trichomonas vaginalis wurde bei drei Proteinen untersucht: Ferredoxin
(TvFd, TVAG_003900), iron-sulfur cluster assembly protein (TvIscA,
TVAG_456770) und malic enzyme (TvME, TVAG_267870). Am 5’-Ende der
Gene wurden durch Verwendung spezifischer Primer die für das
Transitpeptid kodierenden Nukleotide nicht amplifiziert, so dass die
Aminosäuren des Transitpeptids am N-Terminus des Proteins fehlten.
Proteine ohne Transitpeptid sind als ΔTP gekennzeichnet. Zur Kontrolle
wurden die entsprechenden Proteine in voller Länge verwendet.
Folgende Aminosäuren an den N-Termini wurden entfernt (grau und
kursiv markiert):
TvFd: MLSQVCRFGTITA... – 7 Aminosäuren
TvIscA: MLSSIIRSFAKARP... – 8 Aminosäuren
TvME: MLTSSVSVPVRNICRAK... – 11 Aminosäuren
In allen sechs Fällen – je drei mit und drei ohne TP – wurden die
überexprimierten Proteine in allen Fraktionen durch Antikörper gegen einen
Di-Hämagglutinin-Tag (HA-Tag) detektiert (Abb. 3.1). In den
Hydrogenosomen und im Gesamtzellextrakt, der sowohl Cytosol als auch
Hydrogenosomen enthält, wurde stets viel Protein detektiert. In der
cytosolischen Fraktion hingegen gab es ein Signal schwächerer Intensität
oder es wurde kein Signal erzielt. Zur Bestimmung der Reinheit der
Fraktionen wurden die Antikörper von der Membran entfernt und dann mit
Antikörpern gegen die hydrogenosomale Acetat:Succinat CoA Transferase
(TvASCT, TVAG_395550) (van Grinsven et al., 2008) oder Succinyl CoA
Synthetase alpha (TvSCSα, TVAG_165340) erneut inkubiert und detektiert
(Abb. 5.4).
Ergebnisse
41
Um zu überprüfen, ob die Proteine aus der hydrogenosomalen Fraktion
tatsächlich die Membran passieren und in die Matrix gelangen, oder
ausschließlich von außen an die hydrogenosomale Membran assoziieren,
wurden Proteinase K Assays durchgeführt. Bei allen sechs Fällen waren die
Proteine vor Proteolyse geschützt (Abb. 3.1). Die Aktivität der Protease
wurde durch Zugabe von Triton X-100 bestätigt. Als Negativkontrolle wurde
Triton X-100 ohne Proteinase K hinzugegeben.
Abb. 3.1: Proteinimport in Hydrogenosomen von Proteinen mit und ohne Transitpeptid (ΔTP). Gezeigt sind die drei Fraktionen Gesamtzellextrakt, Cytosol und Hydrogenosomen sowie die Proteinase K Behandlung der hydrogenosomalen Fraktion. TvFd: Ferredoxin (TVAG_003900), TvIscA: Iron-sulfur cluster assembly protein (TVAG_456770), TvME: malic enzyme (TVAG_267870), Prot K: Proteinase K, TX100: Triton X-100, +: Anwesenheit, -: Abwesenheit (Major et al., 2013).
3.2 Lokalisation von separaten Proteindomänen
Da die untersuchten Proteine unabhängig vom Transitpeptid in der
hydrogenosomalen Matrix lokalisieren, wurden weitere, möglicherweise
Ergebnisse
42
interne Importsignale gesucht. Bereits in einer früheren Studie wurde gezeigt,
dass das hydrogenosomale Protein Succinyl CoA Synthetase (TvSCSα,
TVAG_165340) ohne Transitpeptid importiert wird (Mentel et al., 2008). Das
Ergebnis konnte in dieser Arbeit reproduziert werden (Abb. 3.2). Folgende
Aminosäuren am N-Terminus wurden entfernt (grau und kursiv markiert):
TvSCSα: MLSSSFERNLHQPL... – 8 Aminosäuren
Zur Untersuchung des Importverhaltens von einzelnen Domänen des
Proteins wurde es in drei individuelle Blöcke gleicher Länge geteilt: TvSCSα
Block 1, TvSCSα Block 2 und TvSCSα Block 3. Als Ausgangsprotein wurde
hierbei TvSCSα-ΔTP (301 Aminosäuren) gewählt. Bei den Genen für
TvSCSα Block 2 und TvSCSα Block 3 wurde ein ATG Startcodon am
5’ Ende für die Proteinexpression hinzugefügt, was in einem Methionin am N-
Terminus resultierte. Somit entstanden drei TvSCSα Teilproteine mit jeweils
101 Aminosäuren, zuzüglich der Aminosäuren des HA-Tags und der
Gateway Erkennungsstelle (Anhang, Punkt 5.4). Alle drei individuellen
Domänen wurden in der hydrogenosomalen Fraktion nachgewiesen und für
Block 1 und 2 konnte der Schutz vor Proteolyse durch Proteinase K gezeigt
werden (Abb. 3.2). Zusätzlich wurden die drei Domänen in jeweils zwei
Konzentrationen nebeneinander aufgetragen (Abb. 3.4). Im direkten
Vergleich war die deutlich schwächere Exposition von Block 3 erkennbar.
Außerdem konnte eine Doppelbande in der hydrogenosomalen Fraktion bei
Block 1 und 2 beobachtet werden. Im Cytosol hingegen war stets jeweils nur
eine Bande vorhanden.
Ergebnisse
43
Abb. 3.2: Immunodetektion des HA-markierten TvSCSα Proteins in den drei Fraktionen Gesamtzellextrakt, Cytosol und Hydrogenosomen. Dargestellt ist das Gesamtprotein mit und ohne Transitpeptid sowie die drei individuellen Domänen. TvSCSα: Succinyl CoA Synthetase (TVAG_165340), Prot K: Proteinase K, TX100: Triton X-100, +: Anwesenheit, -: Abwesenheit (Major et al., 2013).
Zusätzlich wurde ein zweites Protein zur Untersuchung interner Signale in
drei Blöcke unterteilt, die hydrogenosomale Thioredoxin Reduktase 2
(TvTrxRh2, TVAG_125360). In einer vorangegangenen Studie wurde das
Protein, das kein charakteristisches N-terminales Importmotiv aufweist, in
den Hydrogenosomen lokalisiert (Mentel et al., 2008). Die
Domänenaufteilung wurde in diesem Fall nach der Proteinstruktur
ausgewählt, die Einteilung orientierte sich an bioinformatisch vorhergesagten
α-Helices. Demzufolge wurde TvTrxRh2 Block 1 aus den Aminosäuren 1 bis
116, TvTrxRh2 Block 2 aus 117 bis 229 und TvTrxRh2 Block 3 aus 230 bis
311 gebildet. Diese Domänen wurden ebenfalls in der hydrogenosomalen
Fraktion detektiert (Abb. 3.4).
Ergebnisse
44
Abb. 3.3: Suborganellare Lokalisation der Blöcke 1 und 2 von TvSCSα und TvTrxRh2 durch Trennung von Membran und Matrix.
Die Lokalisation in organello durch Trennung der Hydrogenosomen in
Membran- und Matrixfraktion zeigte ebenfalls die Lokalisation der einzelnen
Blöcke (Abb. 3.3). Die zuvor in den Hydrogenosomen beobachtete
Doppelbande trat hierbei stets nur in der Membranfraktion auf, nicht jedoch
in der Matrix.
Bei beiden Proteinen war der dritte Teil deutlich schwieriger zu
detektieren als die ersten beiden, da das Signal bei TvSCSα Block 3 und
TvTrxRh2 Block 3 schwächer war als die anderen (Abb. 3.4). Zudem war bei
Block 3 keine Doppelbande nachweisbar.
Ergebnisse
45
Abb. 3.4: Vergleich der Lokalisation der einzelnen Domänen von TvSCSα (TVAG_165340) und TvTrxRh2 (TVAG_125360). Zu beobachten sind Migrationsdifferenzen bei den Blöcken sowie Unterschiede bei der Expositionsintensität der Signale. Aufgetragen sind jeweils zwei Konzentrationen (25 und 50 µg). Das angegebene Molekulargewicht in Kilodalton (kDa) basiert auf einer Vorhersage aus der Aminosäurezusammensetzung der Fusionsproteine. GZ: Gesamtzellextrakt, C: Cytosol, H: Hydrogenosomen.
3.3 2D-‐Trennung von TvSCSα Block 2 Hydrogenosomen
Zur Untersuchung der Doppelbande wurde die hydrogenosomale Fraktion
von TvSCSα Block 2 durch isoelektrische Fokussierung nach dem
isoelektrischen Punkt und anschließend durch SDS-PAGE nach dem
Molekulargewicht getrennt. Bei der Immunodetektion ist hierbei neben der
Größenabweichung der beiden Banden auch eine Abweichung des
Ergebnisse
46
isoelektrischen Punktes bei einem pH Gradienten von 6 bis 11 festgestellt
worden (Abb. 3.5).
Abb. 3.5: Immunodetektion des C-terminalen HA-Tags der zweiten Domäne von TvSCSα (TvSCSα Block 2) Hydrogenosomen nach zweidimensionaler Elektrophorese.
3.4 Immunofluoreszenzlokalisation
Die Proteine TvFd-ΔTP, TvIscA-ΔTP, TvME-ΔTP, TvSCSα-ΔTP sowie
TvSCSα Block 1 und 2 wurden in situ durch Immunofluoreszenzmikroskopie
lokalisiert (Abb. 3.6). Der grüne Kanal repräsentiert jeweils das HA-markierte
Protein, der rote Kanal den hydrogenosomalen Marker. Ausgelöst wird die
grüne Farbe durch eine Fluoreszenz bei 488 nm, die rote durch Fluoreszenz
bei 633 nm. In beiden Kanälen sind stets Konturen innerhalb der Zelle
erkennbar. In keinem Fall ist die komplette Zelle mit Signal ausgefüllt, was
die Bindungsspezifität der Antikörper bestätigt. Die Überlagerung der beiden
Kanäle (merge) zeigt auch eine Überlagerung der beiden Signale, was ein
starkes Indiz für eine hydrogenosomale Lokalisation des Proteins ist. Der
Zellkern ist mit DAPI blau angefärbt, mit Ausnahme bei der Probe TvSCSα-
ΔTP, bei der kein DAPI verwendet wurde. Der Skalierungsbalken misst 2 µm
und ermöglicht die Einschätzung der Größendimension und der Maße der
Zellen.
Ergebnisse
47
Abb. 3.6: Lokalisation hydrogenosomaler HA-markierter Proteine ohne Transitpeptide mittels Immunofluoreszenz. Grün: Anti-HA (Alexa fluor 488), Rot: Anti-ASCT (Alexa fluor 633). Merge: grüner und roter Kanal überlagert + DAPI (blau). Skalierungsbalken: 2 µm.
3.5 Experimentelle Verifikation vorhergesagter Lokalisation
Um bioinformatische Vorhersagen zum Proteinimport von T. vaginalis
Proteinen in Hydrogenosomen experimentell zu bestätigen, wurden drei
weitere Proteine auf ihre subzelluläre Lokalisation untersucht (Abb. 3.7). Die
Ergebnisse waren Teil des Projektes zur Optimierung von maschinellen
Vorhersageparametern zur Charakterisierung der Proteindestination
(Burstein et al., 2012). Hierbei wurden zwei Datensätze erstellt, die sich in
Ergebnisse
48
der Berücksichtigung des Transitpeptids voneinander unterschieden und mit
denen die Importwahrscheinlichkeit der einzelnen Proteine des Trichomonas
Gesamtproteoms nach 57 verschiedenen Parametern berechnet wurde. Als
Ergebnis gab das Programm einen Wert zwischen 0 und 1 aus: Je höher der
Wert, desto wahrscheinlicher die hydrogenosomale Lokalisation des Proteins.
Eine Auswahl an Kandidaten wurde anschließend zur Verifikation der
Vorhersagen durch Zellfraktionierung und Immunodetektion der HA-
markierten und homolog überexprimierten Proteine bestimmt. In dieser Arbeit
wurden TvHSP60 (TVAG_088050), TvIscA (TVAG_361540) und TvPEP
Carboxykinase (TVAG_139300) untersucht (Tab. 3.1).
Tab. 3.1: Importwahrscheinlichkeiten der zu testenden Proteine nach maschineller Vorhersage mit Parametern aus zwei Datensätzen, mit und ohne Berücksichtigung des Transitpeptids im Datensatz (aus Burstein et al., 2012).
Zugangsnummer Transitpeptid TP+ Vorhersage TP- Vorhersage
TVAG_088050 Ja 1,0000 0,9691
TVAG_361540 Ja 1,0000 1,0000
TVAG_139300 Nein 0,9433 0,0426
Wie von dem Programm vorhergesagt, wurden TvHSP60 und TvIscA in der
hydrogenosomalen und TvPEP Carboxykinase in der cytosolischen Fraktion
nachgewiesen (Abb. 3.7). Weitere Proteine wurden auf diese Weise getestet
und der Vergleich zwischen Vorhersage und tatsächlicher Lokalisation der
Proteine ergab eine Zuverlässigkeit der Vorhersagen von 71 % (Burstein et
al., 2012).
Ergebnisse
49
Abb. 3.7: Proteinlokalisation durch Immunodetektion der HA-markierten Proteine von TvHSP60, TvIscA, TvPEP Carboxykinase in den Zellfraktionen Gesamtzellextrakt, Cytosol und Hydrogenosomen von Trichomonas vaginalis Zellen, die jeweils eins der Proteine exprimierten (Burstein et al., 2012).
3.6 Transkriptionsanalyse von Ferredoxin und IscA
Neben den Migrationsdifferenzen der TvSCSα und TvTrxRh2 Blöcke
(Abb. 3.4) wurden auch bei Immunodetektionen der HA-markierten
Fusionsproteine Ferredoxin und TvIscA Abweichungen in der SDS-PAGE
beobachtet. Zur Untersuchung dieses Phänomens wurden die Proteine nach
einer zweidimensionalen Trennung sequenziert. Als Resultat konnten dabei
jedoch keine Veränderungen am Protein festgestellt werden, die diese
Beobachtungen erklären würden. Deshalb wurden daraufhin die Transkripte
untersucht. T. vaginalis Zellen wurden mit den Konstrukten TvFd und TvIscA
im Expressionsvektor pTagvag2 transfiziert. Aus den Kulturen wurde
Gesamt-RNA isoliert und cDNA hergestellt. Diese diente dann als
Ausgangssubstrat für eine PCR zur Analyse der Transkripte von TvFd und
TvIscA (Abb. 3.8). Die PCR wurde jeweils mit den Forward Primern der
genannten Gene und PolyT Reverse Primern durchgeführt. Die erzeugten
Amplifikate hatten eine Größe von ca. 600 bis 700 Basenpaaren, was
deutlich die eigentliche Größe der Gene übersteigt und auch nicht durch den
in doppelter Ausführung vorhandenen HA-Tag, der eine Größe von 54
Ergebnisse
50
Basenpaaren aufweist, erklärt werden kann. Das Ferredoxingen
(TVAG_003900) in der genomischen DNA hat laut TrichDB eine kodierende
Sequenz mit einer Länge von 303 bp (ohne Stoppkodon) und die mRNA eine
Länge von 341 bp, das Gen für TvIscA (TVAG_456770) besteht aus 393 bp
und die mRNA aus 430 bp.
Sequenzierungen sämtlicher in dieser Arbeit amplifizierten Gene aus
genomischer DNA ergaben stets die erwartete Größe, die Sequenzen
stimmten mit den bei TrichDB angegebenen überein. Zur Bestimmung der
Sequenz wurden die Amplifikate aus cDNA in den Klonierungsvektor pJET
ligiert und sequenziert. Zusätzlich wurde die 3’-Region mittels PCR
amplifiziert unter Verwendung eines Forward Primers gegen den HA-Tag
und eines Reverse Primers gegen den Poly A Schwanz. Das Ergebnis der
Sequenzierung ist als Nukleotidsequenz und der entsprechenden
Aminosäuresequenz dargestellt (Abb. 3.9). Zwischen dem HA-Tag und der
Polyadenylierungsstelle befindet sich ein Sequenzabschnitt des Vektors
pTagvag2. Die Terminatorregion (3’ UTR des malic enzyme) befindet sich im
Vektor auch erst nach dieser Sequenz (Abb. 5.3).
Ergebnisse
51
Abb. 3.8: Agarosegelaufnahmen zur Transkriptionsanalyse von TvFd und TvIscA. Links: Hergestellte cDNA aus isolierter Gesamt-RNA transfizierter T. vaginalis Kulturen und einer nicht transfizierten Wildtyp-Kultur (WT) zur Kontrolle. Rechts: Amplifikate von TvFd (TVAG_003900) und TvIscA (TVAG_456770) aus den jeweiligen entsprechenden cDNAs unter Verwendung spezifischer Primer gegen den Start des Gens und den Poly-A Schwanz.
Die sequenzierten Nukleotide des Vektors (Abb. 3.9) am 3’-Ende der Gene
erklären die Größenzunahme der Gene aus cDNA (Abb. 3.8), somit wird bei
der Transkription in Trichomonas auch Vektorsequenz mit abgelesen. Bei
der Translation scheinen die Proteine jedoch nicht davon betroffen zu sein,
da diese Sequenz bei der oben genannten Sequenzierung der Proteine nicht
gefunden wurde. Somit können die SDS-PAGE Unterschiede mit den hier
erzielten Erkenntnissen nicht erklärt werden.
Ergebnisse
52
TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTAACTCGAGTAACAAGTACCTCATCGACAACGAGCTCGCAACAGCTGTTCCACCAAAGGGTACATCTCTCAAGGACTGGCTCAAGGCTCAGCTCTTCGAACCATCAGCTGACTACGAACCACTTTACTAAGCGCGATTTTTAAACACTTAGCTTTCTTAAAAAAAAAAAAA
YPYDVPDYA*LE*QVPHRQRARNSCSTKGYISQGLAQGSALRTIS*LRTTLLSAIFKHLAFLKKKK
Abb. 3.9: Beispiel einer Sequenz, erhalten aus der Sequenzierung eines Amplifikates mit HA-Forward und PolyT-Reverse Primern. Unten ist die daraus resultierende Aminosäuresequenz aufgeführt. Sequenzdomänen sind farblich hervorgehoben. Grün: HA-Tag; Rot: Stoppkodons; Orange: Restriktionsschnittstelle; Blau: Sequenz des Vektors pTagvag2; Schwarz: Poly A.
3.7 Isolation genomischer DNA aus Cyanobakterien
Aus Sektion V Cyanobakterien wurde genomische DNA isoliert und durch
einen Dichtegradienten gereinigt. Bei der Reinigung wurde die DNA von in
der Probe vorhandenen Polysacchariden und RNA getrennt, die im
Röhrchen sedimentierten. Unter UV-Licht war die DNA als Bande im
Zentrifugenröhrchen (Abb. 3.10) und die RNA als leuchtendes Pellet am
Röhrchenboden (nicht dargestellt) zu erkennen. Anschließend wurde das
Ethidiumbromid entfernt und die DNA durch Elektrophorese im Agarosegel
analysiert (Abb. 3.10). Die Qualität der DNA wurde durch Restriktion mit
HindIII überprüft (Abb. 3.11). Die DNA wurde anschließend zur
Sequenzierung an das Center for Biotechnology der Universität Bielefeld
übergeben.
Ergebnisse
53
Abb. 3.10: Fotoaufnahme eines verschweißten Polyallomer Beckmann Röhrchens mit Cyanobakterien DNA-Bande in Ethidiumbromid, an einem Stativ befestigt und mit UV-Licht visualisiert. Die Bande bildete sich nach 40 h Zentrifugation bei 150000 g und 20 °C in einem Cäsiumchlorid Gradienten, wobei RNA und Polysaccharide pelletierten.
Abb. 3.11: Isolierte und gereinigte DNA im Agarosegel aus den Sektion V Cyanobakterien Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912, Chlorogloeopsis fritschii PCC 9212, Fischerella muscicola PCC 73103, Fischerella muscicola PCC 7414, Fischerella thermalis PCC 7521 und dem Sektion IV Cyanobakterium Scytonema hofmanni PCC 7110.
Ergebnisse
54
Abb. 3.12: Überprüfung der DNA Qualität durch Restriktion mit HindIII und Elektrophorese über Nacht in einem 0,7 %igen Agarosegel bei niedriger Voltzahl.
Die Eckdaten der Genome aus der Sequenzierung sind dargestellt (Abb.
3.13). Unter den Sektion V Cyanobakterien hat Fischerella thermalis mit
5340 kodierenden Sequenzen das kleinste Genom. Der Kandidat Scytonema
hofmanni PCC 7110 aus Sektion IV hingegen hat mit 12356 Genen das
größte bisher sequenzierte prokaryotische Genom überhaupt (Dagan et al.,
2013). Durch Lücken in den Genomen, deren Ursache in zahlreichen
repetitiven Elementen liegt, sind die Genome jedoch nicht vollständig
geschlossen. Das einzige Genom, das durch die nachträgliche Erstellung
von Fosmiddatenbanken vollständig entschlüsselt wurde, ist das von
C. fritschii PCC 6912. Die aus der Sequenzierung resultierten Daten dienten
als Ausgangsmaterial für phylogenetische Analysen.
Ergebnisse
55
Abb. 3.13: Sequenzierdaten der untersuchten cyanobakteriellen Genome aus der Sequenzierung am CeBiTec (Center for Biotechnology) an der Universität Bielefeld (aus Dagan et al., 2013).
Diskussion
56
4 Diskussion Die Zellorganellen eukaryotischer Zellen sind durch Endosymbiose
entstanden (Embley & Martin, 2006). Im Verlauf der Evolution von
freilebenden Prokaryoten zu Organellen rezenter Zellen fand sowohl
Reduktion als auch Gentransfer vom Organell in den Zellkern statt, so dass
die cytosolisch translatierten Proteine durch die Doppelmembran der
Organellen importiert werden müssen (Chacinska et al., 2009; Gould et al.,
2008; Martin & Herrmann, 1998; Palmer, 1997). Im Gegensatz zu
Mitochondrien, die noch ein eigenes Genom besitzen, wurden bei
Trichomonas Hydrogenosomen keine Gene nachgewiesen (Clemens &
Johnson, 2000). Während der Proteinimport und die darin involvierte
Maschinerie in Saccharomyces cerevisiae Mitochondrien bereits eingehend
studiert wurde (Wiedemann et al., 2004), ist der Proteinimport-Mechanismus
bei Trichomonas vaginalis Hydrogenosomen nur in den Grundzügen
aufgeklärt, jedoch werden hier kontinuierlich Fortschritte erzielt (Rada et al.,
2011).
In dieser Doktorarbeit wurde der Proteinimport in die
Hydrogenosomen erforscht. Hierbei wurde der Einfluss von N-terminalen
Präsequenzen (Transitpeptide) hoch exprimierter Matrixproteine auf den
Import untersucht. Des Weiteren wurde das Wissen über vorhandene interne
Importsignale erweitert.
4.1 Transitpeptide und interne Signale
Aufgrund der gemeinsamen Abstammung von Hydrogenosomen und
Mitochondrien (Müller et al., 2012), wurden auch Ähnlichkeiten im
Proteinimport zwischen aeroben Mitochondrien und Trichomonas
Hydrogenosomen vermutet (Bradley et al., 1997; Dyall et al., 2000; Häusler
et al., 1997). In Mitochondrien ist für den Import von Matrixproteinen das N-
terminale Transitpeptid essentiell. Membranproteine besitzen hingegen auch
interne Signale, die zum Targeting der Proteine beitragen (Chacinska et al.,
2009). Im Vergleich dazu wurden bei hydrogenosomalen T. vaginalis
Diskussion
57
Proteinen Gemeinsamkeiten zu mitochondrialen Signalen festgestellt: In vitro
Untersuchungen von Ferredoxin ergaben eine strikte Abhängigkeit vom
Transitpeptid für den Import in das Organell (Bradley et al., 1997). Bereits
eine Mutation der zweiten Aminosäure des Transitpeptids (Leucin zu Glycin)
resultierte im Abbruch des Imports. Bei in vivo Studien wurde die
cytosolische Lokalisation von TvFd-ΔTP von derselben Arbeitsgruppe
berichtet, jedoch nur bei grober Pelletierung der Organellen (Dyall et al.,
2000).
Zusätzlich wurde eine hydrogenosomale Prozessierungspeptidase
(HPP) als Äquivalent der mitochondrialen Peptidase (MPP) in den
Hydrogenosomen beschrieben, die für das Entfernen der Transitpeptide
nach erfolgtem Import zuständig ist (Brown et al., 2007; Šmíd et al., 2008).
Die Prozessierung des Transitpeptides konnte für einige hydrogenosomale
Proteine gezeigt werden: Ferredoxin (TvFd, Johnson et al., 1990), TvME
(Hrdý & Müller, 1995b), TvPFO (Hrdý & Müller, 1995a), Adenylatkinase
(TvAK, Länge et al., 1994), TvSCSα (Lahti et al., 1994), TvSCSβ (Lahti et al.,
1992) und TvHSP60 (Bui et al., 1996).
Dass Proteine auch interne Importsignale besitzen, war zunächst nur
bei hydrogenosomalen Membranproteinen, wie z.B. TvHMP31, bekannt
(Dyall et al., 2000). In späteren Studien wurde auch für Matrixproteine
bestätigt, dass interne Signale vorhanden sein müssen, da trotz Entfernens
des Transitpeptids von TvSCSα bei in vivo Studien ein Import in die
Hydrogenosomen von Trichomonas vaginalis beobachtet wurde (Mentel et
al., 2008). Des Weiteren wurde der Import von Matrixproteinen in T. vaginalis
Hydrogenosomen, die kein charakteristisches Transitpeptid aufweisen, wie
der TvTrxRh2 (Mentel et al., 2008) und Giardia intestinalis IscS (Doležal et
al., 2005), experimentell belegt. In einer Analyse des hydrogenosomalen
Proteoms (Rada et al., 2011; Schneider et al., 2011) wurden über 500
Proteine vorhergesagt, die im Organell lokalisieren, wovon jedoch nur etwa
die Hälfte ein klassisches N-terminales Importmotiv aufweist (Burstein et al.,
2012).
In dieser Doktorarbeit wurden drei hydrogenosomale Proteine
ausgewählt und der Zusammenhang zwischen ihren Transitpeptiden und
Diskussion
58
dem Import in die Hydrogenosomen untersucht: Ferredoxin (TvFd,
TVAG_003900), TvIscA (TVAG_456770) und malic enzyme (TvME,
TVAG_267870). Die Lokalisation der Proteine in voller Länge sowie mit
entferntem N-Terminus wurde über einen C-terminalen HA-Tag durch
Immunodetektion (Abb. 3.1) und Immunofluoreszenz (Abb. 3.5)
nachgewiesen. Für die Lokalisation in organello wurden bei
Hydrogenosomen Proteinase K Assays sowie eine Membran und Matrix
Fraktionierung durchgeführt. Die nativen Proteine wurden erwartungsgemäß
in den Hydrogenosomen detektiert. Ebenso lokalisierten die Proteine ohne
Transitpeptid in der hydrogenosomalen Fraktion. Durch diese Ergebnisse
wurde gezeigt, dass interne Importsignale stärker verbreitet sind als bisher
angenommen und eher die Regel als eine Ausnahme in Trichomonas
vaginalis zu sein scheinen.
Bei einem weiteren Protein wurden im Rahmen dieser Studie die
gleichen Ergebnisse erzielt, TvPFO A (TVAG_198110) mit entferntem
Transitpeptid MLRSFGKRIP... (grau und kursiv markiert) wurde in den
Hydrogenosomen nachgewiesen (Major et al., 2013). In der Datenbank
TrichDB wurden weitere Proteine mit diesem Transitpeptid gefunden: Die
hypothetischen Proteine TVAG_131910 und TVAG_210030 (Carlton et al.,
2007). Bei einer BLAST Suche wird TVAG_131910 mit TvBspA ähnlichen
Proteinen gruppiert, welche Oberflächenproteine darstellen (Noël et al.,
2010). TVAG_210030 gruppiert mit OsmC ähnlichen Proteinen,
möglicherweise Alkylhydroperoxid Reduktasen, von denen auch Kandidaten
im hydrogenosomalen Proteom gefunden wurden (Pütz, 2007; Schneider et
al., 2011). Weitere PFO Isoformen sind in der Genomdatenbank annotiert:
TVAG_230580, TVAG_242960 und TVAG_254890. Deren Transitpeptid
MLRNF ist ebenfalls bei anderen Proteinen vorhanden: Bei den
hypothetischen Proteinen TVAG_495580 und evtl. TVAG_343440 (ORF
DS113284-6-63181-61430). Bei diesen beiden Proteinen wurde bei einer
BLAST Suche keine bekannten konservierten Domänen gefunden. Die
Transitpeptide der restlichen untersuchten Proteine sind jeweils nur bei ihnen
selbst vertreten. Eine Liste von T. vaginalis Proteinen, deren N-terminale
Sequenzen charakteristische Transitpeptideigenschaften, wie Länge, Ladung
Diskussion
59
und vorhergesagte Prozessierungsstelle aufweisen ist verfügbar (Šmíd et al.,
2008).
Die Ergebnisse (Abb. 3.1) wurden für jedes untersuchte Protein bei
wiederholten Transfektionen reproduzierbar beobachtet. Besonders
interessant waren die Beobachtungen bei Ferredoxin, da sie sich nicht mit
früheren Ergebnissen decken. Es wurde beschrieben, dass TvFd-ΔTP nach
Zentrifugation vom Gesamtzellextraktellextrakt bei 12000 g im Überstand
(cytosolische Fraktion) verbleibt und nicht mit den Organellen pelletiert (Dyall
et al., 2000). In dieser Doktorarbeit (Abb. 3.1) hingegen konnte bei keinem
Ansatz mit TvFd-ΔTP mehr HA-markiertes Protein im Cytosol (Zentrifugation
vom Gesamtzelletrakt bei 7500 g) als in Hydrogenosomen (nach Reinigung
mit einem Percoll Gradienten) festgestellt werden. TvFd-ΔTP war allerdings
schwieriger zu detektieren als TvFd mit Transitpeptid und die anderen
Proteine (Abb. 3.1). So musste bei TvFd-ΔTP mindestens 100 µg
Proteinextrakt eingesetzt werden, um eine Bande detektieren zu können,
während bei TvFd und den anderen untersuchten Proteinen bereits 20 µg
ausreichten. Selbst bei Überladung mit bis zu 1 mg Protein war TvFd-ΔTP
nur spurenweise im Cytosol vorhanden. Wurde jedoch das Transitpeptid
eines anderen hydrogenosomalen Proteins N-terminal an TvFd-ΔTP
angehangen, war eine normale Detektion bei 20 µg Protein möglich. So
konnte TvFd-ΔTP mit den Transitpeptiden von TvSCSα MLSSSFERN und
TvPFO A MLRSF in die Hydrogenosomen importiert werden (Major, 2009),
obwohl sie das TvTrxRh1 Transitpeptid nicht ersetzen konnten – TvTrxRh1-
ΔTP verblieb mit den beiden Transitpeptiden im Cytosol (Mentel et al., 2008).
Somit wurde für TvTrxRh1 (TVAG_281360) gezeigt, dass das eigene
Transitpeptid nicht durch Transitpeptide anderer hydrogenosomaler Proteine
ersetzbar ist (Mentel et al., 2008) und somit das einzige bisher experimentell
bestätigte T. vaginalis Protein ist, das ohne eigenes Transitpeptid nicht in
das Hydrogenosom importiert wird (Burstein et al., 2012; Mentel et al., 2008).
Dafür wurde erwartungsgemäß TvFd-ΔTP mit dem TP der TvTrxRh1
MFSIIFFSRFS importiert (Major, 2009).
In einer Studie reichte neben der kompletten Entfernung des
Transitpeptids von Ferredoxin bereits die Mutation des Leucins an Position
Diskussion
60
zwei aus, um einen Importabbruch zu bewirken (Bradley et al., 1997). Eine
mögliche Erklärung zu der Diskrepanz mit den Ergebnissen aus dieser
Studie wäre, dass in den beiden Arbeiten verschiedene Bedingungen
vorherrschten (in vivo gegen in vitro) und verschiedene T. vaginalis Stämme
sowie unterschiedliche Tags verwendet wurden (Major et al., 2013).
Aufschluss könnte eine Wiederholung der Leucin zu Glycin Mutation im
Transitpeptid unter den in dieser Arbeit verwendeten Bedingungen geben.
Aufgrund der bisherigen Erkenntnisse wäre auch hier ein Import in die
Hydrogenosomen zu erwarten.
TVAG_292710_Fd4 1 MLCSVSNYRFFK-LTVVTKAGEKVPINFNDGQTLFDAVSGTKAEGLQGKCGGSQVCGECH TVAG_068150_Fd5 1 MLCSFSNSRFFK-LTVVTPAGEKVPINFNDGQTLFDAVSGTKAEGLQGKCGGSQVCGECH TVAG_251200_Fd6 1 MLCQQSNIRYFPSLTIVNSKGEKTKVDFEDGQRLFDAVEGTKAEYIRGECGGNMSCGLCF TVAG_003900_Fd1 1 --MLSQVCRFGT--ITAVKGGVKKQLKFEDDQTLFTVLTEAGLMSADDTCQGNKACGKCI TVAG_399860_Fd2 1 MLSQCSPLRFGS--VTVTKGGAKKTLNYEDEQTLFTVLTEAGLMSTEGTCSGNRACGKCF TVAG_213140_Fd3 1 -MLSLCQTRFAS--LTAIKGGQSKTINFEEGTNLFELLVDNGMMSKDQTCQGNIGCGKCT GL50803_27266 1 MSLLSSIRRFIT--FRVVQQGVEHTVSGAVGQSLLDAIKAAHIP-IQDACEGHLGCGTCG TVAG_078730_Fd7 1 --MLASISRSAV-KIHWTGKGCDKIVEGHNGETLLKIAERNKLP-LPNACEGNRACATCQ TVAG_292710_Fd4 60 CKIPQNLYV---VPDDDEKELLASGQDVTPTSRLACNLALNSKFDGATIEMTH------- TVAG_068150_Fd5 60 CKLPQNLYV---APDADEKELLASGTGVTPTSRLACQLSLNSKFDGATIEMTH------- TVAG_251200_Fd6 61 VEVPPNAFK---QPDVKEMDLLEETDGTTKYSRLACQLILGPQFEDVEIHVRQ------- TVAG_003900_Fd1 57 CKHVSGKVA---AAEDDEKEFLEDQP---ANARLACAITLSGENDGAVFEL--------- TVAG_399860_Fd2 59 CKHTGGKVA---DADEEEKEFLEDQP---AGTRLACCITLTGENNGATFEV--------- TVAG_213140_Fd3 58 IGIKKGKLP---PPIEEEDDILPKD-----GKRLACAITLTKAQDGIEIEV--------- GL50803_27266 58 VYLDKKTYKRIPRATKEEAVLLDQVPNPKPTSRLSCAVKLSSMLEGATVRIPSFNKNVLS TVAG_078730_Fd7 57 VYVNKGGDLLN-EISDAEYDTLDYAVDLREQSRLACTCVLQTDDGEMDVVIPERCRNIDV TVAG_292710_Fd4 ---------------- TVAG_068150_Fd5 ---------------- TVAG_251200_Fd6 ---------------- TVAG_003900_Fd1 ---------------- TVAG_399860_Fd2 ---------------- TVAG_213140_Fd3 ---------------- GL50803_27266 118 ESDILASEEKKRHGQH TVAG_078730_Fd7 116 SEFKKKKSIL------
Abb. 4.1: Alignment der sieben Ferredoxine von Trichomonas vaginalis und eines Ferredoxins von Giardia intestinalis (GL50803_27266) aus TrichDB und GiardiaDB.
In einer weiteren Arbeit wurde gezeigt, dass Giardia intestinalis Fd in
T. vaginalis Hydrogenosomen importiert wurde, GiFd-ΔTP jedoch im Cytosol
verblieb (Doležal et al., 2005). Das Giardia Ferredoxin GL50803_27266
gehört zur gleichen Proteinfamilie der [2Fe-2S] Ferredoxine wie die
Ferredoxine von Trichomonas (Abb. 4.1; Nixon et al., 2002b). Das
Transitpeptid MSLLSSIRRFITFRV... (grau und kursiv dargestellt) ist zwar
ähnlich zu Transitpeptiden in Trichomonas (Šmíd et al., 2008), doch die
Diskussion
61
Aminosäureidentität des Alignments der beiden Proteine liegt nur bei 30%
(Abb. 4.2). Somit könnte es sein, dass eventuell vorhandene interne Signale
des Giardia Ferredoxins von der Trichomonas Importmaschinerie nicht als
solche erkannt werden. Zudem enthält das Gen nach GiardiaDB Annotation
ein Intron (Nixon et al., 2002a), wurde jedoch in der oben genannten Arbeit
aus genomischer DNA amplifiziert (Doležal et al., 2005), was die
Vergleichbarkeit weiter einschränkt. Generell gibt es Introns sowohl bei
Giardia als auch bei Trichomonas (Roy et al., 2012; Vaňáčová et al., 2005).
GL50803_27266 1 MSLLSSIRRFITFRVVQQGVEHTVSGAVGQSLLDAIKAAHIP-IQDACEGHLGCGTCGVY TVAG_03900_Fd1 1 --MLSQVCRFGTITAVKGGVKKQLKFEDDQTLFTVLTEAGLMSADDTCQGNKACGKC--- GL50803_27266 60 LDKKTYKRIPRATKEEAVLLDQVPNPKPTSRLSCAVKLSSMLEGATVRIPSFNKNVLSES TVAG_03900_Fd1 56 ICKHVSGKVAAAEDDEKEFLEDQP---ANARLACAITLSGENDGAVFEL----------- GL50803_27266 120 DILASEEKKRHGQH TVAG_03900_Fd1 -------------- Abb. 4.2: Alignment zweier Ferredoxine aus Giardia intestinalis und Trichomonas vaginalis. Die Aminosäureidentität beträgt 30 %.
Das Giardia Ferredoxin wurde in einer weiteren Arbeit homolog exprimiert
und lokalisiert, wobei von Transitpeptid-abhängigem Import berichtet wurde
(Regoes et al., 2005). GiFd-ΔTP wurde mittels HA-Tag im Cytosol lokalisiert
und das Transitpeptid war in der Lage, GFP in Mitosomen zu importieren.
Doch es fehlt die Kontrolle von GiFd mit TP und auch hier wird auf das Intron
in der Sequenz nicht eingegangen. Ein Import über interne Signale wurde
aber für GiHSP60, GimtHSP70 und GiIscS gezeigt.
Wird der Proteinimport von Trichomonas Hydrogenosomen mit
Proteinimport bei anaeroben Parasiten mit stark reduzierten Mitochondrien,
etwa bei den Mikrosporidien, verglichen, so sind Gemeinsamkeiten
feststellbar. Deren mitosomale Matrixproteine haben keine erkennbaren N-
terminalen Transitpeptide, sondern interne Importsignale (Hjort et al., 2010).
So wurde die mitosomale Lokalisation für Encephalitozoon cuniculi
Ferredoxin gezeigt (Williams et al., 2008), obwohl es kein klassisches
Importmotiv aufweist (Abb. 4.3). Ebenso sind auch bei Giardia Ferredoxine
Diskussion
62
ohne Transitpeptid vorhanden (Abb. 5.6), die jedoch kürzer sind als die
anderen [2Fe-2S] Ferredoxine, und somit zu den 2[4Fe-4S] Ferredoxinen
gehören. Diese könnten allerdings im Cytosol lokalisieren, wo sie am
Stoffwechsel und der Wasserstoffproduktion beteiligt wären (Lloyd et al.,
2002; Müller et al., 2012). Im mitosomalen Proteom wurde nur das lange
[2Fe-2S] Ferredoxin identifiziert (Jedelský et al., 2011).
AEWD_070560 1 MDMFSAPDRIPEQIRIFFKTMKQVVPAKAVCGSTVLDVAHKNGVDLEGACEGNLACSTCH TVAG_003900_Fd1 1 --MLSQVCRFGTITAVKGGVKKQLKFEDDQTLFTVLTEAG--LMSADDTCQGNKACGKC- AEWD_070560 61 VILEEPLYRKLGEPSDKEYDLIDQAFGATGTSRLGCQLRVDKSFENAVFTVPRATKNMAV TVAG_003900_Fd1 56 --ICKHVSGKVAAAEDDEKEFLEDQP---ANARLACAITLSGENDGAVFEL--------- AEWD_070560 121 DGFKPKPH TVAG_003900_Fd1 --------
Abb. 4.3: Alignment zwischen Encephalitozoon cuniculi und Trichomonas vaginalis Ferredoxin. Die Aminosäureidentität beträgt 24 %.
Der Proteinimport in homologe Organellen verschiedener Organismen kann
unterschiedlich verlaufen. In Mitochondrien ist am Beispiel des
Intermembranraumproteins MIA40 bekannt, dass dieses Protein in
verschiedenen Organismen auf unterschiedliche Weise importiert wird. In
Hefe ist das Protein ScMIA40 groß (403 bzw. 427 Aminosäuren) und wird
über ein Transitpeptid importiert (Chacinska et al., 2004; Naoé et al., 2004),
in höheren Organismen, wie bei HsMIA40, ist es klein (142 Aminosäuren)
und der Import erfolgt über interne Signale (Chacinska et al., 2008; Hofmann
et al., 2005).
Um die internen Signale weiter zu erforschen, könnten in zukünftigen
Studien die sechs weiteren Ferredoxine von Trichomonas durch das
Entfernen der Transitpeptide auf hydrogenosomalen Import untersucht
werden, sofern diese wie TvFd1 auch hydrogenosomal sind. Sollte eines
oder mehrere davon von seinem TP obligat für den Import abhängig sein, so
wäre ein Vergleich zur TvFd1 Referenz interessant, andernfalls würde die
Diskussion
63
These, dass interne Signale überwiegend vorhanden sind und den Import
beeinflussen, weiter untermauert werden.
Interne Signale wurden in dieser Arbeit am Protein TvSCSα
(TVAG_165340) untersucht. Dessen hydrogenosomale Lokalisation wurde
mit und ohne TP MLSSSFERNLHQPL... (grau und kursiv markiert) bereits
früher beschrieben (Mentel et al., 2008) und in dieser Arbeit bestätigt (Abb.
3.2). Um die Lokalisation des potentiellen internen Signals einzugrenzen
wurde das Protein TvSCSα-ΔTP in drei jeweils 101 Aminosäuren
umfassende Domänen unterteilt (Anhang, Punkt 5.4). Überraschenderweise
lokalisierte jede einzelne Domäne unabhängig voneinander in den
Hydrogenosomen (Abb. 3.2). Das gleiche Ergebnis wurde für die drei
Domänen der Thioredoxin Reduktase TvTrxRh2 erzielt (Abb. 3.3), bei der die
Blockeinteilung nach alpha-Helices erfolgte wie zuvor beschrieben (Zimorski,
2010), TvTrxRh2 lokalisiert auch in voller Länge ohne klassisches TP in den
Hydrogenosomen (Mentel et al., 2008). Daraus resultiert, dass interne
Signale in mehreren Teilen der Proteine vorhanden sein müssen und von der
Zelle für den Import erkannt werden. Für die jeweils ersten beiden Blöcke
sind die Ergebnisse eindeutig, die Proteine werden importiert und sind vor
Proteolyse geschützt. Bei den dritten Blöcken ist die Detektion durch das
schwache Signal bei der Exposition schwieriger.
Bei Einsatz einer Proteinmenge von bis zu 500 µg bei TvSCSα
Block 3 (Abb. 3.2) und TvTrxRh2 Block 3 (nicht dargestellt) wurden allerdings
auch diese in der hydrogenosomalen Fraktion nachgewiesen. Bei geringerer
Konzentration (50 µg; Abb. 3.4) war bei Block 3 der beiden Proteine eine
spurweise Detektion in den Hydrogenosomen bereits möglich. Im Gegensatz
zu Block 1 und 2 konnte jedoch kein erfolgreicher Schutz vor Proteolyse
gezeigt werden, insofern ist es möglich, dass das Protein nur von außen an
die Hydrogenosomen assoziiert, aber nicht in der Lage ist, in die Matrix
importiert zu werden.
Um die Detektierbarkeit von schwer nachweisbaren Konstrukten zu
verbessern, könnten andere Promotoren getestet werden (Liston & Johnson,
1998; Quon et al., 1994; Smith & Johnson, 2011; Smith et al., 2011), sofern
Diskussion
64
die Ursache dafür transkriptionsbedingt ist. Der hier eingesetzte TvSCSα
Promotor ist aber bereits als starker, selbstinduzierender Promotor bekannt
(Liston & Johnson, 1999). Alternativ könnte ein Tetracyclin-induziertes
Expressionssystem eingesetzt werden (Ortiz & Johnson, 2003).
Die Resultate zeigen (Abb. 3.2 bis Abb. 3.4), dass interne Signale bei
Matrixproteinen vorhanden sind und auch Proteine mit deletierten
Transitpeptiden in die Hydrogenosomen importiert werden können. Das
Importsignal des Transitpeptids kann demnach von internen Signalen
kompensiert werden. Weitere Studien sind notwendig, um die Relevanz von
Transitpeptiden für den Import quantitativ zu erfassen. Da trotzdem ein
Protein bekannt ist, bei dem ein Transitpeptid zwingend erforderlich für den
Import ist (TrxRh1, Mentel et al. 2008), kommen Fragen nach der Evolution
der Transitpeptide auf. Der Erwerb von Transitpeptiden wird diskutiert und es
werden verschiedene Möglichkeiten in Betracht gezogen, unter anderem
durch Exon shuffling, alternatives Splicing, Promotor Mutation und
Duplikation bereits vorhandener Signale (Kadowaki et al., 1996; Kubo et al.,
1999; Long et al., 1996; Murcha et al., 2005). Bei Trichomonas wird anhand
von in silico Analysen vermutet, dass die N-Termini direkt von bakteriellen
Vorläufern erworben wurden (Yu et al., 2012). Wenig ist jedoch über das
Zusammenspiel zwischen internen Signalen und Transitpeptiden bei
Matrixproteinen bekannt, so dass weitere Experimente notwendig sind, um
ein besseres Verständnis ihrer Evolution zu bekommen.
4.2 Migrationsdifferenzen in der SDS-‐PAGE
Im Laufe der vorliegenden Arbeiten wurde beobachtet, dass nach Trennung
durch SDS-PAGE der einzelnen Domänen von TvSCSα und TvTrxRh2
Doppelbanden in der hydrogenosomalen Fraktion auftraten (Abb. 3.4). Im
Cytosol hingegen war stets nur eine der beiden Banden, die schneller
migrierende, vorhanden (Abb. 3.4). Eindeutig zu beobachten war dieses
Phänomen bei TvSCSα Block 1 und 2 und bei TvTrxRh2 Block 2 (Abb. 3.4).
In früheren Studien wurden Doppelbanden im Zusammenhang mit dem
Proteinimport stets mit der Prozessierung des Transitpeptides in Verbindung
Diskussion
65
gebracht, wie bei TvHMP31 (Dyall et al., 2000), GiIscU (Doležal et al., 2005)
und anderen (Šmíd et al., 2008). In den genannten Arbeiten lag die
hydrogenosomale Bande stets unter der cytosolischen Bande bzw. das
Molekulargewicht verringerte sich nach Zugabe einer
Prozessierungspeptidase. In dem hier vorliegenden Fall war jedoch das
Gegenteil zutreffend: Die langsamer migrierende Proteinbande der
hydrogenosomalen Fraktion lokalisierte oberhalb der cytosolischen Bande
(Abb. 3.4). Die Blöcke haben zudem kein charakteristisches Transitpeptid, so
dass von einer Prozessierung nicht auszugehen ist. Bei der Trennung von
Membran und Matrix trat die Doppelbande nur in der Membran auf, in der
Matrix hingegen war nur eine Bande vorhanden (Abb. 3.3).
Es könnte hierbei möglicherweise ein Transportzustand vorliegen, der
durch eine kovalente Modifikation des Proteins hervorgerufen wird und somit
temporär das Molekulargewicht verändert. Bei zweidimensionaler
Elektrophorese lag die obere Bande von TvSCSα Block 2 zudem weiter im
basischen Bereich als die untere (Abb. 3.5). Proteinreinigung und -
sequenzierung könnten zur Aufklärung des Phänomens beitragen. Versuche,
das Protein über eine HA-Affinitätssäule zu reinigen blieben ohne Erfolg. Ein
möglicher Ansatz wäre, das hydrogenosomale Proteom mit
zweidimensionaler Elektrophorese zu trennen, die richtigen Spots zu
identifizieren (Rabilloud, 2002; Rabilloud et al., 2010) und mögliche
Proteinmodifikationen zu entdecken.
Es sind diverse Proteinmodifikationen bekannt (Mann & Jensen, 2003),
die das Molekulargewicht von Proteinen beeinträchtigen. Unwahrscheinlich
sind GPI-Anker, da diese in Trichomonas nicht vorkommen (Carlton et al.,
2007; Hirt et al., 2007; Hirt et al., 2011). Ebenso wenig in Betracht kommen
Prenylierung, Palmitoylierung oder Ubiquitinierung (Major et al., 2013), da sie
nicht die entsprechenden Änderungen im Molekulargewicht in diesem
Rahmen verursachen. Phosphorylierungen sind dagegen eher
wahrscheinliche, da die observierten Größenunterschiede der einzelnen
Banden im SDS-Gel von ca. 1 bis 2 kDa mit bereits beschriebenen
Mobilitätsvariationen übereinstimmen (Wegener & Jones, 1984) und
reversible Phosphorylierungen gängig sind bei mitochondrialen Proteinen
Diskussion
66
(Cui et al., 2010). Ob Phosphorylierungen in diesem Fall vorliegen, könnte
durch Phosphorylierungsexperimente bzw. den Einsatz von PhosTag Gelen
überprüft werden (Kinoshita et al., 2006; Kinoshita et al., 2004).
Proteinmodifikationen könnten einen Einfluss auf den Proteinimport haben,
dies wurde in Trichomonas jedoch noch nicht berichtet. Im Gegensatz zu
Mitochondrien (Abb. 4.4) ist beispielsweise beim TOM Komplex von
Hydrogenosomen bisher nur TOM40 beschrieben (Rada et al., 2011;
Schneider et al., 2011).
Abb. 4.4: Proteinimportmaschinerie der äußeren Membran in Hefe-Mitochondrien, verändert aus Chacinska et al., 2009. Positiv geladene Transitpeptide (+++: positive Nettoladung, ααα: alpha helices) werden durch TOM20 erkannt, interne Signale durch TOM70. Die Proteine werden weitergeleitet zu TOM22 und dann zu TOM40. Matrixproteine mit N-terminalem Signal passieren den Kanal in linearer Konformation, Membranproteine mit internen Signalen in Loop Formation.
Phosphoryliert werden können die OH-Gruppen der Aminosäuren Serin,
Threonin und Tyrosin. Aber auch die Aminosäuren Histidin, Lysin, Arginin
und Cystein sind phosphorylierbar (Matthews, 1995). Die Blöcke von
TvSCSα und TvTrxRh2 wurden auf potenzielle Phosphorylierungsstellen mit
NetPhos getestet (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/; Blom et al.,
1999). Jeder Block wies dabei mindestens eine phosphorylierbare
Aminosäure auf.
Experimentell wurde daraufhin ein Dephosphorylierungsassay mit
frisch isolierten Hydrogenosomen der TvSCSα Blöcke 1 und 2 durchgeführt,
bei dem jedoch keine Veränderung zur Kontrolle feststellbar war, beide
Diskussion
67
Banden waren weiterhin vorhanden. Möglicherweise waren die eingesetzten
5 U alkalischer Phosphatase nicht ausreichend oder die
Versuchsbedingungen nicht optimal gewählt. Es könnte allerdings auch sein,
dass die Modifikation trotz gegebener Indizien in diesem Fall nicht vorliegt.
So wurde beispielsweise in einer kürzlich durchgeführten Charakterisierung
des Phosphoproteoms von T. vaginalis das Protein TvSCSα nicht gelistet
(Yeh et al., 2012).
Die Ursache für das Auftreten der Doppelbanden konnte im Rahmen
dieser Arbeit nicht ermittelt werden. Für die exakte Ermittlung der
Proteinmodifikation könnte in zukünftigen Experimenten eine
Proteinsequenzierung beider Banden nach Reinigung durch
zweidimensionale Gelelektrophorese erfolgen. Alternativ könnte eine
affinitätschromatographische Reinigung durchgeführt werden, falls eines der
Proteine aufgrund von Membranassoziation schwierig durch isoelektrische
Fokussierung von anderen Proteinen zu trennen sein sollte.
Bei den hier durchgeführten Arbeiten wurden gelegentlich auch leicht
abweichende, unerwartete Migrationshöhen der Proteine Ferredoxin und
TvIscA beobachtet (nicht dargestellt). Die Sequenzierung der Proteine nach
Trennung durch zweidimensionale Gelelektrophorese ergab allerdings keine
signifikanten Modifikationen. Das Überlesen von Stoppkodons wurde als
Möglichkeit in Betracht gezogen, so dass Teile des Plasmids zwischen
Stoppkodon und 3’-UTR des malic enzyme ebenfalls translatiert werden
könnten (Abb. 5.3). Die Möglichkeit der Stoppkodon Überlesung wurde
während der Analyse in Trichomonas auch in der Literatur berichtet (Kay et
al., 2012). In Hefe ist das Überlesen von Stoppkodons oder der Wechsel von
Leserahmen bekannt (Nakamura et al., 1996; von der Haar & Tuite, 2007).
Bestätigt werden konnte dies in dieser Arbeit nicht und weitere Experimente
diesbezüglich konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt
werden. Amplifikate aus cDNA deuten jedoch darauf hin, dass die mRNA
länger ist als erwartet (Abb. 3.8), möglicherweise bedingt durch die große
Entfernung des malic enzyme Terminators im Plasmid. Das native
Ferredoxin-Gen hat in genomischer DNA nur kurze UTRs – an der 5’-Region
16 und an der 3’-Region 18 Nukleotide (Johnson et al., 1990).
Diskussion
68
4.3 Cyanobakterielle Genome
Parallel zu den hydrogenosomalen Studien wurden fünf Genome von Sektion
V Cyanobakterien und ein zusätzliches von einem Sektion IV
Cyanobakterium zur Erforschung des Vorläufers der Chloroplasten
sequenziert. Cyanobakterien gelten als die plastidären Vorgänger, da sie die
einzigen freilebenden Prokaryoten sind, die die Fähigkeit zur Sauerstoff
produzierenden Photosynthese haben. Aufgrund häufiger lateraler
Gentransfers innerhalb der Cyanobakterien ist der genaue Kandidat
schwierig zu bestimmen (Shi & Falkowski, 2008). Phylogenetische Analysen
haben jedoch gezeigt, dass das ursprüngliche Cyanobakterium, aus dem die
Plastiden hervorgegangen sind, zur filamentösen und Heterozysten
bildenden Gruppe gehören könnte (Deusch et al., 2008).
Die Ergebnisse (Abb. 3.13) haben gezeigt, dass die angewandten
Methoden für ausreichende DNA Qualität und Quantität zur Sequenzierung
und Erstellung einer Genomdatenbank geeignet sind, sofern es gelingt,
störende Polysaccharidschichten zu entfernen. Aufgrund von repetitiven
Elementen konnte mit dieser Methode jedoch keines der Genome vollständig
geschlossen werden. Hierfür wurden bei Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912
Fosmidbanken erstellt, wodurch die Lücken geschlossen werden konnten.
Die Stämme der Sektion V zeigen bei einem Vergleich mit 45 weiteren
cyanobakteriellen Genomen die größte Ähnlichkeit zu pflanzlichen Genen
cyanobakteriellen Ursprungs, womit die These bestätigt wird, dass ein
Cyanobakterium dieser Klasse der Vorläufer der Chloroplasten war (Dagan
et al., 2013).
Seit der Sequenzierung des ersten cyanobakteriellen Genoms im Jahr
1996 von Synechocystis sp. PCC 6803 (Kaneko & Tabata, 1997; Kaneko et
al., 1996) werden die Sequenzdaten in der Datenbank CyanoBase
(http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase/) annotiert und sind dort abrufbar
(Nakamura et al., 2000; Nakao et al., 2010). Alternativ sind die Daten bei
NCBI verfügbar oder auf der Website des jeweiligen Genomprojekts, in
diesem Fall auf www.molevol.de/resources.
Diskussion
69
Das Genom von Scytonema hofmanni PCC 7110 der Sektion IV ist mit 12
Mb und über 12000 Genen das größte bisher sequenzierte prokaryotische
Genom (Dagan et al., 2013). Die einzigen cyanobakteriellen Genome, die
größer geschätzt werden, sind die von Calothrix PCC 7101, PCC 7102 und
PCC 7426, die ebenfalls zur Sektion IV gehören, und möglicherweise
weiterer Stämme, zu denen keine Genominformationen verfügbar sind
(Herdman et al., 1979; Lachance, 1981). Allerdings ist das Genom von
Calothrix hoch repetitiv (Mazel et al., 1990), wie auch das anderer Vertreter
der Sektionen IV und V (Katayama et al. 2002).
4.4 Fazit und Ausblick
Die vorliegenden Arbeiten haben Aspekte des Proteinimports in
Hydrogenosomen von T. vaginalis und die Kenntnisse über Importsignale
beleuchtet. Zugleich haben diese Arbeiten neue Fragen zum Proteinimport
aufgeworfen. Die Signale der verhältnismäßig kurzen, N-terminalen
Transitpeptide konnten in allen in dieser Doktorarbeit untersuchten Fällen
von internen Importsignalen kompensiert werden. Somit wurde gezeigt, dass
in hydrogenosomalen Matrixproteinen interne Signale häufiger auftreten als
bisher angenommen und eher die Regel als die Ausnahme zu sein scheinen.
Die Bedeutung der Transitpeptide scheint dabei von geringerer Relevanz zu
sein als bei Proteinen von Mitochondrien der Hefe oder anderen Organismen.
Zudem wurde gezeigt, dass die internen Signale in mehreren Domänen
eines Proteins vorkommen und diese dazu befähigen, individuell und
unabhängig voneinander in das Organell importiert zu werden. Ein allgemein
gültiges Motiv für ein internes Importsignal konnte allerdings nicht identifiziert
werden. Weiterer Forschungsbedarf besteht außerdem bei der Frage,
inwieweit cytosolische Faktoren den Import beeinflussen und ob
Proteinmodifikationen entscheidend für deren Destination sein könnten.
Künftige Studien könnten andere Aspekte beleuchten, beispielsweise ob und
inwiefern mRNA Assoziation an das Organell Auswirkungen auf den
Proteinimport in die Hydrogenosomen hat, wie es bei Mitochondrien in Hefe
beschrieben wurde (Fox, 2012).
Diskussion
70
In dieser Studie wurden nur hochexprimierte hydrogenosomale Proteine
untersucht. In weiterführenden Experimenten könnte untersucht werden, ob
dies auch auf weniger stark exprimierte Proteine zutrifft. Zusätzlich könnten
Proteine mit langen Transitpeptiden untersucht werden. Das Protein mit dem
längsten in dieser Arbeit betrachteten Transitpeptid war TvME. Dabei wurden
11 Aminosäuren entfernt. Ob Proteine mit längeren Transitpeptiden ebenfalls
ihre Importkompetenz behalten, wenn diese deletiert werden, könnte in
weiterführenden Studien untersucht werden.
Anhang
71
5 Anhang
5.1 Vektorkarten
Abb. 5.1: pJET1.2/blunt Klonierungsvektor (Fermentas). Plasmidkarte gezeichnet nach Vorlage aus dem Herstellerprotokoll.
Anhang
72
Abb. 5.2: pDONR221 Klonierungsvektoren des Gateway Systems (Invitrogen) für die BP Rekombination. Plasmidkarten verändert nach Vorlage des Herstellers.
Anhang
73
Abb. 5.3: Expressionsvektoren pTagvag2 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. J Tachezy, Universität Prag) und pStreptag (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. S. B. Gould, Universität Düsseldorf).
Anhang
74
5.2 Kontrollen
Abb. 5.4: Kontrollen zu Abb. 3.1 zur Bestimmung der Reinheit der Fraktionen. Membranen wurden gestrippt und mit einem Antikörper gegen ein hydrogenosomales Protein, Anti-ASCT bzw. Anti-SCS, detektiert.
5.3 Alignments
TVAG_003900_Fd1 1 --MLSQVCRFGT--ITAVKGGVKKQLKFEDDQTLFTVLTEAGLMSADDTCQGNKACGKCI TVAG_399860_Fd2 1 MLSQCSPLRFGS--VTVTKGGAKKTLNYEDEQTLFTVLTEAGLMSTEGTCSGNRACGKCF TVAG_213140_Fd3 1 -MLSLCQTRFAS--LTAIKGGQSKTINFEEGTNLFELLVDNGMMSKDQTCQGNIGCGKCT TVAG_292710_Fd4 1 MLCSVSNYRFFK-LTVVTKAGEKVPINFNDGQTLFDAVSGTKAEGLQGKCGGSQVCGECH TVAG_068150_Fd5 1 MLCSFSNSRFFK-LTVVTPAGEKVPINFNDGQTLFDAVSGTKAEGLQGKCGGSQVCGECH TVAG_251200_Fd6 1 MLCQQSNIRYFPSLTIVNSKGEKTKVDFEDGQRLFDAVEGTKAEYIRGECGGNMSCGLCF TVAG_078730_Fd7 1 ---MLASISRSAVKIHWTGKGCDKIVEGHNGETLLKIAERNKLP-LPNACEGNRACATCQ TVAG_003900_Fd1 57 CKHVSG--KVAAAEDDEKEFLEDQP---ANARLACAITLSGENDGAVFEL---------- TVAG_399860_Fd2 59 CKHTGG--KVADADEEEKEFLEDQP---AGTRLACCITLTGENNGATFEV---------- TVAG_213140_Fd3 58 IGIKKG--KLPPPIEEEDDILPKD-----GKRLACAITLTKAQDGIEIEV---------- TVAG_292710_Fd4 60 CKIPQN--LYVVPDDDEKELLASGQDVTPTSRLACNLALNSKFDGATIEMTH-------- TVAG_068150_Fd5 60 CKLPQN--LYVAPDADEKELLASGTGVTPTSRLACQLSLNSKFDGATIEMTH-------- TVAG_251200_Fd6 61 VEVPPN--AFKQPDVKEMDLLEETDGTTKYSRLACQLILGPQFEDVEIHVRQ-------- TVAG_078730_Fd7 57 VYVNKGGDLLNEISDAEYDTLDYAVDLREQSRLACTCVLQTDDGEMDVVIPERCRNIDVS TVAG_003900_Fd1 --------- TVAG_399860_Fd2 --------- TVAG_213140_Fd3 --------- TVAG_292710_Fd4 --------- TVAG_068150_Fd5 --------- TVAG_251200_Fd6 --------- TVAG_078730_Fd7 117 EFKKKKSIL Abb. 5.5: Trichomonas vaginalis Ferredoxin alignment.
Anhang
75
GL50803_9662 1 ----------------------------------------MPIKLDAAKCCATMEC---- GL50803_10329 1 ----------------------------------------MRVHIIEGKCTGCGDC---- GL50803_27266 1 MSLLSSIRRFITFRVVQQGVEHTVSGAVGQSLLDAIKAAHIPIQDACEGHLGCGTCGVYL GL50803_9662 17 -------------CEVCPADVFDFPSGAKVVSVARPDACIECGACVSACASNALSL---- GL50803_10329 17 -------------IPSCAYNVLHMDEVTNRVVIAPSYGCVGCLQCLAVCTHDAIGTPVRY GL50803_27266 61 DKKTYKRIPRATKEEAVLLDQVPNPKPTSRLSCAVKLSSMLEGATVRIPSFNKNVLSESD GL50803_9662 ------------- GL50803_10329 64 E------------ GL50803_27266 121 ILASEEKKRHGQH Abb. 5.6: Giardia intestinalis Alignment von zwei kurzen 2[4Fe-4S] Ferredoxinen und einem langen [2Fe-2S] Ferredoxin.
5.4 Sequenzen
Detaillierte Proteinsequenzen der drei Blöcke von TvSCSα und TvTrxRh2 mit
C-terminaler Gateway Erkennungsstelle (blau) und HA-Tag (grün) sowie
einem zusätzlichen Methionin am N-Terminus der Blöcke 2 und 3.
TvSCSα Block 1 – 13,69 kDa
MLHQPLLFIDKDTKVVIQGIGNQGQFHSRLMRQYGTKVVGAVHPKKAGSIIAGLPIFKNMKEVVKRTDANASLIFVPAPGAAAACIEAAQAGMGLVVCITEQLCIQKLYPYDVPDYAYPYDVPDYA
TvSCSα Block 2 – 13,61 kDa
MHIPQHDMIKVKKVMKETGCQLIGPNCPGLIQPGTHTKLGIIPTNIFNNGKIGIVSRSGTLTYEAAYATTLAGLGQSTVVGIGGDPFAGQLHTDVVKRFAAQLCIQKLYPYDVPDYAYPYDVPDYA
TvSCSα Block 3 – 13,57 kDa
MDPQTEGIILIGEIGGTSEEDAAEWIAKTKLTQEKPVVAFIAGATAPPGKRMGHAGAIVSGGKGTAEGKYKALEAAGVRIARHPGNMGKFIFEEMKRMGKIQLCIQKLYPYDVPDYAYPYDVPDYA
Anhang
76
TvTrxRh2 Block 1 – 15,24 kDa
MSGDIDWTKAETVDIAIIGSGPGGSTAALYAARAGFKVIVLHGEVPGGQLTTTTELENFPGWKGTGPGLVEAIEKQATEAGAEYKYEVVTKVDFSVNPKLLSTDMDTHYKARSVIVQLCIQKLYPYDVPDYAYPYDVPDYA
TvTrxRh2 Block 2 – 15,19 kDa
MATGAKALYLGLPNEERLKGKGVSGCATCDGPLYKGKDVVVVGGGDAAAEEAIFLSKICKSVKLVHRRDQLRASLPMRKRVEASSIQMIWNTVIEDVLGENKVTGVKVKNVVTNQLCIQKLYPYDVPDYAYPYDVPDYA
TvTrxRh2 Block 3 – 11,96 kDa
MEVSEIPCDGLFVAIGHKPATEVFKDYLQTDEQGYFLTNGTPVTSIPGVFVCGDCADRHYRQAITSAATGCQAALLAEKYLTDQLCIQKLYPYDVPDYAYPYDVPDYA
Literaturverzeichnis
77
6 Literaturverzeichnis
Abe, Y., Shodai, T., Muto, T., Mihara, K., Torii, H., Nishikawa, S., Endo, T. & Kohda, D. (2000). Structural basis of presequence recognition by the mitochondrial protein import receptor Tom20. Cell 100, 551–560.
Ahting, U., Thieffry, M., Engelhardt, H., Hegerl, R., Neupert, W. &
Nussberger, S. (2001). Tom40, the pore-forming component of the protein-conducting TOM channel in the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology 153, 1151–1160.
Akhmanova, A., Voncken, F., van Alen, T., van Hoek, A., Boxma, B.,
Vogels, G., Veenhuis, M. & Hackstein, J. H. P. (1998). A hydrogenosome with a genome. Nature 396, 527–528.
Alconada, A., Kübrich, M., Moczko, M., Hönlinger, A. & Pfanner, N.
(1995). The mitochondrial receptor complex: the small subunit Mom8b/Isp6 supports association of receptors with the general insertion pore and transfer of preproteins. Molecular and Cellular Biology 15, 6196–6205.
Allen, S., Balabanidou, V., Sideris, D. P., Lisowsky, T. & Tokatlidis, K.
(2005). Erv1 mediates the Mia40-dependent protein import pathway and provides a functional link to the respiratory chain by shuttling electrons to cytochrome c. Journal of Molecular Biology 353, 937–944.
Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J. (1990).
Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215, 403–410.
Altschul, S. F., Madden, T. L., Schäffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller,
W. & Lipman, D. J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25, 3389–3402.
Archibald, J. M. (2009). The puzzle of plastid evolution. Current Biology 19,
81–88.
Literaturverzeichnis
78
Aurrecoechea, C., Brestelli, J., Brunk, B. P., Carlton, J. M., Dommer, J., Fischer, S., Gajria, B., Gao, X., Gingle, A., Grant, G., Harb, O. S., Heiges, M., Innamorato, F., Iodice, J., Kissinger, J. C., Kraemer, E., Li, W., Miller, J. A., Morrison, H. G., Nayak, V., Pennington, C., Pinney, D. F., Roos, D. S., Ross, C., Stoeckert Jr, C. J., Sullivan, S., Treatman, C. & Wang, H. (2009). GiardiaDB and TrichDB: integrated genomic resources for the eukaryotic protist pathogens Giardia lamblia and Trichomonas vaginalis. Nucleic Acids Research 37, 526–530.
Banci, L., Bertini, I., Cefaro, C., Ciofi-Baffoni, S., Gallo, A., Martinelli, M.,
Sideris, D. P., Katrakili, N. & Tokatlidis, K. (2009). MIA40 is an oxidoreductase that catalyzes oxidative protein folding in mitochondria. Nature Structural & Molecular Biology 16, 198–206.
Barberà, M. J., Ruiz-Trillo, I., Tufts, J. Y. A., Bery, A., Silberman, J. D. &
Roger, A. J. (2010). Sawyeria marylandensis (Heterolobosea) has a hydrogenosome with novel metabolic properties. Eukaryotic Cell 9, 1913–1924.
Becker, T., Böttinger, L. & Pfanner, N. (2012). Mitochondrial protein import:
from transport pathways to an integrated network. Trends in Biochemical Sciences 37, 85–91.
Becker, T., Wenz, L. S., Krüger, V., Lehmann, W., Müller, J. M., Goroncy,
L., Zufall, N., Lithgow, T., Guiard, B., Chacinska, A., Wagner, R., Meisinger, C. & Pfanner, N. (2011). The mitochondrial import protein Mim1 promotes biogenesis of multispanning outer membrane proteins. The Journal of Cell Biology 194, 387–395.
Bertani, G. (1951). Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation
by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology 62, 293–300. Bihlmaier, K., Mesecke, N., Terziyska, N., Bien, M., Hell, K. & Herrmann,
J. M. (2007). The disulfide relay system of mitochondria is connected to the respiratory chain. The Journal of Cell Biology 179, 389–395.
Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for
screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research 7, 1513–1523.
Blom, N., Gammeltoft, S. & Brunak, S. (1999). Sequence and structure-
based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites. Journal of Molecular Biology 294, 1351–1362.
Literaturverzeichnis
79
Blum, H., Beier, H. & Gross, H. J. (1987). Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis 8, 93–99.
Boxma, B., de Graaf, R. M., van der Staay, G. W. M., van Alen, T. A.,
Ricard, G., Gabaldón, T., van Hoek, A. H. A. M., Moon-van der Staay, S. Y., Koopman, W. J. H., van Hellemond, J. J., Tielens, A. G. M., Friedrich, T., Veenhuis, M., Huynen, M. A. & Hackstein, J. H. P. (2005). An anaerobic mitochondrion that produces hydrogen. Nature 434, 74–79.
Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72, 248–254.
Bradley, P. J., Lahti, C. J., Plümper, E. & Johnson, P. J. (1997). Targeting
and translocation of proteins into the hydrogenosome of the protist Trichomonas: similarities with mitochondrial protein import. The EMBO Journal 16, 3484–3493.
Broers, C. A. M., Stumm, C. K., Vogels, G. D. & Brugerolle, G. (1990).
Psalteriomonas lanterna gen. nov., sp. nov., a free-living amoeboflagellate isolated from freshwater anaerobic sediments. European Journal of Protistology 25, 369–380.
Brown, M. T., Goldstone, H. M. H., Bastida-Corcuera, F., Delgadillo-
Correa, M. G., McArthur, A. G. & Johnson, P. J. (2007). A functionally divergent hydrogenosomal peptidase with protomitochondrial ancestry. Molecular Microbiology 64, 1154–1163.
Brugerolle, G., Bricheux, G. & Coffe, G. (2000). Immunolocalization of two
hydrogenosomal enzymes of Trichomonas vaginalis. Parasitology Research 86, 30–35.
Bui, E. T. N., Bradley, P. J. & Johnson, P. J. (1996). A common
evolutionary origin for mitochondria and hydrogenosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 9651–9656.
Burstein, D., Gould, S. B., Zimorski, V., Kloesges, T., Kiosse, F., Major,
P., Martin, W. F., Pupko, T. & Dagan, T. (2012). A machine learning approach to identify hydrogenosomal proteins in Trichomonas vaginalis. Eukaryotic Cell 11, 217–228.
Literaturverzeichnis
80
Carlton, J. M., Hirt, R. P., Silva, J. C., Delcher, A. L., Schatz, M., Zhao, Q., Wortman, J. R., Bidwell, S. L., Alsmark, U. C. M., Besteiro, S., Sicheritz-Ponten, T., Noël, C. J., Dacks, J. B., Foster, P. G., Simillion, C., Van de Peer, Y., Miranda-Saavedra, D., Barton, G. J., Westrop, G. D., Müller, S., Dessi, D., Fiori, P. L., Ren, Q., Paulsen, I., Zhang, H., Bastida-Corcuera, F. D., Simoes-Barbosa, A., Brown, M. T., Hayes, R. D., Mukherjee, M., Okumura, C. Y., Schneider, R., Smith, A. J., Vaňáčová, Š., Villalvazo, M., Haas, B. J., Pertea, M., Feldblyum, T. V., Utterback, T. R., Shu, C.-L., Osoegawa, K., de Jong, P. J., Hrdý, I., Horváthová, L., Zubácová, Z., Doležal, P., Malik, S.-B., Logsdon Jr, J. M., Henze, K., Gupta, A., Wang, C. C., Dunne, R. L., Upcroft, J. A., Upcroft, P., White, O., Salzberg, S. L., Tang, P., Chiu, C.-H., Lee, Y.-S., Embley, T. M., Coombs, G. H., Mottram, J. C., Tachezy, J., Fraser-Liggett, C. M. & Johnson, P. J. (2007). Draft genome sequence of the sexually transmitted pathogen Trichomonas vaginalis. Science 315, 207–212.
Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T. & Pfanner, N.
(2009). Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell 138, 628–644.
Chacinska, A., Guiard, B., Müller, J. M., Schulze-Specking, A., Gabriel,
K., Kutik, S. & Pfanner, N. (2008). Mitochondrial biogenesis, switching the sorting pathway of the intermembrane space receptor Mia40. The Journal of Biological Chemistry 283, 29723–29729.
Chacinska, A., Pfannschmidt, S., Wiedemann, N., Kozjak, V., Sanjuán
Szklarz, L. K., Schulze-Specking, A., Truscott, K. N., Guiard, B., Meisinger, C. & Pfanner, N. (2004). Essential role of Mia40 in import and assembly of mitochondrial intermembrane space proteins. The EMBO Journal 23, 3735–3746.
Clark, C. G. & Diamond, L. S. (2002). Methods for cultivation of luminal
parasitic protists of clinical importance. Clinical Microbiology Reviews 15, 329–341.
Claros, M. G. & Vincens, P. (1996). Computational method to predict
mitochondrially imported proteins and their targeting sequences. European Journal of Biochemistry 241, 779–786.
Clemens, D. L. & Johnson, P. J. (2000). Failure to detect DNA in
hydrogenosomes of Trichomonas vaginalis by nick translation and immunomicroscopy. Molecular and Biochemical Parasitology 106, 307–313.
Literaturverzeichnis
81
Collins, T. J. (2007). ImageJ for microscopy. BioTechniques 43, 25–30. Conrad, M., Zubácová, Z., Dunn, L. A., Upcroft, J., Sullivan, S. A.,
Tachezy, J. & Carlton, J. M. (2011). Microsatellite polymorphism in the sexually transmitted human pathogen Trichomonas vaginalis indicates a genetically diverse parasite. Molecular and Biochemical Parasitology 175, 30–38.
Conrad, M. D., Gorman, A. W., Schillinger, J. A., Fiori, P. L., Arroyo, R.,
Malla, N., Dubey, M. L., Gonzalez, J., Blank, S., Secor, W. E., & Carlton, J. M. (2012). Extensive genetic diversity, unique population structure and evidence of genetic exchange in the sexually transmitted parasite Trichomonas vaginalis. PLoS Neglected Tropical Diseases 6, e1573.
Cudmore, S. L., Delgaty, K. L., Hayward-McClelland, S. F., Petrin, D. P. &
Garber, G. E. (2004). Treatment of infections caused by metronidazole-resistant Trichomonas vaginalis. Clinical Microbiololgy Reviews 17, 783–793.
Cui, Z., Hou, J., Chen, X., Li, J., Xie, Z., Xue, P., Cai, T., Wu, P., Xu, T. &
Yang, F. (2010). The profile of mitochondrial proteins and their phosphorylation signaling network in INS-1 beta cells. Journal of Proteome Research 9, 2898–2908.
Dabir, D. V., Leverich, E. P., Kim, S.-K., Tsai, F. D., Hirasawa, M., Knaff,
D. B. & Koehler, C. M. (2007). A role for cytochrome c and cytochrome c peroxidase in electron shuttling from Erv1. The EMBO Journal 26, 4801–4811.
Dagan, T., Roettger, M., Stucken, K., Landan, G., Koch, R., Major, P.,
Gould, S. B., Goremykin, V. V., Rippka, R., Tandeau de Marsac, N., Gugger, M., Lockhart, P. J., Allen, J. F., Brune, I., Maus, I., Pühler, A. & Martin, W. F. (2013). Genomes of stigonematalean cyanobacteria (subsection V) and the evolution of oxygenic photosynthesis from prokaryotes to plastids. Genome Biology and Evolution 5, 31–44.
de Graaf, R. M., Duarte, I., van Alen, T. A., Kuiper, J. W. P., Schotanus,
K., Rosenberg, J., Huynen, M. A. & Hackstein, J. H. P. (2009). The hydrogenosomes of Psalteriomonas lanterna. BMC Evolutionary Biology 9, 287.
Literaturverzeichnis
82
Delgadillo, M. G., Liston, D. R., Niazi, K. & Johnson, P. J. (1997). Transient and selectable transformation of the parasitic protist Trichomonas vaginalis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94, 4716–4720.
Deusch, O., Landan, G., Roettger, M., Gruenheit, N., Kowallik, K. V.,
Allen, J. F., Martin, W. & Dagan, T. (2008). Genes of cyanobacterial origin in plant nuclear genomes point to a heterocyst-forming plastid ancestor. Molecular Biology and Evolution 25, 748–761.
Diamond, L. S. (1957). The establishment of various trichomonads of
animals and man in axenic cultures. The Journal of Parasitology 43, 488–490.
Dietmeier, K., Hönlinger, A., Bömer, U., Dekker, P. J. T., Eckerskorn, C.,
Lottspeich, F., Kübrich, M. & Pfanner, N. (1997). Tom5 functionally links mitochondrial preprotein receptors to the general import pore. Nature 388, 195–200.
Doležal, P., Vaňáčová, Š., Tachezy, J. & Hrdý, I. (2004). Malic enzymes of
Trichomonas vaginalis: two enzyme families, two distinct origins. Gene 329, 81–92.
Doležal, P., Likić, V., Tachezy, J. & Lithgow, T. (2006). Evolution of the
molecular machines for protein import into mitochondria. Science 313, 314–318.
Doležal, P., Šmíd, O., Rada, P., Zubácová, Z., Bursać, D., Suták, R.,
Nebesárová, J., Lithgow, T. & Tachezy, J. (2005). Giardia mitosomes and trichomonad hydrogenosomes share a common mode of protein targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 10924–10929.
Dyall, S. D., Brown, M. T. & Johnson, P. J. (2004). Ancient invasions: from
endosymbionts to organelles. Science 304, 253–257. Dyall, S. D., Koehler, C. M., Delgadillo-Correa, M. G., Bradley, P. J.,
Plümper, E., Leuenberger, D., Turck, C. W. & Johnson, P. J. (2000). Presence of a member of the mitochondrial carrier family in hydrogenosomes: conservation of membrane-targeting pathways between hydrogenosomes and mitochondria. Molecular and Cellular Biology 20, 2488–2497.
Literaturverzeichnis
83
Dyall, S. D., Lester, D. C., Schneider, R. E., Delgadillo-Correa, M. G., Plümper, E., Martinez, A., Koehler, C. M. & Johnson, P. J. (2003). Trichomonas vaginalis Hmp35, a putative pore-forming hydrogenosomal membrane protein, can form a complex in yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry 278, 30548–30561.
Embley, T. M. & Martin, W. (2006). Eukaryotic evolution, changes and
challenges. Nature 440, 623–630. Esser, K., Tursun, B., Ingenhoven, M., Michaelis, G. & Pratje, E. (2002).
A novel two-step mechanism for removal of a mitochondrial signal sequence involves the mAAA complex and the putative rhomboid protease Pcp1. Journal of Molecular Biology 323, 835–843.
Fox, T. D. (2012). Mitochondrial protein synthesis, import, and assembly.
Genetics 192, 1203–1234. Franzén, O., Jerlström-Hultqvist, J., Castro, E., Sherwood, E., Ankarklev,
J., Reiner, D. S., Palm, D., Andersson, J. O., Andersson, B. & Svärd, S. G. (2009). Draft genome sequencing of Giardia intestinalis assemblage B isolate GS: is human giardiasis caused by two different species? PLoS Pathogens 5, e1000560.
Freeman, C. D., Klutman, N. E. & Lamp, K. C. (1997). Metronidazole. A
therapeutic review and update. Drugs 54, 679–708. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S. & Lazarow, P. B. (1982). Isolation of
intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology 93, 97–102.
Gaskell, G. J. (2000). Multiple sequence alignment tools on the Web.
BioTechniques 29, 60–62. Gebert, M., Schrempp, S. G., Mehnert, C. S., Heißwolf, A. K., Oeljeklaus,
S., Ieva, R., Bohnert, M., von der Malsburg, K., Wiese, S., Kleinschroth, T., Hunte, C., Meyer, H. E., Haferkamp, I., Guiard, B., Warscheid, B., Pfanner, N. & van der Laan, M. (2012). Mgr2 promotes coupling of the mitochondrial presequence translocase to partner complexes. The Journal of Cell Biology 197, 595–604.
Literaturverzeichnis
84
Gebert, N., Gebert, M., Oeljeklaus, S., von der Malsburg, K., Stroud, D. A., Kulawiak, B., Wirth, C., Zahedi, R. P., Doležal, P., Wiese, S., Simon, O., Schulze-Specking, A., Truscott, K. N., Sickmann, A., Rehling, P., Guiard, B., Hunte, C., Warscheid, B., van der Laan, M., Pfanner, N. & Wiedemann, N. (2011). Dual function of Sdh3 in the respiratory chain and TIM22 protein translocase of the mitochondrial inner membrane. Molecular Cell 44, 811–818.
Gershoni, J. M. & Palade, G. E. (1983). Protein blotting: principles and
applications. Analytical Biochemistry 131, 1–15. Gill, E. E., Diaz-Triviño, S., Barberà, M. J., Silberman, J. D., Stechmann,
A., Gaston, D., Tamas, I. & Roger, A. J. (2007). Novel mitochondrion-related organelles in the anaerobic amoeba Mastigamoeba balamuthi. Molecular Microbiology 66, 1306–1320.
Goldberg, A. V., Molik, S., Tsaousis, A. D., Neumann, K., Kuhnke, G.,
Delbac, F., Vivares, C. P., Hirt, R. P., Lill, R. & Embley, T. M. (2008). Localization and functionality of microsporidian iron-sulphur cluster assembly proteins. Nature 452, 624–628.
Goodman, R. P., Ghabrial, S. A., Fichorova, R. N. & Nibert, M. L. (2011).
Trichomonasvirus: a new genus of protozoan viruses in the family Totiviridae. Archives of Virology 156, 171–179.
Gorrell, T. E., Yarlett, N. & Müller, M. (1984). Isolation and characterization
of Trichomonas vaginalis ferredoxin. Carlsberg Research Communications 49, 259–268.
Gould, S. B., Waller, R. F. & McFadden, G. I. (2008). Plastid evolution.
Annual Review of Plant Biology 59, 491–517. Hampl, V., Silberman, J. D., Stechmann, A., Diaz-Triviño, S., Johnson, P.
J. & Roger, A. J. (2008). Genetic evidence for a mitochondriate ancestry in the 'amitochondriate' flagellate Trimastix pyriformis. PLoS ONE 3, e1383.
Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with
plasmids. Journal of Molecular Biology 166, 557–580. Harp, D. F. & Chowdhury, I. (2011). Trichomoniasis: evaluation to execution.
European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology 157, 3–9.
Literaturverzeichnis
85
Hartley, J. L., Temple, G. F. & Brasch, M. A. (2000). DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research 10, 1788–1795.
Häusler, T., Stierhof, Y. D., Blattner, J. & Clayton, C. (1997). Conservation
of mitochondrial targeting sequence function in mitochondrial and hydrogenosomal proteins from the early-branching eukaryotes Crithidia, Trypanosoma and Trichomonas. European Journal of Cell Biology 73, 240–251.
Heinz, E., Williams, T. A., Nakjang, S., Noël, C. J., Swan, D. C., Goldberg,
A. V., Harris, S. R., Weinmaier, T., Markert, S., Becher, D., Bernhardt, J., Dagan, T., Hacker, C., Lucocq, J. M., Schweder, T., Rattei, T., Hall, N., Hirt, R. P. & Embley, T. M. (2012). The genome of the obligate intracellular parasite Trachipleistophora hominis: new insights into microsporidian genome dynamics and reductive evolution. PLoS Pathogens 8, e1002979.
Henze, K. & Martin, W. (2003). Evolutionary biology: essence of
mitochondria. Nature 426, 127–128. Herdman, M., Janvier, M., Rippka, R. & Stanier, R. Y. (1979). Genome
size of cyanobacteria. Journal of General Microbiology 111, 73–85. Herlan, M., Vogel, F., Bornhövd, C., Neupert, W. & Reichert, A. S. (2003).
Processing of Mgm1 by the rhomboid-type protease Pcp1 is required for maintenance of mitochondrial morphology and of mitochondrial DNA. The Journal of Biological Chemistry 278, 27781–27788.
Heukeshoven, J. & Dernick, R. (1988). Increased sensitivity for Coomassie
staining of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using PhastSystem Development Unit. Electrophoresis 9, 60–61.
Hewitt, V., Alcock, F. & Lithgow, T. (2011). Minor modifications and major
adaptations: the evolution of molecular machines driving mitochondrial protein import. Biochimica et Biophysica Acta 1808, 947–954.
Hill, K., Model, K., Ryan, M. T., Dietmeier, K., Martin, F., Wagner, R. &
Pfanner, N. (1998). Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins. Nature 395, 516–521.
Hirt, R. P., Müller, S., Embley, T. M. & Coombs, G. H. (2002). The diversity
and evolution of thioredoxin reductase: new perspectives. Trends in Parasitology 18, 302–308.
Literaturverzeichnis
86
Hirt, R. P., Noël, C. J., Sicheritz-Ponten, T., Tachezy, J. & Fiori, P. L. (2007). Trichomonas vaginalis surface proteins: a view from the genome. Trends in Parasitology 23, 540–547.
Hirt, R. P., de Miguel, N., Nakjang, S., Dessi, D., Liu, Y.-C., Diaz, N.,
Rappelli, P., Acosta-Serrano, A., Fiori, P. L. & Mottram, J. C. (2011). Trichomonas vaginalis pathobiology: new insights from the genome sequence. Advances in Parasitology 77, 87–140.
Hjort, K., Goldberg, A. V., Tsaousis, A. D., Hirt, R. P. & Embley, T. M.
(2010). Diversity and reductive evolution of mitochondria among microbial eukaryotes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B, Biological Sciences 365, 713–727.
Hofmann, S., Rothbauer, U., Mühlenbein, N., Baiker, K., Hell, K. & Bauer,
M. F. (2005). Functional and mutational characterization of human MIA40 acting during import into the mitochondrial intermembrane space. Journal of Molecular Biology 353, 517–528.
Hönlinger, A., Bömer, U., Alconada, A., Eckerskorn, C., Lottspeich, F.,
Dietmeier, K. & Pfanner, N. (1996). Tom7 modulates the dynamics of the mitochondrial outer membrane translocase and plays a pathway-related role in protein import. The EMBO Journal 15, 2125–2137.
Hrdý, I. & Müller, M. (1995a). Primary structure and eubacterial relationships
of the pyruvate:ferredoxin oxidoreductase of the amitochondriate eukaryote Trichomonas vaginalis. Journal of Molecular Evolution 41, 388–396.
Hrdý, I. & Müller, M. (1995b). Primary structure of the hydrogenosomal
malic enzyme of Trichomonas vaginalis and its relationship to homologous enzymes. The Journal of Eukaryotic Microbiology 42, 593–603.
Hrdý, I., Hirt, R. P., Doležal, P., Bardoňová, L., Foster, P. G., Tachezy, J.
& Embley, T. M. (2004). Trichomonas hydrogenosomes contain the NADH dehydrogenase module of mitochondrial complex I. Nature 432, 618–622.
Huang, K.-Y., Chien, K.-Y., Lin, Y.-C., Hsu, W.-M., Fong, I.-K., Huang, P.-
J., Yueh, Y.-M., Gan, R. R.-C. & Tang, P. (2009). A proteome reference map of Trichomonas vaginalis. Parasitology Research 104, 927–933.
Literaturverzeichnis
87
Jedelský, P. L., Doležal, P., Rada, P., Pyrih, J., Šmíd, O., Hrdý, I., Šedinová, M., Marcinčiková, M., Voleman, L., Perry, A. J., Beltràn, N. C., Lithgow, T. & Tachezy, J. (2011). The minimal proteome in the reduced mitochondrion of the parasitic protist Giardia intestinalis. PLoS ONE 6, e17285.
Jenkins, T. M., Gorrell, T. E., Müller, M. & Weitzman, P. D. J. (1991).
Hydrogenosomal succinate thiokinase in Tritrichomonas foetus and Trichomonas vaginalis. Biochemical and Biophysical Research Communications 179, 892–896.
Jerlström-Hultqvist, J., Franzén, O., Ankarklev, J., Xu, F., Nohýnková, E.,
Andersson, J. O., Svärd, S. G. & Andersson, B. (2010). Genome analysis and comparative genomics of a Giardia intestinalis assemblage E isolate. BMC Genomics 11, 543.
Johnson, P. J., d'Oliveira, C. E., Gorrell, T. E. & Müller, M. (1990).
Molecular analysis of the hydrogenosomal ferredoxin of the anaerobic protist Trichomonas vaginalis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87, 6097–6101.
Kadowaki, K., Kubo, N., Ozawa, K. & Hirai, A. (1996). Targeting
presequence acquisition after mitochondrial gene transfer to the nucleus occurs by duplication of existing targeting signals. The EMBO Journal 15, 6652–6661.
Kaneko, T. & Tabata, S. (1997). Complete genome structure of the
unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. Plant & Cell Physiology 38, 1171–1176.
Kaneko, T., Sato, S., Kotani, H., Tanaka, A., Asamizu, E., Nakamura, Y.,
Miyajima, N., Hirosawa, M., Sugiura, M., Sasamoto, S., Kimura, T., Hosouchi, T., Matsuno, A. Muraki, A., Nakazaki, N., Naruo, K., Okumura, S., Shimpo, S., Takeuchi, C., Wada, T., Watanabe, A., Yamada, M., Yasuda, M. & Tabata, S. (1996). Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research 3, 109–136.
Kang, D. H., Gho, Y. S., Suh, M. K. & Kang, C. (2002). Highly sensitive and
fast protein detection with coomassie brilliant blue in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Bulletin of the Korean Chemical Society 23, 1511–1512.
Literaturverzeichnis
88
Katayama, T., Okamoto, S., Narikawa, R., Fujisawa, T., Kawashima, S., Itoh, M., Ohmori, M., Kanehisa, M. (2002). Comprehensive analysis of tandem repeat sequences in cyanobacteria genome. Genome Informatics 13, 400–401.
Katinka, M. D., Duprat, S., Cornillot, E., Méténier, G., Thomarat, F.,
Prensier, G., Barbe, V., Peyretaillade, E., Brottier, P., Wincker, P., Delbac, F., El Alaoui, H., Peyret, P., Saurin, W., Gouy, M., Weissenbach, J. & Vivarès, C. P. (2001). Genome sequence and gene compaction of the eukaryote parasite Encephalitozoon cuniculi. Nature 414, 450–453.
Katzen, F. (2007). Gateway® recombinational cloning: a biological operating
system. Expert Opinion on Drug Discovery 2, 571–589. Kay, C., Woodward, K. D., Lawler, K., Self, T. J., Dyall, S. D. & Kerr, I. D.
(2012). The ATP-binding cassette proteins of the deep-branching protozoan parasite Trichomonas vaginalis. PLoS Neglected Tropical Diseases 6, e1693.
Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K. & Koike, T. (2006).
Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Molecular & Cellular Proteomics 5, 749–757.
Kinoshita, E., Takahashi, M., Takeda, H., Shiro, M. & Koike, T. (2004).
Recognition of phosphate monoester dianion by an alkoxide-bridged dinuclear zinc(II) complex. Dalton Transactions, 1189–1193.
Koppen, M. & Langer, T. (2007). Protein degradation within mitochondria:
versatile activities of AAA proteases and other peptidases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 42, 221–242.
Kubo, N., Harada, K., Hirai, A. & Kadowaki, K. (1999). A single nuclear
transcript encoding mitochondrial RPS14 and SDHB of rice is processed by alternative splicing: common use of the same mitochondrial targeting signal for different proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96, 9207–9211.
Lachance, M.-A. (1981). Genetic relatedness of heterocystous
cyanobacteria by deoxyribonucleic acid-deoxyribonucleic acid reassociation. International Journal of Systematic Bacteriology 31, 139–147.
Literaturverzeichnis
89
Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680–685.
Lahti, C. J., d'Oliveira, C. E. & Johnson, P. J. (1992). β-succinyl-coenzyme
A synthetase from Trichomonas vaginalis is a soluble hydrogenosomal protein with an amino-terminal sequence that resembles mitochondrial presequences. Journal of Bacteriology 174, 6822–6830.
Lahti, C. J., Bradley, P. J. & Johnson, P. J. (1994). Molecular
characterization of the α-subunit of Trichomonas vaginalis hydrogenosomal succinyl CoA synthetase. Molecular and Biochemical Parasitology 66, 309–318.
Laloraya, S., Gambill, B. D. & Craig, E. A. (1994). A role for a eukaryotic
GrpE-related protein, Mge1p, in protein translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91, 6481–6485.
Land, K. M., Delgadillo-Correa, M. G., Tachezy, J., Vaňáčová, Š., Hsieh,
C. L., Sutak, R. & Johnson, P. J. (2004). Targeted gene replacement of a ferredoxin gene in Trichomonas vaginalis does not lead to metronidazole resistance. Molecular Microbiology 51, 115–122.
Landy, A. (1989). Dynamic, structural, and regulatory aspects of λ site-
specific recombination. Annual Review of Biochemistry 58, 913–949. Länge, S., Rozario, C. & Müller, M. (1994). Primary structure of the
hydrogenosomal adenylate kinase of Trichomonas vaginalis and its phylogenetic relationships. Molecular and Biochemical Parasitology 66, 297–308.
Li, Y., Dudek, J., Guiard, B., Pfanner, N., Rehling, P. & Voos, W. (2004).
The presequence translocase-associated protein import motor of mitochondria. Pam16 functions in an antagonistic manner to Pam18. The Journal of Biological Chemistry 279, 38047–38054.
Lindmark, D. G. & Müller, M. (1973). Hydrogenosome, a cytoplasmic
organelle of the anaerobic flagellate Tritrichomonas foetus, and its role in pyruvate metabolism. The Journal of Biological Chemistry 248, 7724–7728.
Lindmark, D. G., Müller, M. & Shio, H. (1975). Hydrogenosomes in
Trichomonas vaginalis. The Journal of Parasitology 61, 552–554.
Literaturverzeichnis
90
Liston, D. R. & Johnson, P. J. (1998). Gene transcription in Trichomonas vaginalis. Parasitology Today 14, 261–265.
Liston, D. R. & Johnson, P. J. (1999). Analysis of a ubiquitous promoter
element in a primitive eukaryote: early evolution of the initiator element. Molecular and Cellular Biology 19, 2380–2388.
Lithgow, T. & Schneider, A. (2010). Evolution of macromolecular import
pathways in mitochondria, hydrogenosomes and mitosomes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B, Biological Sciences 365, 799–817.
Lloyd, D., Ralphs, J. R. & Harris, J. C. (2002). Giardia intestinalis, a
eukaryote without hydrogenosomes, produces hydrogen. Microbiology 148, 727–733.
Long, M., de Souza, S. J., Rosenberg, C. & Gilbert, W. (1996). Exon
shuffling and the origin of the mitochondrial targeting function in plant cytochrome c1 precursor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 7727–7731.
Lu, G. & Moriyama, E. N. (2004). Vector NTI, a balanced all-in-one
sequence analysis suite. Briefings in Bioinformatics 5, 378–388. Major, P. (2009). Die Funktion der N-terminalen Extension für die
intrazelluläre Lokalisierung des hydrogenosomalen Ferredoxins aus Trichomonas vaginalis. Diplomarbeit, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf.
Major, P., Zimorski, V., Hoffmann, K., Pereira Brás, X., Martin, W. F. &
Gould, S. B. (2013). The N-terminal sequences of four major hydrogenosomal proteins are not essential for import into hydrogenosomes of Trichomonas vaginalis. Journal of Eukaryotic Microbiology 60, 89–97.
Mandel, M. & Higa, A. (1970). Calcium-dependent bacteriophage DNA
infection. Journal of Molecular Biology 53, 159–162. Mann, M. & Jensen, O. N. (2003). Proteomic analysis of post-translational
modifications. Nature Biotechnology 21, 255–261.
Literaturverzeichnis
91
Mapa, K., Sikor, M., Kudryavtsev, V., Waegemann, K., Kalinin, S., Seidel, C. A. M., Neupert, W., Lamb, D. C. & Mokranjac, D. (2010). The conformational dynamics of the mitochondrial Hsp70 chaperone. Molecular Cell 38, 89–100.
Marom, M., Dayan, D., Demishtein-Zohary, K., Mokranjac, D., Neupert, W.
& Azem, A. (2011). Direct interaction of mitochondrial targeting presequences with purified components of the TIM23 protein complex. The Journal of Biological Chemistry 286, 43809–43815.
Martin, W. & Müller, M. (1998). The hydrogen hypothesis for the first
eukaryote. Nature 392, 37–41. Martin, W. & Herrmann, R. G. (1998). Gene transfer from organelles to the
nucleus: how much, what happens, and why? Plant Physiology 118, 9–17.
Matthews, H. R. (1995). Protein kinases and phosphatases that act on
histidine, lysine, or arginine residues in eukaryotic proteins: a possible regulator of the mitogen-activated protein kinase cascade. Pharmacology & Therapeutics 67, 323–350.
Mazel, D., Houmard, J., Castets, A. M. & Tandeau de Marsac, N. (1990).
Highly repetitive DNA sequences in cyanobacterial genomes. Journal of Bacteriology 172, 2755–2761.
Mazet, M., Diogon, M., Alderete, J. F., Vivarès, C. P. & Delbac, F. (2008).
First molecular characterisation of hydrogenosomes in the protozoan parasite Histomonas meleagridis. International Journal for Parasitology 38, 177–190.
McArthur, A. G., Morrison, H. G., Nixon, J. E. J., Passamaneck, N. Q. E.,
Kim, U., Hinkle, G., Crocker, M. K., Holder, M. E., Farr, R., Reich, C. I., Olsen, G. E., Aley, S. B., Adam, R. D., Gillin, F. D. & Sogin, M. L. (2000). The Giardia genome project database. FEMS Microbiology Letters 189, 271–273.
McQuibban, G. A., Saurya, S. & Freeman, M. (2003). Mitochondrial
membrane remodelling regulated by a conserved rhomboid protease. Nature 423, 537–541.
Literaturverzeichnis
92
Mentel, M., Zimorski, V., Haferkamp, P., Martin, W. & Henze, K. (2008). Protein import into hydrogenosomes of Trichomonas vaginalis involves both N-terminal and internal targeting signals: a case study of thioredoxin reductases. Eukaryotic Cell 7, 1750–1757.
Mesecke, N., Terziyska, N., Kozany, C., Baumann, F., Neupert, W., Hell,
K. & Herrmann, J. M. (2005). A disulfide relay system in the intermembrane space of mitochondria that mediates protein import. Cell 121, 1059–1069.
Mesecke, N., Bihlmaier, K., Grumbt, B., Longen, S., Terziyska, N., Hell, K.
& Herrmann, J. M. (2008). The zinc-binding protein Hot13 promotes oxidation of the mitochondrial import receptor Mia40. EMBO Reports 9, 1107–1113.
Michon, T., Galante, M. & Velours, J. (1988). NH2-terminal sequence of the
isolated yeast ATP synthase subunit 6 reveals post-translational cleavage. European Journal of Biochemistry 172, 621–625.
Minge, M. A., Silberman, J. D., Orr, R. J. S., Cavalier-Smith, T.,
Shalchian-Tabrizi, K., Burki, F., Skjæveland, Å. & Jakobsen, K. S. (2009). Evolutionary position of breviate amoebae and the primary eukaryote divergence. Proceedings of the Royal Society of London Series B, Biological Sciences 276, 597–604.
Morrison, H. G., McArthur, A. G., Gillin, F. D., Aley, S. B., Adam, R. D.,
Olsen, G. J., Best, A. A., Cande, W. Z., Chen, F., Cipriano, M. J., Davids, B. J., Dawson, S. C., Elmendorf, H. G., Hehl, A. B., Holder, M. E., Huse, S. M., Kim, U. U., Lasek-Nesselquist, E., Manning, G., Nigam, A., Nixon, J. E. J., Palm, D., Passamaneck, N. E., Prabhu, A., Reich, C. I., Reiner, D. S., Samuelson, J., Svärd, S. G. & Sogin, M. L. (2007). Genomic minimalism in the early diverging intestinal parasite Giardia lamblia. Science 317, 1921–1926.
Mossmann, D., Meisinger, C. & Vögtle, F.-N. (2012). Processing of
mitochondrial presequences. Biochimica et Biophysica Acta 1819, 1098–1106.
Müller, M. (1988). Energy metabolism of protozoa without mitochondria.
Annual Review of Microbiology 42, 465–488. Müller, M. (1993). The hydrogenosome. Journal of General Microbiology 139,
2879–2889.
Literaturverzeichnis
93
Müller, M., Mentel, M., van Hellemond, J. J., Henze, K., Woehle, C., Gould, S. B., Yu, R.-Y., van der Giezen, M., Tielens, A. G. M. & Martin, W. F. (2012). Biochemistry and evolution of anaerobic energy metabolism in eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews 76, 444–495.
Murcha, M. W., Rudhe, C., Elhafez, D., Adams, K. L., Daley, D. O. &
Whelan, J. (2005). Adaptations required for mitochondrial import following mitochondrial to nucleus gene transfer of ribosomal protein S10. Plant Physiology 138, 2134–2144.
Naamati, A., Regev-Rudzki, N., Galperin, S., Lill, R. & Pines, O. (2009).
Dual targeting of Nfs1 and discovery of its novel processing enzyme, Icp55. The Journal of Biological Chemistry 284, 30200–30208.
Nakamura, Y., Ito, K. & Isaksson, L. A. (1996). Emerging understanding of
translation termination. Cell 87, 147–150. Nakamura, Y., Kaneko, T. & Tabata, S. (2000). CyanoBase, the genome
database for Synechocystis sp. strain PCC6803: status for the year 2000. Nucleic Acids Research 28, 72.
Nakao, M., Okamoto, S., Kohara, M., Fujishiro, T., Fujisawa, T., Sato, S.,
Tabata, S., Kaneko, T. & Nakamura, Y. (2010). CyanoBase: the cyanobacteria genome database update 2010. Nucleic Acids Research 38, 379–381.
Naoé, M., Ohwa, Y., Ishikawa, D., Ohshima, C., Nishikawa, S., Yamamoto,
H. & Endo, T. (2004). Identification of Tim40 that mediates protein sorting to the mitochondrial intermembrane space. The Journal of Biological Chemistry 279, 47815–47821.
Neuhoff, V., Stamm, R. & Eibl, H. (1985). Clear background and highly
sensitive protein staining with Coomassie Blue dyes in polyacrylamide gels: A systematic analysis. Electrophoresis 6, 427–448.
Nixon, J. E. J., Wang, A., Morrison, H. G., McArthur, A. G., Sogin, M. L.,
Loftus, B. J. & Samuelson, J. (2002a). A spliceosomal intron in Giardia lamblia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 3701–3705.
Literaturverzeichnis
94
Nixon, J. E. J., Wang, A., Field, J., Morrison, H. G., McArthur, A. G., Sogin, M. L., Loftus, B. J. & Samuelson, J. (2002b). Evidence for lateral transfer of genes encoding ferredoxins, nitroreductases, NADH oxidase, and alcohol dehydrogenase 3 from anaerobic prokaryotes to Giardia lamblia and Entamoeba histolytica. Eukaryotic Cell 1, 181–190.
Noël, C. J., Diaz, N., Sicheritz-Ponten, T., Šafaříková, L., Tachezy, J.,
Tang, P., Fiori, P.-L. & Hirt, R. P. (2010). Trichomonas vaginalis vast BspA-like gene family: evidence for functional diversity from structural organisation and transcriptomics. BMC Genomics 11, 99.
Nolden, M., Ehses, S., Koppen, M., Bernacchia, A., Rugarli, E. I. &
Langer, T. (2005). The m-AAA protease defective in hereditary spastic paraplegia controls ribosome assembly in mitochondria. Cell 123, 277–289.
Nunnari, J., Fox, T. D. & Walter, P. (1993). A mitochondrial protease with
two catalytic subunits of nonoverlapping specificities. Science 262, 1997–2004.
Ortiz, D. & Johnson, P. J. (2003). Tetracycline-inducible gene expression in
Trichomonas vaginalis. Molecular and Biochemical Parasitology 128, 43–49.
Osman, C., Wilmes, C., Tatsuta, T. & Langer, T. (2007). Prohibitins interact
genetically with Atp23, a novel processing peptidase and chaperone for the F1F0-ATP synthase. Molecular Biology of the Cell 18, 627–635.
Pal, D., Banerjee, S., Cui, J., Schwartz, A., Ghosh, S. K. & Samuelson, J.
(2009). Giardia, Entamoeba, and Trichomonas enzymes activate metronidazole (nitroreductases) and inactivate metronidazole (nitroimidazole reductases). Antimicrobial Agents and Chemotherapy 53, 458–464.
Palmer, J. D. (1997). Organelle genomes: going, going, gone! Science 275,
790–791. Parfrey, L. W., Lahr, D. J. G., Knoll, A. H. & Katz, L. A. (2011). Estimating
the timing of early eukaryotic diversification with multigene molecular clocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 13624–13629.
Literaturverzeichnis
95
Paul, R. G., Williams, A. G. & Butler, R. D. (1990). Hydrogenosomes in the rumen entodiniomorphid ciliate Polyplastron multivesiculatum. Journal of General Microbiology 136, 1981–1989.
Petrin, D., Delgaty, K., Bhatt, R. & Garber, G. (1998). Clinical and
microbiological aspects of Trichomonas vaginalis. Clinical Microbiology Reviews 11, 300–317.
Pfanner, N. & Geissler, A. (2001). Versatility of the mitochondrial protein
import machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, 339–349. Pfanner, N., Wiedemann, N., Meisinger, C. & Lithgow, T. (2004).
Assembling the mitochondrial outer membrane. Nature Structural & Molecular Biology 11, 1044–1048.
Pusnik, M., Mani, J., Schmidt, O., Niemann, M., Oeljeklaus, S.,
Schnarwiler, F., Warscheid, B., Lithgow, T., Meisinger, C. & Schneider, A. (2012a). An essential novel component of the noncanonical mitochondrial outer membrane protein import system of trypanosomatids. Molecular Biology of the Cell 23, 3420–3428.
Pusnik, M., Schmidt, O., Perry, A. J., Oeljeklaus, S., Niemann, M.,
Warscheid, B., Meisinger, C., Lithgow, T. & Schneider, A. (2012b). Response to Žárský et al. Current Biology 22, 481–482.
Pütz, S. (2007). Charakterisierung des hydrogenosomalen Proteoms aus
dem mikroaerophilen Humanparasiten Trichomonas vaginalis. Inaugural-Dissertation, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf.
Pütz, S., Gelius-Dietrich, G., Piotrowski, M. & Henze, K. (2005).
Rubrerythrin and peroxiredoxin: two novel putative peroxidases in the hydrogenosomes of the microaerophilic protozoon Trichomonas vaginalis. Molecular and Biochemical Parasitology 142, 212–223.
Quon, D. V. K., Delgadillo, M. G., Khachi, A., Smale, S. T. & Johnson, P.
J. (1994). Similarity between a ubiquitous promoter element in an ancient eukaryote and mammalian initiator elements. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91, 4579–4583.
Rabilloud, T. (2002). Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics:
Old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics 2, 3–10.
Literaturverzeichnis
96
Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S. & Lelong, C. (2010). Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: past, present and future. Journal of Proteomics 73, 2064–2077.
Rada, P., Doležal, P., Jedelský, P. L., Bursac, D., Perry, A. J., Šedinová,
M., Smíšková, K., Novotný, M., Beltrán, N. C., Hrdý, I., Lithgow, T. & Tachezy, J. (2011). The core components of organelle biogenesis and membrane transport in the hydrogenosomes of Trichomonas vaginalis. PLoS ONE 6, e24428.
Rao, S., Schmidt, O., Harbauer, A. B., Schönfisch, B., Guiard, B.,
Pfanner, N. & Meisinger, C. (2012). Biogenesis of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: protein kinase A phosphorylates the precursor of Tom40 and impairs its import. Molecular Biology of the Cell 23, 1618–1627.
Regoes, A., Zourmpanou, D., León-Avila, G., van der Giezen, M., Tovar,
J. & Hehl, A. B. (2005). Protein import, replication, and inheritance of a vestigal mitochondrion. The Journal of Biological Chemistry 280, 30557–30563.
Rehling, P., Model, K., Brandner, K., Kovermann, P., Sickmann, A.,
Meyer, H. E., Kühlbrandt, W., Wagner, R., Truscott, K. N. & Pfanner, N. (2003). Protein insertion into the mitochondrial inner membrane by a twin-pore translocase. Science 299, 1747–1751.
Rice, P., Longden, I. & Bleasby, A. (2000). EMBOSS: the european
molecular biology open software suite. Trends in Genetics 16, 276–277.
Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M. & Stanier, R. Y.
(1979). Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. Journal of General Microbiology 111, 1–61.
Roise, D. & Schatz, G. (1988). Mitochondrial presequences. The Journal of
Biological Chemistry 263, 4509–4511. Roy, S. W., Hudson, A. J., Joseph, J., Yee, J. & Russell, A. G. (2012).
Numerous fragmented spliceosomal introns, AT-AC splicing, and an unusual dynein gene expression pathway in Giardia lamblia. Molecular Biology and Evolution 29, 43–49.
Literaturverzeichnis
97
Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B. & Erlich, H. A. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487–491.
Saitoh, T., Igura, M., Obita, T., Ose, T., Kojima, R., Maenaka, K., Endo, T.
& Kohda, D. (2007). Tom20 recognizes mitochondrial presequences through dynamic equilibrium among multiple bound states. The EMBO Journal 26, 4777–4787.
Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A
laboratory manual, vol. 2. New York: Cold Spring Harbor laboratory press.
Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with
chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74, 5463–5467.
Santos, J. M., Graindorge, A. & Soldati-Favre, D. (2012). New insights into
parasite rhomboid proteases. Molecular and Biochemical Parasitology 182, 27–36.
Sasaki, Y., Sone, T., Yoshida, S., Yahata, K., Hotta, J., Chesnut, J. D.,
Honda, T. & Imamoto, F. (2004). Evidence for high specificity and efficiency of multiple recombination signals in mixed DNA cloning by the Multisite Gateway system. Journal of Biotechnology 107, 233–243.
Sasaki, Y., Sone, T., Yahata, K., Kishine, H., Hotta, J., Chesnut, J. D.,
Honda, T. & Imamoto, F. (2008). Multi-gene gateway clone design for expression of multiple heterologous genes in living cells: Eukaryotic clones containing two and three ORF multi-gene cassettes expressed from a single promoter. Journal of Biotechnology 136, 103–112.
Schmidt, O., Harbauer, A. B., Rao, S., Eyrich, B., Zahedi, R. P.,
Stojanovski, D., Schönfisch, B., Guiard, B., Sickmann, A., Pfanner, N. & Meisinger, C. (2011). Regulation of mitochondrial protein import by cytosolic kinases. Cell 144, 227–239.
Schneider, H.-C., Berthold, J., Bauer, M. F., Dietmeier, K., Guiard, B.,
Brunner, M. & Neupert, W. (1994). Mitochondrial Hsp70/MIM44 complex facilitates protein import. Nature 371, 768–774.
Literaturverzeichnis
98
Schneider, R. E., Brown, M. T., Shiflett, A. M., Dyall, S. D., Hayes, R. D., Xie, Y., Loo, J. A. & Johnson, P. J. (2011). The Trichomonas vaginalis hydrogenosome proteome is highly reduced relative to mitochondria, yet complex compared with mitosomes. International Journal for Parasitology 41, 1421–1434.
Schwebke, J. R. & Burgess, D. (2004). Trichomoniasis. Clinical
Microbiology Reviews 17, 794–803. Shi, T. & Falkowski, P. G. (2008). Genome evolution in cyanobacteria: the
stable core and the variable shell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 2510–2515.
Shiflett, A. M. & Johnson, P. J. (2010). Mitochondrion-related organelles in
eukaryotic protists. Annual Review of Microbiology 64, 409–429. Shiota, T., Mabuchi, H., Tanaka-Yamano, S., Yamano, K. & Endo, T.
(2011). In vivo protein-interaction mapping of a mitochondrial translocator protein Tom22 at work. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 15179–15183.
Šmíd, O., Matušková, A., Harris, S. R., Kučera, T., Novotný, M.,
Horváthová, L., Hrdý, I., Kutějová, E., Hirt, R. P., Embley, T. E., Janata, J. & Tachezy, J. (2008). Reductive evolution of the mitochondrial processing peptidases of the unicellular parasites Trichomonas vaginalis and Giardia intestinalis. PLoS Pathogens 4, e1000243.
Smith, A. & Johnson, P. (2011). Gene expression in the unicellular
eukaryote Trichomonas vaginalis. Research in Microbiology 162, 646–654.
Smith, A. J., Chudnovsky, L., Simoes-Barbosa, A., Delgadillo-Correa, M.
G., Jonsson, Z. O., Wohlschlegel, J. A. & Johnson, P. J. (2011). Novel core promoter elements and a cognate transcription factor in the divergent unicellular eukaryote Trichomonas vaginalis. Molecular and Cellular Biology 31, 1444–1458.
Stechmann, A., Hamblin, K., Pérez-Brocal, V., Gaston, D., Richmond, G.
S., van der Giezen, M., Clark, C. G. & Roger, A. J. (2008). Organelles in Blastocystis that blur the distinction between mitochondria and hydrogenosomes. Current Biology 18, 580–585.
Literaturverzeichnis
99
Stojanovski, D., Bohnert, M., Pfanner, N. & van der Laan, M. (2012). Mechanisms of protein sorting in mitochondria. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 4, 1–18.
Tai, J.-H., Su, H.-M., Tsai, J., Shaio, M.-F. & Wang, C. C. (1993). The
divergence of Trichomonas vaginalis virus RNAs among various isolates of Trichomonas vaginalis. Experimental Parasitology 76, 278–286.
Taylor, A. B., Smith, B. S., Kitada, S., Kojima, K., Miyaura, H.,
Otwinowski, Z., Ito, A. & Deisenhofer, J. (2001). Crystal structures of mitochondrial processing peptidase reveal the mode for specific cleavage of import signal sequences. Structure 9, 615–625.
Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994). CLUSTAL W:
improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22, 4673–4680.
Tjaden, J., Haferkamp, I., Boxma, B., Tielens, A. G. M., Huynen, M. &
Hackstein, J. H. P. (2004). A divergent ADP/ATP carrier in the hydrogenosomes of Trichomonas gallinae argues for an independent origin of these organelles. Molecular Microbiology 51, 1439–1446.
Tovar, J., Fischer, A. & Clark, C. G. (1999). The mitosome, a novel
organelle related to mitochondria in the amitochondrial parasite Entamoeba histolytica. Molecular Microbiology 32, 1013–1021.
Tovar, J., León-Avila, G., Sánchez, L. B., Sutak, R., Tachezy, J., van der
Giezen, M., Hernández, M., Müller, M. & Lucocq, J. M. (2003). Mitochondrial remnant organelles of Giardia function in iron-sulphur protein maturation. Nature 426, 172–176.
Tsaousis, A. D., Kunji, E. R. S., Goldberg, A. V., Lucocq, J. M., Hirt, R. P.
& Embley, T. M. (2008). A novel route for ATP acquisition by the remnant mitochondria of Encephalitozoon cuniculi. Nature 453, 553–557.
van der Giezen, M. (2009). Hydrogenosomes and mitosomes: conservation
and evolution of functions. Journal of Eukaryotic Microbiology 56, 221–231.
Literaturverzeichnis
100
van Grinsven, K. W. A., Rosnowsky, S., van Weelden, S. W. H., Pütz, S., van der Giezen, M., Martin, W., van Hellemond, J. J., Tielens, A. G. M. & Henze, K. (2008). Acetate:succinate CoA-transferase in the hydrogenosomes of Trichomonas vaginalis - identification and characterization. The Journal of Biological Chemistry 283, 1411–1418.
van Wilpe, S., Ryan, M. T., Hill, K., Maarse, A. C., Meisinger, C., Brix, J.,
Dekker, P. J. T., Moczko, M., Wagner, R., Meijer, M., Guiard, B., Hönlinger, A. & Pfanner, N. (1999). Tom22 is a multifunctional organizer of the mitochondrial preprotein translocase. Nature 401, 485–489.
Vaňáčová, Š., Yan, W., Carlton, J. M. & Johnson, P. J. (2005).
Spliceosomal introns in the deep-branching eukaryote Trichomonas vaginalis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 4430–4435.
Vidakovic, M. S., Fraczkiewicz, G. & Germanas, J. P. (1996). Expression
and spectroscopic characterization of the hydrogenosomal [2Fe-2S] ferredoxin from the protozoan Trichomonas vaginalis. The Journal of Biological Chemistry 271, 14734–14739.
Vogelstein, B. & Gillespie, D. (1979). Preparative and analytical purification
of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 76, 615–619.
Vögtle, F.-N., Prinz, C., Kellermann, J., Lottspeich, F., Pfanner, N. &
Meisinger, C. (2011). Mitochondrial protein turnover: role of the precursor intermediate peptidase Oct1 in protein stabilization. Molecular Biology of the Cell 22, 2135–2143.
Vögtle, F.-N., Wortelkamp, S., Zahedi, R. P., Becker, D., Leidhold, C.,
Gevaert, K., Kellermann, J., Voos, W., Sickmann, A., Pfanner, N. & Meisinger, C. (2009). Global analysis of the mitochondrial N-proteome identifies a processing peptidase critical for protein stability. Cell 139, 428–439.
von der Haar, T. & Tuite, M. F. (2007). Regulated translational bypass of
stop codons in yeast. Trends in Microbiology 15, 78–86. Waizenegger, T., Schmitt, S., Zivkovic, J., Neupert, W. & Rapaport, D.
(2005). Mim1, a protein required for the assembly of the TOM complex of mitochondria. EMBO Reports 6, 57–62.
Literaturverzeichnis
101
Wegener, A. D. & Jones, L. R. (1984). Phosphorylation-induced mobility shift in phospholamban in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels - evidence for a protein-structure consisting of multiple identical phosphorylatable subunits. The Journal of Biological Chemistry 259, 1834–1841.
Weksberg, T. E., Lynch, G. C., Krause, K. L. & Pettitt, B. M. (2007).
Molecular dynamics simulations of Trichomonas vaginalis ferredoxin show a loop-cap transition. Biophysical Journal 92, 3337–3345.
Wiedemann, N., Pfanner, N. & Ryan, M. T. (2001). The three modules of
ADP/ATP carrier cooperate in receptor recruitment and translocation into mitochondria. The EMBO Journal 20, 951–960.
Wiedemann, N., Frazier, A. E. & Pfanner, N. (2004). The protein import
machinery of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry 279, 14473–14476.
Williams, B. A. P., Hirt, R. P., Lucocq, J. M. & Embley, T. M. (2002). A
mitochondrial remnant in the microsporidian Trachipleistophora hominis. Nature 418, 865–869.
Williams, B. A. P., Cali, A., Takvorian, P. M. & Keeling, P. J. (2008).
Distinct localization patterns of two putative mitochondrial proteins in the microsporidian Encephalitozoon cuniculi. Journal of Eukaryotic Microbiology 55, 131–133.
Wu, X., Zarka, A. & Boussiba, S. (2000). A simplified protocol for preparing
DNA from filamentous cyanobacteria. Plant Molecular Biology Reporter 18, 385–392.
Yano, M., Terada, K. & Mori, M. (2003). AIP is a mitochondrial import
mediator that binds to both import receptor Tom20 and preproteins. The Journal of Cell Biology 163, 45–56.
Yarlett, N., Hann, A. C., Lloyd, D. & Williams, A. (1981). Hydrogenosomes
in the rumen protozoon Dasytricha ruminantium Schuberg. Biochemical Journal 200, 365–372.
Yarlett, N., Hann, A. C., Lloyd, D. & Williams, A. G. (1983).
Hydrogenosomes in a mixed isolate of Isotricha prostoma and Isotricha intestinalis from ovine rumen contents. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry 74, 357–364.
Literaturverzeichnis
102
Yarlett, N., Coleman, G. S., Williams, A. G. & Lloyd, D. (1984). Hydrogenosomes in known species of rumen entodiniomorphid protozoa. FEMS Microbiology Letters 21, 15–19.
Yarlett, N., Martinez, M. P., Moharrami, M. A. & Tachezy, J. (1996). The
contribution of the arginine dihydrolase pathway to energy metabolism by Trichomonas vaginalis. Molecular and Biochemical Parasitology 78, 117–125.
Yarlett, N., Orpin, C. G., Munn, E. A., Yarlett, N. C. & Greenwood, C. A.
(1986). Hydrogenosomes in the rumen fungus Neocallimastix patriciarum. Biochemical Journal 236, 729–739.
Yarlett, N., Lindmark, D. G., Goldberg, B., Moharrami, M. A. & Bacchi, C.
J. (1994). Subcellular localization of the enzymes of the arginine dihydrolase pathway in Trichomonas vaginalis and Tritrichomonas foetus. Journal of Eukaryotic Microbiology 41, 554–559.
Yeh, Y.-M., Huang, K.-Y., Richie Gan, R.-C., Huang, H.-D., Wang, T.-C. V.
& Tang, P. (2012). Phosphoproteome profiling of the sexually transmitted pathogen Trichomonas vaginalis. Journal of Microbiology, Immunology and Infection, in press.
Young, J. C., Hoogenraad, N. J. & Hartl, F. U. (2003). Molecular
chaperones Hsp90 and Hsp70 deliver preproteins to the mitochondrial import receptor Tom70. Cell 112, 41–50.
Yu, D., Wang, Y., Fang, X., Hu, S., Tang, P. & Fu, Y. (2012). Acquisition of
hydrogenosomal presequences: examples from Trichomonas vaginalis. FEMS Microbiology Letters 330, 127–131.
Yuh, Y. S., Liu, J. Y. & Shaio, M. F. (1997). Chromosome number of
Trichomonas vaginalis. Journal of Parasitology 83, 551–553. Žárský, V., Tachezy, J. & Doležal, P. (2012). Tom40 is likely common to all
mitochondria. Current Biology 22, 481–482. Zeng, X., Neupert, W. & Tzagoloff, A. (2007). The metalloprotease
encoded by ATP23 has a dual function in processing and assembly of subunit 6 of mitochondrial ATPase. Molecular Biology of the Cell 18, 617–626.
Literaturverzeichnis
103
Zimorski, V. (2010). Kompartimentierung des Energiestoffwechsels und Proteinimport in Hydrogenosomen bei Trichomonas vaginalis. Inaugural-Dissertation, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf.
Zimorski, V., Major, P., Yu, R.-Y., Hoffmann, K., Pereira Brás, X., Tucci,
S., Mentel, M., Gould, S. B., Henze, K. & Martin, W. F. (2012). Evolutionary significance of anaerobic energy metabolism in eukaryotes. Journal of Endocytobiosis and Cell Research 23, 64–68.
Zubáčová, Z., Cimbůrek, Z. & Tachezy, J. (2008). Comparative analysis of
trichomonad genome sizes and karyotypes. Molecular and Biochemical Parasitology 161, 49–54.
Zwart, K. B., Goosen, N. K., van Schijndel, M. W., Broers, C. A. M.,
Stumm, C. K. & Vogels, G. D. (1988). Cytochemical localization of hydrogenase activity in the anaerobic protozoa Trichomonas vaginalis, Plagiopyla nasuta and Trimyema compressum. Journal of General Microbiology 134, 2165–2170.
Danksagung
104
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. William Martin für die Möglichkeit der
Promotion und für sein entgegengebrachtes Interesse an meinen Projekten
sowie die Bereitstellung des interessanten Themas. Ich bedanke mich
ebenfalls für die exzellenten Arbeitsbedingungen und wissenschaftlichen
Kontakte.
Prof. Dr. Tal Dagan und Dr. Karina Stucken danke ich für die
Hilfsbereitschaft in Bioinformatik und im Labor zu Themen rund um
Cyanobakterien sowie ausgezeichnete Zusammenarbeit in der Lehre.
Ich danke PD Dr. Katrin Henze für die Übernahme des Korreferats und für
Hilfe bei organisatorischen Angelegenheiten.
Dr. Sven B. Gould danke ich für zahlreiche innovative Vorschläge, Ideen und
Inspirationen, die den Umfang und die Qualität meiner Arbeit bereichert
haben, sowie für seinen Einsatz bei der Modernisierung und Erweiterung der
Laborausstattung.
Ich danke Dr. Verena Zimorski für ihre stetige Hilfsbereitschaft und
themenbezogenen Diskussionen sowie konstruktive Kritik. Auch in
laborsicherheitstechnischen Fragen war sie stets engagiert und in der Lehre
vorbildlich.
Ich danke Dr. Xavier Pereira Brás für hilfreiche Ratschläge im Laboralltag.
Bedanken möchte ich mich auch bei meinen Büronachbarn Ovidiu Popa,
Houda El-Haddad und Re-Young Yu für die angenehme Atmosphäre
außerhalb des Labors.
Ich danke Kathrin Hoffmann, Kai Ming Cheung, Gary Kusdian, Jörn Habicht
und Harald Preisner für die Hilfe im Labor.
Ich danke dem ganzen Institut für Molekulare Evolution und dem Institut für
Genomische Mikrobiologie für die schöne gemeinsame Zeit während meiner
gesamten Promotion. Sowohl im Arbeitsalltag im Labor, als auch bei
Konferenzen, Betriebsausflügen und den Weihnachtsfeiern.
Erklärung
105
Erklärung
Hiermit versichere ich, die Dissertation selbstständig und ohne unerlaubte
Hilfsmittel verfasst zu haben. Verwendete Quellen wurden kenntlich gemacht.
Die Dissertation wurde bei keinen anderen Institutionen eingereicht und es
wurden bisher keine erfolglosen Promotionsversuche unternommen.