El super-organismo humano
Ecología Microbiana del Tracto Gastrointestinal (GI).
400-500 especies bacterianas habitan el tracto intestinal humano.
El 99% de las bacterias totales pertenecen a 30-40 especies.
La mayor población se halla en el colon, con 1014 células bacterianas. (10 veces más que todas las células del cuerpo).
Patógenos intestinales
Diarrea asociada a Clostridium difficile Gastritis y úlceras asociadas a Helicobacter
pylori Enterocolitis asociada a Salmonella,
Escherichia, Pasteurella. Diarreas asociadas a rotavirus. Colitis y mala absorción Giardia intestinalis
(parásito intestinal).
Probióticos Prebióticos
Microorganismos que producen efectos benéficos en la saluddel consumidor. (Bifidobacterias, Lactobacilos)
Compuestos no digeribles que favorecen el desarrollo y establecimiento de la flora bacteriana benéfica en el colon. (galacto-oligosacáridos de leche materna, fructo-oligosacáridos de plantas, sorbitol, xilitol, isomaltosa)
Simbióticos
Empleando leche hervida como medio de cultivo aisló un cultivo puro “Bacterium lactis”. (Lactobacillus, 1901)
Lactobacillus
Lister Joseph (1857)
Estudios originados por la longevidad de ciudadanos búlgaros.
Primeros estudios científicos que respaldan los efectos benéficos en la salud por consumo de leche fermentada con “Bulgarian bacillus” (Lactobacillus bulgaricus).
Producción de compuestos benéficos Exclusión de patógenos en la mucosa intestinal.Estimulación del sistema inmuneEliminación de productos tóxicos
Elías Metchnikoff, 1907
Henry Tissier (1906)
Bifidobacterium
•Observó abundantes bacterias “Y” en heces de niños Observó abundantes bacterias “Y” en heces de niños saludables, y escasas en aquellas de niños con diarreas. saludables, y escasas en aquellas de niños con diarreas. ((Bacillus bifidus).•Nueve de cada diez niños tratados con B bifidus se recuperaron rápidamente de la diarrea.
Microorganismos vivos que después de ser ingeridos en cantidades adecuadas, otorgan beneficios a la salud que superan las inherentes necesidades básicas nutricionales
Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura. Organización Mundial de la Salud (FAO/WHO), 2001
Definición
Lilly & Stilwell, 1965
Sustancias secretadas por un organismo y capaces deestimular el crecimiento de otro.
Guarner & Shaafsma, 1998
Microorganismos vivos que cuando se consumen en cantidades adecuadas como parte de un alimento, confieren al huésped un beneficio para la salud.
Inocuidad (GRAS, QPS). Identificación taxonómica de la cepa
probiótica Estabilidad genética Resistencia frente a antibióticos
Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos
Criterios de seguridad
Kakisu E, 2010
Viabilidad en el producto Factibilidad de reproducción a mayor
escala Resistencia a fagos Si forman parte de un alimento,
estabilidad de propiedades probióticas durante vida útil del mismo
Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos
Criterios tecnológicos
Resistencia a condiciones del tracto GI Viabilidad y eventual proliferación en intestino Capacidad de adherirse y colonizar fácilmente el
tracto gastrointestinal compitiendo con patógenos. Presentar actividad antagónica frente a patógenos
in vitro e in vivo. Sinergismos de cepas probióticas Capacidad comprobable de otorgar beneficios al
huésped
Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos
Criterios funcionales
Criterios de seguridad: Identificación de la cepa probiótica:Resolución taxonómica de las técnicas de uso más frecuente
RFLPPFGERibotipificaciónAFLP, AP-PCR, rep-PCR, RAPD ARDRATipificación mediante bacteriocinas, fagotipificaciónSerotipificaciónZimogramasPatrones electroforéticos de proteínas celulares totalesHibridaciones DNA-DNA% G+CMarcadores quimiotaxonómicosFingerprinting de ácidos grasos celulares Estructura de pared celularFenotipoSecuencia de rRNASondas de DNASecuencias de DNA
Familia
GéneroEspecie
Cepa
Modificado de Vandamme et al., 1996
Prevención y tratamiento de diarreas, úlceras y enfermedades inflamatorias crónicas de tracto GI
Remodelación de las comunidades bacterianas gastrointestinales (Bifidobacterium spp, Lactobacillus reuteri)
Modulación de la respuesta inmune Prevención y disminución de efectos pro-inflamatorios en
alergias Profilaxis y tratamiento de enfermedades urogenitales Aumento de la digestibilidad de la lactosa por aporte de beta
galactosidasa
Efectos hipocolesterolemiantes ? Efectos terapéuticos en el tratamiento del cáncer ?
Criterios funcionales: Efectos benéficos sobre la salud
Criterios funcionales: Efectos benéficos sobre la salud
Lutgendorff et al, 2010
La administración de probióticos reduce la apoptosis intestinal en pancreatitis aguda en ratas. Aumento del antioxidante glutatión (GSH)
Probiótico multicepa: Lactobacillus acidophilus (W70), Lactobacillus casei (W56), Lactobacillus salivarius (W24), Lactococcus lactis (W58), Bifidobacterium bifidum (W23), and Bifidobacterium lactis (W52) (previously classifiedas Bifidobacterium infantis) (EcologicH 641, Winclove Bio Industries, Amsterdam, the Netherlands).
Efecto dosis-respuesta de diferentes cepas probióticas sobre perfiles lipídicos
Ooi & Liong, 2010
Efecto dosis-respuesta de diferentes cepas probióticas sobre perfiles lipídicos: estudios en humanos
Ooi & Liong, 2010
Existen algunos datos controversiales, atribuíbles a diferencias en las cepas empleadas, dosis y duración del tratamiento, grupos contol inadecuados, etc
Efectos inmunológicos
Modulación de la respuesta inmune: aumento de IgA, activación células NK, incremento de la actividad fagocítica, proliferación de linfocitos B, producción de citoquinas (IL2, IL6, IL10) o factor de necrosis tumoral (TNF) (Takeda et al, 2006; Sheih et al, 2001; Kitazawa et al, 2001; Galdeano y Perdigón, 2006; Humen et al, 2005)
Materia fecal
Sangre
Intestino
IgA especifica.
Antígenos específicos de Giardia
IgG esp.
Recuento de Trofozoitos
Enzimas
Histología
Muestras:Muestras:
Giardia intestinalis
Cepa WB clon C6
(5x105 por animal)
Estudio de la cinética de infección Estudio de la cinética de infección en merión. en merión.
Administración de Lactobacillus johnsonii LA1 (108 UFC/animal/día)
Sacrificio y muestreo
Sacrificio y muestreo
Sacrificio y muestreo
Día 0 7 14 21 Día 0 7 14 21 2828
Grupo Tratamiento:
Grupo Placebo: Agua mineral (Humen et al, 2005)
Efectos inmunológicos
Cinética de infección:Cinética de infección:
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 10 20 30
time post-inoculation (days)
infe
ctio
n ra
te
La1
Placebo
En el grupo placebo hay un pico de infección al día 7 (p=0.05)En el grupo placebo hay un pico de infección al día 7 (p=0.05)
Days post-inoculationDays post-inoculation
Day 7Day 7 Day 14Day 14 Day 21Day 21
La1La1 PlaceboPlacebo La1La1 PlaceboPlacebo La1La1 PlaceboPlacebo
Infecction rateInfecction rate 3/113/11 10/1210/12 0/120/12 6/146/14 0/60/6 3/63/6
Fisher test (p)Fisher test (p) 0.010.01 0.020.02 0.090.09
Determinación de antígenos específicosDeterminación de antígenos específicos de giardia de giardia (GSA-65)(GSA-65) en en
materia fecalmateria fecal
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30
time (days)
rati
o o
f G
SA
65 +
an
imal
s
La1
Placebo
En el grupo Placebo se encontró un aumento en En el grupo Placebo se encontró un aumento en la liberación de antígenos (GSA-65) la liberación de antígenos (GSA-65) dependiente del tiempo. dependiente del tiempo.
El grupo tratamiento mostró una menor El grupo tratamiento mostró una menor liberación de antígeno.liberación de antígeno.
Efectos inmunológicos
Humen et al, 2005
Posibles Mecanismos Probióticos
Actividad anti microbiana/Interferencia con patógenos.
Regulación de la digestión y eliminación de sustancias nocivas.
Efectos inmunológicos.
Ácidos: acético, láctico, propiónico: > pH e inactivan crecimiento bacteriano (E coli, Salmonella, etc.)
H2O2, forma radicales libres atacan membrana lipídica. (Candida, Gardenella).
Bacteriocinas: péptidos anti microbianos. Interaccionan con receptores de la bacteria blanco-produciendo cambios a nivel de membrana que conducen a la muerte bacteriana. (Nisina)
Competencia por sustratos. Competencia por sitios de unión al epitelio, efectos
estéricos.
Actividad anti microbiana/competenciaActividad anti microbiana/competencia
Regulación de la digestión y eliminación de sustancias nocivas
Mejora la absorción de nutrientes. Elimina sustancias tóxicas (derivados fenólicos
de metabolismos de aminoácidos, etc., efectos anti carcinogénicos y anti tumorales).
Facilitan la hidrólisis de lípidos y proteínas liberando aminoácidos y ácidos grasos fácil de absorber.
Aporte de enzimas que ayudan degradar sustancias. Ej. Intolerancia a la latosa (β-galactosidasa).
Aporte de vitaminas.
Identificación Cepa Genotípica y Fenotípicamente.
(Hibridación, PCR, PFEG)
Características FuncionalesTests in vitroEnsayos en Animales
Aseguramiento de la inocuidad (GRAS)In vitro y/o animalFase 1 estudio en humanos (voluntarios sanos)Sin actividad hemolítica ni producción de toxinas, no presentar resistencia a antibióticos, etc.
Ensayos en humanos doble ciego controlado con placebo (Fase2, grupo con patología). Diseño apropiado de experimento. Resultados preliminares
Fase 3. Ensayos efectividad al compararlos con tratamiento estándar de una condición específica.
Rotulado:Contenido: Cepa , especie etcMínimo Nº de bacterias viables del contenidoCondiciones apropiadas de almacenaje
Recomendado un 2º ensayo independiente para confirmar resultados.
Probiótico
Food and Agriculture Organizationof the United Nations World Health Organization. FAO/WHO
Pautas para el desarrollo de un Probiótico
Bacterias del ácido láctico
Gram positivas
No esporulantes
Cocos o bacilos no respiradores
Catalasa negativos
Productoras de ácido láctico
(Hagen et al., 2005)
Estructura
Metabolismo
Aplicaciones biotecnológicas
Composición
Proteína láctea (% w/w)a Mín 2,7%
Grasa láctea (% w/w) Menos del 10%
Acidez valorable, expresada como % de ácido láctico (% w/w)
Mín. 0,6%
Suma de microorganismos que constituyen el cultivo (ufc/g, en total)
Mín. 107
Levaduras (ufc/g) Mín. 104
Etanol No establecido
Alimento obtenido por incubación de leche con gránulos de kefir.Los gránulos, compuestos por una matriz de proteínas y polisacáridos, contienen lactobacilos, lactococos, bacterias del ácido acético y levaduras, responsables de la fermentación.
El kefir
Lactobacillus
L. kefiranofaciens, L. acidophilus, L. alimentarius, L. casei, L. rhamnosus.
Heterofermentadores:
ácido acético
L. brevis, L. buchneri, L. kefir, L. fermentum, L. fructivorans.
Homofermentadores:
Glucosa ácido láctico
etanol
Glucosaácido láctico
QPS (Qualified Presumption of Safe, UE) GRAS (Generally Recognised As Safe, USA)
Bacterial cells S-layer extraction, LiCl 5 M 37 ºC, 2 hs, 180 rpm
Dialysis
S-layer protein Monomers Re-assembling
in suspensionat liquid-surface interfaceson lipid filmson liposomeson solid supports
Subunits are held together and attached to the underlying cell surface by noncovalent
interactions. Monomers have self-assembly ability to form regular layers Interactions can be disrupted in a reversible way by cation substitution or high concentration
of chaotropic agents
S-layer proteins: General aspects
Relatively small size 25 kDa to 71 kDa.
Basic proteins with high pI between 9,0 y 10,4.
Low content of cysteine and methionine
High content of hydrophobic and hydroxyl amino acids.
No SLH motifs have been detected but the attachment of the S-layer protein to the cell
wall seems to involve also secondary cell wall polymers (SCWP).
Presence of S-layer proteins are strain dependent
Adhesive properties were demonstrated in several lactobacilli S-layers
S-layer proteins of lactobacilli: General features
Proposed or identified adhesive surface proteins of Lactobacillus
S-layer protein
Target Species / Strain Reference
S-layer protein Avian intestinal epithelial cells Lactobacillus acidophilus spp.Schneitz et al., 1993
CbSA Collagens, laminin Lactobacilluscrispatus JCM 5810 Toba et al., 1995
SlpA Fibronectin, human epithelial cell line
Lactobacillus brevis ATCC 8287Hynönen et al., 2002
S-layer protein Red blood cells Lactobacillus kefir CIDCA 8321 Garrote et al., 2004
Red blood cells Lactobacillus parakefir CIDCA 8328 Garrote et al., 2004
SlpA Murine ileal epithelial cells Lactobacillus acidophilus M92Frece et al., 2005
S-layer protein human epithelial cells Lactobacillus helveticus R0052Johnson-Henry et al., 2007
S-layer protein Mammalian epithelial cell Lactobacillus amylovorus spp.Jakava-Viljanen et al., 2007
S-layer protein Sacharomyces lipolytica Lactobacillus kefir CIDCA 8315Golowczyc et al., 2009
S-layer proteins of lactobacilli: Adhesive properties
Interacción entre L. kefir y S. lipolytica aisladas de gránulos de kefir
Golowczyc et al, 2009Actividad tipo lectina de la capa S (inhibición de la coagregación con levaduras en presencia de periodato o azúcares)Inhibición de la hemaglutinación por pérdida de capa S
Distribución diferencial de bacterias en el colon
Adaptado de Swidsinki et al. 2009
FISH
Sykora J, Valeckova K, Amlerova J, Siala K, Dedek P, Watkins S, et al. Effects of a specially designedfermented milk product containing probiotic Lactobacillus casei DN-114 001 and the eradication ofH. pylori in children: a prospective randomized double-blind study. J Clin Gastroenterol 2005;39:692.
Ooi & Liong. Cholesterol-Lowering Effects of Probiotics and Prebiotics: A Review of in Vivo and in Vitro Findings. Int. J. Mol. Sci. 2010, 11, 2499-2522
Martín A. Humen,Graciela L. De Antoni, Jalil Benyacoub, María E. Costas, Marta I. Cardozo, Leonora Kozubsky, Kim-Yen Saudan, Angele Boenzli-Bruand, Stephanie Blum , Eduardo J. Schiffrin, and Pablo F. Pérez1,2*Lactobacillus johnsonii La1 Antagonizes Giardia intestinalis In Vivo. Infect Immun. 2005 73(2): 1265–1269.