Download - Eléments Génétiques Mobiles
Les éléments mobiles sont des fragments d’ADN insérés dans le génome d’un organisme hôte, qui ont la propriété de se déplacer d’un point à un autre du génome: on dit « de transposer » à l’intérieur de la même cellule.
On peut les classer en deux groupes chez les bactéries :
- les transposons
- les plasmides
Eléments génétiques mobiles
Les plasmides
Molécules d'ADN circulaire
� Extrachromosomiques
� Réplication autonome
� Transmis de façon stable au cours des divisions cellulaires
� Non indispensables à la bactérie-hôte
� Confèrent à la bactérie-hôte une grande souplesse génétique
� Présents chez la plupart des espèces bactériennes
� Très différents les uns des autres
� Taille variable entre 1 à 400 kb
Les plasmides : caractéristiques générales
Association modulaire de gènes regroupés en unités fonctionnelles.� Les gènes impliqués dans la réplication
• Un plasmide est un réplicon, il possède donc un système de réplication autonome, lui permettant de se maintenir à un taux constant dans les cellules au cours des divisions successives.
• Ce système de régulation est à l'origine du phénomène d'incompatibilité et du contrôle du nombre de copies plasmidiques dans la cellule bactérienne.
• Des plasmides incompatibles ne peuvent coexister dans la même cellule,car leur réplication est soumise au même système de régulation.
• Les plasmides sont ainsi classés en groupe d'incompatibilité ou groupe Inc.
• Des plasmides appartenant au même groupe d'incompatibilité présentent de fortes homologies ADN/ADN et sont fortement apparentés structuralement.
Propriétés des plasmides
� Les gènes de transfert : les plasmides conjugatifs• Un plasmide conjugatif : plasmide autotransférable d'une bactérie à une
autre par conjugaison.• Taille > 30 kb chez Escherichia coli 90 kb - 30 à 50 kb gènes tra.• Nombre de copies faible : 1 à 3 par cellule.• L'ensemble des gènes nécessaires à la conjugaison chez F sont organisés
en opéron : l'opéron tra.• Codent pour :
les pili sexuelsles protéines nécessaires à la conjugaison
• Transfert :Interspécifique, intragénérique, « hétérogrammique »
• Conséquence : rôle très important dans la dissémination de l'information génétique.
Propriétés des plasmides
Les plasmides non conjugatifs : non autotransférables
Taille plus petite : 1 à 70 kb
Souvent cryptiques
Contrôle relâché de la réplication : nombre de copies > 10
Mais il peuvent être transférés à une autre bactérie par :
• transduction
• mobilisation
Plasmides non conjugatifs
Les gènes impliqués dans la réplication
oriR
rep
Plasmide
oriRoriR : origine de réplication: origine de réplication reprep : gènes de réplication: gènes de réplication
Les gènes de transfert : les plasmides conjugatifs
oriRoriR : origine de réplication: origine de réplication reprep : gènes de réplication: gènes de réplication opéronopéron tratra : opéron des gènes de transfert: opéron des gènes de transfert
oriR
rep
Plasmideconjugatif
opéron tra
oriR
Les gènes conférant des propriétés nouvellesaux bactéries
oriRoriR : origine de réplication: origine de réplication reprep : gènes de réplication: gènes de réplication opéronopéron tratra : opéron des gènes de transfert: opéron des gènes de transfert
Plasmide R
conjugatif
gène(s)de résistance
ou de virulence
opéron tra
rep
Les gènes de résistance aux antibiotiques
Les plasmides de résistance aux antibiotiques ou plasmides R, découverts dans les années 1950.
Plasmides retrouvés dans toutes les espèces bactériennes, à l'exception deStreptococcus pneumoniae.
C'est de loin le support génétique le plus fréquent de la résistance aux antibiotiques.La résistance plasmidique concerne la quasi-totalité des antibiotiquesLa résistance est liée à la synthèse de protéines nouvelles et non à une modification
des constituants bactériens normaux(mutation chromosomique) :
. altération de la cible de l'antibiotique (sulfamides)
. modification du transport de l'antibiotique (tétracycline)
. inactivation de l'antibiotique (ß-lactamines, aminosides)
. substitution de la cible de l'antibiotique (macrolides)
Les gènes conférant des propriétés nouvelles aux bactéries
Genres ou espèces bactériennes portant des plasmides de résistance aux antibiotiques
Bactéries à Gram négatif EnterobacteriaecaePseudomonasAeromonasVibrioHaemophilusAcinetobacterBordetellaPasteurellaYersiniaCampylobacterBacteroidesNeisseria gonorrhoeaeNeisseria meningitidis
Bactéries à Gram positif
ActinomycesBacillusClostridiumListeriaStreptococcus sp.Enterococcus sp.Lactococcus sp.Staphylococcus sp.Lactococcus sp.Staphylococcus sp.
Les gènes de virulence- Etudiés surtout chez les entérobactéries (Escherichia coli, Shigella, Yersinia,
Salmonella), mais également chez des bactéries à Gram positif (Staphylococcus aureus, Bacillus anthracis).
- Plasmides de grande taille : > 200 kb.Exemples :
Le plasmide de virulence de Shigella code pour les protéines permettant à la bactérie de se multiplier dans les cellules de la muqueuse digestive.Certaines hémolysines sont localisées sur des plasmides.Toxine LT ou ST chez E. coli entérotoxinogène.Facteurs d'adhésion.
Les gènes conférant des propriétés nouvelles aux bactéries
Ce sont des facteurs non indispensables à la vie de la bactérie.Cause d'erreur pour l'identification des souches.Sont d'un grand intérêt sur le plan biotechnologique, car peuvent
dégrader des produits chimiques.
Les gènes conférant des propriétés nouvelles aux bactéries
Les gènes métaboliques
Les transposons
� Séquence d'ADN capable de promouvoir leur translocation
- d'un réplicon sur un autre : transposition intermoléculaire
- sur le même réplicon : transposition intramoléculaire
La transposition
- Séquences d'ADN capables de changer de localisation dans le génome sans jamais apparaître à l'état libre
- Les transposons ne peuvent se répliquer mais codent pour les déterminants de la transposition et ceux d'autres fonctions (résistance aux antibiotiques)
- La transposition: mécanisme d'évolution rapide consistant dans l'addition pure et simple de gènes (ADN) de taille définie au sein d'un génome (chromosome / plasmide) et en l'absence d'homologie de séquence nucléotidique (recombinaison illégitime).
Définition des transposons
- Première évocation de gènes mobiles venue d'expériences de génétique chez le maïs (Mcclintock 1951).
- Lors de caractérisation des plasmides, il a été observé d'étranges recombinaisons de gènes de résistance aux antibiotiques:
Découverte des séquences IS (insertion sequences) en 1968 dans l’opéron galde E. coli, puis d’un transposon poteur de la résistance à l’ampicilline chez P.aeruginosa en 1971.Le gène amp, s'accompagnait du même accroissement de taille du plasmide receveur, preuve directe d'une addition de matériel génétique (10 kb)(1974).
Découverte des transposons chez les bactéries
Caractéristiques générales
- Événement rare (10-5 à 10-6).
- Absence d'homologie entre les ADN interagissant.
- Indépendante des fonctions de recombinaison de la bactérie-hôte (protéine RecA).
- Peut théoriquement s'intégrer n'importe où. Cependant certaines régions riches en A+T, entraînant une certaine conformation de l'ADN-cible, constituent des points chauds d'insertion.
- Multicopies dans certaines bactéries: exemple: 5-10 copies de IS1 dans E coli, 40 copies dans Salmonella.
La transposition
Transposition
TnTnTn
Tn
P1
P2
Chromosome
Classification- Les séquences d'insertion.
- Les transposons composites.
- La famille Tn3.
- Les transposons conjugatifs.
Les transposons
tnp
IR IRIS
Séquences d'insertion
IS : séquence d'insertionIR : séquence inversée répétéetnp: transposase (endonucléase spécifique + intégrase)
- Éléments transposables les plus simples, très répandus chez les bactéries à Gram négatif (entérobactéries)
- Plusieurs copies intégrées dans le chromosome ou dans un plasmide.
- Structure moléculaire: taille ( 700 et 5700 bp). Flanquées de 2 séquences inversées répétées plus ou moins parfaites (IR), indispensables pour la transposition et affines de facteurs de transposition.
- La longueur de la séquence cible génomique est variable d’une IS à l’autre, pas de séquence consensus.
?+
( )
( )?
+
Tn
?
ADN Cible
Tn
tnpA tnpR bla
SRIIR IR
Transposons de type Tn3
IR : séquence inversée répétée et tnpA, gène codant pour la transposase
tnpR : gène codant pour la résolvase SRI: site de résolution interne
bla : gène de résistance aux ß-lactamines
Très nombreux chez les bactéries :
- à Gram négatif : Tn3 (4.9 kb, ApR), Tn4 (20 kb, ApR, SmR, SuR), Tn1721 (10 kb,TcR)
- à Gram positif: Tn551 (5.3 kb, EmR), Tn917 (5.2 kb, EmR)
Tnp
IR IRIS
tnp
IR IRIS
Transposons composites
IS : séquence d'insertionIR : séquence inversée répétéetnp : transposase
Fragment d'ADN :gène de résistance aux antibiotiques, gène de virulence,gène métabolique
Très nombreux chez les bactéries à Gram négatif :. Tn5 (5,7 kb, KmR). Tn9 (2,6 kb, CmR). Tn10 (9,3 kb, TcR)
cat chloramphénicoltet tétracyclineKm kanamycine
Insertions- dans une phase codante : interruption de la phase, polypeptide tronqué.
- en amont d'un gène dans une zone régulatrice : dérégulation •soit transcription inhibée (éloignement entre promoteur et séquences
activatrices ou destruction de ces dernières, •soit transcription activée (promoteur propre faible, remplacé par un
promoteur fort présent à l'intérieur du transposon); ceci peut conduire à l'induction ectopique (ectopique = autre lieu) de la transcription (dérégulation spatio-temporelle).
Inversions ou délétions
affectant les portions de génome situées entre deux éléments transposables :
•dans la même orientation : délétion •en orientation opposée : inversion
Types de mutations causées par les transposons
Transposons conjugatifs
fonction tra+ tetM xis-Tn int-tn
xis-Tn : gène codant pour l'excisionaseint-Tn : gène codant pour l'intégrasetetM : gène codant pour la résistancefonction tra+ : gènes nécessaires au transfert
Détectés chez les bactéries à Gram positif :
. Tn916 (E. faecalis, 16 kb, TcR)
. Tn1545 (S. pneumoniae, 25 kb, KmR, EmR, TcR
Tn1545 et transposons apparentés
Tn91618 kb Tra+
Hc Hc Hc Hc Hc
2324 22 21 20 19 17 16 15 14 13 6 9 7 int-Tnxis-TntetM18 812
Hc
oriT10
Tn154525,3 kb Tra+
Hc Hc Hc Hc Hc
6 9 7 int-Tnxis-TntetM 812
Hc
10ermAMaphA
Mobilités intra- et intercellulaire de Tn1545 et des éléments apparentés
Chromosome
Plasmide
Intégration(Int)
Excision(Xis +Int) Intégration
(Int)
D o n a tric e R é c e p tr ic ex
Transfert(tra)
Tn1545
Spectre d'hôte des transposons conjugatifs
Bacillus spp.Clostridium spp.Enterococcus spp.Lactococcus spp.Listeria spp.Staphylococcus spp.Streptococcus spp.
Escherichia coliPseudomonas fluorescens
potentiel donneur de Tn916
- Les transposons constituent un génome collectif ou un patrimoine génétique commun, dans lequel puissent les bactéries en fonction de leur nécessité d'adaptation ou de la pression de sélection
- Ces éléments sont la preuve du "génie génétique in vivo : Création de mutations nouvelles, de recombinaisons, de réarrangements des génomes. Ils contribuent au polymorphisme.
- Mutations: modulation de l'expression d'un gène.- Réarrangements: insertion, inversions, délétions…
Rôle et intérêt des transposons
Modes de transposition
• par l’intermédiaire d’une coupure simple brin (transposon procaryotes: Mu, Tn3). Les extrémités 3’OH libérées peuvent servir d’amorce à la réplication. Une réplication semi-conservative a lieu pendant la transposition (cf l’exemple de Tn3).
Excision de l’élément transposable •parfaite : par recombinaison entre les séquences cibles (qui sont en orientation directe), restauration de la séquence sauvage, avec une seule séquence cible. •imparfaite : par recombinaison sur les LTRs (ex: Ty), une LTR reste au site d'insertion entre deux séquences cibles qu'on appelle LTR solo. •imparfaite : par cassure double brin et réparation imparfaite (ex: élément P), délétion de matériel génomique de part et d'autre du point d'insertion •réarrangement : addition de matériel génomique inconnu
Recombinaison •entre 2 éléments situés sur des chromosomes non homologues : translocation
•entre 2 éléments non alléliques mais situés sur des chromosomes homologues : translocation.
Conversion géniqueModification de la séquence d'un élément transposable par copie de la séquence d'un autre élément transposable du même type situé ailleurs dans le génome.
Extraction et purification de l'ADN plasmidiqueMini préparation par la méthode de la lyse alcaline.
- Lyse des bactéries.- Dénaturation de l'ADN par action combinée de la soude et du SDS.- Renaturation de l'ADN plasmidique et précipitation de l'ADN
chromosomique.
Ultracentrifugation en chlorure de césium bromure d'éthidium.
Analyse du contenu plasmidique par électrophorèse en gel d'agarose.- Digestion par des enzymes de restriction : profil de restriction.- Transfert selon la technique de Southern et hybridation avec des sondes
spécifiques.
Méthodes d'études des plasmides (1)
Cure et transfert de l'ADN plasmidiqueCure plasmidique : élimination du plasmide de la bactérie qui l'héberge.
- Cure spontanée, événement rare.- Cure chimique avec des produits qui vont inhiber sélectivement la
réplication plasmidique ou interférer avec la ségrégation de ces molécules (agents intercalants).
- Cure thermique.
Transfert- Conjugaison à une bactérie réceptrice.- Transformation.
Méthodes d'études des plasmides (2)
TRANSFORMATION
Extraction de l'ADN plasmidique
Sélection Km (ou Ap, Sm, Tc)
Phénotype : (Ap, Km, Tc)Souche : T1 (transformant 1)
Bactérie sauvage (WT)P1
P3P2
p1 : plasmide conjugatifApKmTc
P2 : plasmide non conjugatifSmSu mobilisable par p1
P3 : plasmide non conjugatif Apnon mobilisable par p1
P1
Bactérie sauvage (WT)
P1P2P3
+ Réceptrice compétente
P3P2
(Sm, Su)T2
(Ap)T3
Kmou Apou Tc Sm Ap
antPintI1
attI+
antP
ant1R+
resistance gene 1
integrase gene
Int
resistance gene 2
Int
Les Intégrons : des structures qui permettent une construction modulaire des plasmides de résistance