ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL:
DETECCIÓN POR CITOMETRÍA DE FLUJO
Bioq. Elisa Sajaroff
Laboratorio de Inmunología Celular Servicio de Inmunología y Reumatología
Hospital de Pediatría Dr.J.P.Garrahan
ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL (EMR)
DEFINICIÓN: DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE CANTIDADES MÍNIMAS DE BLASTOS (NO DETECTABLES POR OBSERVACIÓN MORFOLÓGICA) EN MÉDULA ÓSEA.
MÉTODOS DISPONIBLES:
CITOMETRÍA DE FLUJO
BIOLOGÍA MOLECULAR
EMR: MÉTODOS DISPONIBLES
Citometría de flujo (CF) Biología molecular
Fundamento -Inmunofenotipo aberrante. -Rearreglos de Ig/TCR.
-Genes de fusión
Ventajas -Cuantificación directa.
-Menor cantidad de células.
-Más económico. Resultados más rápidos
-Mayor sensibilidad.
-Target paciente específico.
Limitaciones -Posibles falsos negativos por cambios inmunofenotípicos.
-Sensibilidad limitada.
-Posibles falsos negativos por pérdida del target.
-Mayor cantidad de células.
-Muy laborioso.
EMR por citometría de flujo (CF) La identificación de los blastos se basa en su
inmunofenotipo diferente al de la célula normal de médula ósea.
FENOTIPO ABERRANTE DE LOS BLASTOS
ASINCRONISMO MADURATIVO
ANTÍGENOS DE OTRO LINAJE
NIVEL DE EXPRESIÓN ANTIGÉNICA DIFERENTE
AL NORMAL
LLA-B: CD20+CD34+
LLA-B: CD13+CD33+ CD117+
LLA-T: CD79a+CD33+
LLA-B: SUB-EXPRESIÓN CD10, CD45, CD38 SOBRE-EXPRESION CD10, CD58, CD19
LLA-T:
SOBRE-EXPRESIÓN CD99, CD7
SUB-EXPRESIÓN CD3, CD5
EXPRESIÓN ECTÓPICA
LLA-T CD3CITO+Tdt+
Detección de eventos poco frecuentes por CF:
DEPENDE DE DOS VARIABLES:
* Diferencia fenotípica entre blastos y células normales
* Número de células analizadas.
SENSIBILIDAD:
*Condiciones ideales (células con inmunofenotipo muy
diferente y adquiriendo > 107 células): 1 en 106
*Habitualmente: 1 en 104 / 105
Que debemos saber antes de hacer EMR: 1. Inmunofenotipo normal de células hematopoyéticas en médula ósea.
2. Inmunofenotipo de la leucemia al debut.
Panel para EMR LLA-B en 4 colores
Tubo FITC PE PerCP APC
1 Syto-16 CD10 CD45 CD19
2 CD20 CD10 CD34 CD19
3 CD58 CD10 CD45 CD19
4 CD10+
CD20
CD38 CD45 CD19
Tubo
FITC PE PerCP PE-Cy7
APC APC-H7
1 Syto-16
CD10 CD45 CD19
2 CD20 CD10 CD34 CD19
CD45
3 CD58 CD10 CD45 CD34
CD19 CD45
4 CD10+
CD20
CD38 CD45 CD34
CD19
Panel para EMR LLA-T en 4 colores
Tubo FITC PE PerCP APC
1 Syto-16 CD7 CD45 CD3
2 CD99 CD7 CD5 CD3
3 Tdt CD7 CD3 CITO
CD3
4 CD4 CD8 CD45 CD3
Perfil normal de expresión antigénica en MO. Linaje linfoide B.
Diagnóstico Día 15 Día 33
Sem 12 MO normal
M.O. Normal linaje B regenerativo
LLA-B día 15
Blastos CD45 negativo-tenue y CD38 negativo, ambos hallazgos aberrantes.
M.O. Normal LLA-T dia 15
Los blastos muestran > expresion de CD99 y CD7 que los normales y CD3 superficie parcial
Normal #1 Normal #2
LLA-B dia 33 Negativa,
solo se observan LB
maduros.
Ejemplo de día 33 sin blastos
Médula regenerativa con blastos
Médula regenerativa con blastos
CAMBIOS INMUNOFENOTÍPICOS: 16/31 casos (2010) (52%)
<CD34 >CD20 >CD45
PORQUE HACER EMR EN LLA?
Asignación de grupos de riesgo (GR) en LLA
pediátrica
Edad
Características biológicas al Dx WBC Alteraciones citogenéticas y/o moleculares Rta. a la prednisona en SP MO día 15
Respuesta temprana al tratamiento -Protocolo ALLI-2002 Morfológica (<5%, 5-25%, >25%) - Protocolo ALLIC-2009 EMR por CF al Día 15 (<0.1%, 0.1-10%, >10%)
Estratificación en grupos de riesgo ALLIC 2009
Diagnóstico y Día 8
Edad 1 - 5 años WBC < 20000/ul
Blastos D8 1000/ul
Edad <1 y 6 años ó WBC 20000/ul
Blastos D8 1000/ul
Blastos D8 1000/ul t (9;22) ó t(4;11) ó
hipodiploidía < 45Cr
EMR D15 <0.1% >0.1 y <10% >10%
RIESGO ESTÁNDAR
<10% >10%
RIESGO INTERMEDIO
RIESGO ALTO
Todos los resultados
Cosas importantes a tener en cuenta:
Muestra: sangre periférica vs MO
Momento del tratamiento.
Método
Impacto pronóstico
APLICACIONES CLÍNICAS DE LA EMR
OBJETIVO
Evaluar el impacto pronóstico de la determinación de EMR por CF al día 15 en los pacientes de AEIOP 2000 en los que se asignó grupo de riesgo por BM D33 y D78.
% ptes. % MRD SLE 5 años
IAR 5 años
GR
42% <0.1% 89.9 % 7.5% RS
47% 0.1-10% 79.3 % 17.2% RI
11% ≥10% 46.1 % 47.2% RA
Determinación de los valores de EMR CF para la asignación de GR
EMR por CF al día 15 en MO
Identificar pacientes con alto y bajo riesgo de recaída
Ajustar la intensidad del tto para evitar la recaída
• EMR al Dia 15 por CF factor pronóstico
independiente más importante disponible en
este momento del tto.
• En un análisis multivarianza la EMR por CF al
día 15 ≥10% resultó ser un factor de riesgo
de recaída independiente aún en los
pacientes que habían sido estratificados en
base a la EMR por BM al día 33 y 78.
Resumiendo…
Riesgo estándar EMR <0.1% RE
EMR 0.1-10% RI
EMR >10% RA
Riesgo intermedio EMR <10% RI
EMR >10% RA
Riesgo alto cualquier valor EMR RA
ALLIC 2009 (Acute Lymphoblastic Leukemia Intercontinental
2009)
EMR por CF es incorporada como criterio de estratificación sólo después de que haya
sido estandarizada y evaluada para los laboratorios participantes.
PAUTAS ALLIC 2009
PAUTAS ALLIC 2009 para obtener la habilitación del laboratorio para EMR-CF
*Monitoreo Intralaboratorio: -Control estricto de calibración y mantenimiento del citómetro. -Estandarización de metodologías.
*Monitoreo Interlaboratorios: -Entrenamiento: Transferencia de pautas de trabajo en el laboratorio sponsor AIEOP-BFM -Control de calidad: I.-Los laboratorios participantes deben completar exitosamente 2 rondas de análisis de datos. II.- Control de calidad externo UK-NEQAS. III.-Control de resultados de EMR en laboratorio sponsor:
-Envío copia del análisis y resultado alcanzado de EMR D15. -Evaluación por el sponsor. -Conclusión final del análisis y ratificación del resultado.
Pautas ALLIC 09. Marcación y adquisición.
• Muestra: Médula ósea del Día 15.
• Marcación y adquisición:
– Marcación seguida de lisis ( salvo en casos de hipocelularidad extrema donde se lisa primero).
– Adquirir al menos 300000 células nucleadas (cél syto +), y que representen el 30% de la celularidad de la médula (%syto+ ≥30%)
– Cargar al menos 700,000 céls/tubo.
– Nosotros normalmente marcamos 2x106 cél para adquirir 1x106 cells
Criterios evaluabilidad:
1. Eritroblastos >2% (células syto+CD45- FSC/SSC
adecuado)
2. Syto + >30% y >300000 células nucleadas
3. Cluster EMR de al menos 30 células (30 cél
patológicas en 300000 totales para alcanzar la
sensibilidad de 0,01% requerida para la EMR)
Reporte • Identificación del paciente
• Panel utilizado,
• # y % células nucleadas,
• % eritroblastos,
• % EMR.
• Si hay discrepancia en el valor entre los
tubos, se reporta el valor más alto del tubo
donde se ve con mayor claridad la población.
Nuestra experiencia
RESULTADOS – (Presentado en BFM, Kiel, 2013) EMR AL DÍA 15 por CITOMETRÍA DE FLUJO
EMR D15 ALLIC-09 (pac elegibles n=163, jul´11-mayo 13)
n (%) Pacientes (n) reasignados de GR por EMR D15 CF
No evaluables 8 (5)
< 0.1% 43 (26.5)
≥ 0.1-10% 87 (53.7) 19
≥ 10% 24 (14.8) 10 (8 RI a RA y 2 RE a RA)
La EMR D15CF permitió reasignar a 29 pacientes (18%) a un grupo de mayor riesgo con la consiguiente
adecuación de la intensidad del tratamiento.
Asignación de Grupos de Riesgo
GR
inicial
(n)
GR con
EMR (n)
% GR
GRE 38 17 10.4
GRI 96 107 65.7
GRA 29 39 23.9
Demográfica de los grupos de riesgo
GRE
(n=17)
GRI
(n=108)
GRA
(n=39)
B-ALL 17 (100%)
14 com
3 preB
100 (93%)
3 undetermined
3 BI, 70 BII
23 BIII, 1 B IV
22 (56%)
2 BI, 14 BII
4 BIII
2 Bcp with eos
T-ALL 0 7
2 TI
5 TIII
1 early
17
1 TI , 1 TII
8 TIII, 6 TIV
1 early
LALA 0 1
B-My
0
Grupo de alto riesgo (n=31)
• Por Biología molecular/citogenético (n=9) • 2 t(5;14) (EMR<10%)
• 4 BCR-ABL (1 con EMR>10%)
• 3 MLL rearreglado (EMR 2>10% y 1<0,1%, 2 con MRP)
• Por mala rta a la prednisona (n=16)
• 9 con EMR>10%
• 6 con EMR 0,1-10%
• 1 con EMR detectable <0,1% • (Marian y paiva mll con mala rta, estan en bm)
• Por EMR >10% (n=6)
Nivel de EMR durante el tto
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Día 15 Día 33 Sem 12
no evaluable >10% 0.1-10% <0.1%
PROTOCOLO PILOTO
• Noviembre 2009 a Junio 2011 (Sólo HPG)
• PACIENTES INGRESADOS: 130
• PACIENTES ELEGIBLES: 105
– 19% CAMBIO GRUPO DE RIESGO POR EMR D15
– 20% DE RECAÍDAS
pSLE global del PILOTO
pEFS (SE) (n=105): 72 (5)%
pSLE en los GR del PILOTO
GRE (n=15).pEFS (SE): 100 (0)%
GRI (n= 64).pEFS (SE): 74 (7)%
GRA (n=26).pEFS (SE): 50 (10)%
p-value: 0.0006
Análisis de las recaídas según EMR día 33 y 78
• EMR+(CF y/o Rq-PCR, día 33 y/o 78) >0,1%
• 27 casos • Recaídas: n=13
• EMR– (CF y/o Rq-PCR, día 33 y/o 78) <0,1%
• 78 casos • Recaídas: n=7
p<0,00001
pSLE según EMR+/- (día 33, CF y/o Rq-PCR n= 103)
MRD + (n=26): pEFS (SE): 44 (10)%
MRD – (n=77): pEFS (SE): 82 (5)%
Log-rank test: p= 0,0001
Análisis de concordancia al día 33 y 78 en la EMR por CF y BM (cut off 0.01%)
n=24
0.000
0.001
0.010
0.100
1.000
10.000
100.000
0.000 0.001 0.010 0.100 1.000 10.000 100.000
FC MRD
RqP
CR
MR
D
n=29 R2=0.8579
n=11 (9<0.1%)
n = 182 179 neg/neg
PAUTAS INDISPENSABLES PARA LA PUESTA A PUNTO DE LA EMR
• Estandarización metodológica.
• Entrenamiento y desarrollo de criterio adecuado
del operador.
• Conocimiento del inmunofenotipo normal de
células hematopoyéticas en médula ósea.
• Panel completo al diagnóstico que permita definir
el panel de seguimiento.
• Evaluación de posibles cambios fenotípicos.
La EMR por CF:
•Especialmente útil en etapas tempranas del
tratamiento.
•Es indispensable para la correcta adecuación del
tratamiento en los protocolos actuales de LLA.
CONCLUSIONES
Algunos casos clínicos
Ojo syto+ < 30% y < 300000 eventos syto+ La muestra es no evaluable!!! la EMR lo reasignaría a un grupo de mayor Riesgo. EMR=0,07*100/22,2= 0,32%
Al repetir syto 60,3% y 424501 eventos syto+ EMR = 0,2*100/60,3= 0,33% Ahora podemos informar este resultado!
Day 0
Day 15
Syto 88,1%
EMR
5,8*100/88,1=6,67%
Day 33
EMR D33
0,04*100/79,3=0,05%
Day 78
EMR D78=
0,03*100/66=0,045%
Day 15 Syto 97% - 679343 events styo+ Normoblasts 49% - MRD 0.71%
Day 33 Syto 73% 736174 events styo+ Normoblasts 37% MRD % 0.04%
Hospital de Pediatría Dr. J.P. Garrahan Servicio de Inmunología y Reumatología Dr. Ricardo Russo Laboratorio de Inmunología Celular
Bioq. Jorge Rossi Bioq. Andrea Bernasconi Téc. Marianela Sanz Bioq. Elisa Sajaroff Bioq. Carolina Carrara
Muchas gracias por su atención…