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Evangelina Agriello
Bahía Blanca
Enfermedad residual mínima por Citometría de Flujo
Multiparamétrica en Leucemia Linfocítica Crónica
72º CONGRESO ARGENTINO DE BIOQUÍMICA, ABA
22 al 25 de agosto de 2017, CABA,
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UTILIDAD DE LA EMR EN LLC
• Evaluar la respuesta a la terapia
• Identificar la cinética de la depleción tumoral
• Identificar la recaída
• Surrogate en ensayos clínicos y post transplante alogénico
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Objetivo ACTUAL alcanzado por los Métodos de análisis de la EMR
Erradicación completa
de la LLC
Erradicación completa
de la LLC
Remisión clínica con ausencia de
EMR
en sp y mo
Erradicación completa
de la LLC
Remisión clínica con ausencia de
EMR
en sp y mo
<1 célula de LLC en 10000
leucocitos normales
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Requerimientos actuales de los Métodos
PARA LA DETERMINACION de la EMR
ESTANDARIZABLE
Alta
específicidad
Alta
sensibilidad
Alta reproducibilidad
interlaboratorio
Independiente del tratamiento
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Métodos actuales de análisis de EMR
ASO IGH RQ-PCR
Citometría de flujo
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Análisis comparativo de Citometría de flujo vs ASO IGH RQ PCR gcllsg cll8 TRIAL
CF & PCR demuestran ser comparables para la cuantificación de EMR
con una sensibilidad de 10-4
PCR alcanza menores valores de EMR (<10-4 )
Bottcher et al .,Leukemia, 2009
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ASO IGH RQ-PCR
Diseño paciente específico
Muy laborioso
Alto costo
Análisis de cada paciente
al diagnóstico
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APLICABILIDAD TECNICA DE EMR
Técnica ASO IGH RQ-PCR
Citometría de
Flujo
Multiparamétrica
Sensibilidad
analítica
10-4
– 10-5
10-4
Aplicabilidad ~80%
>90%
Experiencia ++
++
Costo ++
+
Tiempo de proceso semanas 1 o 2 días
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APLICABILIDAD TECNICA DE EMR
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It is an independent scientific consortium that aims at innovation and standardization of flow cytometric immunophenotyping to
further improve and progress diagnostic patient care
JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907
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Citometría de Flujo Multicolor (8 colores) con Estandarización técnica completa
Seteo del instrumento Protocolos de Inmunofenotipificación (SOPs) Paneles que definen diagnósticos precisos
Desarrollo de nuevo software: Combinación de multiples tubos: cálculo y vista APS Mapeo de muestras de leucemias de diagnóstico y follow-up contra
templados de muestras “normales/control”
Desarrollo de protocolos a 8-colores para diagnóstico, clasificación y monitoreo de enfermedades hematológicas
Paneles diseñados para contester una pregunta clínica específica
JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907
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INSTRUMENT CONFIGURATION FACSCANTO II,
3 LASERS (4-2-2), BECTON DICKINSON
VIOLET LASER 425/50 525/50
405 nm Pacific Blue Pacific Orange
BD Horizon V450 BD Horizon V500
BLUE LASER 530/30 576/26 695/40 780/60
488nm FITC PE PerCP-Cy5.5 Pe-Cy7
RED LASER 660/20 780/60
633nm APC APC H7
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Standard Operating Protocol SOP PARA EL
SETEO DEL INSTRUMENTO
Umbral: fijo a 10.000
Ajustar el voltaje para lograr el valor target medio para la ventana de la población linfoide
FSC:55000
(rango: 50000-60000)
SSC: 13000
(rango: 11000 – 15000)
50ul SP+2ml FACS Lysing + lavado con PBS – BSA
Seteo de FSC y SSC (FACSDiVa software)
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APS Automatic Population Separator
LT CD8
LT CD4
Monocitos
Linfocitos T CD4+
Linfocitos T CD8+
Linfocitos B CD19+
Monocitos
•FSC •SSC
•FL1 •FL2 •FL3 •FL4
•FL3 •FL6 •FL7 •FL8
M5 M4 M3 M2
M1
M6
12 archivos fusionados de 2 centros
CD20+4/CD45/L+CD8/K+CD56/CD5/CD19/CD3/CD38
MFI (CV < 15%)
Centro A Centro B
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Results of the Euroflow QA programme 6th round, on May 2015
CD5 CD19 CD8 T cell CD4 T cell B cell
CD5 CD19 CD8 T cell CD4 T cell B cell
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Panel
standard International
4 colores consumen tiempoLeukemia (2007) 21, 956–964
κ λ CD19 CD5
CD20 CD38 CD19 CD5
CD81 CD22 CD19 CD5
CD43 CD79b CD19 CD5
CD45 CD14 CD19 CD3
Rawstron et al., Leukemia, 2007
Diseño de combinaciones de
marcadores dirigidos contra el
fenotipo aberrante de las
células patológicas
Control de contamination: LT y Mo
Determina el límite de detección
La menor variabilidad
interlaboratorio entre las
combinaciones testeados
Marcadores troncales
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4 colores
κ λ CD19 CD5
CD20 CD38 CD19 CD5
CD81 CD22 CD19 CD5
CD43 CD79b CD19 CD5
CD45 CD14 CD19 CD3
6 colores
CD19/CD5/CD20/CD3/CD38/CD79b
CD19/CD5/CD20/CD81/CD22/CD43
8 colores
CD19/CD5/CD20/CD3/CD81/CD79b/CD22/CD43
ericll.org/projects
discriminación de
LLC de linfocitos B
normales
Leukemia (2013) 27, 142–149
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4 colores
κ λ CD19 CD5
CD20 CD38 CD19 CD5
CD81 CD22 CD19 CD5
CD43 CD79b CD19 CD5
CD45 CD14 CD19 CD3
6 colores
CD19/CD5/CD20/CD3/CD38/CD79b
CD19/CD5/CD20/CD81/CD22/CD43
8 colores
CD19/CD5/CD20/CD3/CD81/CD79b/CD22/CD43
TUBE BV421 BV510 FITC PE PerCP-Cy5.5
PECy7 APC APC-C750
v7-1 CD27 CD3 CD79b CD5 CD22 CD19 CD200 CD81
v7-2 CD27 CD3 CD79b CD5 CD20 CD19 ROR1 CD81
ERICLL
discriminación
de LLC de
linfocitos B
normales
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Conclusión
Aunque ASO IGH RQ- PCR logra mayor sensibilidad de detección (hasta1cel tumoral en 10
6 leucocitos), requiere mas tiempo, muestra al diagnóstico y
ensayo paciente específico
CFM es la técnica recomendada para EMR por las sgtes razones:
bajo costo
menor tiempo de procesamiento
un marcador de entidad, NO paciente específico
Mas colores, menos células, menos reactivos,
. . .analisis más simple con
Técnicas estandarizadas
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Gracias !!