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COME SI RIVELANO I RADICALI. Come abbiamo visto c un gruppo di radicali persistenti che possono essere ottenuti in alta concentrazione in soluzione, o anche come liquidi o solidi puri. Tali specie possono essere studiate per mezzo di tutte le tecniche convenzionali a disposizione del chimico, il loro spettro infrarosso ed ultravioletto pu essere determinato ed possibile effettuare esperimenti per determinare la suscettibilit magnetica che confermino la presenza di elettroni spaiati. Inoltre i loro spettri EPR possono essere rilevati e da questi possono essere ricavate numerose informazioni sulla loro struttura. La maggior parte dei radicali esiste per come intermedio transiente, che non presente in alta concentrazione. La presenza di intermedi radicalici pu spesso essere dedotta dalla natura dei prodotti di reazione o dallo studio della cinetica della reazione. Alternativamente la reazione pu essere inibita con un radicale persistente che intrappola il radicale transiente. Tuttavia la conferma della presenza di intermedi radicalici attraverso metodi fisici di solito comporta che si generi unalta concentrazione di radicali per irraggiamento con una luce molto intensa, o che si prepari il radicale per trasferimento elettronico con uno ione di un metallo di transizione che sia presente in alta concentrazione. In questo modo la flash fotolisi (Flash Photolysis) ha permesso lo studio dello spettro elettronico di numerosi radicali. Altri sono stati studiati allo spettrometro EPR, che permette il rilevamento di specie paramagnetiche, usando sorgenti luminose molto intense.

LA SPETTROSCOPIA EPR

La spettroscopia di risonanza di spin elettronico (ESR electronic spin resonance o EPR electronic paramagnetic resonance) una tecnica che permette lo studio di radicali liberi stabili o persistenti. Essa permette inoltre lo studio delle specie radicaliche transienti che si formano nel corso di una reazione.

CONDIZIONE DI RISONANZA E RILASSAMENTO. Qui di seguito sono descritte succintamente le basi teoriche su cui fondata questa tecnica. Come sappiamo l'elettrone una particella subatomica, che possiede una certa massa ed una certa carica, dotata di un movimento di rotazione attorno a se stessa che viene chiamato spin (trottola). Tale spin pu essere uguale a o a - a seconda del verso in cui ruota lelettrone. A causa della sua rotazione l'elettrone genera inoltre anche un campo magnetico. Nel caso in cui lelettrone venga sottoposto ad un campo magnetico esterno lenergia dei due stati di spin che in condizioni normali sono degeneri, viene modificata a causa dellinterazione del campo magnetico esterno con quello generato dallelettrone. La differenza di energia che si viene a creare tra i due stati di spin uguale a: E = gEEH (1)

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dove H il campo magnetico applicato, E il magnetone di Bohr1 (9,2733 x 10-21 erg/gaus) e gE un numero adimensionale che per lelettrone libero vale 2,0023 e che per gli elettroni in atomi o in molecole (cio non isolati) ha un valore che dipende dallintorno dellelettrone.

Splitting dei livelli di spin di un elettrone in presenza di un campo magnetico H.

Quando lelettrone esposto ad una radiazione elettromagnetica appropriata la cui frequenza soddisfa la condizione di risonanza: h = gEEH = E - E (2) sono possibili transizioni tra i due livelli energetici cio gli elettroni possono assorbire energia per passare da uno stato allaltro. Allo stesso modo irradiando lelettrone con una radiazione di frequenza costante, e variando la forza H del campo magnetico applicato si pu raggiungere il valore che soddisfa la condizione di risonanza. Quando tale condizione soddisfatta, le transizioni possono avere luogo in entrambe le direzioni dando luogo ad assorbimento (EE) o ad emissione (EE) di energia.

i) Segnale EPR (assorbimento) ottenuto a frequenza costante e intensit H del campo

variabile; ii) Derivata prima del segnale di assorbimento EPR. Il fatto che il sistema nel suo complesso assorba o emetta energia verr dunque determinato dalla direzione del maggior numero di transizioni, e poich le due transizioni hanno la stessa probabilit di avvenire, la popolazione dei due livelli e ha 1 Unit fondamentale del momento di dipolo magnetico di un atomo, dato da mb = e(h/2)/2me, dove e la carica dell'elettrone, h la costante di Planck, ed me la massa dell'elettrone. Il momento di dipolo magnetico una grandezza vettoriale che esprime quantitativamente le propriet magnetiche di un atomo dovute al moto orbitale degli elettroni intorno al nucleo.

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unimportanza determinante. Si avr cos assorbimento solo quando la popolazione del livello pi basso (n1) sar pi grande di quella del livello pi alto (n2). La legge di distribuzione di Boltzman predice appunto un leggero eccesso di popolazione nel livello pi basso, cio (n1 n2) > 0 per cui di solito si ha un assorbimento anche se molto piccolo; per aumentare il livello di segnale registrabile, nella tecnica EPR si usa quindi registrare lo spettro di assorbimento come derivata prima. Uno spettrometro EPR consiste essenzialmente di un elettromagnete, il quale permette di variare con continuit il campo magnetico applicato, di un generatore di radiazioni elettromagnetiche che emette microonde in un campo molto ristretto di frequenze, di una cella portacampioni e di un rilevatore che permette di misurare lentit dellassorbimento subito dalla radiazione elettromagnetica. I segnali forniti dal rilevatore vengono registrati in funzione dellintensit del campo magnetico.

PARAMAGNETISMO DI RADICALI ORGANICI.

Nello stato fondamentale dei composti organici stabili sia gli orbitali interni che quelli di legame sono occupati ognuno da due elettroni che differiscono solo per il valore di Ms (gli elettroni si dicono accoppiati e si indicano generalmente con il simbolo ). Lo stato di un sistema un singoletto in quanto ha molteplicit2* 1 ed diamagnetico. Nel caso in cui una molecola organica abbia un orbitale occupato da un solo elettrone spaiato, allora esso si trover in uno stato di doppietto e sar paramagnetica dando luogo ad uno spettro EPR. Il paramagnetismo di tali molecole deriva quasi esclusivamente dallo spin dell'elettrone spaiato, cosicch i loro valori di ge (o pi semplicemente g) differiscono solo di poco da quello tipico dell'elettrone libero (2,0023). Il segnale EPR ben risolto di un radicale organico pu contenere anche pi di cento linee ed per questo che si parla di spettri EPR. La complessit degli spettri dipende dalla interazione dell'elettrone spaiato con i nuclei con numero quantico di spin non nullo presenti nel radicale. Analogamente al caso dell'elettrone infatti, anche i nuclei degli atomi possono possedere un momento magnetico nucleare che dipender dal numero di neutroni e di protoni che contengono che sar associato al numero quantico di spin nucleare I. Il valore di I vale multipli dispari di per nuclei che possiedono un numero di massa dispari: I = 1/2 per 1H, 13C, 19F, 31P; I = 3/2 per 11B, 23Na, 33S, 39K, 63Cu; I = 5/2 per 55Mn; I = 7/2 per 51V, 133Cs, etc. multipli interi di 1 per nuclei che possiedono un numero di massa pari e carica nucleare dispari: I = 1 per 2H, 14N; I = 3 per 10B, etc;

2 La molteplicit di una molecola: Un singoletto una molecola con un'unica funzione d'onda e che non ha elettroni spaiati. Un doppietto e un tripletto hanno funzioni d'onda che possono essere scritte in due e tre modi, rispettivamente come conseguenza della presenza di uno o due elettroni spaiati. In generale il numero di elettroni spaiati +1 corrisponde alla molteplicit della molecola.

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mentre nuclei con numero di massa pari e carica nucleare pari sono privi di momento magnetico nucleare avendo un numero quantico di spin nullo: I = 0 per 12C, 16O, 32S, etc. Linterazione dellelettrone spaiato con uno o pi di questi nuclei sdoppia il segnale che deriva dallelettrone. Il numero di linee che vengono ottenute dallinterazione con n nuclei equivalenti sono date dallequazione: numero di linee = 2 n I + 1 dove I il numero quantico di spin nucleare e n il numero di nuclei equivalenti che interagiscono. In figura sono riportati i diagrammi che mostrano l'interazione tra l'elettrone spaiato con atomi aventi spin non nulli.

Splitting di un segnale ESR originato dall'interazione dell'elettrone spaiato con un nucleo

avente numero quantico di spin I = (a sinistra o I = 1 a destra). La separazione tra le righe si chiama costante di accoppiamento ed caratteristica di ogni nucleo in ogni composto radicalico (in pratica unindicazione di quanto un particolare nucleo interagisca con l'elettrone spaiato). Lo spettro riportato nella parte sinistra della figura pu ben rappresentare la situazione di un atomo di idrogeno: in questo caso la distanza tra le righe di circa 500 Gauss. Lo spettro nella parte destra della figura potrebbe rappresentare invece quello di un radicale in cui l'elettrone spaiato interagisce con un unico nucleo avente spin I = 1, per esempio un atomo di azoto. Cos linterazione dellelettrone con un atomo di idrogeno sdoppia in due il segnale mentre linterazione con tre atomi di idrogeno equivalenti come nel metil radicale produce uno sdoppiamento che risulta in un quartetto.

C

H

H H

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Per tre nuclei equivalenti aventi spin = infatti lo spettro consiste di quattro righe aventi intensit relative 1:3:3:1, tutte ugualmente separate tra loro. Nel caso particolare del metile, la costante di accoppiamento di circa 23 Gauss. La notevole differenza di accoppiamento riscontrata in H e CH3 da ricercarsi nel fatto che nel metil radicale l'elettrone spaiato localizzato sull'atomo di carbonio, cio lontano dagli atomi di idrogeno che ottengono comunque una certa frazione d densit di spin mediante polarizzazione indiretta. Lintensit delle righe si dedurr dallo sdoppiamento successivo delle stesse; nel caso di n idrogeni equivalenti la situazione sar quella riportata sotto:

N righe e intensit relative N atomi equ con I = 1/2.

0

1

2

3

4

5

Nel caso in cui gli atomi adiacenti siano atomi di azoto che hanno numero quantico di spin nucleare uguale ad 1 e quindi dividono il segnale in 3, la situazione sarebbe la seguente:

N righe e intensit relative N atomi equ. con I = 1

0

1

2

3

4

Tale situazione piuttosto difficile da incontrare in quanto raramente presente un numero cos elevato di atomi di azoto equivalenti ma lo schema pu aiutare a far capire il meccanismo con il quale vengono sdoppiati i segnali. Inoltre tale schema applicabile in ogni caso in cui latomo abbia I = 1 (ad esempio il deuterio).

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Una situazione molto pi frequente quella in cui si abbia la contemporanea presenza di atomi di idrogeno non equivalenti o atomi diversi. In questo caso vale la formula: (2nA IA + 1) (2nB IB +1) etc. = N Totale di righe dove nA sono il numero di nuclei equivalenti con momento magnetico nucleare IA, nB il numero di nuclei equivalenti con momento magnetico nucleare IB, ecc. Vediamo alcuni esempi. ESEMPIO 1 Lo spettro EPR del radicale anione del benzochinone risulta composto da 5 righe. Infatti in tale radicale sono presenti quattro atomi di idrogeno equivalenti ed avremo quindi: (2 * 4 * 1/2 + 1) = 5 righe.

Gli atomi di idrogeno equivalenti danno cinque righe (intensit 1:4:6:4:1) con costante di accoppiamento di 2.35 Gauss. ESEMPIO 2 Lo spettro EPR dei radicale di-tert-butil nitrossido risulta composto da 3 righe. Infatti in questo caso lelettrone sente solamente linfluenza dellatomo di azoto

C

CH3

H3C

CH3

N

O

C

CH3

CH3

CH3

O

H

H

H

H

O

O

H

H

H

H

O

O

H

H

H

H

O *

*

*

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ESEMPIO 3 Lo spettro EPR dei radicale N-tert-butil-N-(2,2-dimetil-1-fenilpropil)-nitrossido risulta invece composto di 6 righe. In questo caso lelettrone sente linfluenza dellatomo di azoto e dellatomo di idrogeno in allazoto. Si avr quindi: (2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 1 * 1/2 + 1) = 6 righe. Pi precisamente, latomo di azoto d origine a tre righe (intensit 1:1:1) con costante di accoppiamento di circa 14 Gauss, ognuna delle quali viene sdoppiata a sua volta in un doppietto (intensit 1:1) con costante di accoppiamento di circa 3.2 Gauss.

ESEMPIO 4 Lo spettro EPR del radicale N-metil-N-tert-butil nitrossido risulta invece composto di 12 righe. In questo caso lelettrone sente linfluenza dellatomo di azoto e dei tre atomi di idrogeno del metile attaccato allazoto. Si avr quindi: (2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 3 * 1/2 + 1) = 12 righe. Pi precisamente, latomo di azoto d origine a tre righe (intensit 1:1:1) con costante di accoppiamento di 16.25 Gauss, ognuna delle quali viene sdoppiata a sua volta in un quartetto (intensit 1:3:3:1) con costante di accoppiamento di 13.13 Gauss.

ESEMPIO 5 Nel caso in cui gli atomi di idrogeno del metile siano stati sostituiti con atomi di deuterio lo spettro EPR del radicale N-metil-N-tert-butil nitrossido sar completamente differente.

C

CH3

H3C

CH3

N

O

CH3

C

CH3

H3C

CH3

N

O

CH

t-Bu

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In questo caso infatti, lelettrone sentir comunque linfluenza dellatomo di azoto e dei tre atomi di deuterio del metile attaccato allazoto che hanno per I = 1 e non come lidrogeno. Si avr quindi: (2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 3 * 1 + 1) = 21 righe. Pi precisamente, latomo di azoto dar comunque origine a tre righe (intensit 1:1:1) con costante di accoppiamento di 16.25 Gauss, ma ognuna di esse sar sdoppiata a sua volta in un eptetto (intensit 1:3:6:7:6:3:1) con costante di accoppiamento di 1.87 Gauss.

ESEMPIO 6 Lo spettro EPR delletil radicale risulta composto da 12 righe. Infatti in tale radicale sono presenti due atomi di idrogeno equivalenti di tipo e tre atomi di idrogeno equivalenti di tipo . Avremo quindi: (2 * 2 * 1/2 +1) * (2 * 3 * 1/2 +1) = 12 righe. Gli atomi di idrogeno di tipo danno tre righe (intensit 1:2:1) con costante di accoppiamento di 22.4 Gauss. Inoltre, a causa della contemporanea presenza dei tre atomi di idrogeno di tipo equivalenti, ognuna di queste righe viene divisa a sua volta in un quartetto (intensit 1:3:3:1) con costante di accoppiamento 26.9 Gauss.

ESEMPIO 7 Lo spettro EPR del radicale anione della naftalina risulta composto da 25 righe.

C

CH3

H3C

CH3

N

O

CD3

CH3 CH2

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Infatti in tale radicale sono presenti quattro atomi di idrogeno equivalenti di tipo e quattro atomi di idrogeno equivalenti di tipo . Avremo quindi: (2 * 4 * 1/2 +1) * (2 * 4 * 1/2 +1) = 25 righe. Gli atomi di idrogeno di tipo danno cinque righe (intensit 1:4:6:4:1) con costante di accoppiamento di 4,95 Gauss. Inoltre, a causa della contemporanea presenza dei quattro atomi di idrogeno di tipo equivalenti, ognuna di queste righe viene divisa a sua volta in un quintetto (intensit 1:4:6:4:1) con costante di accoppiamento 1,87 Gauss.

*

ESEMPIO 8 Lo spettro EPR del butadiene radicale anione risulta composto da 15 righe. Infatti in tale radicale sono presenti quattro atomi di idrogeno terminali equivalenti e due atomi di idrogeno centrali equivalenti. Avremo quindi: (2 * 4 * 1/2 +1) * (2 * 2 * 1/2 +1) = 15 righe.

CH2 CH2

CH

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Gli atomi di idrogeno di tipo terminali danno origine ad un quintetto (intensit 1:4:6:4:1) con costante di accoppiamento di 7.5 Gauss. Inoltre, a causa della contemporanea presenza dei due atomi di idrogeno centrali equivalenti, ognuna di queste righe viene divisa a sua volta in un tripletto (intensit 1:2:1) con costante di accoppiamento 2.75 Gauss. ESEMPIO 9 Lo spettro EPR del radicale 2-fenil-2-metil-indolin-3-on-nitrossido risulta invece composto di 27 righe. In questo caso lelettrone sente linfluenza dellatomo di azoto e dei quattro atomi di idrogeno sullanello aromatico. Gli atomi di idrogeno in meta sono pressoch equivalenti come lo sono quelli in orto ed in para. Si avr quindi: (2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 2 * 1/2 + 1) * (2 * 2 * 1/2 + 1)= 27 righe. Pi precisamente, latomo di azoto d origine a tre righe (intensit 1:1:1) con costante di accoppiamento di 8.7 Gauss, ognuna delle quali viene sdoppiata a sua volta in un tripletto (intensit 1:2:1) con costante di accoppiamento di 2.8 Gauss (Hp e Ho), che viene a sua volta sdoppiato in un tripletto (intensit 1:2:1) pi piccolo di 0.9 Gauss (Hm).

Riflessione: Spiegare lo spettro EPR del propenil radicale e del butenil radicale.

C CH

CH2

H

HC C

HCH

H

HCH3

radicalepropenilico

radicalebutenilico

N

O

CH3

O

Ph

Hm

Hp

Hm

Ho

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RISONANZA DI SPIN ELETTRONICO IN BIOLOGIA La spettroscopia di risonanza di spin elettronica (EPR) ha costantemente trovato applicazioni nella problematica biochimica e biomedica, come un mezzo potente e sensibile per la rivelazione di specie radicaliche. Ci si applica tanto al rilevamento (e allidentificazione) dintermedi radicalici in reazioni metaboliche, quanto allosservazione di specie paramagnetiche stabili presenti in natura, o al rilevamento di radicali prodotti da radiazioni esterne o, infine, all'analisi di sonde paramagnetiche introdotte in sistemi biologici specifici (spin labeling). Sebbene esista una grande potenzialit per l'osservazione diretta di specie radicaliche associate a specifici fenomeni biochimici, il paramagnetismo si manifesta naturalmente assai di rado in sistemi biologici. Tuttavia grandi vantaggi possono essere ottenuti dalla introduzione di una qualche versatile sonda contenente un centro paramagnetico. Uno "spin label" ideale un radicale libero stabile (spesso organico) di struttura e/o reattivit tali da consentirne l'introduzione in una particolare zona dei sistemi biologici e della macromolecola. Sebbene a prima vista una tale sonda possa sembrare facilmente ottenibile, in realt non lo . Infatti la maggior parte degli "spin-labels" usati attualmente sono radicali nitrossidi protetti la cui sintesi stata perfezionata solo in tempi recenti.

N

R

CH3

CH3CH3

O

CH3

Qui di seguito schematizzata una struttura generale di un tale nitrossido: Sebbene la tecnica dello "spin-labeling" faccia generalmente riferimento all'uso di radicali nitrossidi, si hanno anche altri esempi in cui NO2, Mn2+, altri ioni paramagnetici di metalli di transizione, ioni di lantanidi, ed altri radicali organici di diversa matura sono stati usati come sonde per lo studio di particolari si temi. Tuttavia, a causa della loro grande versatilit, sensibilit e variet di informazioni da essi ottenibili, i radicali nitrossidi, hanno trovato un predominante impiego nella tecnica dello Spin-Labeling.