Erfahrungen mit den neuen mikrobiologischen
Untersuchungsparametern nach
EU-Badegewässerrichtlinie 2006/7/EG
Dr. Alfons Hack
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt
im Gesundheitswesen
Erfahrungsaustausch Badegewässer
Friedberg
25.03.2010
Die Publikation ist ausschließlich als Download beim UBA verfügbar.
http://www.umweltbundesamt.de/gesundheit/badegewaesser/index.htm
Herausgeber: Umweltbundesamt
Postfach 14 06
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Telefax: 0340/2103 2285
Internet: http://www.umweltbundesamt.de
Redaktion: Dr. Regine Szewzyk
Dessau-Roßlau, Juli 2009
Empfehlung zur praktischen Umsetzung der
EG-Badegewässerrichtlinie (UBA 2009)
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
Inhalt der UBA-Empfehlung zur praktischen
Umsetzung der EG-Badegewässerrichtlinie
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
1. Konformitätsbestimmung in der Übergangszeit
- E. coli
- Intestinale Enterokokken
2. Angabe der Untersuchungsergebnisse, Vergleichbarkeit
mikrobiologischer Untersuchungsverfahren
3. Wahl der Verdünnungen bei den MPN-Verfahren
4. Bedingungen bei Anwendung der Membranfiltration
5. Umgang mit Werten unter- und oberhalb der Nachweis-
bzw. der Bestimmungsgrenze
Referenzmethoden
Parameter
(Dimension)
Norm Methodik
Intestinale Enterokokken
(KBE/100 mL)
DIN EN ISO 7899-1
DIN EN ISO 7899-2
MPN
MF
Escherichia coli
(KBE/100 mL)
DIN EN ISO 9308-3
(DIN EN ISO 9308-1) *
MPN
(MF)
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
* = Die Methode ist nicht in die deutsche Musterverordnung des Bund-Länder-Arbeits-
kreises "Badegewässer" und in die hessische Badegewässerverordnung von 07.2008
aufgenommen worden. Sie ist für Wasser mit hohem Keimgehalt nicht geeignet.
MPN = Most-Probable-Number-Verfahren
MF = Membranfiltrations-Verfahren
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
Membranfiltration
Membranfilter,
Porengröße 0,4 µmEdelstahlfritte
Absaug-
vorrichtungAbstellhahn
Nachweis und Zählung von Intestinalen Enterokokken
DIN EN ISO 7899-2:2000 (Membranfiltration)
• Membranfiltration
• Inkubation auf Enterokokken-Agar nach Slanetz und
Bartley 44 4 h bei 36°C
• Charakteristische Kolonien erfassen
(Kolonie erhaben, rot, kastanienbraun oder rosa im
Zentrum oder insgesamt Verdacht auf Enterokokken)
• Filter auf Galle-Äsculin-Azid Agar transferieren
und 2 h bei 44°C inkubieren
• Gelbbraune bis schwarze Färbung im umgebenden Medium
Intestinale Enterokokken!
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
Enterokokkennachweis
DIN EN ISO 7899-2
Galle-Aeskulin-AgarSlanetz-Bartley-Agar
Filteroberseite
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
Anzuchtkultur auf
Slanetz-Bartley-Agar
Identifizierung auf
Galle-Aeskulin-Agar
Filterrückseite
KenngrößenA B
bei Wasserqualität
konstant sehr gut
oder gut
Cbei Wasserqualität
ausreichend
oder schlechter
Ansatzvolumen (mL) 100 10 5 1
Untere Bestimmungs-
grenze (KBE/100 mL)1 10 20 100
Obere Bestimmungs-
grenze (KBE/100 mL)200 2000 4.000 20.000
Varianten des Membranfiltrationsverfahrens
bei erwarteter
Verschmutzung
zusätzlich zu B
im Regelfallnicht
empfohlen
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
Anwendung
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
Miniaturisiertes MPN-VerfahrenDIN EN ISO 7899-1 und DIN EN ISO 9308-3
Mikrotiterplatte
mit Nährsubstrat
Multipipette mit
sterilen Spitzen
Petrischale mit Probe
1:2 bzw. 1:20
verdünnt
Probe
original
Bestimmung von Escherichia coli und Intestinalen
Enterokokken mittels MPN-Verfahren
• Probenverdünnungen im allgemeinen 1:2 oder (1:2 und 1:20)
• Mikrotiterplatten füllen (200 µL / Vertiefung):
96 x 1:2-Verdünnung oder
64 x 1:2-Verdünnung + 32 x 1:20-Verdünnung
• Escherichia coli:
Nährmedium mit 4-Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid (MUG).
Inkubation bei 44°C mindestens 36 h, höchstens 72 h
• Intestinale Enterokokken:Nährmedium mit 4-Methylumbelliferyl-ß-D-Glucosid (MUD). Inkubation bei 44°C mindestens 36 h, höchstens 72 h
• Ablesung unter UV-Licht (366 nm)
Blaue Fluoreszenz E. coli bzw. Enterokokken Charakteristische Zahl
• Ablesen der Wahrscheinlichkeitszahl „MPN“
• Ergebnisangabe als KBE / 100 mL (wissenschaftlich korrekt: MPN / 100 mL)
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
MPN-Test auf E. coli
1:2-Verdünnung
10 von 96 positiv
MPN-Tabelle: 10 110 KBE / 100 mL
95%-Intervall: 59 - 204
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
Varianten des Mikrotiterverfahrens
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
Kenngrößen Ansatz bei
Wasserqualität
konstant sehr gut,
konstant gut
Ansatz bei
Wasserqualität
ausreichend,
mangelhaft
Verdünnung(en) 1:2 1:2 und 1:20
MT-Platten-Ansatz,
Verdünnungen96 x 1:2
64 x 1:2
32 x 1:20
Untere Bestimmungsgrenze
(KBE/100 mL)< 10 < 15
Obere Bestimmungsgrenze
(KBE/100 mL)4.564 34.659
Angabe bei „vermeidbarer
Überschreitung“ (UBA)9.128 -
Ist auf Grund äußerer Umstände, der Wetterlage oder auf Grund bisheriger Erfahrungen damit zu rechnen (z.B. bei kurz-
zeitigen Verschmutzungen oder Havarien), dass die obere Bestimmungsgrenze von 4.564 KBE/100 mL überschritten wird,
ist die Untersuchung von Anfang an mit den zwei Verdünnungsstufen 1:2 und 1:20 durchzuführen (UBA, Juli 2009).
*
*
Grenzwerte für Binnengewässer
KBE/100 mL (Perzentil)
Parameter Ausgezeichnete
Qualität
Gute
Qualität
Ausreichende
Qualität
Intestinale
Enterokokken200 (95-%) 400 (95-%) 330 (90-%)
E. coli 500 (95-%) 1000 (95-%) 900 (90-%)
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
Maßnahmen bei hohen Einzelwerten
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
Wird bei der Badegewässerüberwachung für den Parameter Escherichia coli ein Ein-
zelwert von mehr als 1.800 KBE/100 mL oder für den Parameter Intestinale Entero-
kokken ein Einzelwert von mehr als 700 KBE/100 mL festgestellt, so ist eine sofortige
Nachkontrolle durchzuführen. Werden die Werte wieder überschritten, wird ein zeit-
weiliges Badeverbot erlassen.
Das Verbot ist aufzuheben, wenn der geometrische Mittelwert von mindestens drei an
repräsentativen Stellen des Badegewässers entnommenen Wasserproben (oder das
Ergebnis einer flächenintegrierten Probenahme von mindestens drei Stellen) einen
Wert von unter 280 KBE/100 mL bei Escherichia coli und unter 100 KBE/100 mL bei
den Intestinalen Enterokokken ergeben hat.
Empfehlung der Badewasserkommission – Musterverordnung des BLAK
Verordnung über die Qualität und die Bewirtschaftung der Badegewässer (VO-BGW)
Bedingung für die Aufhebung von Badeverboten
Wenn durch Messungen festgestellt wird, dass mindestens
wieder ausreichende Qualität vorliegt.
I. Bewertung mittels 90-Perzentil:
< 900 KBE/100 mL (E. coli)
< 330 KBE/100 mL (Enterokokken)
Es sind relativ viele Proben nötig.
II. Bewertung mittels 50-Perzentil (= Median, geom. Mittel):
< 280 KBE/100 mL (E. coli)
< 100 KBE/100 mL (Intestinale Enterokokken)
Es sind nur wenige Proben nötig (mindestens 3).
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
RingversuchMPN
KBE/100 mLI/2008 Ausschlussgrenze unten 694
Mittelwert 1.167Ausschlussgrenze oben 1.757
III/2008 Ausschlussgrenze unten 87
Mittelwert 228Ausschlussgrenze oben 431
II/2009 Ausschlussgrenze unten 207
Mittelwert 480Ausschlussgrenze oben 856
Ringversuchsergebnisse des NLGA
EU-Badegewässermikrobiologie – E. coli
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
RV KenngrößenMPN
KBE/100 mLMF
KBE/100 mL
I/2008 Ausschlussgrenze unten 34 172
Mittelwert 191 573Ausschlussgrenze oben 500 1.195
III/2008 Ausschlussgrenze unten 22 170
Mittelwert 124 379Ausschlussgrenze oben 333 665
II/2009 Ausschlussgrenze unten 130 260
Mittelwert 354 494Ausschlussgrenze oben 680 798
Eigene Untersuchungen an realen Proben bestätigen im Grundsatz die Diskrepanz
zwischen den Ergebnissen der beiden Untersuchungsverfahren. MPN < MF
Bebrütungstemperatur 44°C 36°C
Ringversuchsergebnisse des NLGA
EU-Badegewässermikrobiologie – Intestinale Enterokokken
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
Konzentrationen intestinaler Enterokokken im Wasser aus mittelhessi-
schen Badeseen und Fließgewässern im Sommer 2007 - Vergleich der
Membranfiltermethodik mit dem MPN-Verfahren – DIN-Methoden
10
100
1000
10000
0 10 20 30 40 50 60
En
tero
ko
kk
en
KB
E /
100
mL
Filter SB
MPN DIN
log
Die relativen Standard-
abweichungen der Methodik
wurden an Vergleichsproben
aus Dill und Dietzhölze er-
mittelt (jeweils n = 8)
Bei Werten unter der Bestim-
mungsgrenze wurden die
Werte der Bestimmungs-
grenze für die Darstellung
verwendet.
MF > MPN : 25 Proben
MF < MPN : 12 Proben
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
E. coli-Konzentrationen im Wasser aus mittelhessischen Badeseen und
Fließgewässern im Sommer 2007 - Vergleich der Membranfiltermethodik
mit dem MPN-Verfahren - DIN Methoden
10
100
1000
10000
0 10 20 30 40 50 60
E. co
li K
BE
/ 1
00
mL
Filter TTC
MPN DIN
log
Die relativen Standard-
abweichungen der Methodik
wurden an Vergleichsproben
aus Dill und Dietzhölze er-
mittelt (jeweils n = 8)
Bei Werten unter der Bestim-
mungsgrenze wurden die
Werte der Bestimmungs-
grenze für die Darstellung
verwendet.
Konformitätsüberprüfung
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
• Für jedes Badegewässer am Ende der Badesaison
• Grundbedingung: ausreichend viele Bestimmungen von
E. coli und Intestinalen Enterokokken
• Erste Messung kurz vor Beginn der Saison und mindestens
monatlich weitere Messungen bis zum Ende der Saison
• Bewertung 2010 noch nach den Regeln für die Übergangszeit
• Bewertung bis spätestens zum Jahr 2011 (BRD) auf der
Basis von Daten der letzten vier Jahre nach den neuen
Regeln, d.h. Beurteilung anhand von
- 95-Perzentil (sehr gute Qualität und gute Qualität)
- 90-Perzentil (ausreichende Qualität)
Alternative Untersuchungsmethoden
• Alternative Untersuchungsmethoden sind zulässig.
• Die Gleichwertigkeit damit erzielter Ergebnisse mit den
Ergebnissen der Referenzmethoden ist zu belegen.
• Die Kommission verlangt Prüfung nach DIN EN ISO 17994:2004.
• Das Umweltbundesamt stellt die Gleichwertigkeit fest.
• Es veröffentlicht darüber eine Liste im Bundesgesundheitsblatt.
Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen (HLPUG), Dillenburg
Zur Zeit ist noch keine Alternativmethode verfügbar.
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!