ESAME ISTOLOGICO :
• esame estemporaneo mediante uso del criostato
• biopsie mirate su tessuti e\o su organi
• prelievi autoptici
ESAME ISTOLOGICO :
• esame estemporaneo mediante uso del criostato
• biopsie mirate su tessuti e\o su organi
• prelievi autoptici
ESAME CITOLOGICO :
• esame su versamento interstiziale
• esame su urine
• esame su striscio vaginale
• agoaspirato
ESAME CITOLOGICO :
• esame su versamento interstiziale
• esame su urine
• esame su striscio vaginale
• agoaspirato
ITER DI PROCEDURA NEL LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA
ITER DI PROCEDURA NEL LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA
• 1 FASE PROPEDEUTICA
• 2 FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO
• 3 FASE PRE-ANALITICA
• 4 FASE ANALITICA
• 5 FASE POST-ANALITICA
• 6 FASE INTERPRETATIVA
• 7 REFERTAZIONE
• 1 FASE PROPEDEUTICA
• 2 FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO
• 3 FASE PRE-ANALITICA
• 4 FASE ANALITICA
• 5 FASE POST-ANALITICA
• 6 FASE INTERPRETATIVA
• 7 REFERTAZIONE
ISTOLOGIA :
• richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno
• allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame
• contestuale invio di reperto anatomico o istologico (vetrini di consulenza)
• esecuzione autopsia e relativi prelievi effettuata dal medico anatomo-patologo
ISTOLOGIA :
• richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno
• allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame
• contestuale invio di reperto anatomico o istologico (vetrini di consulenza)
• esecuzione autopsia e relativi prelievi effettuata dal medico anatomo-patologo
CITOLOGIA :
• richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno
• allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame
• contestuale invio di campione citologico o di vetrino con striscio vaginale già eseguito dal ginecologo
• (preparazione ed anamnesi del paziente sottoposto ad agoaspirato in apposito ambulatorio)
CITOLOGIA :
• richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno
• allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame
• contestuale invio di campione citologico o di vetrino con striscio vaginale già eseguito dal ginecologo
• (preparazione ed anamnesi del paziente sottoposto ad agoaspirato in apposito ambulatorio)
1 FASE PROPEDEUTICA1 FASE PROPEDEUTICA
ISTOLOGIA :
• ricezione biopsie e reperti
• classificazione e numerazione reperti su apposito registro interno annuale progressivo
• compilazione apposito modulo di profilo mirato
• riduzione reperti anatomici ad opera del medico in apposite cassettine per istologia
• procedura di fissazione dei tessuti in processatore automatico (autotecnico) (circa 15 h.)
• (accensione e preparazione del criostato negli esami estemporanei)
ISTOLOGIA :
• ricezione biopsie e reperti
• classificazione e numerazione reperti su apposito registro interno annuale progressivo
• compilazione apposito modulo di profilo mirato
• riduzione reperti anatomici ad opera del medico in apposite cassettine per istologia
• procedura di fissazione dei tessuti in processatore automatico (autotecnico) (circa 15 h.)
• (accensione e preparazione del criostato negli esami estemporanei)
2 FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO
2 FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO
ISTOLOGIA :
• inclusione in paraffina dei reperti in precedenza fissati
• preparazione microtomo e bagno termostatato stendi-sezioni
• raccolta sezioni istologiche di circa 3 µ su vetrini; loro fissazione in stufa a secco termostatata; procedimento deparaffinazione in solventi
• (per esame al criostato : riduzione reperto e taglio sezioni con loro immediata fissazione in metanolo)
ISTOLOGIA :
• inclusione in paraffina dei reperti in precedenza fissati
• preparazione microtomo e bagno termostatato stendi-sezioni
• raccolta sezioni istologiche di circa 3 µ su vetrini; loro fissazione in stufa a secco termostatata; procedimento deparaffinazione in solventi
• (per esame al criostato : riduzione reperto e taglio sezioni con loro immediata fissazione in metanolo)
3 FASE PRE - ANALITICA3 FASE PRE - ANALITICA
ISTOLOGIA :
• colorazione manuale o automatizzata delle sezioni su vetrino
• colorazione di routine E.-E.
• colorazioni speciali
• reazioni specifiche di immuno-isto-chimica
• montaggio vetrini in mezzo di inclusione idoneo
• (colorazione esame criostato)
• Controllo di qualità :
• uso di sezioni già risultate positive in qualità di controllo positivo
• controlli inter-laboratorio
ISTOLOGIA :
• colorazione manuale o automatizzata delle sezioni su vetrino
• colorazione di routine E.-E.
• colorazioni speciali
• reazioni specifiche di immuno-isto-chimica
• montaggio vetrini in mezzo di inclusione idoneo
• (colorazione esame criostato)
• Controllo di qualità :
• uso di sezioni già risultate positive in qualità di controllo positivo
• controlli inter-laboratorio
4 FASE ANALITICA4 FASE ANALITICA
ISTOLOGIA :
• apposizione etichette identificative sui vetrini contenenti le sezioni colorate
• archiviazione in apposite rastrelliere delle cassettine per istologia contenenti le inclusioni in paraffina
• consegna dei vassoi contenenti i vetrini e dei moduli di profilo mirato al medico anatomo-patologo specialista
• archiviazione dei vetrini diagnosticati in istoteche
ISTOLOGIA :
• apposizione etichette identificative sui vetrini contenenti le sezioni colorate
• archiviazione in apposite rastrelliere delle cassettine per istologia contenenti le inclusioni in paraffina
• consegna dei vassoi contenenti i vetrini e dei moduli di profilo mirato al medico anatomo-patologo specialista
• archiviazione dei vetrini diagnosticati in istoteche
5 FASE POST - ANALITICA5 FASE POST - ANALITICA
ISTOLOGIA :
• osservazione dei vetrini al microscopio ottico
• interpretazione e diagnosi da parte del medico anatomo-patologo specialista
• refertazione su apposito modulo di profilo mirato e relativa consegna in segreteria amministrativa
• Controllo di qualità :
• lettura vetrini incrociata tra medico lettore e medico revisore
• lettura alla cieca inter-laboratorio
ISTOLOGIA :
• osservazione dei vetrini al microscopio ottico
• interpretazione e diagnosi da parte del medico anatomo-patologo specialista
• refertazione su apposito modulo di profilo mirato e relativa consegna in segreteria amministrativa
• Controllo di qualità :
• lettura vetrini incrociata tra medico lettore e medico revisore
• lettura alla cieca inter-laboratorio
6 FASE INTERPRETATIVA6 FASE INTERPRETATIVA
7 REFERTAZIONE7 REFERTAZIONE
• refertazione su apposito modulo in segreteria amministrativa
• archiviazione documentazione cartacea
• inserimento su personal computer del referto in archivio informatico dedicato per singola area di interesse (istologia; citologia; immunopatologia)
• archiviazione documentazione informatica
• consegna del referto dalla segreteria al reparto o al medico richiedente o al paziente
• refertazione su apposito modulo in segreteria amministrativa
• archiviazione documentazione cartacea
• inserimento su personal computer del referto in archivio informatico dedicato per singola area di interesse (istologia; citologia; immunopatologia)
• archiviazione documentazione informatica
• consegna del referto dalla segreteria al reparto o al medico richiedente o al paziente
DOPO IL PRELIEVODOPO IL PRELIEVO
• -Tessuti Freschi inviati direttamente al patologo: perché e come.
• -Tessuti sotto vuoto
• Banche di tessuti: perché e come. Problemi connessi.
• -Tessuti Freschi inviati direttamente al patologo: perché e come.
• -Tessuti sotto vuoto
• Banche di tessuti: perché e come. Problemi connessi.
• La diagnosi istopatologica, che si basa sullo studio della morfologia, richiede l’ uso di fissativi idonei a preservare nello statu quo ante migliore possibile la struttura del campione. La fissazione di un tessuto fornisce quindi una immagine statica, la quale, benché non ne rappresenti proprio le caratteristiche dell’ aspetto in vivo, deve tuttavia essere costantemente riproducibile.
Requisiti fondamentali del fissativo ideale :
• sicura preservazione della morfologia di base
• integrità della struttura antigenica
• impedimento di alterazioni biochimiche nei tessuti, per aggiunta o sottrazione di componenti chimiche
• opposizione ai processi autolitici e putrefattivi.
• La diagnosi istopatologica, che si basa sullo studio della morfologia, richiede l’ uso di fissativi idonei a preservare nello statu quo ante migliore possibile la struttura del campione. La fissazione di un tessuto fornisce quindi una immagine statica, la quale, benché non ne rappresenti proprio le caratteristiche dell’ aspetto in vivo, deve tuttavia essere costantemente riproducibile.
Requisiti fondamentali del fissativo ideale :
• sicura preservazione della morfologia di base
• integrità della struttura antigenica
• impedimento di alterazioni biochimiche nei tessuti, per aggiunta o sottrazione di componenti chimiche
• opposizione ai processi autolitici e putrefattivi.
FISSAZIONE DEI TESSUTIFISSAZIONE DEI TESSUTI
FissazioneFissazione
Definizione
Trattamento chimico che porta alla immobilizzazione e alla
stabilizzazione di componenti tessutali con minima
dislocazione ed estrazione dei composti nativi
La FORMA delle cellule e dei tessuti deve venir conservata il
più possibile simile alla condizione vitale
Definizione
Trattamento chimico che porta alla immobilizzazione e alla
stabilizzazione di componenti tessutali con minima
dislocazione ed estrazione dei composti nativi
La FORMA delle cellule e dei tessuti deve venir conservata il
più possibile simile alla condizione vitale
FissazioneFissazioneUna fissazione ideale prevede:• Stabilizzazione contro modificazioni successive indotte da
trattamenti susseguenti quale l’inclusione in paraffina
• Simultaneità nel campione della reazione tessuto-fissativo
( rapida penetrazione e diffusione nei tessuti )
• Riproducibilità del processo di fissazione nonostante differente composizione del tessuto
• Assenza di “anormali” componenti prodotti o estrazione di componenti native
• Rapidità di azione ( per evitare l’insorgere di autolisi )• Assenza di “sovra-fissazione”
Una fissazione ideale prevede:• Stabilizzazione contro modificazioni successive indotte da
trattamenti susseguenti quale l’inclusione in paraffina
• Simultaneità nel campione della reazione tessuto-fissativo
( rapida penetrazione e diffusione nei tessuti )
• Riproducibilità del processo di fissazione nonostante differente composizione del tessuto
• Assenza di “anormali” componenti prodotti o estrazione di componenti native
• Rapidità di azione ( per evitare l’insorgere di autolisi )• Assenza di “sovra-fissazione”
Fissazione dei TessutiFissazione dei Tessuti
• Molto importante è lo spessore del campione di tessuto che non deve, in genere, superare i 3 mm, onde evitare che al centro del tessuto intervengano fenomeni degenerativi prima dell’arrivo del fissativo.
• Una buona fissazione, atto preliminare più importante della tecnica istologica, pena la perdita irreparabile del tessuto dipende:- dal tipo, dal pH e dalla concentrazione del fissativo usato, - dalla osmolarità e dalle forze ioniche in atto - dalla temperatura e dalla durata dell’intera operazione
• In genere i fissativi più usati intervengono sulle proteine e sui lipidi, mentre i glicidi, specie se a basso peso molecolare, vengono solo inclusi tra le proteine fissate e possono diffondere nell’acqua.
• Molto importante è lo spessore del campione di tessuto che non deve, in genere, superare i 3 mm, onde evitare che al centro del tessuto intervengano fenomeni degenerativi prima dell’arrivo del fissativo.
• Una buona fissazione, atto preliminare più importante della tecnica istologica, pena la perdita irreparabile del tessuto dipende:- dal tipo, dal pH e dalla concentrazione del fissativo usato, - dalla osmolarità e dalle forze ioniche in atto - dalla temperatura e dalla durata dell’intera operazione
• In genere i fissativi più usati intervengono sulle proteine e sui lipidi, mentre i glicidi, specie se a basso peso molecolare, vengono solo inclusi tra le proteine fissate e possono diffondere nell’acqua.
FissazioneFissazione Classificazione
I fissativi si dividono in due classi a seconda che agiscano per:
1) Coagulazione: denaturazione irreversibile delle proteine, con
nuove stabilizzazioni tra gruppi diversi di diverse proteine
che reagiscono una con l’altra formando aggregati
MODIFICANO in modo irreversibile la struttura terziaria
3 Modi: movimento termico con distruzione della struttura
secondaria e terziaria (calore)
repulsione elettrostatica tra parti diverse di una
stessa proteina (acidi forti, sali di metallo)
rimozione di H2O con disidratazione (etanolo)La disidratazione con etanolo può seguire la fissazione per Cross-link
ClassificazioneI fissativi si dividono in due classi a seconda che agiscano per:
1) Coagulazione: denaturazione irreversibile delle proteine, con
nuove stabilizzazioni tra gruppi diversi di diverse proteine
che reagiscono una con l’altra formando aggregati
MODIFICANO in modo irreversibile la struttura terziaria
3 Modi: movimento termico con distruzione della struttura
secondaria e terziaria (calore)
repulsione elettrostatica tra parti diverse di una
stessa proteina (acidi forti, sali di metallo)
rimozione di H2O con disidratazione (etanolo)La disidratazione con etanolo può seguire la fissazione per Cross-link
FissazioneFissazione
2) CROSS LINKING: ovvero la formazione di legami crociati
tra
polipeptidi all’interno di una stessa proteina o tra proteine
vicine
STABILIZZANO la conformazione nativa della proteina E’ un processo ADDITIVO, più o meno sensibile
Tipico di ALDEIDI, CARBODIMIDE
Utile anche in ME, Istochimica
2) CROSS LINKING: ovvero la formazione di legami crociati
tra
polipeptidi all’interno di una stessa proteina o tra proteine
vicine
STABILIZZANO la conformazione nativa della proteina E’ un processo ADDITIVO, più o meno sensibile
Tipico di ALDEIDI, CARBODIMIDE
Utile anche in ME, Istochimica
Tecniche di fissazione :
• per immersione, consistente nel sommergere il tessuto nel liquido fissativo, con rapporto volumetrico minimo tra fissativo e campione di 10 : 1
• per perfusione, in assoluto la migliore da un punto di vista teorico - pratico, ma limitata all’ animale da esperimento o ad organi asportati in loco e con vasi integri
• per uso di vapori, secondo cui i tessuti si fissano grazie ai vapori che si liberano da una soluzione fissativa riscaldata, permettendo così una fissazione in situ (si evita in tal modo che alcune sostanze solubili possano diffondere in soluzione e disperdersi). Si usano fissativi altamente volatili come : formaldeide, glutaraldeide, acido osmico.
Tecniche di fissazione :
• per immersione, consistente nel sommergere il tessuto nel liquido fissativo, con rapporto volumetrico minimo tra fissativo e campione di 10 : 1
• per perfusione, in assoluto la migliore da un punto di vista teorico - pratico, ma limitata all’ animale da esperimento o ad organi asportati in loco e con vasi integri
• per uso di vapori, secondo cui i tessuti si fissano grazie ai vapori che si liberano da una soluzione fissativa riscaldata, permettendo così una fissazione in situ (si evita in tal modo che alcune sostanze solubili possano diffondere in soluzione e disperdersi). Si usano fissativi altamente volatili come : formaldeide, glutaraldeide, acido osmico.
FISSAZIONE DEI TESSUTIFISSAZIONE DEI TESSUTI
Fissazione dei TessutiFissazione dei Tessuti La Formalina:
E’ il più diffuso ed usato fissativo in istopatologia, ad un valore di pH prossimo a 7.0. La formalina diviene monomerica ed idratata, una molecola di basso peso molecolare capace di penetrate rapidamente nei tessuti, con la formazione di gruppi idrossi-metile con le proteine, e con la formazione di legami di tipo metilenico tra catene polipeptidiche (cross-linking)
• Formalina al 10%: formaldeide polimerizzata in soluzione acquosa satura al 40% e successivamente diluita 1:10 (detta anche formaldeide 4%)
• Formalina salata: 100 ml di formaldeide al 40% + 9 g di NaCl + 900 ml di H20; è una soluzione isotonica che impedisce la coartazione ed il rigonfiamento cellulare
• Formalina nel tamponata: 100 ml di formaldeide 40% + 900 ml di H20 + 4 g di fosfato acido di sodio + 6.5 g di fosfato disodico anidro; impedisce l’acidificazione dei tessuti (fenomeno dovuto alla trasformazione della formaldeide in acido formico), mantenendo il pH a 7.0.
La Formalina:
E’ il più diffuso ed usato fissativo in istopatologia, ad un valore di pH prossimo a 7.0. La formalina diviene monomerica ed idratata, una molecola di basso peso molecolare capace di penetrate rapidamente nei tessuti, con la formazione di gruppi idrossi-metile con le proteine, e con la formazione di legami di tipo metilenico tra catene polipeptidiche (cross-linking)
• Formalina al 10%: formaldeide polimerizzata in soluzione acquosa satura al 40% e successivamente diluita 1:10 (detta anche formaldeide 4%)
• Formalina salata: 100 ml di formaldeide al 40% + 9 g di NaCl + 900 ml di H20; è una soluzione isotonica che impedisce la coartazione ed il rigonfiamento cellulare
• Formalina nel tamponata: 100 ml di formaldeide 40% + 900 ml di H20 + 4 g di fosfato acido di sodio + 6.5 g di fosfato disodico anidro; impedisce l’acidificazione dei tessuti (fenomeno dovuto alla trasformazione della formaldeide in acido formico), mantenendo il pH a 7.0.
Modi di Applicazione ( 1 )Modi di Applicazione ( 1 ) Immersione
Il campione deve essere immerso in almeno
20 volte volume di fissativo
Ottima fissazione se:
• dimensioni adeguate (< 3 mm di spessore)
• minimo intervallo tra asportazione e immersione
(< 30 m ottimale) ( le cellule, tolte dall’organismo,
non sono più ossigenate e muoiono in un tempo
variabile)
Immersione
Il campione deve essere immerso in almeno
20 volte volume di fissativo
Ottima fissazione se:
• dimensioni adeguate (< 3 mm di spessore)
• minimo intervallo tra asportazione e immersione
(< 30 m ottimale) ( le cellule, tolte dall’organismo,
non sono più ossigenate e muoiono in un tempo
variabile)
Modi di ApplicazioneModi di Applicazione Immersione
Importante il tipo di contenitore ( a bocca larga )
e le dimensioni.
Importanti le indicazioni sul recipiente
(non sul coperchio)
Nome, data, Numero; provenienza
Immersione
Importante il tipo di contenitore ( a bocca larga )
e le dimensioni.
Importanti le indicazioni sul recipiente
(non sul coperchio)
Nome, data, Numero; provenienza
Modi di Applicazione ( 2 )Modi di Applicazione ( 2 )Perfusione a circolazione chiusa in forma liquida
(aldeidi)
Distanza tra vasi e cellule: max. 100 micronsDiffusione: penetrazione del fissativo e raggiungimento della
adeguata concentrazione nel tessuto.
Dipende da: rapporto di diffusione del fissativo che a sua volta
dipende da:• Concentrazione• Temperatura• Natura dl fissativo• Topografia del tessuto in rapporto al fissativo• Tipo di tessuto• Cross Link o coagulazione
Perfusione a circolazione chiusa in forma liquida (aldeidi)
Distanza tra vasi e cellule: max. 100 micronsDiffusione: penetrazione del fissativo e raggiungimento della
adeguata concentrazione nel tessuto.
Dipende da: rapporto di diffusione del fissativo che a sua volta
dipende da:• Concentrazione• Temperatura• Natura dl fissativo• Topografia del tessuto in rapporto al fissativo• Tipo di tessuto• Cross Link o coagulazione
Modi di Applicazione ( 3 )Modi di Applicazione ( 3 )
Esposizione di cellule e tessuti disidratati (liofilizzati) a fissativi in forma gassosa (aldeidi) ad
elevata temperatura ( 80°c )
Usata solo per applicazioni particolari in istochimica per rivelare amine biogene ( noradrenalina, serotonina, dopamina)
Esposizione di cellule e tessuti disidratati (liofilizzati) a fissativi in forma gassosa (aldeidi) ad
elevata temperatura ( 80°c )
Usata solo per applicazioni particolari in istochimica per rivelare amine biogene ( noradrenalina, serotonina, dopamina)
Fissazione dei TessutiFissazione dei Tessuti
Fissativi alcolici• Alcool etilico 95°• Alcool etilico 95° ed etere etilico anaparti• Alcool metilico• Alcool metilico ed acetone anaparti
L’alcool di per sé, per il basso potenziale di ossidazione e per la moderata capacità di penetrazione, non è un buon fissativo per istologia ( ma è meglio di niente ); determina eccessiva coartazione ed indurimento dei tessuti, denatura le proteine e coagula grossolanamente il citoplasma; pertanto si preferisce utilizzarlo in associazione con altre componenti onde ottenere un fissativo più efficace ed omogeneo.
Si è soliti ricorrere all’alcool etilico 95° o all’alcool etilico 50° in egual volume al materiale prelevato come prefissaggio in citologia.
Fissativi alcolici• Alcool etilico 95°• Alcool etilico 95° ed etere etilico anaparti• Alcool metilico• Alcool metilico ed acetone anaparti
L’alcool di per sé, per il basso potenziale di ossidazione e per la moderata capacità di penetrazione, non è un buon fissativo per istologia ( ma è meglio di niente ); determina eccessiva coartazione ed indurimento dei tessuti, denatura le proteine e coagula grossolanamente il citoplasma; pertanto si preferisce utilizzarlo in associazione con altre componenti onde ottenere un fissativo più efficace ed omogeneo.
Si è soliti ricorrere all’alcool etilico 95° o all’alcool etilico 50° in egual volume al materiale prelevato come prefissaggio in citologia.
Fissazione dei TessutiFissazione dei Tessuti
Miscele fissatrici a base di alcool:• Liquido di Serra: composto da 2 parti di alcool
etilico 95° ed 1 parte di formaldeide 40% cui si aggiungono poche gocce di acido acetico glaciale
• Liquido di Carnoy: costituito da 6 parti di alcool etilico 99°, 3 parti di cloroformio ed 1 parte di acido acetico glaciale
• Liquido di Clarke: composto da 3 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di acido acetico glaciale
• Formalina alcoolica di Lillie: costituita da 9 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di formaldeide 40%
Miscele fissatrici a base di alcool:• Liquido di Serra: composto da 2 parti di alcool
etilico 95° ed 1 parte di formaldeide 40% cui si aggiungono poche gocce di acido acetico glaciale
• Liquido di Carnoy: costituito da 6 parti di alcool etilico 99°, 3 parti di cloroformio ed 1 parte di acido acetico glaciale
• Liquido di Clarke: composto da 3 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di acido acetico glaciale
• Formalina alcoolica di Lillie: costituita da 9 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di formaldeide 40%
Fissazione dei TessutiFissazione dei Tessuti Miscele fissatrici a base di acido picrico:
•Liquido di Bouin: composto dalla miscela di 15 parti di acido picrico in soluzione satura acquosa, 5 parti di formaldeide 40% ed 1 parte di acido acetico glaciale
•Liquido di Duboscq - Brasil: costituito da 150 ml di alcool etilico 80°, 60 ml di formaldeide 40%, 15 ml di acido acetico glaciale ed 1 g di acido picrico
Entrambi sono fissativi molto penetranti; tuttavia, la presenza dell’acido picrico e di quello acetico è di ostacolo ad eventuali indagini retrospettive e di estrazione del DNA e, inoltre, scioglie facilmente la maggior parte delle calcificazioni presenti.
Miscele fissatrici a base di acido picrico:
•Liquido di Bouin: composto dalla miscela di 15 parti di acido picrico in soluzione satura acquosa, 5 parti di formaldeide 40% ed 1 parte di acido acetico glaciale
•Liquido di Duboscq - Brasil: costituito da 150 ml di alcool etilico 80°, 60 ml di formaldeide 40%, 15 ml di acido acetico glaciale ed 1 g di acido picrico
Entrambi sono fissativi molto penetranti; tuttavia, la presenza dell’acido picrico e di quello acetico è di ostacolo ad eventuali indagini retrospettive e di estrazione del DNA e, inoltre, scioglie facilmente la maggior parte delle calcificazioni presenti.
Rischi e precauzioni d’uso per i fissativi
Rischi e precauzioni d’uso per i fissativi
Formaldeide : Potenziale allergenico (cancerogenicità) per
inalazione e contatto.
Uso di cappe aspiranti.
Alcool : Rischio incendi
Glutaraldeide
Ac. Picrico
Sali di Mercurio
Tetrossido di Osmio
Importante: uso di armadi dedicati e quantità limitate.
Formaldeide : Potenziale allergenico (cancerogenicità) per
inalazione e contatto.
Uso di cappe aspiranti.
Alcool : Rischio incendi
Glutaraldeide
Ac. Picrico
Sali di Mercurio
Tetrossido di Osmio
Importante: uso di armadi dedicati e quantità limitate.
Tempi d’uso per i fissativiTempi d’uso per i fissativi
Formaldeide 4% (= Formalina 10% )
Velocità di penetrazione = 0,5 cm in 24
Fissazione: Tempo varia a sec. delle dim. del frammento, da
3h a 24h
Alcool etilico 95% : penetra lentamente nei tessuti freschi
Fissazione: accettabile sono in cell. isolate e frammenti
piccoli ( diam 1-2 mm)
Formaldeide 4% (= Formalina 10% )
Velocità di penetrazione = 0,5 cm in 24
Fissazione: Tempo varia a sec. delle dim. del frammento, da
3h a 24h
Alcool etilico 95% : penetra lentamente nei tessuti freschi
Fissazione: accettabile sono in cell. isolate e frammenti
piccoli ( diam 1-2 mm)
Tecnica di inclusione in paraffina :
• Si effettua di routine su campioni privi di problemi particolari, tenendo presente che, con essa, si rendono solubili e si asportano dai tessuti i grassi.
• La paraffina (a punto di fusione di 58 - 60 °C) è chimicamente inattiva e conserva bene i tessuti che devono essere disidratati con immersione in alcool etilico (70°, 95° 99°) e diafanizzati con solventi della paraffina (cloroformio, benzene, toluene, xilene) prima di venire impregnati in essa e successivamente inclusi in blocchetti.
• In genere, il processo di inclusione avviene mediante l’ uso di inclusori automatici, fatti funzionare in ore notturne, e di dispensatori di paraffina, utilizzati per ottenere dei blocchetti ben compatti che contengono il tessuto pronto per essere sezionato con gli appositi microtomi.
Tecnica di inclusione in paraffina :
• Si effettua di routine su campioni privi di problemi particolari, tenendo presente che, con essa, si rendono solubili e si asportano dai tessuti i grassi.
• La paraffina (a punto di fusione di 58 - 60 °C) è chimicamente inattiva e conserva bene i tessuti che devono essere disidratati con immersione in alcool etilico (70°, 95° 99°) e diafanizzati con solventi della paraffina (cloroformio, benzene, toluene, xilene) prima di venire impregnati in essa e successivamente inclusi in blocchetti.
• In genere, il processo di inclusione avviene mediante l’ uso di inclusori automatici, fatti funzionare in ore notturne, e di dispensatori di paraffina, utilizzati per ottenere dei blocchetti ben compatti che contengono il tessuto pronto per essere sezionato con gli appositi microtomi.
INCLUSIONE DEI TESSUTIINCLUSIONE DEI TESSUTI
DisidratazioneDisidratazioneETANOLO
METANOLO
ACETONE
PROPANEDIOLO
ETANOLO
METANOLO
ACETONE
PROPANEDIOLO
ChiarificazioneChiarificazione
XILOLO
BENZOLO
CLOROFORMIO
XILOLO
BENZOLO
CLOROFORMIO
InclusioneInclusioneParaffina
Gelatina / Agar
Celloidina
Resine
Paraffina
Gelatina / Agar
Celloidina
Resine
• Idrosolubili (Metacrilati)• Idrosolubili (Metacrilati)
• Epossidiche• Epossidiche
Congelamento dei tessutiCongelamento dei tessuti
• Effetti del congelamento
• Metodi di congelamento
• Effetti del congelamento
• Metodi di congelamento
• Blocchi di metallo
• Produzione di “Neve CO2”
• Ghiaccio secco
• Appar. Termo-elettrici
• Gas liquidi (N2)
• Blocchi di metallo
• Produzione di “Neve CO2”
• Ghiaccio secco
• Appar. Termo-elettrici
• Gas liquidi (N2)
Sostanze “Protettive”• Glicerolo / DMSOSostanze “Protettive”• Glicerolo / DMSO
METODO IDEALE
FREON
ISOPENTANO
METODO IDEALE
FREON
ISOPENTANOConservazione di tessuti e cellule
Conservazione di tessuti e cellule
METODI RAPIDIMETODI RAPIDI Metodo T (°C) Efficienza Metodo T (°C) Efficienza
Tessuti in liquidi refrigerati
Tessuti in liquidi refrigerati
Tessuti in contatto dimetalli refrigerati
Tessuti in contatto dimetalli refrigerati
Fluido organicoIn gas liquido (N2)
Fluido organicoIn gas liquido (N2)
Fluido organicoIn ghiaccio secco Liquido organico
Fluido organicoIn ghiaccio secco Liquido organico
RaffreddamentoTermo-elettricoRaffreddamentoTermo-elettrico
Supporto metallicoRaffreddato per conduzione
Supporto metallicoRaffreddato per conduzione
aa
aa
bb
- 196- 196
- 79- 79
- 30- 30
- 40- 40
Il più veloceIl più veloce
Ottimale per lamaggior parte delleapplicazioni in M.O
Ottimale per lamaggior parte delleapplicazioni in M.O
scarsascarsa
scarsascarsa
a: N-esano, isopentano, miscele di butano e pentano
b: giaccio secco in miscela con etanolo, metanolo o acetone
a: N-esano, isopentano, miscele di butano e pentano
b: giaccio secco in miscela con etanolo, metanolo o acetone
SezionamentoSezionamento
• Microtomo
• Criostato
• Ultra-microtomia M.E.
• Microtomo
• Criostato
• Ultra-microtomia M.E.
• Temp. ideali per i vari tipi di tessuto
• Lama
• Tratt. delle sezioni1) Essicamento (+
fissazione) 2) Freeze drying o altri
metodi
• Temp. ideali per i vari tipi di tessuto
• Lama
• Tratt. delle sezioni1) Essicamento (+
fissazione) 2) Freeze drying o altri
metodi
Rischio
ambientale
Rischio
ambientale
Freeze – Drying (Liofilizzazione)
Freeze – Drying (Liofilizzazione)
• Principi
• Applicazione ai tessuti
• Trattamento successivo
• Principi
• Applicazione ai tessuti
• Trattamento successivo
Freeze – SobstitutionFreeze – Sobstitution
• Condiz. di congelamento
• Condiz. di liofilizzazione
Temp. Tempo
Trappola di N2O
• Condiz. di congelamento
• Condiz. di liofilizzazione
Temp. Tempo
Trappola di N2O
Inclusione in paraffina Inclusione in paraffina
Fissazione in vapori Fissazione in vapori
Tecnica di preparazione delle sezioni in paraffina, di circa 3 µ, per essere colorate :
E’ un procedimento atto ad assicurare che la paraffina, non miscibile con acqua ed alcool, venga eliminata ed il tessuto possa essere impregnato dal colorante. Quindi è necessario utilizzare dei solventi della paraffina ed idratare gradualmente il tessuto sino all’ H2O distillata. Nel caso in cui il colorante sia in soluzione alcoolica ci si arresta all’ alcool 95°.
Tecnica di preparazione delle sezioni in paraffina, di circa 3 µ, per essere colorate :
E’ un procedimento atto ad assicurare che la paraffina, non miscibile con acqua ed alcool, venga eliminata ed il tessuto possa essere impregnato dal colorante. Quindi è necessario utilizzare dei solventi della paraffina ed idratare gradualmente il tessuto sino all’ H2O distillata. Nel caso in cui il colorante sia in soluzione alcoolica ci si arresta all’ alcool 95°.
SPARAFFINATURA DELLE SEZIONISPARAFFINATURA DELLE SEZIONI
• xilolo 5 ’
• xilolo 5 ’
• xilolo 5 ’
• etanolo 100° 5 ’
• etanolo 100° 5 ’
• etanolo 100° 5 ’
• etanolo 95° 5 ’
• etanolo 70° 5 ’
• etanolo 50° 5 ’
• H2O distillata ––›
• ––› colorazione
• xilolo 5 ’
• xilolo 5 ’
• xilolo 5 ’
• etanolo 100° 5 ’
• etanolo 100° 5 ’
• etanolo 100° 5 ’
• etanolo 95° 5 ’
• etanolo 70° 5 ’
• etanolo 50° 5 ’
• H2O distillata ––›
• ––› colorazione
Colorazione dei tessutiColorazione dei tessuti• Composizione (Gruppi reattivi –SO4 / = PO4 / - COOH / - O / - S/ -NH3)
• Tipo di colorante / pH / Solventi / Additivi
• Tipo di legame
• Composizione (Gruppi reattivi –SO4 / = PO4 / - COOH / - O / - S/ -NH3)
• Tipo di colorante / pH / Solventi / Additivi
• Tipo di legametra colorante e tessutotra colorante e tessuto
• Ionico (Salino – elettrostatico)
• Covalenti (tra non metalli = elettroni condivisi tra due atomi)
• Complessi es. gruppi aldeidici R. Schiff (atomo centrale con 1 o 2 legami) es Ag. Diammina
• Intermolecolari (van der Waal)
• Ionico (Salino – elettrostatico)
• Covalenti (tra non metalli = elettroni condivisi tra due atomi)
• Complessi es. gruppi aldeidici R. Schiff (atomo centrale con 1 o 2 legami) es Ag. Diammina
• Intermolecolari (van der Waal)
Colorazione dei tessutiColorazione dei tessuti
• Colorazione di macromolecole sulla base di cariche (ioniche)
• Componenti tissutali
• Coloranti
• Colorazione di macromolecole sulla base di cariche (ioniche)
• Componenti tissutali
• Coloranti
• Basofile
• Acidofile
• Neutrofile
• Basofile
• Acidofile
• Neutrofile
• Cationici (basici)
• Anionici (acidi)
• Cationici (basici)
• Anionici (acidi)
COLORANTICOLORANTI : DEFINIZIONE : DEFINIZIONECROMOGENO ( CROMOGENO ( Luce visibileLuce visibile 400- 400-800 800
mm)mm)
Criteri di purezzaCriteri di purezza SpettroSpettro
Gruppi cromoforiGruppi cromofori-N -N -N -N azoazo c=cc=c alkenealkene N = O N = O nitrosonitroso c=oc=o oxooxo N - O2N - O2 nitronitro (gruppi auxocromi)(gruppi auxocromi)
es: -SHes: -SH
NOMENCLATURANOMENCLATURAcoloranticoloranti
COLORANTICOLORANTI : DEFINIZIONE : DEFINIZIONECROMOGENO ( CROMOGENO ( Luce visibileLuce visibile 400- 400-800 800
mm)mm)
Criteri di purezzaCriteri di purezza SpettroSpettro
Gruppi cromoforiGruppi cromofori-N -N -N -N azoazo c=cc=c alkenealkene N = O N = O nitrosonitroso c=oc=o oxooxo N - O2N - O2 nitronitro (gruppi auxocromi)(gruppi auxocromi)
es: -SHes: -SH
NOMENCLATURANOMENCLATURAcoloranticoloranti
NITRONITROAZOAZOCHINONICICHINONICI
NITRONITROAZOAZOCHINONICICHINONICI
Pratica di colorazione dei tessutiPratica di colorazione dei tessuti
Reattivi Reattivi PurezzaPurezza
AcquaAcqua
Etichetta sui reattiviEtichetta sui reattivi
ConservazioneConservazione
Scarto /Scarto / ScaricamentoScaricamento
Reattivi Reattivi PurezzaPurezza
AcquaAcqua
Etichetta sui reattiviEtichetta sui reattivi
ConservazioneConservazione
Scarto /Scarto / ScaricamentoScaricamento
Technical quality Purified / Pure / Very pure Analytical grade
Technical quality Purified / Pure / Very pure Analytical grade
Coloranti(Assorbimento colore osservato)
Coloranti(Assorbimento colore osservato)
Coloranti cationici Nuclei / Batteri
pH 3-4 per la completa ionizzazione di gruppi di
fosfato DNA / RNA (selettivo)
es. col. GRAM
Effetto di diversi fissativi / Concentrazione di sali
Coloranti cationici Nuclei / Batteri
pH 3-4 per la completa ionizzazione di gruppi di
fosfato DNA / RNA (selettivo)
es. col. GRAM
Effetto di diversi fissativi / Concentrazione di sali
+ Cresyl-violetto + I2
- col. Rosso = Fucsina
+ Cresyl-violetto + I2
- col. Rosso = Fucsina
ZIEL-NIELSENZIEL-NIELSEN
· EMATEINAEMATEINA ossidazione di ematossilinaossidazione di ematossilina
Compl. con ALCompl. con AL EMALLUME EMALLUME (Mayer - (Mayer -
Carazzi)Carazzi)
FeFe EMAT. HARRIS - Lillie EMAT. HARRIS - Lillie
· EMATEINAEMATEINA ossidazione di ematossilinaossidazione di ematossilina
Compl. con ALCompl. con AL EMALLUME EMALLUME (Mayer - (Mayer -
Carazzi)Carazzi)
FeFe EMAT. HARRIS - Lillie EMAT. HARRIS - Lillie
COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)
progressiveprogressive - Differenziazione- DifferenziazioneEmatossilineEmatossiline
regressiveregressive - pH- pH
progressiveprogressive - Differenziazione- DifferenziazioneEmatossilineEmatossiline
regressiveregressive - pH- pH
Colorazione dei tessutiColorazione dei tessuti Reazione di Blocco Reazione di Blocco
• Ossidazione - Ossidanti
• Riduzione
• Acilazione / Alchilazione (form. di derivati acidi)
• Saponificazione (idrolisi di derivati acidi
• Deaminazione
• Ossidazione - Ossidanti
• Riduzione
• Acilazione / Alchilazione (form. di derivati acidi)
• Saponificazione (idrolisi di derivati acidi
• Deaminazione
Deboli
Medi
Forti
Deboli
Medi
Forti
H2O2 / I2
Ac. Perform.
Permanganato
H2O2 / I2
Ac. Perform.
Permanganato
• sezioni in H2O distillata
• Emallume acido di Mayer,
filtrato, 7’
• lavare H2O di fonte 10’
• soluzione satura Li2CO3 15”
• lavare H2O di fonte 10’
• sezioni in H2O distillata
• Emallume acido di Mayer,
filtrato, 7’
• lavare H2O di fonte 10’
• soluzione satura Li2CO3 15”
• lavare H2O di fonte 10’
• Eosina [0.25 %], acidificata con
qualche goccia di CH3COOH
1’
• lavare in H2O distillata 2’
• disidratare in etanolo 95° 4’
• disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
• Eosina [0.25 %], acidificata con
qualche goccia di CH3COOH
1’
• lavare in H2O distillata 2’
• disidratare in etanolo 95° 4’
• disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE DI ROUTINE IN ISTOLOGIA Ematossilina - Eosina
COLORAZIONE DI ROUTINE IN ISTOLOGIA Ematossilina - Eosina
Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma rossoRisultati : nucleo blu scuro; citoplasma rosso
Colorazione con coloranti basiciColorazione con coloranti basici
La colorabilità dipende da vari fattori:La colorabilità dipende da vari fattori:
• pH
• disidratazione
• fissazione
• temperatura
• pH
• disidratazione
• fissazione
• temperatura
Colorazione con coloranti basiciColorazione con coloranti basici
Dipende da:Dipende da:
• pH della soluzione
• Tipo di colorante
• Tempo e temperatura
• Tampone
• Trattamento dopo la colorazione
• pH della soluzione
• Tipo di colorante
• Tempo e temperatura
• Tampone
• Trattamento dopo la colorazione
Meccanismo:Meccanismo:
• Aggregati di coloranti legati a gruppi acidi
• Legame ionico + f. van der Waal
es. Blu di Toluidina
• Aggregati di coloranti legati a gruppi acidi
• Legame ionico + f. van der Waal
es. Blu di Toluidina
MetacromasiaMetacromasia Visibile
U.V.
Visibile
U.V.
Alcool
resist.
Alcool
resist.
+
-
+
-
PASPAS
H C OH
H C OH
H C OH
H C OH
H C
H C
H C
H C
OO
• sezioni in H2O distillata
• soluzione Alcian blu 8 GX
[1% in CH3COOH 3 %] 30 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• contrasto nucleare con NFR
(rosso nucleare neutro [1 %]
in solfato di alluminio [5 %]
a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’
• sezioni in H2O distillata
• soluzione Alcian blu 8 GX
[1% in CH3COOH 3 %] 30 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• contrasto nucleare con NFR
(rosso nucleare neutro [1 %]
in solfato di alluminio [5 %]
a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• disidratare in etanolo 95°
4’
• disidratare in etanolo 100°
4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
• lavare in H2O distillata 5 ’
• disidratare in etanolo 95°
4’
• disidratare in etanolo 100°
4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ALCIAN BLU pH 2.5”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ALCIAN BLU pH 2.5”
Risultati : nucleo rosso intenso; glico - proteine acide blu - verde; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue
Risultati : nucleo rosso intenso; glico - proteine acide blu - verde; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue
• sezioni in H2O distillata
• alcune sezioni possono essere pre-trattate con -amilasi (diastasi) [0.1 % in PBS] a 37 °C 30 ’
• HIO4 (acido periodico) [0.5 - 1 % in H2O distillata] 15 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• reattivo di Schiff (fucsina solforosa) 45 - 60 ’
• lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 ’
• lavare in H2O di fonte 15’
• sezioni in H2O distillata
• alcune sezioni possono essere pre-trattate con -amilasi (diastasi) [0.1 % in PBS] a 37 °C 30 ’
• HIO4 (acido periodico) [0.5 - 1 % in H2O distillata] 15 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• reattivo di Schiff (fucsina solforosa) 45 - 60 ’
• lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 ’
• lavare in H2O di fonte 15’
• contrasto nucleare con
emallume 5 ’
• lavare in H2O di fonte 15 ’
• disidratare in etanolo 95°
4’
• disidratare in etanolo 100°
4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
• contrasto nucleare con
emallume 5 ’
• lavare in H2O di fonte 15 ’
• disidratare in etanolo 95°
4’
• disidratare in etanolo 100°
4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PAS (acido periodico di Schiff) e PAS
Diastasi”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PAS (acido periodico di Schiff) e PAS
Diastasi”
Risultati : nucleo blu scuro; glicogeno e glico-proteine neutre rosso magenta. Dopo pretrattamento con diastasi il glicogeno non si colora
Risultati : nucleo blu scuro; glicogeno e glico-proteine neutre rosso magenta. Dopo pretrattamento con diastasi il glicogeno non si colora
• sezioni in H2O distillata
• soluzione Alcian blu 8 GX
[1% in CH3COOH 3 %] 30 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• HIO4 (acido periodico) [0.5 - 1 % in H2O distillata] 15 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• reattivo di Schiff (fucsina solforosa) 45 - 60 ’
• lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 ’
• sezioni in H2O distillata
• soluzione Alcian blu 8 GX
[1% in CH3COOH 3 %] 30 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• HIO4 (acido periodico) [0.5 - 1 % in H2O distillata] 15 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• reattivo di Schiff (fucsina solforosa) 45 - 60 ’
• lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 ’
• lavare in H2O distillata 10’
• contrasto nucleare con
ematossilina Carazzi 5 ’
• lavare in H2O di fonte 15 ’
• disidratare in etanolo 95°
4’
• disidratare in etanolo 100°
4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
• lavare in H2O distillata 10’
• contrasto nucleare con
ematossilina Carazzi 5 ’
• lavare in H2O di fonte 15 ’
• disidratare in etanolo 95°
4’
• disidratare in etanolo 100°
4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ALCIAN - PAS (VIALLI)”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ALCIAN - PAS (VIALLI)”
Risultati : nucleo blu scuro; glico - proteine acide blu - verde; glico - proteine, glicogeno e sostanze PAS+ rosso - magenta; collagene rosso; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue; altre strutture giallo
Risultati : nucleo blu scuro; glico - proteine acide blu - verde; glico - proteine, glicogeno e sostanze PAS+ rosso - magenta; collagene rosso; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue; altre strutture giallo
• sezioni in H2O distillata
• immergere in alcool isopropilico 60 % 5’
• soluzione di Oil Red O [0,5 % in 200 ml di alcool isopropilico 100°] agitata a caldo e filtrata 20’
• differenziare in alcool isopropilico 60° 20”
• lavare in H2O di fonte 5’
• eventuale colorazione nucleare con ematossilina 5’
• lavare in H2O di fonte 10’
• montare in glicerina e lutare
• sezioni in H2O distillata
• immergere in alcool isopropilico 60 % 5’
• soluzione di Oil Red O [0,5 % in 200 ml di alcool isopropilico 100°] agitata a caldo e filtrata 20’
• differenziare in alcool isopropilico 60° 20”
• lavare in H2O di fonte 5’
• eventuale colorazione nucleare con ematossilina 5’
• lavare in H2O di fonte 10’
• montare in glicerina e lutare
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DELL’ OIL RED O x I LIPIDI”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DELL’ OIL RED O x I LIPIDI”
Risultati : lipidi neutri ed esteri di colesterolo rosso; fosfolipidi rosa pallido; nuclei blu - scuroRisultati : lipidi neutri ed esteri di colesterolo rosso; fosfolipidi rosa pallido; nuclei blu - scuro
• sezioni in H2O distillata
• immergere in alcool etilico 55 ° 5’
• soluzione satura di Sudan nero B in alcool etilico 55 ° 40’
• differenziare in alcool etilico 55° 20”
• lavare in H2O di fonte 5’
• montare in glicerina e lutare
• sezioni in H2O distillata
• immergere in alcool etilico 55 ° 5’
• soluzione satura di Sudan nero B in alcool etilico 55 ° 40’
• differenziare in alcool etilico 55° 20”
• lavare in H2O di fonte 5’
• montare in glicerina e lutare
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO AL SUDAN NERO B x I LIPIDI”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO AL SUDAN NERO B x I LIPIDI”
Risultati : lipidi neutri blu - nero; con tale metodo si colorano anche gli steridi, gli acidi grassi, i fosfolipidi e i glicolipidi. I nuclei ed i proteoglicani acidi si colorano in bruno, tuttavia ben differenziato dal colore dei lipidi
Risultati : lipidi neutri blu - nero; con tale metodo si colorano anche gli steridi, gli acidi grassi, i fosfolipidi e i glicolipidi. I nuclei ed i proteoglicani acidi si colorano in bruno, tuttavia ben differenziato dal colore dei lipidi
• sezioni in H2O distillata
• immergere in alcool etilico 70 ° 5’
• soluzione satura in parti eguali di Sudan III e IV miscelata in alcool etilico 70 ° ed acetone in parti eguali 10’
• differenziare in alcool etilico 50° 20”
• lavare in H2O di fonte 5’
• Emallume acido di Mayer, filtrato, 7’
• lavare in H2O di fonte 5’
• montare in glicerina e lutare
• sezioni in H2O distillata
• immergere in alcool etilico 70 ° 5’
• soluzione satura in parti eguali di Sudan III e IV miscelata in alcool etilico 70 ° ed acetone in parti eguali 10’
• differenziare in alcool etilico 50° 20”
• lavare in H2O di fonte 5’
• Emallume acido di Mayer, filtrato, 7’
• lavare in H2O di fonte 5’
• montare in glicerina e lutare
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO AL SUDAN III e SUDAN IV”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO AL SUDAN III e SUDAN IV”
Risultati : lipidi neutri da rosso ad arancio; nuclei blu - scuroRisultati : lipidi neutri da rosso ad arancio; nuclei blu - scuro
• sezioni in H2O distillata
• immergere in soluzione contenente Orceina [1 g + 0.4 ml acido nitrico + 100 ml alcool etilico 95 °] 24 h
• lavare l’ eccesso di colorante in alcool etilico 85 ° 2’
• lavare H2O distillata 10’
• colorare con miscela contenente : [0.35 g Blu di alizarina acido + solfato di alluminio 10 g / 100 ml H2O distillata] 10’
• lavare H2O distillata 10’
• sezioni in H2O distillata
• immergere in soluzione contenente Orceina [1 g + 0.4 ml acido nitrico + 100 ml alcool etilico 95 °] 24 h
• lavare l’ eccesso di colorante in alcool etilico 85 ° 2’
• lavare H2O distillata 10’
• colorare con miscela contenente : [0.35 g Blu di alizarina acido + solfato di alluminio 10 g / 100 ml H2O distillata] 10’
• lavare H2O distillata 10’
• soluzione acquosa di acido fosfomolibdico [5 % ] 20’
• lavare H2O distillata 10’
• soluzione contenente : [Orange G 2 g + verde luce 0.2 g + CH3COOH 2 ml /100 ml H2O distillata] 10’
• lavare H2O di fonte 5’
• disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
• soluzione acquosa di acido fosfomolibdico [5 % ] 20’
• lavare H2O distillata 10’
• soluzione contenente : [Orange G 2 g + verde luce 0.2 g + CH3COOH 2 ml /100 ml H2O distillata] 10’
• lavare H2O di fonte 5’
• disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ORCEINA x FIBRE ELASTICHE”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ORCEINA x FIBRE ELASTICHE”
Risultati : fibre elastiche bruno - rossastro; fibre muscolari e citoplasma violetto; fibre collagene e reticolari verde; eritrociti e mielina arancione; nuclei e strutture basofile blu scuro
Risultati : fibre elastiche bruno - rossastro; fibre muscolari e citoplasma violetto; fibre collagene e reticolari verde; eritrociti e mielina arancione; nuclei e strutture basofile blu scuro
• sezioni in H2O distillata• ossidare in permanganato di
K ( KMnO4 ) 5’• lavare in H2O di fonte 5’• soluzione di acido ossalico
(C2H2O4) 1’• lavare in H2O di fonte 5’• mordenzare in Allume ferrico
[2 %] 5’• lavare in H2O di fonte 5’• lavare in H2O distillata• soluzione di Argento nitrato
(AgNO3) ammoniacale [10 %] al buio 5 - 8’
• lavare in H2O distillata• sviluppare in soluzione di
formalina [10 %] 3’
• sezioni in H2O distillata• ossidare in permanganato di
K ( KMnO4 ) 5’• lavare in H2O di fonte 5’• soluzione di acido ossalico
(C2H2O4) 1’• lavare in H2O di fonte 5’• mordenzare in Allume ferrico
[2 %] 5’• lavare in H2O di fonte 5’• lavare in H2O distillata• soluzione di Argento nitrato
(AgNO3) ammoniacale [10 %] al buio 5 - 8’
• lavare in H2O distillata• sviluppare in soluzione di
formalina [10 %] 3’
• lavare in H2O di fonte 5’• lavare in H2O distillata• differenziare in Cloruro oro
(HAuCl4) [1 %] 8 - 10’• lavare in sodio tiosolfato
(Na2SO2O3) [5 %] 5’• lavare H2O di fonte 5’• contrasto nucleare con NFR
(rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’
• lavare H2O di fonte 5’• disidratare in etanolo 95°
4’• disidratare in etanolo 100°
4’ (3 cambi)• chiarificare in xilolo (3 cambi)• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
• lavare in H2O di fonte 5’• lavare in H2O distillata• differenziare in Cloruro oro
(HAuCl4) [1 %] 8 - 10’• lavare in sodio tiosolfato
(Na2SO2O3) [5 %] 5’• lavare H2O di fonte 5’• contrasto nucleare con NFR
(rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’
• lavare H2O di fonte 5’• disidratare in etanolo 95°
4’• disidratare in etanolo 100°
4’ (3 cambi)• chiarificare in xilolo (3 cambi)• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI GOMORI PER IL RETICOLO”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI GOMORI PER IL RETICOLO”
Risultati : fibre reticolari nero; collagene ocra -bruno scuro; nuclei rosso intensoN. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)
Risultati : fibre reticolari nero; collagene ocra -bruno scuro; nuclei rosso intensoN. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)
• sezioni in H2O distillata
• ossidare con soluzione di KMnO4 (permanganato di K) 5’
• lavare H2O di fonte 5’
• soluzione di C2H2O4 (acido ossalico) 1’
• lavare H2O di fonte 5’
• soluzione di Weigert (resorcina - fucsina) a 60° C
120’
• lavare H2O di fonte 10’
• Emallume acido di Mayer, filtrato, 3’
• sezioni in H2O distillata
• ossidare con soluzione di KMnO4 (permanganato di K) 5’
• lavare H2O di fonte 5’
• soluzione di C2H2O4 (acido ossalico) 1’
• lavare H2O di fonte 5’
• soluzione di Weigert (resorcina - fucsina) a 60° C
120’
• lavare H2O di fonte 10’
• Emallume acido di Mayer, filtrato, 3’
• lavare H2O di fonte 10’
• soluzione satura Li2CO3 15”
• lavare H2O di fonte 10’
• soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml) 3’
• lavare H2O di fonte 5’
• disidratare in etanolo 95°4’
• disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
• lavare H2O di fonte 10’
• soluzione satura Li2CO3 15”
• lavare H2O di fonte 10’
• soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml) 3’
• lavare H2O di fonte 5’
• disidratare in etanolo 95°4’
• disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ELASTIC - VAN GIESON”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ELASTIC - VAN GIESON”
Risultati : fibre elastiche marrone scuro - nero; collagene rosa - rosso; connettivo giallo; nuclei blu scuro
Risultati : fibre elastiche marrone scuro - nero; collagene rosa - rosso; connettivo giallo; nuclei blu scuro
• La M.E. utilizza il potere separatore, a brevissima lunghezza d’ onda, delle radiazioni elettroniche emesse dal cannone elettronico (Filamento di Tungsteno e cilindro di Wehnelt) che consentono di ottenere, in modo appropriato con lenti elettro-magnetiche, ingrandimenti lineari di 30.000 x ed oltre.
• M.E.T. = Microscopia elettronica a trasmissione; permette di ottenere l’ immagine elettronica, riprodotta su lastra fotografica o su schermo fluorescente, reale ed ingrandita di una sezione di tessuto (spessa da 10 a 100 nm), i cui punti possono essere attraversati o meno da un fascio di elettroni.
• M.E.S. = Microscopia elettronica a scansione; permette di ottenere un perfetto esame tridimensionale della superficie di un oggetto o un pezzo anatomico o biologico, scandendo il fascio di elettroni la superficie per linee successive, come un pennello elettronico. L’ immagine si ottiene direttamente su tubo a raggi catodici. L’ ingrandimento finale è da 20 a 100.000 x.
• Dato il potere di penetrazione molto basso degli elettroni, le sezioni devono essere ultra-sottili (60-150 nm), fissate in Tetraossido di Osmio o in Glutaraldeide, incluse in resina e colorate con sali di metalli pesanti(acetato di Uranile e citrato di Piombo), onde aumentare il contrasto dell’ immagine.
• La M.E. utilizza il potere separatore, a brevissima lunghezza d’ onda, delle radiazioni elettroniche emesse dal cannone elettronico (Filamento di Tungsteno e cilindro di Wehnelt) che consentono di ottenere, in modo appropriato con lenti elettro-magnetiche, ingrandimenti lineari di 30.000 x ed oltre.
• M.E.T. = Microscopia elettronica a trasmissione; permette di ottenere l’ immagine elettronica, riprodotta su lastra fotografica o su schermo fluorescente, reale ed ingrandita di una sezione di tessuto (spessa da 10 a 100 nm), i cui punti possono essere attraversati o meno da un fascio di elettroni.
• M.E.S. = Microscopia elettronica a scansione; permette di ottenere un perfetto esame tridimensionale della superficie di un oggetto o un pezzo anatomico o biologico, scandendo il fascio di elettroni la superficie per linee successive, come un pennello elettronico. L’ immagine si ottiene direttamente su tubo a raggi catodici. L’ ingrandimento finale è da 20 a 100.000 x.
• Dato il potere di penetrazione molto basso degli elettroni, le sezioni devono essere ultra-sottili (60-150 nm), fissate in Tetraossido di Osmio o in Glutaraldeide, incluse in resina e colorate con sali di metalli pesanti(acetato di Uranile e citrato di Piombo), onde aumentare il contrasto dell’ immagine.
MICROSCOPIA ELETTRONICAMICROSCOPIA ELETTRONICA
MICROSCOPIA ELETTRONICA“METODO DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI”
MICROSCOPIA ELETTRONICA“METODO DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI”
• taglio delle sezioni ultra-sottili con ultra-microtomo con lama di cristallo o di diamante
• le sezioni, di spessore appropriato, vengono raccolte su dei retini di rame circolari e di 3 mm di Ø
• colorare con acetato di uranile in soluzione acquosa satura 10’
• lavare in H2O distillata
• colorare con citrato di piombo
10’
• lavare in H2O distillata
• far seguire la disidratazione secondo le tecniche usuali
• osservare al M.E.
• taglio delle sezioni ultra-sottili con ultra-microtomo con lama di cristallo o di diamante
• le sezioni, di spessore appropriato, vengono raccolte su dei retini di rame circolari e di 3 mm di Ø
• colorare con acetato di uranile in soluzione acquosa satura 10’
• lavare in H2O distillata
• colorare con citrato di piombo
10’
• lavare in H2O distillata
• far seguire la disidratazione secondo le tecniche usuali
• osservare al M.E.
• fissare un frammento di 1 mm3 in glutaraldeide [2.5 %] in buffer cacodilato o in PBS a 4 °C 2-6 h
• lavare in PBS (3 cambi) 10’
• post-fissazione in tetraossido di osmio [1.30 %] a 4 °C 2 h
• lavare in PBS 20’
• disidratare i campioni in serie ascendente di alcool 2-3 h
• chiarificare in toluene o in ossido di propilene 1 h
• resina epossidica EPON + toluene [1 : 1] RT 12 h
• resina epossidica EPON RT 12 h• inclusione in capsule di gelatina o di
plastica e polimerizzazione in stufa a 60 °C 48 h
• fissare un frammento di 1 mm3 in glutaraldeide [2.5 %] in buffer cacodilato o in PBS a 4 °C 2-6 h
• lavare in PBS (3 cambi) 10’
• post-fissazione in tetraossido di osmio [1.30 %] a 4 °C 2 h
• lavare in PBS 20’
• disidratare i campioni in serie ascendente di alcool 2-3 h
• chiarificare in toluene o in ossido di propilene 1 h
• resina epossidica EPON + toluene [1 : 1] RT 12 h
• resina epossidica EPON RT 12 h• inclusione in capsule di gelatina o di
plastica e polimerizzazione in stufa a 60 °C 48 h
Risultati : doppia colorazione con aumento del contrasto e maggior evidenza di particolari ultrastrutturali; immagini in bianco e nero e\o con tonalità di grigio.
Risultati : doppia colorazione con aumento del contrasto e maggior evidenza di particolari ultrastrutturali; immagini in bianco e nero e\o con tonalità di grigio.
Citologia
Finalità
Necessità di ottimale fissazione e colorazione delle varie componenti
Modalità di preparazione
Citologia
Finalità
Necessità di ottimale fissazione e colorazione delle varie componenti
Modalità di preparazione
Preparati citologiciPreparati citologici
• Cervice uterina
• Urine • Versamenti
• Bronchi
• Vie bilari
• Polmone• Mammella• Tiroide• Linfonodi
• Cervice uterina
• Urine • Versamenti
• Bronchi
• Vie bilari
• Polmone• Mammella• Tiroide• Linfonodi
• Striscio - Spatole• Citocentrifugati
• Striscio - Spatole• Citocentrifugati
• Spazzolati• Spazzolati
• Agoaspirati• Agoaspirati
• Microbiopsie• Microbiopsie
CitologiaCitologia
• Automatica
• Strisci
• Citocentrifuga Filtri Millipore
• Centrifugazione liquidi
• Inclusione di sedimenti
• Automatica
• Strisci
• Citocentrifuga Filtri Millipore
• Centrifugazione liquidi
• Inclusione di sedimenti
• Analisi d’immagine• Citometria di flusso
• Analisi d’immagine• Citometria di flusso
• Ago• Spatole• Anse
• Ago• Spatole• Anse
Agoaspirati
Sedimenti Fissazione Inclusione
Principali Fissativi
Agoaspirati
Sedimenti Fissazione Inclusione
Principali FissativiAlcool
Formalina
Alcool
Formalina O
H- C H
OH- C
H
• sezioni in H2O distillata
• Ematossilina di Harris, filtrata, 3’
• lavare H2O di fonte 5’
• soluzione alcool - acida a pH 3 (etanolo 70° + HCl) 10”
• lavare H2O di fonte 2’
• soluzione satura Li2CO3 15”
• lavare H2O di fonte 10’
• soluzione di etanolo 70° 2’
• soluzione di etanolo 95° 2’
• sezioni in H2O distillata
• Ematossilina di Harris, filtrata, 3’
• lavare H2O di fonte 5’
• soluzione alcool - acida a pH 3 (etanolo 70° + HCl) 10”
• lavare H2O di fonte 2’
• soluzione satura Li2CO3 15”
• lavare H2O di fonte 10’
• soluzione di etanolo 70° 2’
• soluzione di etanolo 95° 2’
• Colorare in Orange G 6 3’
• etanolo 95° (2 cambi) 20”
• Colorare in EA 50 3’
• etanolo 95° (2 cambi) 20”
• disidratare in etanolo 95° 4’
• disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
• Colorare in Orange G 6 3’
• etanolo 95° (2 cambi) 20”
• Colorare in EA 50 3’
• etanolo 95° (2 cambi) 20”
• disidratare in etanolo 95° 4’
• disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “PAPANICOLAOU”
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “PAPANICOLAOU”
Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma variante tra il blu-verdastro (basofilia) ed il rosa-arancione\rosso chiaro (eosinofilia)
Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma variante tra il blu-verdastro (basofilia) ed il rosa-arancione\rosso chiaro (eosinofilia)
Col. PapanicolauVantaggi ed eventi determinanti
• -Definizione dei dettagli nucleari
• -Trasparenza citoplasmatica
• -Differenziaione dei vari tipi cellulari
• -Corretta fissazione
• -Buona col. Nucleare
• -Coloranti con sol. altamente alcooliche
• -Adeguata diafanizzazione
• -Colorazione policromatica
Problemi di colorazione con Papanicolau
1)Coloraz. Nucleare pallida
-Insufficente rimozione di “fissativi a pellicola” (polietilen-
glicole + alcool etilico)-azione decolorante di HCl
-striscio parzialmente asciugato prima della fissazione
Problemi di colorazione con Papanicolau
1)Coloraz. Nucleare pallida
-Insufficente rimozione di “fissativi a pellicola” (polietilen-
glicole + alcool etilico)-azione decolorante di HCl
-striscio parzialmente asciugato prima della fissazione
Problemi di colorazione con Papanicolau
1)Coloraz. Nucleare pallida (2)
-pH dell’acqua corrente poco alcalino
-colorante troppo vecchio
Problemi di colorazione con Papanicolau
1)Coloraz. Nucleare pallida (2)
-pH dell’acqua corrente poco alcalino
-colorante troppo vecchio
Problemi di colorazione con Papanicolau
2)Coloraz. Nucleare troppo intensa
-fissazione con alcool >95%-tempo di immersione in HCl
troppo breve-striscio troppo spesso
che trattiene il colore
(N.B. è possibile decolorare)
Problemi di colorazione con Papanicolau
2)Coloraz. Nucleare troppo intensa
-fissazione con alcool >95%-tempo di immersione in HCl
troppo breve-striscio troppo spesso
che trattiene il colore
(N.B. è possibile decolorare)
Problemi di colorazione con Papanicolau
3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente
-permanenza in alcool 70% troppo lunga = decolorazione
-asciugatura dello striscio prima della fissazione = tutto rosa
Problemi di colorazione con Papanicolau
3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente
-permanenza in alcool 70% troppo lunga = decolorazione
-asciugatura dello striscio prima della fissazione = tutto rosa
Problemi di colorazione con Papanicolau
3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente
-striscio di alterno spessore-tempo di coloraz. scarso o non
scuotimento del cestello-scarsa col. con verde luce =
sostituire o pH non 4,5-5
Problemi di colorazione con Papanicolau
3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente
-striscio di alterno spessore-tempo di coloraz. scarso o non
scuotimento del cestello-scarsa col. con verde luce =
sostituire o pH non 4,5-5
Problemi di colorazione con Papanicolau
4) Riscio di inquinamento e trasporto di cellule
-filtrare i coloranti
Problemi di colorazione con Papanicolau
4) Riscio di inquinamento e trasporto di cellule
-filtrare i coloranti
• sezioni in H2O distillata
• Giemsa puro diluito in H2O al [10 o 20 %] 60’
• differenziare in CH3COOH diluito (0.4 ml acido acetico glaciale \ 100 ml H2O) 10”
• lavare in H2O distillata
• differenziare in etanolo 95°, controllando al microscopio
10”
• arrestare la differenziazione con alcool iso-propilico 2’
(3 cambi)
• sezioni in H2O distillata
• Giemsa puro diluito in H2O al [10 o 20 %] 60’
• differenziare in CH3COOH diluito (0.4 ml acido acetico glaciale \ 100 ml H2O) 10”
• lavare in H2O distillata
• differenziare in etanolo 95°, controllando al microscopio
10”
• arrestare la differenziazione con alcool iso-propilico 2’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
effetto Giemsa : produce una particolare colorazione viola -rossastra della cromatina del nucleo a causa dell’ eosinato di Azur.La soluzione di Giemsa pura è formata da eosinato di Azur II, contenente eosinato di Azur B ed eosinato di blu di metilene sciolti anaparti.
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
effetto Giemsa : produce una particolare colorazione viola -rossastra della cromatina del nucleo a causa dell’ eosinato di Azur.La soluzione di Giemsa pura è formata da eosinato di Azur II, contenente eosinato di Azur B ed eosinato di blu di metilene sciolti anaparti.
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GIEMSA”
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GIEMSA”
Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto* specialmente elettiva per le cellule del sangue *
Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto* specialmente elettiva per le cellule del sangue *
• sezioni fatte essiccare all’aria
• post-fissazione in metanolo
15’
• lavare in H2O di fonte 5’
• soluzione di Giemsa puro diluito al [15 %] in buffer fosfato a pH 6.8 (22 ml 0.5 M Na2HPO4 + 32 ml 0.5 M KH2PO4 / 1000 ml H2O distillata) 15’
• sezioni fatte essiccare all’aria
• post-fissazione in metanolo
15’
• lavare in H2O di fonte 5’
• soluzione di Giemsa puro diluito al [15 %] in buffer fosfato a pH 6.8 (22 ml 0.5 M Na2HPO4 + 32 ml 0.5 M KH2PO4 / 1000 ml H2O distillata) 15’
• lavare in H2O distillata
(3 cambi)
• fare asciugare a secco
• chiarificare in xilolo (3
cambi)
• montare in mezzo
d’inclusione (Entellan o
balsamo Canada)
• lavare in H2O distillata
(3 cambi)
• fare asciugare a secco
• chiarificare in xilolo (3
cambi)
• montare in mezzo
d’inclusione (Entellan o
balsamo Canada)
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GIEMSA modificato”
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GIEMSA modificato”
Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto(eseguito specie su strisci)
Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto(eseguito specie su strisci)
• sezioni in H2O distillata
• cristalvioletto o violetto di metile [1 %] 1 - 2’
• scolare eccesso di colorante
• soluzione di Lugol 3 0”
• lavare in H2O di fonte
• differenziare in soluzione di alcool - acetone 20”
• lavare in H2O di fonte
• fucsina basica o rosso neutro [1 %] 1 - 2’
• lavare in H2O di fonte e tamponare con carta bibula
• sezioni in H2O distillata
• cristalvioletto o violetto di metile [1 %] 1 - 2’
• scolare eccesso di colorante
• soluzione di Lugol 3 0”
• lavare in H2O di fonte
• differenziare in soluzione di alcool - acetone 20”
• lavare in H2O di fonte
• fucsina basica o rosso neutro [1 %] 1 - 2’
• lavare in H2O di fonte e tamponare con carta bibula
• disidratare in etanolo 100° 1’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
• disidratare in etanolo 100° 1’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GRAM”
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GRAM”
Risultati : Batteri Gram + blu scuro; batteri Gram - rosso; colorazione di fondo rosa N. B. : porre attenzione alla differenziazione
Risultati : Batteri Gram + blu scuro; batteri Gram - rosso; colorazione di fondo rosa N. B. : porre attenzione alla differenziazione
• sezioni in H2O distillata
• fucsina basica [10 ml di soluzione al 10 % in etanolo 100 °] in acido fenico [+100 ml fenolo 5 % in H2O distillata e filtrato]; flambare le sezioni sul bunsen sino a farle fumare
• lavare in H2O distillata
• differenziare in soluzione alcool - acida [HCl 3% in etanolo 70°] finché le sezioni non cedono più colore
• lavare in H2O di fonte 10 ’
• sezioni in H2O distillata
• fucsina basica [10 ml di soluzione al 10 % in etanolo 100 °] in acido fenico [+100 ml fenolo 5 % in H2O distillata e filtrato]; flambare le sezioni sul bunsen sino a farle fumare
• lavare in H2O distillata
• differenziare in soluzione alcool - acida [HCl 3% in etanolo 70°] finché le sezioni non cedono più colore
• lavare in H2O di fonte 10 ’
• blu di metilene [1 % in H2O
distillata] 5 - 10 ’
• lavare in H2O di fonte
• disidratare in etanolo 100° sino a che le sezioni non divengono blu pallide 2’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
• blu di metilene [1 % in H2O
distillata] 5 - 10 ’
• lavare in H2O di fonte
• disidratare in etanolo 100° sino a che le sezioni non divengono blu pallide 2’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ZIEHL - NEELSEN (KOCH)”
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ZIEHL - NEELSEN (KOCH)”
Risultati : Bacilli alcool - acido resistenti rosso; flora batterica e tessuti vari bluN. B. : porre attenzione alla differenziazione
Risultati : Bacilli alcool - acido resistenti rosso; flora batterica e tessuti vari bluN. B. : porre attenzione alla differenziazione
Tecnica di allestimento dei preparati citologici in celloidina :
E’ un procedimento atto ad assicurare che tutto il materiale cellulare sia conservato durante i passaggi analitici, raccogliendo le cellule in un film di celloidina così da renderle compatte e non dispersibili.
• celloidina 10 % : sciogliere 10 g. di celloidina in fiocchi in 50 ml di alcool etilico 99° e poi aggiungere 50 ml di etere (conservare in recipiente di vetro ben sigillato)
• riempire di celloidina 10 % una provetta in propilene, svuotarla, capovolgerla per allontanarne l’ eccesso onde ottenerne uno strato di 20 - 50 µ. di spessore (cell - bag)
• riempire la provetta di cloroformio che indurisce la celloidina e svuotarla di quest’ ultimo prima dell’ uso
• riempire la provetta con la sospensione cellulare, tappare e centrifugare
• allontanare il surnatante, estrarre delicatamente il cell - bag, ridurne le dimensioni per facilitarne l’ alloggiamento nelle cassettine citologiche ed includere in paraffina.
Tecnica di allestimento dei preparati citologici in celloidina :
E’ un procedimento atto ad assicurare che tutto il materiale cellulare sia conservato durante i passaggi analitici, raccogliendo le cellule in un film di celloidina così da renderle compatte e non dispersibili.
• celloidina 10 % : sciogliere 10 g. di celloidina in fiocchi in 50 ml di alcool etilico 99° e poi aggiungere 50 ml di etere (conservare in recipiente di vetro ben sigillato)
• riempire di celloidina 10 % una provetta in propilene, svuotarla, capovolgerla per allontanarne l’ eccesso onde ottenerne uno strato di 20 - 50 µ. di spessore (cell - bag)
• riempire la provetta di cloroformio che indurisce la celloidina e svuotarla di quest’ ultimo prima dell’ uso
• riempire la provetta con la sospensione cellulare, tappare e centrifugare
• allontanare il surnatante, estrarre delicatamente il cell - bag, ridurne le dimensioni per facilitarne l’ alloggiamento nelle cassettine citologiche ed includere in paraffina.
INCLUSIONE DELLE CELLULEINCLUSIONE DELLE CELLULE
• sezioni in H2O distillata
• Ematossilina di Harris, filtrata,
3’
• lavare H2O di fonte 5’
• soluzione alcool - acida a pH 3
(alcool 70° + HCl) 10”
• lavare H2O di fonte 2’
• soluzione satura Li2CO3 15”
• lavare H2O di fonte 10’
• sezioni in H2O distillata
• Ematossilina di Harris, filtrata,
3’
• lavare H2O di fonte 5’
• soluzione alcool - acida a pH 3
(alcool 70° + HCl) 10”
• lavare H2O di fonte 2’
• soluzione satura Li2CO3 15”
• lavare H2O di fonte 10’
• Eosina [0.25 %], acidificata con
qualche goccia di CH3COOH
1’
• lavare in H2O distillata 2’
• disidratare in etanolo 95° 4’
• disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
• Eosina [0.25 %], acidificata con
qualche goccia di CH3COOH
1’
• lavare in H2O distillata 2’
• disidratare in etanolo 95° 4’
• disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE DI ROUTINE IN CITOLOGIA Ematossilina - Eosina
COLORAZIONE DI ROUTINE IN CITOLOGIA Ematossilina - Eosina
Risultati : nucleo e batteri gram + blu scuro; citoplasma ed emazie rosa-rosso.Risultati : nucleo e batteri gram + blu scuro; citoplasma ed emazie rosa-rosso.
• sezioni in H2O distillata
• ossidare le sezioni in HIO4 [0.5 % in H2O distillata] 15 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] + 0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2 ml di Borace [5 %]) 60 - 90 ’
• lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’
• HAuCl4 (cloruro oro) [1 %] 2 - 3 ’
• sezioni in H2O distillata
• ossidare le sezioni in HIO4 [0.5 % in H2O distillata] 15 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] + 0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2 ml di Borace [5 %]) 60 - 90 ’
• lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’
• HAuCl4 (cloruro oro) [1 %] 2 - 3 ’
• sodio tiosolfato [3 %] 2 - 3 ’
• lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’
• verde di metile [1 %] 5 - 10 ’
• disidratare in etanolo 95° 4 ’
• disidratare in etanolo 100° 4 ’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
• sodio tiosolfato [3 %] 2 - 3 ’
• lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’
• verde di metile [1 %] 5 - 10 ’
• disidratare in etanolo 95° 4 ’
• disidratare in etanolo 100° 4 ’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ARGENTO - METENAMMINA x I MICETI”
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ARGENTO - METENAMMINA x I MICETI”
Risultati : miceti in nero; nucleo verde intenso Risultati : miceti in nero; nucleo verde intenso
• sezioni in H2O distillata
• soluzione Ammoniaca [2 %] in etanolo 95° overnight
• ossidare le sezioni in HIO4 [0.5 % in H2O distillata] 15 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica filtrata e pre-riscaldata : (25 ml H2O distillata + 2 ml di Borace [5 %] + 25 ml soluzione stock : (100 ml di metenammina [3 %] + 5 ml di AgNO3 [5 %]) controllare al microscopio
30’ - 40 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• HAuCl4 (cloruro oro) [0.2 %] 2 - 3 ’
• lavare in H2O di fonte 5’
• sezioni in H2O distillata
• soluzione Ammoniaca [2 %] in etanolo 95° overnight
• ossidare le sezioni in HIO4 [0.5 % in H2O distillata] 15 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica filtrata e pre-riscaldata : (25 ml H2O distillata + 2 ml di Borace [5 %] + 25 ml soluzione stock : (100 ml di metenammina [3 %] + 5 ml di AgNO3 [5 %]) controllare al microscopio
30’ - 40 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• HAuCl4 (cloruro oro) [0.2 %] 2 - 3 ’
• lavare in H2O di fonte 5’
• sodio tiosolfato [2 %] 2 - 3 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• liquido di Bouin a 60 °C 30’
• lavare in H2O di fonte 10’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• soluzione di acido Fosfotungstico [2 %] 1 - 2’
• lavare in H2O di fonte 10’
• soluzione di cromotropo 2 R : (100 ml. HCl 0.1M + 0.3 g. cromotropo 2 R) 15 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• disidratare in etanolo 95° 3 ’
• disidratare in etanolo 100° 3 ’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione neutro
• sodio tiosolfato [2 %] 2 - 3 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• liquido di Bouin a 60 °C 30’
• lavare in H2O di fonte 10’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• soluzione di acido Fosfotungstico [2 %] 1 - 2’
• lavare in H2O di fonte 10’
• soluzione di cromotropo 2 R : (100 ml. HCl 0.1M + 0.3 g. cromotropo 2 R) 15 ’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• disidratare in etanolo 95° 3 ’
• disidratare in etanolo 100° 3 ’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione neutro
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ARGENTO - METENAMMINA - PAS”
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ARGENTO - METENAMMINA - PAS”
Risultati : miceti in nero; membrane basali in nero; background in rosso Risultati : miceti in nero; membrane basali in nero; background in rosso
• sezioni in H2O distillata
• soluzione di Lugol 5’
• decolorare in iposolfito di sodio [5 %] 2’
• lavare in H2O di fonte 5’
• lavare in H2O distillata
• soluzione Dominici (Orange G [1 %] + eritrosina [0.2 %] + 0.05 ml CH3COOH) 10 - 15’
• lavare in H2O di fonte 5’
• lavare in H2O distillata
• sezioni in H2O distillata
• soluzione di Lugol 5’
• decolorare in iposolfito di sodio [5 %] 2’
• lavare in H2O di fonte 5’
• lavare in H2O distillata
• soluzione Dominici (Orange G [1 %] + eritrosina [0.2 %] + 0.05 ml CH3COOH) 10 - 15’
• lavare in H2O di fonte 5’
• lavare in H2O distillata
• soluzione di blu di toluidina [0.5 %] 2 - 3’
• lavare in H2O di fonte3’
• differenziare in CH3COOH sino a che le sezioni virano al rosa
• disidratare in etanolo 95° 4 ’
• disidratare in etanolo 100° 4 ’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
• soluzione di blu di toluidina [0.5 %] 2 - 3’
• lavare in H2O di fonte3’
• differenziare in CH3COOH sino a che le sezioni virano al rosa
• disidratare in etanolo 95° 4 ’
• disidratare in etanolo 100° 4 ’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI MANN - DOMINICI”
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI MANN - DOMINICI”
Risultati : nuclei blu scuro; eritrociti giallo - arancio; connettivo rosso; granulociti eosinofili rosso; granulociti neutrofili viola; granulociti basofili bluelettivo per il tessuto emopoietico, i linfomi ed i midolli
Risultati : nuclei blu scuro; eritrociti giallo - arancio; connettivo rosso; granulociti eosinofili rosso; granulociti neutrofili viola; granulociti basofili bluelettivo per il tessuto emopoietico, i linfomi ed i midolli
• sezioni in H2O distillata
• soluzione contenente Orceina acetica [ 2 %] ( 90 ml CH3COOH puro + 2 g
orceina + 100 ml H2O distillata 30’
• lavare in CH3COOH [45 %] 1’
• lavare in alcool butilico terziario 2’
• soluzione di xilolo ed alcool butilico terziario 1 : 1 2’
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
• sezioni in H2O distillata
• soluzione contenente Orceina acetica [ 2 %] ( 90 ml CH3COOH puro + 2 g
orceina + 100 ml H2O distillata 30’
• lavare in CH3COOH [45 %] 1’
• lavare in alcool butilico terziario 2’
• soluzione di xilolo ed alcool butilico terziario 1 : 1 2’
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN CITO-GENETICA “METODO ALL’ ORCEINA ACETICA”COLORAZIONE IN CITO-GENETICA
“METODO ALL’ ORCEINA ACETICA”
Risultati : i cromosomi si colorano in rosso - porporauna variante con l’ aggiunta di fast green e ripetuti ed accurati passaggi in alcool a vario grado è utilizzata per identificare la cromatina sessuale che si colora in rosso ed il citoplasma in verde chiaro.
Risultati : i cromosomi si colorano in rosso - porporauna variante con l’ aggiunta di fast green e ripetuti ed accurati passaggi in alcool a vario grado è utilizzata per identificare la cromatina sessuale che si colora in rosso ed il citoplasma in verde chiaro.
Microscopia a fluorescenzaMicroscopia a fluorescenza
Fluorescenza Fluorescenza Illuminazione con luce a breve
Emissione nel visibile
Illuminazione con luce a breve
Emissione nel visibile
Filtri
Fluoroforo (Fluorocromo)
Fosforescenza
Filtri
Fluoroforo (Fluorocromo)
Fosforescenza
Eccitazione / SbarramentoEccitazione / Sbarramento
Caratt. Spettro di Assorbimento
Caratt. Spettro di Emissione
Caratt. Spettro di Assorbimento
Caratt. Spettro di Emissione
Piccole quantitàPiccole quantità
Tipi di FluorescenzaTipi di Fluorescenza
• Autofluorescenza
O• Fluorescenza indotta - Amine biogane + C carboline
H N
• Fluorocromi - effetto “QUENCNING” - vantaggi caratteristici
DNA ACRIDINE ORANGE (verde) RNA Rosso
METACROMASIA concentrazione polimeri 1 maggiore
A.O. Citologia METACROMASIA MASCHERATA
• Autofluorescenza
O• Fluorescenza indotta - Amine biogane + C carboline
H N
• Fluorocromi - effetto “QUENCNING” - vantaggi caratteristici
DNA ACRIDINE ORANGE (verde) RNA Rosso
METACROMASIA concentrazione polimeri 1 maggiore
A.O. Citologia METACROMASIA MASCHERATA
- fibre elastiche - LIPOFUSCINE
- NADH2 - Porfirine- Vit. A
- Farmaci
- fibre elastiche - LIPOFUSCINE
- NADH2 - Porfirine- Vit. A
- Farmaci
TetraciclineAdriamicinaChinacrineBenzopirene
TetraciclineAdriamicinaChinacrineBenzopirene
Reagenti di SCHIFF Fluorescenti ALDEIDI
FUCSINA BASICA (para-rosanilina)
Tioflarina T AMILOIDE PROCION yellow cellule (neuroni)
BANDEGGIO CROMOSOMICO COL. SOPRAVITALE cell sorting
Reagenti di SCHIFF Fluorescenti ALDEIDI
FUCSINA BASICA (para-rosanilina)
Tioflarina T AMILOIDE PROCION yellow cellule (neuroni)
BANDEGGIO CROMOSOMICO COL. SOPRAVITALE cell sorting
IMMUNOFLUORESCENZA Lampade
Problemi di DECADENZA FOTOGRAFIA
Liq. di montaggio VETRI
IMMUNOFLUORESCENZA Lampade
Problemi di DECADENZA FOTOGRAFIA
Liq. di montaggio VETRI
XENONMERCURIOXENONMERCURIO
Gruppi reattivi dimostrabili su sezioniGruppi reattivi dimostrabili su sezioni
• Importanza in patologia diagnostica • Importanza in patologia diagnostica
Acidi Nucleici Acidi Nucleici
• Coloraz. con coloranti basici
• Valutazione Quantitativa (Microspettrofotometria)
• Controlli con trattamento enzimatico (RNAsi - DNAsi)
• Reaz. Di FEULGEN
• Coloraz. con coloranti basici
• Valutazione Quantitativa (Microspettrofotometria)
• Controlli con trattamento enzimatico (RNAsi - DNAsi)
• Reaz. Di FEULGEN
•M.O. Ordinaria
•M. Fluorescenza
(Acridina Orange)
Metacromasia
•M.O. Ordinaria
•M. Fluorescenza
(Acridina Orange)
Metacromasia
Metodi per la dimostrazione di acidi nucleici
Metodi per la dimostrazione di acidi nucleici
· Metodi qualitativiMetodi qualitativi
quantitativiquantitativi
· Interesse in patologiaInteresse in patologia
VIRUSVIRUS
· Distribuzione del DNADistribuzione del DNA
· Met. FeulgenMet. Feulgen
· Metodi qualitativiMetodi qualitativi
quantitativiquantitativi
· Interesse in patologiaInteresse in patologia
VIRUSVIRUS
· Distribuzione del DNADistribuzione del DNA
· Met. FeulgenMet. Feulgen
• CROMO-GALLOCIANINACROMO-GALLOCIANINA
• Reaz. di FEULGEN Reaz. di FEULGEN per legame purina - Desossiribosoper legame purina - Desossiriboso
Idrolisi acidaIdrolisi acida Formaz. di gr. aldeidiciFormaz. di gr. aldeidiciFrammentazione del DNAFrammentazione del DNA
ConcentrazioneConcentrazioneHClHCl
TemperaturaTemperatura
• CROMO-GALLOCIANINACROMO-GALLOCIANINA
• Reaz. di FEULGEN Reaz. di FEULGEN per legame purina - Desossiribosoper legame purina - Desossiriboso
Idrolisi acidaIdrolisi acida Formaz. di gr. aldeidiciFormaz. di gr. aldeidiciFrammentazione del DNAFrammentazione del DNA
ConcentrazioneConcentrazioneHClHCl
TemperaturaTemperatura
SensibilitàSensibilitàSpecificità diSpecificità di
- reazione- reazione- localizzazione- localizzazione
SensibilitàSensibilitàSpecificità diSpecificità di
- reazione- reazione- localizzazione- localizzazione
COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)
• sezioni in H2O distillata
• idrolisi in HCl 1 N a 60 °C per un tempo ottimale in relazione al fissativo usato
da 4’ a 25’
(usare anche HCl 5 N a RT) (10’)
• lavare in HCl 1 N freddo e poi in H2O distillata
• reattivo di Schiff 40’ - 60’
• lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2’
• lavare in H2O di fonte 15’
• sezioni in H2O distillata
• idrolisi in HCl 1 N a 60 °C per un tempo ottimale in relazione al fissativo usato
da 4’ a 25’
(usare anche HCl 5 N a RT) (10’)
• lavare in HCl 1 N freddo e poi in H2O distillata
• reattivo di Schiff 40’ - 60’
• lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2’
• lavare in H2O di fonte 15’
• contrasto citoplasmatico con
verde luce [1 %] 1’
• lavare in H2O di fonte 2’
• disidratare in etanolo 95°
4’
• disidratare in etanolo 100°
4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
• contrasto citoplasmatico con
verde luce [1 %] 1’
• lavare in H2O di fonte 2’
• disidratare in etanolo 95°
4’
• disidratare in etanolo 100°
4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “FEULGEN reazione”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “FEULGEN reazione”
Risultati : il DNA si colora in modo elettivo in rosso magenta; citoplasma verdeRisultati : il DNA si colora in modo elettivo in rosso magenta; citoplasma verde
Metodi per la dimostrazione di acidi nucleici
Metodi per la dimostrazione di acidi nucleici
· Metodi qualitativiMetodi qualitativi
quantitativiquantitativi
· Interesse in patologiaInteresse in patologia
VIRUSVIRUS
· Distribuzione del DNADistribuzione del DNA
· Met. FeulgenMet. Feulgen
· Metodi qualitativiMetodi qualitativi
quantitativiquantitativi
· Interesse in patologiaInteresse in patologia
VIRUSVIRUS
· Distribuzione del DNADistribuzione del DNA
· Met. FeulgenMet. Feulgen
Valutazione quantitativaValutazione quantitativa
Principi
Variazione di assorbimento
Lunghezza d’onda
Principi
Variazione di assorbimento
Lunghezza d’onda
CellCell
LuceLuce
Metodi alternativiMetodi alternativi
BRDUBRDU
TIMIDINA TRITIMIDINA TRIZZIATAIATA
- Ibridizzazione in - Ibridizzazione in situsitu
- Immunocitochimica- Immunocitochimica
- Autoradiografia- Autoradiografia
- Citofluorimetria- Citofluorimetria cell sortercell sorter
BRDUBRDU
TIMIDINA TRITIMIDINA TRIZZIATAIATA
- Ibridizzazione in - Ibridizzazione in situsitu
- Immunocitochimica- Immunocitochimica
- Autoradiografia- Autoradiografia
- Citofluorimetria- Citofluorimetria cell sortercell sorter
LaserLaser
AutoradiografiaAutoradiografia• Principi
• Potere di risoluzione
• Stripping
• Emulsione
• Marcatori H3 / P4 / S
• Principi
• Potere di risoluzione
• Stripping
• Emulsione
• Marcatori H3 / P4 / S
Tempo di EsposizioneTempo di Esposizione
• Principi
(Conteggio granuli / fondo)
• Principi
(Conteggio granuli / fondo)
• Timidina H3
• Ibridizzazione in situ
• Legame di affinità
• Timidina H3
• Ibridizzazione in situ
• Legame di affinità
Ibridizzazione in situ (ISH) Ibridizzazione in situ (ISH)
• Dimostrazione di geni su cromosomi (FISH)
• mRNA specifico - gene espressione(vantaggi rispetto a ICC)
• RNA / DNA virale
• Metodi - Sonde
• Dimostrazione di geni su cromosomi (FISH)
• mRNA specifico - gene espressione(vantaggi rispetto a ICC)
• RNA / DNA virale
• Metodi - SondeRiboprobes
Oligos
Riboprobes
Oligos
Marcatura - Raidoatt.
Auto-radiografia
Non radioatt.
Marcatura - Raidoatt.
Auto-radiografia
Non radioatt.
• Biotina
• Digoxiganina
• Fluorescina
• Biotina
• Digoxiganina
• Fluorescina
ICCICC
- S- H - pH
- S- H - pH
• Questa tecnica consente di identificare specifiche sequenze di DNA ed RNA e di rivelare in quali cellule tali sequenze sono espresse.
• La metodica si basa sulla capacità della doppia elica del DNA di dissociarsi (quando riscaldata a 80-100°C, o esposta ad ambiente basico a pH 13)[DENATURAZIONE] per poi ricostituirsi, partendo da due singole eliche complementari [IBRIDIZZAZIONE].
• Se una delle due emieliche è marcata, si può rendere visibile l’ avvenuta ibridizzazione di doppie eliche neoformate costituite da probe e da acidi nucleici ad esso complementari.
• La marcatura del DNA avviene chimicamente per inserzione di un gruppo sulfone in 5 sull’ anello della Citosina che reagisce con un AbMc anti-sulfone, e quindi con un 2° Ab coniugato a fosfatasi alcalina (N.B. : inibire la fosfatasi alcalina endogena con esposizione ad 80° C x 5’).
• Il trattamento con DNasi e\o RNasi elimina la comparsa di positività, mentre quello con solo uno dei due enzimi evidenzia selettivamente un unico tipo di acido nucleico.
• Questa tecnica consente di identificare specifiche sequenze di DNA ed RNA e di rivelare in quali cellule tali sequenze sono espresse.
• La metodica si basa sulla capacità della doppia elica del DNA di dissociarsi (quando riscaldata a 80-100°C, o esposta ad ambiente basico a pH 13)[DENATURAZIONE] per poi ricostituirsi, partendo da due singole eliche complementari [IBRIDIZZAZIONE].
• Se una delle due emieliche è marcata, si può rendere visibile l’ avvenuta ibridizzazione di doppie eliche neoformate costituite da probe e da acidi nucleici ad esso complementari.
• La marcatura del DNA avviene chimicamente per inserzione di un gruppo sulfone in 5 sull’ anello della Citosina che reagisce con un AbMc anti-sulfone, e quindi con un 2° Ab coniugato a fosfatasi alcalina (N.B. : inibire la fosfatasi alcalina endogena con esposizione ad 80° C x 5’).
• Il trattamento con DNasi e\o RNasi elimina la comparsa di positività, mentre quello con solo uno dei due enzimi evidenzia selettivamente un unico tipo di acido nucleico.
IBRIDIZZAZIONE IN SITUI S H
IBRIDIZZAZIONE IN SITUI S H
Ibridizzazione in situ (ISH) Ibridizzazione in situ (ISH)
• Problemi
• Esami genico su singole cellule prelevate da sezioni
(necessità di identificazione del tipo di cellule)
• Problemi
• Esami genico su singole cellule prelevate da sezioni
(necessità di identificazione del tipo di cellule)
• Sensibilità
• Localizzazione (Definizione)
• Conservazione strutturale
• Sensibilità
• Localizzazione (Definizione)
• Conservazione strutturale
• Sistemi laser / catapulta• Sistemi laser / catapulta
• sezioni in H2O distillata
• trattare in soluzione di Lugol 10’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] + 0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2 ml di Borace [5 %]) 60’ - 90 ’ o 18-24 h. al buio RT
• lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’
• HAuCl4 (cloruro oro) [1 %] 2 - 3 ’
• sezioni in H2O distillata
• trattare in soluzione di Lugol 10’
• lavare in H2O distillata 5 ’
• mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] + 0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2 ml di Borace [5 %]) 60’ - 90 ’ o 18-24 h. al buio RT
• lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’
• HAuCl4 (cloruro oro) [1 %] 2 - 3 ’
• sodio tiosolfato [3 %] 2 - 3 ’
• lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’
• contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’
• disidratare in etanolo 95° 4 ’
• disidratare in etanolo 100° 4 ’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
• sodio tiosolfato [3 %] 2 - 3 ’
• lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’
• contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’
• disidratare in etanolo 95° 4 ’
• disidratare in etanolo 100° 4 ’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI GOMORI PER LA MELANINA”COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI GOMORI PER LA MELANINA”
Risultati : granuli di melanina nero; cheratina arancio; nuclei rosso intensoRisultati : granuli di melanina nero; cheratina arancio; nuclei rosso intenso
• sezioni in H2O distillata
• soluzione di Ferrocianuro di K [10 %] 5’
• soluzione di Ferrocianuro K [10 %] + HCl [10 %] (70 ml + 30 ml) 25’
• lavare H2O di fonte 5’
• lavare H2O distillata
• contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’
• sezioni in H2O distillata
• soluzione di Ferrocianuro di K [10 %] 5’
• soluzione di Ferrocianuro K [10 %] + HCl [10 %] (70 ml + 30 ml) 25’
• lavare H2O di fonte 5’
• lavare H2O distillata
• contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’
• lavare H2O di fonte
5’
• disidratare in etanolo 95°
4’
• disidratare in etanolo 100°
4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
• lavare H2O di fonte
5’
• disidratare in etanolo 95°
4’
• disidratare in etanolo 100°
4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PERLS x IL FERRO”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PERLS x IL FERRO”
Risultati : i depositi di ferro si colorano in blu; i nuclei in rosso intensoN. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)
Risultati : i depositi di ferro si colorano in blu; i nuclei in rosso intensoN. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)
• sezioni in H2O distillata
• soluzione di lavoro di Rhodanina [0.3 % in etanolo 100°] (6 ml / 100 ml H2O
distillata) a 60° C 120 - 180’
• lavare H2O di fonte 5’
• lavare H2O distillata
• contrasto nucleare con ematossilina Carrazzi 1’
• lavare H2O distillata
• sezioni in H2O distillata
• soluzione di lavoro di Rhodanina [0.3 % in etanolo 100°] (6 ml / 100 ml H2O
distillata) a 60° C 120 - 180’
• lavare H2O di fonte 5’
• lavare H2O distillata
• contrasto nucleare con ematossilina Carrazzi 1’
• lavare H2O distillata
• lavare in soluzione di Borace [0.5 %] (tetraborato di sodio) 2’
• lavare H2O distillata
• disidratare in etanolo 95°4’
• disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
• lavare in soluzione di Borace [0.5 %] (tetraborato di sodio) 2’
• lavare H2O distillata
• disidratare in etanolo 95°4’
• disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PER IL RAME”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PER IL RAME”
Risultati : depositi di rame color rosa - rosso; nuclei blu scuroRisultati : depositi di rame color rosa - rosso; nuclei blu scuro
• sezioni in H2O distillata
• soluzione acquosa di AgNO3
(nitrato Argento) [3 %] 60’
• sviluppare in una soluzione di idrochinone [0.5 %] 3’
• lavare H2O di fonte 5’
• fissare in una soluzione di tiosolfato di sodio [5 %] 3’
• lavare H2O di fonte 5’
• lavare H2O distillata
• sezioni in H2O distillata
• soluzione acquosa di AgNO3
(nitrato Argento) [3 %] 60’
• sviluppare in una soluzione di idrochinone [0.5 %] 3’
• lavare H2O di fonte 5’
• fissare in una soluzione di tiosolfato di sodio [5 %] 3’
• lavare H2O di fonte 5’
• lavare H2O distillata
• contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’
• lavare H2O di fonte 5’
• disidratare in etanolo 95°4’
• disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
• contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’
• lavare H2O di fonte 5’
• disidratare in etanolo 95°4’
• disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI Von KOSSA x IL CALCIO”COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI Von KOSSA x IL CALCIO”
Risultati : sali di calcio (fosfati e carbonati) nero; nuclei rosso intensoN. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)
Risultati : sali di calcio (fosfati e carbonati) nero; nuclei rosso intensoN. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)
• sezioni in H2O distillata
• soluzione di lavoro secondo Fouchet : (acido Tricloroacetico (C2HCl3O2) [25 %](50 ml) + Cloruro
ferrico (FeCl3) [10 %]( 5 ml)
5 - 10 ’
• lavare H2O distillata
• soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml)
3’
• sezioni in H2O distillata
• soluzione di lavoro secondo Fouchet : (acido Tricloroacetico (C2HCl3O2) [25 %](50 ml) + Cloruro
ferrico (FeCl3) [10 %]( 5 ml)
5 - 10 ’
• lavare H2O distillata
• soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml)
3’
• lavare H2O distillata
• disidratare in etanolo 95° 4’
• disidratare in etanolo 100° 4’ (3
cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan
o balsamo Canada)
• lavare H2O distillata
• disidratare in etanolo 95° 4’
• disidratare in etanolo 100° 4’ (3
cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan
o balsamo Canada)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “DI FOUCHET x LA BILE”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “DI FOUCHET x LA BILE”
Risultati : biliverdina color verde; collagene rosa - rosso; connettivo giallo Risultati : biliverdina color verde; collagene rosa - rosso; connettivo giallo
• sezioni in H2O distillata
• soluzione di Luxol Fast Blue 2 G [0.1 % in alcool isopropilico] 60’
• disidratare in alcool isopropilico assoluto 5’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
• sezioni in H2O distillata
• soluzione di Luxol Fast Blue 2 G [0.1 % in alcool isopropilico] 60’
• disidratare in alcool isopropilico assoluto 5’
(3 cambi)
• chiarificare in xilolo (3 cambi)
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
Tale colorazione, sebbene poco specifica per i fosfolipidi, li colora in modo soddisfacente, specie se disciolti in alcool isopropilico e quindi fornisce ottima colorazione della mielina integra (costituita dalla membrana cellulare della cellula di Schwann).
Tale colorazione, sebbene poco specifica per i fosfolipidi, li colora in modo soddisfacente, specie se disciolti in alcool isopropilico e quindi fornisce ottima colorazione della mielina integra (costituita dalla membrana cellulare della cellula di Schwann).
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “LUXOL FAST BLUE”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “LUXOL FAST BLUE”
Risultati : la mielina appare in bluRisultati : la mielina appare in blu
• PREPARAZIONE SOLUZIONI• sol. A : Naftolo AS-D
Cloroacetato [10 mg.] + Dimetilformamide [1 ml.]
• sol . B : buffer fosfato0.1 M [30 ml.]
• sol. C : Pararosanilina - HCl : Pararosanilina idrocloride [2 g.] + HCl 2n [50 ml] (sciogliere a caldo, raffreddare e filtrare)
• sol. D : Sodio Nitrato [400 mg.] + H2O distillata [10 ml.]
• sol. E : “working” Pararosanilina - HCl : sol. C [0.4 ml.] + sol. D [0.4 ml.]
• PREPARAZIONE SOLUZIONI• sol. A : Naftolo AS-D
Cloroacetato [10 mg.] + Dimetilformamide [1 ml.]
• sol . B : buffer fosfato0.1 M [30 ml.]
• sol. C : Pararosanilina - HCl : Pararosanilina idrocloride [2 g.] + HCl 2n [50 ml] (sciogliere a caldo, raffreddare e filtrare)
• sol. D : Sodio Nitrato [400 mg.] + H2O distillata [10 ml.]
• sol. E : “working” Pararosanilina - HCl : sol. C [0.4 ml.] + sol. D [0.4 ml.]
• sezioni in H2O distillata• soluzione substrato : ( 0.8 ml.
sol. E + 30 ml. sol. B; sistemare il pH a 6.3 e aggiungere la sol. A; mescolare e f iltrare) 1’ - 2’
• lavare con H2O distillata 5’• Emallume acido di Mayer,
filtrato, 5’• lavare H2O di fonte 10’
• soluzione satura Li2CO3 15”
• lavare H2O di fonte 10’
• disidratare in etanolo 95° 4’• disidratare in etanolo 100° 4’
(3 cambi)• chiarificare in xilolo (3 cambi)• montare in resina sintetica
• sezioni in H2O distillata• soluzione substrato : ( 0.8 ml.
sol. E + 30 ml. sol. B; sistemare il pH a 6.3 e aggiungere la sol. A; mescolare e f iltrare) 1’ - 2’
• lavare con H2O distillata 5’• Emallume acido di Mayer,
filtrato, 5’• lavare H2O di fonte 10’
• soluzione satura Li2CO3 15”
• lavare H2O di fonte 10’
• disidratare in etanolo 95° 4’• disidratare in etanolo 100° 4’
(3 cambi)• chiarificare in xilolo (3 cambi)• montare in resina sintetica
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ISTOCHIMICA - ENZIMATICA :
“CLORO - ACETATO ESTERASI”
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ISTOCHIMICA - ENZIMATICA :
“CLORO - ACETATO ESTERASI”
Risultati : l’attività enzimatica dell’ esterasi appare in rosa - rosso; i nuclei in blu - scuroRisultati : l’attività enzimatica dell’ esterasi appare in rosa - rosso; i nuclei in blu - scuro
• CONSIDERARE OGNI CAMPIONE BIOLOGICO COME POTENZIALMENTE INFETTO
• SOTTOPORSI ALLE PRINCIPALI VACCINAZIONI
• USARE CAMICI, GUANTI, CALZARI E MASCHERE PROTETTIVE
• USARE GUANTI ED OCCHIALI APPOSITI NEL MANEGGIARE AZOTO LIQUIDO
• USARE GUANTI ANTI-TAGLIO AL MICROTOMO E AL CRIOSTATO
• USARE CAPPE DI ASPIRAZIONE CON FILTRI SPECIFICI PER FORMALDEIDE E PER XILENE
• USARE GUANTI E LAME MONOUSO PER DISSEZIONE
• USARE MASSIMA CAUTELA NELL’ IMPIEGO DI ULTRA-CENTRIFUGHE, FORNO A MICROONDE, AUTOCLAVE, STIRRER ED APPARECCHIATURE ELETTRICHE DA LABORATORIO IN GENERE
• EVITARE DI CONTAMINARE IL PROPRIO POSTO DI LAVORO E TENERLO IL PIU’ PULITO POSSIBILE
• CONTROLLARE PERIODICAMENTE IL SISTEMA ANTI-INCENDIO, I SISTEMI DI ALLARME GAS E L’ ACCESSO ALLE VIE DI FUGA
• OSSERVARE CORRETTA VENTILAZIONE E RICAMBIO ARIA LOCALI
• NON FUMARE E NON CONSERVARE O CONSUMARE CIBI IN LABORATORIO
• CONSIDERARE OGNI CAMPIONE BIOLOGICO COME POTENZIALMENTE INFETTO
• SOTTOPORSI ALLE PRINCIPALI VACCINAZIONI
• USARE CAMICI, GUANTI, CALZARI E MASCHERE PROTETTIVE
• USARE GUANTI ED OCCHIALI APPOSITI NEL MANEGGIARE AZOTO LIQUIDO
• USARE GUANTI ANTI-TAGLIO AL MICROTOMO E AL CRIOSTATO
• USARE CAPPE DI ASPIRAZIONE CON FILTRI SPECIFICI PER FORMALDEIDE E PER XILENE
• USARE GUANTI E LAME MONOUSO PER DISSEZIONE
• USARE MASSIMA CAUTELA NELL’ IMPIEGO DI ULTRA-CENTRIFUGHE, FORNO A MICROONDE, AUTOCLAVE, STIRRER ED APPARECCHIATURE ELETTRICHE DA LABORATORIO IN GENERE
• EVITARE DI CONTAMINARE IL PROPRIO POSTO DI LAVORO E TENERLO IL PIU’ PULITO POSSIBILE
• CONTROLLARE PERIODICAMENTE IL SISTEMA ANTI-INCENDIO, I SISTEMI DI ALLARME GAS E L’ ACCESSO ALLE VIE DI FUGA
• OSSERVARE CORRETTA VENTILAZIONE E RICAMBIO ARIA LOCALI
• NON FUMARE E NON CONSERVARE O CONSUMARE CIBI IN LABORATORIO
SICUREZZA IN LABORATORIOSICUREZZA IN LABORATORIO
• RISCHIO BIOLOGICO : TUBERCOLOSI; BATTERI PIOGENI PER AEROSOL; VIRUS EPATITE - HBV - HCV-; HIV (AIDS); INFEZIONI DA LEGIONELLA E DA BLASTOMYCES; DERMATITI.
• RISCHIO CHIMICO : ESPOSIZIONE A FORMALDEIDE (oltre 1 ppm) e\o GLUTARALDEIDE; ESPOSIZIONE TOSSICA VERSO SOLVENTI ORGANICI (Xilene, Toluene, Benzene, Cloroformio, Alcool....); ESPOSIZIONE VERSO AMINE AROMATICHE(principali coloranti : ponceau,verde luce, fast red, sudan IV, blu toluidina.......); ESPOSIZIONE VERSO LA DAB (benzidina - derivato); ESPOSIZIONE VERSO I METACRILATI (resine per inclusione in M.E., tossiche e corrosive); ESPOSIZIONE ALLERGICA VERSO IL LATTICE.
• RISCHIO NUCLEARE : ESPOSIZIONE VERSO ISOTOPI RADIOATTIVI USATI NEL MARCARE I PROBES (3H, 14C, 45Ca, 32P, 90Sr, 35S, 131I).
• RISCHIO FISICO : PUNTURE, TAGLI, LACERAZIONI ED ABRASIONI CUTANEE(nell’ uso del microtomo o nella dissezione in sala anatomica); ESPLOSIONI ED INCENDI ACCIDENTALI (nella preparazione di reattivi o nello stoccaggio degli alcool), ATTI DOLOSI E CADUTE ACCIDENTALI.
• RISCHIO BIOLOGICO : TUBERCOLOSI; BATTERI PIOGENI PER AEROSOL; VIRUS EPATITE - HBV - HCV-; HIV (AIDS); INFEZIONI DA LEGIONELLA E DA BLASTOMYCES; DERMATITI.
• RISCHIO CHIMICO : ESPOSIZIONE A FORMALDEIDE (oltre 1 ppm) e\o GLUTARALDEIDE; ESPOSIZIONE TOSSICA VERSO SOLVENTI ORGANICI (Xilene, Toluene, Benzene, Cloroformio, Alcool....); ESPOSIZIONE VERSO AMINE AROMATICHE(principali coloranti : ponceau,verde luce, fast red, sudan IV, blu toluidina.......); ESPOSIZIONE VERSO LA DAB (benzidina - derivato); ESPOSIZIONE VERSO I METACRILATI (resine per inclusione in M.E., tossiche e corrosive); ESPOSIZIONE ALLERGICA VERSO IL LATTICE.
• RISCHIO NUCLEARE : ESPOSIZIONE VERSO ISOTOPI RADIOATTIVI USATI NEL MARCARE I PROBES (3H, 14C, 45Ca, 32P, 90Sr, 35S, 131I).
• RISCHIO FISICO : PUNTURE, TAGLI, LACERAZIONI ED ABRASIONI CUTANEE(nell’ uso del microtomo o nella dissezione in sala anatomica); ESPLOSIONI ED INCENDI ACCIDENTALI (nella preparazione di reattivi o nello stoccaggio degli alcool), ATTI DOLOSI E CADUTE ACCIDENTALI.
RISCHI AMBIENTALI IN LABORATORIORISCHI AMBIENTALI IN LABORATORIO
ARTEFATTI ISTOLOGICI
Definizione
Difetti o anomalie dei tessuti, da riferire non ad un processo naturale (fisiologico o patologico) ma all’introduzione di
materiali estranei, a procedure non corrette di fissazione, inclusione, sezionamento, colorazione, montaggio dei vetrini.
E’ importante riconoscere gli artefatti, per evitare di interpretarli (e diagnosticarli) come un processo patologico o
una malattia del paziente.
Definizione
Difetti o anomalie dei tessuti, da riferire non ad un processo naturale (fisiologico o patologico) ma all’introduzione di
materiali estranei, a procedure non corrette di fissazione, inclusione, sezionamento, colorazione, montaggio dei vetrini.
E’ importante riconoscere gli artefatti, per evitare di interpretarli (e diagnosticarli) come un processo patologico o
una malattia del paziente.
ARTEFATTI ISTOLOGICI
1)Artefatti causati prima del prelievo:
1.1. Polvere di talco
1.2. Materiale di sutura
1.3. Effetto da termocauterio
1.4. Effetto da agenti chimici
1.5. Particelle di carbone
6. Garza
1.7. Essicamento
1)Artefatti causati prima del prelievo:
1.1. Polvere di talco
1.2. Materiale di sutura
1.3. Effetto da termocauterio
1.4. Effetto da agenti chimici
1.5. Particelle di carbone
6. Garza
1.7. Essicamento
ARTEFATTI ISTOLOGICI
2) Artefatti causati nell’intervallo tra il prelievo ed il trattamento istologico
2.1. Effetti di schiacciamento
2.2. Essiccazione
2.3. Congelamento
2.4. Chinatura
2.5. Introduzione di materiali estranei quali grani di polvere
2) Artefatti causati nell’intervallo tra il prelievo ed il trattamento istologico
2.1. Effetti di schiacciamento
2.2. Essiccazione
2.3. Congelamento
2.4. Chinatura
2.5. Introduzione di materiali estranei quali grani di polvere
ARTEFATTI ISTOLOGICI
3) Artefatti durante la fissazione
3.1. Autolisi durante la fissazione
3.2. Fissazione inadeguata o incompleta
3.3. Effetti da fissazione con Fiss. di Zenker
(coartazione)
3.4. Deposito di cristalli di Sublimato mercurico
3.5. Effetti di estrazione da fissazione in formalina
3.6. Depositi di Emateina acida da fiss. in formalina
3) Artefatti durante la fissazione
3.1. Autolisi durante la fissazione
3.2. Fissazione inadeguata o incompleta
3.3. Effetti da fissazione con Fiss. di Zenker
(coartazione)
3.4. Deposito di cristalli di Sublimato mercurico
3.5. Effetti di estrazione da fissazione in formalina
3.6. Depositi di Emateina acida da fiss. in formalina
ARTEFATTI ISTOLOGICI
4)Artefatti legati a procedure di inclusione
4.1. Inadeguata fissazione
4.2. Inadeguata disidratazione
4.3. Presenza di residui di liquidi chiarificanti
4.4. Inadeguata infiltrazione di paraffina
4.5. Uso di paraffina troppo calda
4)Artefatti legati a procedure di inclusione
4.1. Inadeguata fissazione
4.2. Inadeguata disidratazione
4.3. Presenza di residui di liquidi chiarificanti
4.4. Inadeguata infiltrazione di paraffina
4.5. Uso di paraffina troppo calda
ARTEFATTI ISTOLOGICI
5) Artefatti legati alle procedure d’inclusione
5.1. Inclusione di frammenti multipli di
diversa durezza
5.2. Orientamento scorretto dei frammenti
5.3. Prolungata esposizione a paraffina sciolta
5) Artefatti legati alle procedure d’inclusione
5.1. Inclusione di frammenti multipli di
diversa durezza
5.2. Orientamento scorretto dei frammenti
5.3. Prolungata esposizione a paraffina sciolta
ARTEFATTI ISTOLOGICI
6)Artefatti da sezionamento erroneo
6.1. Angolo di taglio sbagliato
6.2. Lama o blocchetto mal fissati
(effetto “tende alla veneziana”)
6.3. Lame poco affilate
6.4. Raccolta di frammenti di tessuto anomalo
“pesci”
6)Artefatti da sezionamento erroneo
6.1. Angolo di taglio sbagliato
6.2. Lama o blocchetto mal fissati
(effetto “tende alla veneziana”)
6.3. Lame poco affilate
6.4. Raccolta di frammenti di tessuto anomalo
“pesci”
ARTEFATTI ISTOLOGICI
7) Errori nella raccolta delle sezioni sui vetrini
7.1. Contaminazione dei vetri da muffe o pollini
7.2. Uso di quantità eccessive di adesivo
7.3. Raccolta di frammenti di altri blocchetti
7.4. Pieghe nelle sezioni
7.5. Bolle d’aria sotto le sezioni
7.6. Uso di acqua troppo calda per stendere le sezioni
7) Errori nella raccolta delle sezioni sui vetrini
7.1. Contaminazione dei vetri da muffe o pollini
7.2. Uso di quantità eccessive di adesivo
7.3. Raccolta di frammenti di altri blocchetti
7.4. Pieghe nelle sezioni
7.5. Bolle d’aria sotto le sezioni
7.6. Uso di acqua troppo calda per stendere le sezioni
ARTEFATTI ISTOLOGICI
8) Artefatti da colorazione I
8.1. Mancata sparaffinatura
8.2. Effetti di bolle tra sezione e vetro
8.3. Sbagli nella colorazione con:
8.4. Ematossilina di Harris
8.5. Emallume di Mayer
8.6. Eosina
8.7. Imperfetta disidratazione prima del montaggio
8) Artefatti da colorazione I
8.1. Mancata sparaffinatura
8.2. Effetti di bolle tra sezione e vetro
8.3. Sbagli nella colorazione con:
8.4. Ematossilina di Harris
8.5. Emallume di Mayer
8.6. Eosina
8.7. Imperfetta disidratazione prima del montaggio
ARTEFATTI ISTOLOGICI
8) Artefatti da colorazione II
Sbagli nelle colorazioni speciali:
8.5. PAS
8.6. PAS-diastasi
8.7. Rosso Congo
8.8. Giemsa
8.9. Feulgen
8.10. Metenamina-argento per i funghi
8) Artefatti da colorazione II
Sbagli nelle colorazioni speciali:
8.5. PAS
8.6. PAS-diastasi
8.7. Rosso Congo
8.8. Giemsa
8.9. Feulgen
8.10. Metenamina-argento per i funghi
ARTEFATTI ISTOLOGICI
9) Errori nel montaggio con coprioggetto
9.1. Contaminazione del liquido di montaggio
9.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli
9.3. Erroneo posizionamento del vetrino
9.4. Intrappolamento di bolle d’aria
9.5. Montante troppo abbondante
9.6. Montante troppo scarso
9) Errori nel montaggio con coprioggetto
9.1. Contaminazione del liquido di montaggio
9.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli
9.3. Erroneo posizionamento del vetrino
9.4. Intrappolamento di bolle d’aria
9.5. Montante troppo abbondante
9.6. Montante troppo scarso
ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.1.) Errori nella raccolta delle cellule
c.1.1. Cellule sovrapposte
c.1.2. Cellule troppo rade
c.1.3. Eccessiva quantità di sangue
c.1.4. Mancato uso di adesivo
c.1.5. Effetto da citocentrifuga
c.1.6. Contaminazione batterica (nelle urine)
c.1.7. “Stiramento” delle cellule per compressione
c.1.) Errori nella raccolta delle cellule
c.1.1. Cellule sovrapposte
c.1.2. Cellule troppo rade
c.1.3. Eccessiva quantità di sangue
c.1.4. Mancato uso di adesivo
c.1.5. Effetto da citocentrifuga
c.1.6. Contaminazione batterica (nelle urine)
c.1.7. “Stiramento” delle cellule per compressione
ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.2.) Errori nella fissazione delle cellule
c.2.1. Effetti di essiccamento prima della fissazione
(nella col. di Papanicolau)
c.2.2. Effetti di essiccamento troppo lento
(nella col. di Giemsa)
c.2.) Errori nella fissazione delle cellule
c.2.1. Effetti di essiccamento prima della fissazione
(nella col. di Papanicolau)
c.2.2. Effetti di essiccamento troppo lento
(nella col. di Giemsa)
ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.3) Errori nella colorazione delle cellule
con la col. di Papanicolau
c.3.1. Col. Nucleare troppo debole
c.3.2. Col. Nucleare troppo intensa
c.3.3. Col. con Orange G troppo debole
c.3.4. Col. con Orange G troppo intensa
c.3.5. Col. con Verde luce troppo debole
c.3.6. Col. con Verde luce troppo intensa
c.3) Errori nella colorazione delle cellule
con la col. di Papanicolau
c.3.1. Col. Nucleare troppo debole
c.3.2. Col. Nucleare troppo intensa
c.3.3. Col. con Orange G troppo debole
c.3.4. Col. con Orange G troppo intensa
c.3.5. Col. con Verde luce troppo debole
c.3.6. Col. con Verde luce troppo intensa
ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.4) Errori nel montaggio con coprioggetto
c.4.1. Contaminazione del liquido di montaggio
c.4.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli
c.4.3. Erroneo posizionamento del vetrino
c.4.4. Intrappolamento di bolle d’aria
c.4.5. Montante troppo abbondante
c.4.6. Montante troppo scarso
c.4) Errori nel montaggio con coprioggetto
c.4.1. Contaminazione del liquido di montaggio
c.4.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli
c.4.3. Erroneo posizionamento del vetrino
c.4.4. Intrappolamento di bolle d’aria
c.4.5. Montante troppo abbondante
c.4.6. Montante troppo scarso