ESTRUCTURA DE LA HEMOCIANINA DEL HELIX POMATIA
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ÍNDICE
Resumen
Desarrollo
o Desarrollo del tema
o Sitio activo
o Activación de la hemocianina como fenoloxidasa
o Hemocianina alfa (αD-HpH y αN-HpH)
o Hemocianina beta (β-HpH)
o HpH-d de la hemocianina beta
o HpH-g de la hemocianina beta
Referencias
2
Resumen
Las hemocianinas son enormes proteínas, que se encuentran disueltas en la hemolinfa de
numerosos invertebrados. Su función principal es la de transportar oxígeno extracelularmente, la cual
puede llevar a cabo debido a los dos átomos de cobre que tienen en su sitio activo. Dichos átomos se
unen de forma reversible a una molécula de O2. Esta oxigenación es la que provoca el color azulado de
la hemolinfa de moluscos y artrópodos.
Centrándome en el contenido de la monografía, la estructura de la hemocianina del Helix
Pomatia o caracol de Borgoña (HpH), el cual es un molusco gasterópodo, cuenta con tres isoformas
distintas disueltas en su hemolinfa: dos de tipo alfa (αD-HpH y αN-HpH) y una de tipo beta (βC-HpH).
Dichas isoformas están constituidas por siete u ocho unidades funcionales (FUs) unidas de forma
covalente. La presencia de tres isoformas de la hemocianina solo se da en dos especies: el Helix
Pomatia y el Helix Lucorum.
Desarrollo del tema
Las hemocianinas son enormes metalo-glicoproteínas, concretamente cromoproteínas no
porfirínicas, constituidas por complejos multiméricos de proteínas que interaccionan de forma no
covalente mediante fuerzas electroestáticas, puentes de hidrógeno o fuerzas hidrofóbicas o por puentes
disulfuro. Son proteínas con un enorme peso molecular (en el caso del Helix Pomatia, 9x106 Da) y una
compleja estructura cuaternaria que actúa como transportador de oxígeno en la hemolinfa de
numerosas especies de moluscos (cefalópodos y gasterópodos) y artrópodos (crustáceos y arácnidos).11
Las hemocianinas de los artrópodos y moluscos revelan numerosas diferencias estructurales,
lo que evidencia orígenes evolutivos separados.2 A pesar de las diferentes estructuras terciarias y
cuaternarias de las hemocianinas, las cuales reflejan distintas estructuras primarias, los sitios de unión
del O2 son bastante similares.1
La hemocianina del Helix Pomatia tiene tres isoformas diferentes: dos de tipo alfa (αD-HpH y
αN-HpH) y una de tipo beta (βC-HpH).8 Dichas isoformas están constituidas por siete u ocho unidades
funcionales globulares (FUs) unidas covalentemente. Estas contienen unos 400 residuos de
aminoácido cada una, pero difieren en sus secuencias y patrones génicos. Las tres isoformas presentan
unos valores de pI, determinados por 2D-electroforesis en gel, de 5,3 (αD-HpH), 5,4 (βC-HpH) y 7,0
(αN-HpH), respectivamente.7
Tanto la alfa como la beta hemocianina tienen un contenido casi idéntico de aminoácidos.
Asimismo, tienen unas características comunes. Solo presentan un aminoácido en el extremo N-
terminal: la arginina. No tienen una aminoácido identificado en el extremo C-terminal, aunque algunas
pruebas apuntan hacia la prolina. Los carbohidratos están unidos, normalmente, a la asparagina, lo que
3
ha llevado a proponer una secuencia aminoacídica de la zona de unión: -A-N-S-T-G-. Esta secuencia
coincide con la zona de glicosilación de otras de otras glicoproteínas. Estas moléculas cuentan con la
presencia de complicadas ramificaciones de cadenas de carbohidratos, con la presencia de
glucosamina, manosa, fucosa, galactosa, glucosa y xilosa.4
El ensamblado básico de la molécula nativa de hemocianina en moluscos es un decámero
cilíndrico hueco. Pero en los gasterópodos, como el Helix Pomatia, presenta ciertas variaciones, la
principal es que la molécula está constituida por homodidecámeros formados por la unión de dos
homodecámeros.7 14
Estos decámeros se pliegan en cada una de las unidades funcionales. Cada FUs está formada por dos
dominios estructurales diferenciados, por un lado el α (caracterizado por tener hélices α), y por el otro,
el β (de hoja plegada β). El dominio α se pliega en cuatro hélices α, las cuales engloban el sitio activo,
mientras que el dominio β lo hace en barriles β, que forman cadenas antiparalelas entre ellos.5
Estas
unidades funcionales (subunidades formada por cadenas polipeptídicas) son designadas como HpH-a
hasta HpH-h sobre el extremo N-terminal.8
Figura 1: Arriba, niveles estructurales de la hemocianina en artrópodos y moluscos.5
El decámero consta de una pared formada por una parte externa hecha por 10 copias de un
segmento constituido por las unidades funcionales a-b-c-d-e-f y un complejo en forma de anillo
dipentamérico formado por 10 copias de FU-h.5 Esta última unidad funcional contiene una cola de 100
aminoácidos en el extremo C-terminal que no está presente en las demás FUs, esto es debido a dicha
cola actúa como elemento de unión del anillo dipentamérico formado por las copias de FU-h.9
4
Sitio activo
Las hemocianinas son enormes proteínas transportadoras de oxígeno. Cada unidad funcional
que la forma tiene un sitio activo con dos iones de cobre (Cu2+
) acoplados en un sitio tipo 3, centro
binuclear, formando la estructura de dos pirámides trigonales opuestas. Estos dos átomos de cobre,
denominados CuA y CuB, se enlazan como grupos protéticos a las cuatro hélices α por tres residuos de
histidina cada uno.9 Estos dos iones están sometidos a un acoplamiento antiferromagnético.
Según la estequiometría, cada par de iones de cobre puede unirse reversiblemente a una
molécula de oxígeno. La parte esencial de la oxigenación puede describirse como: [Cu+]2 + O2
[Cu2+
]2 O2 2-
. La proximidad de los dos átomos de Cu2+
puede dar lugar a un acoplamiento dipolar
entre ellos.3 La unión del oxígeno forma un enlace entre los dos átomos de cobre, dicho oxígeno al
unirse se convertiría en un peróxido y se formaría un complejo plano Cu-O2-Cu, esto se ajusta a los
datos espectroscópicos de la hemocianina oxigenada.6
Esta oxigenación provoca un cambio de color, son incoloras cuando están desoxigenadas y
adquieren un tono azul brillante cuando se oxigenan.2
El comportamiento del enlace con el oxígeno se caracteriza por una afinidad baja-moderada, la
cual puede ser modulada por numerosos factores.
Activación de la hemocianina como fenoloxidasa5
Las hemocianinas tienen sitios activos de cobre tipo 3, los cuales se asemejan a los de las
fenoloxidasas (comprenden tirosinas y catecol oxidasas). Estas catalizan el inicio, en dos pasos, de la
síntesis de la melanina y son necesarias en numerosas funciones biológicas. Por un lado, las tirosinas
catalizan las dos etapas (la hidroxilación de monofenoles a o-difenoles y su posterior oxidación a o-
quinonas) y, por el otro, las catecol oxidasas, solo catalizan el segundo paso.
Las hemocianinas pueden ser activadas y convertidas en proteínas con actividad fenoloxidasa
por proteolisis limitada con agentes desnaturalizantes, como son el SDS y la tripsina, mediante un
mecanismo de activación, que consiste en mover los aminoácidos que bloqueen estéricamente el
acceso al sitio activo de las moléculas fenólicas. Por lo que, las hemocianinas realizan un movimiento
parecido al que haría un dominio estructural flexible. Esto posibilita la entrada al sitio activo. Dicha
entrada hace que un fenol entre con una orientación determinada, la cual se define por su interacción
con los residuos de histidina organizados en torno al CuB. Esta orientación del sustrato permite que se
den las reacciones individualmente. Ahora, ese fenol se mueve fijando su grupo hidroxilo a un punto
de coordinación del sitio del CuA. Uno de los átomos de la molécula de O2, que se encuentra unida a
los dos cobres del sitio activo, ataca el anillo fenólico en su posición orto, esto tiene como resultado la
5
formación de un o-difenol, el cual es inmediatamente oxidado. El otro oxígeno se combina con
protones y se produce la formación de una molécula de agua.
Hemocianina alfa (αD-HpH y αN-HpH)
Dos de las isoformas que existen de la hemocianina del Helix Pomatia son de tipo alfa. La
gran diferencia entre estas dos isoformas es que la αD-HpH puede disociarse en sus componentes y la
αN-HpH no. Las moléculas didecaméricas de la αD son bastantes similares a las de la hemocianina
beta.7
La hemocianina alfa es una glicoproteína transportadora de oxígeno. Esta ha sido aislada de la
hemolinfa del Helix Pomatia, cuenta con una masa molecular de 9 MDa. Su parte carbohidratada, la
cual constituye un 9% de la molécula, está formada por residuos de fucosa, xilosa, 3-O-metilgalactosa,
manosa, galactosa, N-acetilgalactosamina y N-acetilglucosamina.10
Los residuos de xilosa se encuentran unidos covalentemente a una cadena carbohidratada
ligada a la asparagina.10
Cuando estas dos isoformas de hemocianina, tras ser tratadas con un buffer que modifique el
pH del medio, muestran el mismo comportamiento después de disociarse y reasociarse sus
subunidades. Las subunidades disociadas, cuando el pH se estabiliza, se reasocian en decámeros y
túbulos de corta longitud. La hemocianina beta también puede sufrir esto, pero al reorganizarse forma
túbulos de mayor tamaño. Esto puede deberse a que fuerte glicosilación de algunas subunidades.7
Hemocianina beta (β-HpH)
La hemocianina beta es una de las tres isoformas de hemocianina que se puede encontrar
disuelta libremente en la hemolinfa del Helix Pomatia. Un estudio de dicha molécula ha desvelado
numerosas características de ella: peso molecular, 9,02 x 106 Da; volumen, 14000 nm
3; radio de giro,
18,4 nm; radio de las subunidades esféricas, 2,5±0,2 nm.13
Esta isoproteína, en un medio con un pH 8 (ligeramente básico), se disocia en sus
subunidades. Al realizar una tripsinolisis controlada se obtienen los siguientes fragmentos HpH-abc y
HpH-ef y las unidades funcionales HpH-d, HpH-g y HpH-h.8
Tras esta tripsinolisis, se forman largas
estructuras tubulares, que parecen ser polímeros lineales de moléculas de hemocianina. Estos
polímeros tubulares y la proteína nativa presentan unas propiedades parecidas, algunas son que ambos
se disocian a pH 8 en ausencia de cationes divalentes, muestran un efecto Bohr parecido o la
absorbancia (346 nm) es la misma en los dos.12
Asimismo, si se realiza otra tripsinolisis diferente, y a los polímeros obtenidos se les realiza
una micrografía electrónica, se puede obtener una reconstrucción en 3D de la molécula. Una posterior
6
difracción óptica de los polímeros tubulares oxigenados y desoxigenados deja ver una disminución del
diámetro acompañado por un aumento de la longitud en el polímero desoxigenado. Las diferencias
entre ambos polímeros pueden deberse a un procedimiento de preparación por parte de la molécula
desoxigenada como forma de exclusión de oxígeno.11
La reasociación del polímero deja ver que la tripsinolisis no afecta a la forma en la que se
determina la interacción de la proteína.12
Posteriormente, una proteolisis limitada de los fragmentos no disociados al completo (HpH-
abc y HpH-ef) permite la obtención aislada de cada FUs. Los puentes disulfuro juegan un importante
papel en su estabilidad conformacional.8
La cadena polipeptídica de cada FUs está plegada en dos dominios diferenciados, un dominio
N-terminal helicoidal (donde está el sitio activo) y otro C-terminal que presenta hoja plegada beta.8
La β-HpH contiene un 7% de carbohidratos, estos están repartidos de forma variable entre las
diferentes FUs. Las regiones de glicosilación se sitúan en HpH-d, HpH-e, HpH-g y HpH-h, mientras
que HpH-c y HpH-f no cuentan con carbohidratos. De las unidades HpH-a y HpH-b aún se
desconocen los lugares de unión de glicanos. La mayoría de estas FUS son bastante estables, tienen
unas temperaturas de desnaturalización entre 77-83ºC.8
HpH-d de la hemocianina beta15
La cadena de la unidad funcional D está formada por un polipéptido compuesto por 410
residuos de aminoácidos. Tiene una masa de 47 kDa.
Presenta una región delimitada, desde el aminoácido 37 al 219, que también está presente en
tirosinas y se trata de un dominio central muy conservado en estas.
CADENA POLIPEPTÍDICA
1 davtvashvr kdldtltage ieslrsafld iqqdhtyeni asfhgkpglc qheghkvacc
61 vhgmptfpsw hrlyveqvee alldhgssva vpyfdwispi qklpdliska tyynsreqrf
121 dpnpffsgkv agedavttrd pqpelfnnny fyeqalyale qdnfcdfeiq fevlhnalhs
181 wlgghakysf ssldytafdp vfflhhantd rlwaiwqelq ryrglpynea dcainlmrkp
241 lqpfqdkkln prnitniysr padtfdyrnh fhyeydtlel nhqtvpqlen llkrrqeygr
301 vfagflihnn glsadvtvyv cvpsgpkgkn dcnhkagvfs vlggelempf tfdrlyklqi
361 tdtikqlglk vnnaasyqlk veikavpgtl ldphilpdps iifepgtker
7
Figura 2: Dos representaciones de la estructura secundaria de la HpH-d. A la izquierda, resaltado con colores los seis aminoácidos
de histidina que forman el sitio activo, donde se encuentran los dos átomos de cobre. A la derecha, se resaltan en color verde los dos
aminoácidos (Cys-His) que forman el enlace tioéter.17
Los aminoácidos 44, 55, 71, 175, 179 y 206 corresponden a histidinas (H), que actúan como
zonas de unión con el cobre, en este caso los residuos 44, 55 y 71 son de unión con el CuA, y los 175,
179 y 206, con el CuB.
Se producen varios enlaces Cys-Cys o puentes disulfuro: entre los aminoácidos 50 y 59, 165 y
232 y 321 y 332. Este enlace es de tipo covalente fuerte y se produce entre los grupos tiol (-SH) de dos
cisteínas. Este tipo de enlace es muy importante en la estructura, plegamiento y función de la proteína.
Entre los residuos 60 y 62 se produce un enlace 2’-(S-cisteinil)-histidina (Cys-His), también
llamado enlace tioéter (o sulfuro).
En el aminoácido 253, Asparagina (N), se puede producir una N-glicosilación, que consiste en
una modificación de la cadena polipeptídica con la adición de carbohidratos.
8
Figura 3: Dos representaciones de la estructura secundaria de la HpH-d. A la izquierda, resaltado en verde el residuo de
asparagina (N), en el que se puede dar una N-glicosilación. A la derecha, resaltado en color verde los dos aminoácidos (Cys-His) que forman
el enlace tioéter.17
La cadena polipeptídica presenta tres regiones
conflictivas, en las que hay un tipo de aminoácidos que
puede convertirse en otro: el aminoácido 60, la cisteína (C)
puede pasar a serina (S), el residuo 62, la histidina (H)
puede ser sustituida por serina (S) y el aminoácido 165, la
cisteína (C) puede pasar a ácido aspártico (D).
Figura 4: A la derecha, representación de la estructura secundaria de
la HpH-d, en la imagen de la derecha se resaltan en azul y verde los tres residuos
que pueden presentar un cambio por otro aminoácido.17
El primer residuo y el último de la cadena
polipeptídica no son aminoácidos terminales, ya que
se trata de, en el caso del primero, de ácido aspártico
(D), y en el del 410, de arginina (R).
Con el plegamiento de la cadena
polipeptídica, se forman dos dominios diferentes:
uno de hélice alfa y otro de hoja plegada beta.
Figura 5: A la izquierda, representación de la estructura
secundaria de la HpH-d.17
HpH-g de la hemocianina beta16
CADENA POLIPEPTÍDICA
1 dihttavagv gvrkdvtrlt vsetenlrea lrrikadngs dgfqsiasfh gsppgcehen
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301 faefllhgig asadvtfdlc dshdhcefag tfailggple hpwafdrlfk ydvtdvfskl
361 hlrpdseyhf nihivsvngt eldshlirsp tvqfvpgvkd yyek
9
La cadena de la unidad funcional G está formada por un polipéptido compuesto por 404
aminoácidos. Tiene un peso molecular de 46 kDa.
La región delimitada desde el aminoácido 41 al 220, también está presentes en tirosinas y se
trata de un dominio central muy conservado en ellas.
Los residuos 50, 61, 77, 176, 180 y 207 corresponden a histidinas (H), se trata de zonas de
unión con un cobre, en este caso los aminoácidos 50, 61 y 77 son de unión con el CuA, y los 176, 180
y 207, con el CuB.
Se producen tres puentes disulfuro (Cys-Cys): entre los aminoácidos 56 y 65, 166 y 233 y 320
y 326.
Figura 6: Dos representaciones de la estructura secundaria de la HpH-g. A la izquierda, resaltado con colores los seis aminoácidos
de histidina que forman el sitio activo, donde se encuentran los dos átomos de cobre. A la derecha, se resaltan en color azul los dos
aminoácidos (Cys-His) que forman el enlace tioéter.18
Entre los residuos 66 y 68, se produce un enlace 2’-(S-cisteinil)-histidina (Cys-His), el cual
también recibe el nombre de enlace tioéter.
Hay tres residuos de asparagina (N), aminoácidos 38, 60 y 378, en los que se puede producir
una N-glicosilación, que se trata de una modificación de la cadena polipeptídica con la adición de
carbohidratos.
10
Figura 7: A la izquierda, representación de la estructura
secundaria de la HpH-g, en la que se resalta en azul y verde los
tres residuos de asparagina (N), en los que se puede dar una N-
glicosilación.18
El primer y último residuo de la cadena
polipeptídica no son aminoácidos terminales, ya
que se trata de, en el caso del primero, de ácido
aspártico (D), y en el del 404, de lisina (K).
Con el plegamiento de la cadena polipeptídica, se forman dos dominios diferentes: uno de
hélice alfa y otro de hoja plegada beta.
El dominio de hélice alfa está formado por
los siguientes aminoácidos: 21-37, 43-49, 72-90,
112-114, 152-160, 165-184, 202-224, 236-237, 253-
257, 261-264, 268-269, 284-295 y 354-360.
El dominio de hoja plegada beta está
constituido por los siguientes aminoácidos: 56-58,
61-63, 124-126, 130-132, 299-308, 313-321, 325-
334, 343-353, 369-376, 380-382 y 391-395.
Figura 8: A la derecha, representación de la estructura
secundaria de la HpH-g.18
11
Referencias
1. Donald Voet; Judith G. Voet; Charlotte W. Pratt. Fundamentos de Bioquímica: La vida a nivel
molecular. 2ª Edición. Editorial Médica Panamericana. 2007. Pp. 186
2. Richard W. Hill; Gordon A. Wyse; Margaret Anderson. Fisiología animal. 2ª Edición.
Editorial Médica Panamericana. 2006. Pp. 693 3. Ei-Ichiro Ochiai. Química bioinorgánica. 1ª Edición. Editorial Reverté, S.A. 1985. Pp. 217-
220. 4. Jan Dijk. Alpha- and beta-hemocyanin el Helix Pomatia. Editorial Groningen, V.R.B.
Offsetdrukkerij, 1971
5. Heinz Decker; Nadja Hellman; Elmar Jaenicke; Bernhard Lieb; Ulrich Meissner; Jürgen
Markl. (2007). Minireview: Recent progress in hemocyanin research. Intregative and
Comparative Biology, volume 47, pp. 631-641
6. Harry A. Kuiper; Ruurd Torensma; Ernst F.J. van Bruggen. (1976). Binding of Carbon
Monoxide to α-Hemocyanin and β-Hemocyanin from Helix Pomatia. Eur. J. Biochem. 68,
425-430.
7. Ludmila Velkova; Ivan Dimitrov; Heinz Schwarz; Stefan Stevanovic; Wolfgang Voelter;
Benedeto Salvato; Pavlina Dolashka-Angelova. (2010). Structure of hemocyanin from garden
snail helix Lucorum. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 157, 16-25.
8. Betül T. Yesilyurt; Constant Gielens; Filip Meersman. Thermal stability of homologous
functional units of Helix Pomatia does not correlate with carbohydrate content. (2008). The
FEBS Journal. Volume 275, Issue 14, pp. 3625-3632.
9. Elmar Jaenicke; Kay Büchler; Jürgen Markl; Heinz Decker; Thomas R.M. Barends.
Cupredoxin-like domains in haemocyanins. (2010). Biochem J. 426, 373-378.
10. J. Albert van Kuik; Herman van Halbeek; Johannis P. Kamerling; Johannes F.G. Vliegenthart.
Primary structure of the Low-molecular-weight Carbohydrate chains of Helix Pomatia α-
Hemocyanin. (1985). The Journal of Biological Chemistry. Volume 260, Nº 26. Pp. 13984-
13988.
11. Jan F.L. van Breemen; Jan H. Ploegman; Ernst F.J. van Bruggen. Structure of helix Pomatia
Oxy-β-hemocyanin and Deoxy-β-hemocyanin Tubular Polymers. (1979). Eur. J. Biochem.
100, pp. 61-65.
12. Jan F.L. van Breemen; Trijntje Wichertjes; Marijke F.J. Muller; Roel van Driel; Ernst F.J. van
Bruggen. Tubular Polymers Derived from Helix Pomatia β-hemocyanin. (1975). Eur. J.
Biochem. 60, 129-135.
13. Johann Berger; Ingrid Pilz; Raphaël Witters; René Lontie. Studies by Small-Angle X-Ray
Scattering of the Quaternary Structure of the β-Haemocyanin of Helix Pomatia. (1977). Eur.
J. Biochem. 80, 79-82.
12
14. Miguel del Campo; Sergio Arancibia; Esteban Nova; Fabián Salazar; Andrea González; Bruno
Moltedo; Pablo de Ioannes; Jorge Ferreira; Augusto Manubens; María Inés Becker.
Hemocianinas, una herramienta inmunológica de la biomedicina actual. (2011). Rev. Med.
Chile.139:pp.236-246.
15. UniProtKB. http://www.uniprot.org/uniprot/P12031
16. UniProtKB. http://www.uniprot.org/uniprot/P56823
17. SWISS-MODEL Repository. http://swissmodel.expasy.org/repository/?pid=smr03&zid=async
18. SWISS-MODEL Repository.
http://swissmodel.expasy.org/repository/smr.php?sptr_ac=P56823&csm=AEF937948AD12E
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