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INSTITUTO PRESBITERIANO MACKENZIE FACULDADE EVANGÉLICA MACKENZIE DO PARANÁ
HOSPITAL UNIVERSITÁRIO EVANGÉLICO MACKENZIE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRINCÍPIOS DA CIRURGIA
Eros Luiz de Sousa
ESTUDO EXPERIMENTAL DA INIBIÇÃO DO VEGF NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA.
Curitiba 2019
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Eros Luiz de Sousa
ESTUDO EXPERIMENTAL DA INIBIÇÃO DO VEGF NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor. Orientador: Professor Dr. Osvaldo Malafaia Coordenador: Professor Dr. Osvaldo Malafaia
Curitiba 2019
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicaçâo (CIP) (Biblioteca da Faculdade Evangélica Mackenzie do Paraná) S725 Sousa, Eros Luiz de.
Estudo experimental da inibição do VEGF na regeneração hepática / Eros Luiz de Sousa. — Curitiba, 2019.
Orientador : Prof. Dr. Osvaldo Malafaia. Tese (doutorado) – Instituto Presbiteriano Mackenzie, Faculdade
Evangélica Mackenzie do Paraná, Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia, 2019.
1. Regeneração hepática. 2. Bevacizumab. 3. Fígado. I. Título.
CDD 616.362
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AGRADECIMENTOS
• Ao Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia (IPEM) da
Faculdade Evangélica Mackenzie do Paraná, representado pelo
Prof. Dr. Osvaldo Malafaia, quem me orientou nessa jornada e com muito
carinho me recebeu.
• Ao Hospital Angelina Caron, representado pelo Coordenador do Centro
de Ensino e Pesquisa, Dr. João Carlos Domingues Repka, o qual
compartilhou sua sabedoria e sua vasta experiência sem restrições, com a
nobreza de um verdadeiro pesquisador.
• Ao Dr. Daniel Dantas Ferrarin, pelo apoio incondicional.
• Aos profissionais do programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia,
do Instituto de Pesquisas Médicas, Bruno e Erika pelas competência,
gentileza e disponibilidade constantes.
• Aos animais que pelas suas mortes contribuíram para promoção da vida de
outras espécies.
• Aos familiares e amigos pelo apoio.
• À CAPES pelo apoio neste estudo e na pesquisa brasileira.
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RESUMO
Introdução: extensas ressecções e transplantes de partes do fígado são possíveis, graças
à sua capacidade regenerativa que é dependente da ativação do fator de crescimento
vascular endotelial (VEGF) o qual também regula angiogênese. O bevacizumabe (BV),
anticorpo monoclonal inibidor do VEGF é um neoadjuvante amplamente utilizado no
tratamento de cânceres restringindo a densidade microvascular, podendo causar efeitos
indesejáveis na cicatrização pós-operatória e na regeneração hepática. Objetivo: avaliar a
regeneração hepática (RH), pós hepatectomia a 70%, sob ação de uma dose (5mg/kg) de
BV num modelo experimental murino, durante 15 dias. Métodos: utilizaram-se 32 ratos
Wistar submetidos à hepatectomia parcial (HP), separados em dois grupos conforme o
tratamento controle (C) tratados com solução fisiológica e BV tratados com BV, subdivididos
conforme o tempo de observação (48 horas e 15 dias) em C48, BV48 e C15, BV15. Os
efeitos do BV na RH foram avaliados nas avaliações ponderais, função hepática (albumina,
transaminases, bilirrubinas e relação APRI). No fígado remanescente avaliaram-se atividade
mitótica, densidade microvascular (angiogênese), proliferação nuclear, histopatologia para
investigar fibrose, edema e congestão. Empregaram-se ANOVA e T-Student com p≤0,05
para as análises estatísticas. Resultados: no décimo quinto dia pós-HP e tratamento com
BV, não ocorreram diferenças nas avaliações ponderais (p=0,0691), na função hepática e
nos índices mitóticos (p=0,1576). Porém, houve diminuição na viabilidade celular
(p=0,0000), densidade microvascular (p=0,0162) e piora na ocorrência de alterações
histopatológicas como fibrose, edema e congestão hepáticas. Conclusão: a dose única de
BV, não causou, ao décimo quinto dia de evolução, alterações ponderais, bioquímicas
séricas (albumina, bilirrubinas e transaminases) e dos índices mitóticos. Contudo induziu
diminuição da densidade microvascular, viabilidade celular e alterações histopatológicas
hepáticas como edema, congestão e fibrose.
Descritores: Regeneração hepática, angiogênese, bevacizumab, VEGF, ratos Wistar.
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ABSTRACT
Background: extensive liver resections and transplants of liver parts are possible thanks to
its regenerative capacity which is dependent on vascular endothelial growth factor (VEGF)
activation which also regulates the angiogenesis. Bevacizumab (BV), a monoclonal antibody
VEGF inhibitor, is a neoadjuvant treatment of cancers widely used, restricting microvascular
density and may cause undesirable effects on postoperative healing and liver regeneration
(LR). Objective: to determine the effect of a single dose (5mg/kg) of BV in LR. Methods: 32
rats submitted to partial hepatectomy (PH) were separated into two groups according to
saline solution (C) or BV (BV) treatment. According to the observation time (48h and 15
days) they were subdivided in C48 and BV48 and C15 and BV15 sub-groups. In LR, the BV
effects were evaluated by weight variation and liver function (albumin, transaminase, bilirubin
and APRI ratio) and in remaining liver were evaluated, mitotic activity, microvascular density
(angiogenesis), nuclear proliferation, histopathology for fibrosis, edema and congestion. For
statistical analysis, the ANOVA and T-Student test was used (of statistical significance when
p≤0.05). Results: on the fifteenth day after PH and BV treatment, there were no differences
in weight evaluations (p=0.0691), liver function and mitotic indexes (p=0.1576). However,
there was a decrease in cell viability (p=0.0000), microvascular density (p = 0.0162) and
worsening in the occurrence of histopathological changes such as liver fibrosis, edema and
congestion. Conclusion: a single BV dose, on the fifteenth day of evolution has no
significant effect in weight evolution, serum biochemical evaluations (albumin, bilirubin and
transaminases) and mitotic index. However, it induced microvascular density decreased, cell
viability and liver histopathological changes such as fibrosis, edema and congestion.
Key words: Hepatic regeneration, angiogenesis, bevacizumab, VEGF, Wistar rats.
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LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - PROMETEU. ESCULTURA DE NICOLAS-SÉBASTIEN ADAM, 1762,
MUSEU DO LOUVRE – PARIS/ FRANÇA ............................................ 20
FIGURA 2 - ILUSTRAÇÃO ORIGINAL PROPOSTA POR FOLKMAN EM 1971 DEMONSTRANDO A ANGIOGÊNESE TUMORAL ..............................
49
FIGURA 3 - AMBIENTE CIRÚRGICO DEMONSTRANDO A MONTAGEM DA MESA CIRÚGICA...................................................................................
56
FIGURA 4 - CORTE HISTOLÓGICO (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO CORADO PELA HEMATOXILINA E EOSINA DE HARRIS, APÓS 48 HORAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL, DEMONSTRANDO NOS DETALHES AS FIGURAS DE MITOSES ..............................................
60
FIGURA 5 - CORTE HISTOLÓGICO (100X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO CORADO POR TÉCNICA IMUNOHISTOQUÍMICA COM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, APÓS 48 HORAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL...................................................................
61
FIGURA 6 - CORTE HISTOLÓGICO (100X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO CORADO POR TÉCNICA IMUNOHISTOQUÍMICA COM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, APÓS 48 HORAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL ..................................................................
62
FIGURA 7 - CORTES HISTOLÓGICOS (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO TRATADO PELO BEVACIZUMABE, CORADO PELO MÉTODO TRICRÔMICO DE GOMORI, APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL, DEMONSTRANDO ÁREAS DE FIBROSE NOS DETALHES “A” E “B”....................................................
63
FIGURA 8 - CORTES HISTOLÓGICOS (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO TRATADO PELO BEVACIZUMABE, CORADO PELO MÉTODO HEMATOXILINA E EOSINA DE HARRIS. NO DETALHE “A” APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL OBSERVA-SE HEMORRAGIA E INFLAMAÇÃO INTRAPARENQUIMATOSAS. NO DETLAHE ¨B¨, APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL OBSERVA-SE CONGESTÃO INTRAPARENQUIMATOSAS, E NO DETALHE “C” APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL OBSERVA-SE INTENSA PROLIFERAÇÃO DUCTAL ..........................
64
9
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO PONDERAL DOS SUB-GRUPOS ...........................................................................................
66
GRÁFICO 2 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS SÉRICAS DE ALBUMINA DOS SUB-GRUPOS .........................................................................
67
GRÁFICO 3 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS DE BILIRRUBINAS TOTAL, DIRETA E INDIRETA DOS SUB-GRUPOS ......................................
68
GRÁFICO 4 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS DE TRANSAMINASES GLUTÂMICO-OXALACÉTICA (TGO) E GLUTÂMICO-PIRÚVICA (TGP) DOS SUB-GRUPOS ...............................................................
69
GRÁFICO 5 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO DO ÍNDIC APRI DOS SUB-GRUPOS ...........................................................................................
70
GRÁFICO 6 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS DETERMINAÇÕES DOS ÍNDICES MITÓTICOS DOS SUB-GRUPOS .....................................................
71
GRÁFICO 7 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR PELO ANTÍGENO NUCLEAR DE PROLIFERAÇÃO CELULAR (PCNA) DOS SUB-GRUPOS ............................................................
72
GRÁFICO 8 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO DA DENSIDADE MICROVASCULAR DOS SUB-GRUPOS .........................................
73
GRÁFICO 9 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO OCORRÊNCIA DE FIBROSE NO PARÊNQUIMA HEPÁTICO DOS SUB-GRUPOS ......................
74
GRÁFICO 10 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO PARÊNQUIMA HEPÁTICO DOS SUB-GRUPOS ............................
75
10
LISTA DE TABELAS TABELA 1 - DEMONSTRATIVO DA ORGANIZAÇÃO DOS GRUPOS DO
ESTUDO E PROCEDIMENTOS REALIZADOS ............................... 55
TABELA 2 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS PESAGENS DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS ....................................................................
66
TABELA 3 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE ALBUMINA DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS ................................
67
TABELA 4 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE BILIRRUBINAS TOTAL, DIRETA E INDIRETA DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS .....................................................................
68
TABELA 5 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE DE TRANSAMINASES GLUTÂMICO-OXALACÉTICA (TGO) E GLUTÂMICO-PIRÚVICA (TGP) DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS
69
TABELA 6 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DETERMINAÇÕES DO ÍNDICE DA RELAÇÃO ASPARTATO-AMINOTRANSFERASE / PLAQUETAS (APRI) DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS .................
70
TABELA 7 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DETERMINAÇÕES DOS ÍNDICES MITÓTICOS DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS ......
71
TABELA 8 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS DA AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR PELA PESQUISA IMUNOHISTOQUÍMICA DO PCNA
72
TABELA 9 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS AVALIAÇÕES DA AVALIAÇÃO DA ANGIOGÊNESE PELA PESQUISA IMUNOHISTOQUÍMICA DO CD34 ...................................................
73
TABELA 10 - PESAGENS DOS RATOS ................................................................ 99
TABELA 11 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS PESAGENS DOS RATOS NOS TEMPOS 0, 48HORAS E 15 DIAS ...................................................
99
TABELA 12 - ORGANIZAÇÃO DOS GRUPOS DE ESTUDO E AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA DAS MÉDIAS DE PESOS ........................................
100
TABELA 13 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE ALBUMINA DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15 .........
110
TABELA 14 - RESULTADOS DAS DOSAGENS SÉRICAS DE BILIRRUBINAS (MG/DL) ............................................................................................
110
TABELA 15 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE BILIRRUBINAS DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15 ........................................................................................
112
TABELA 16 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE
11
BILIRRUBINAS DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15 ........................................................................................
113
TABELA 17 - RESULTADOS DAS DOSAGENS SÉRICAS DE TRANSAMINASES (mg/dl) ...............................................................
115
TABELA 18 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE TRANSAMINASES DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15 ..................................................................................
115
TABELA 19 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DOS ÍNDICES ASPARTATO-AMINOTRANSFERASES DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15 .........................................................................
116
TABELA 20 - RESULTADOS DAS DETERMINAÇÕES DOS ÍNDICES DA RELAÇÃO ASPARTATO AMINOTRANSFERASE / PLAQUETAS (APRI) CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS ......................
117
TABELA 21 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE FIGURAS DE MITOSES EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA E EOSINA EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS .........
119
TABELA 22 - RESULTADOS DAS CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE FIGURAS DE MITOSES EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA E EOSINA EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS..........
120
TABELA 23 - RESULTADOS DAS CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE CÉLULAS MARCADAS PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS ..............................................................................................
124
TABELA 24 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE CÉLULAS MARCADAS PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS ..............................................................................................
125
TABELA 25 - RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES HISTOMÉTRICAS DAS MARCAÇÕES PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS .........
128
TABELA 26 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS AVALIAÇÕES HISTOMÉTRICAS DAS MARCAÇÕES PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS .........
129
TABELA 27 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS AVALIAÇÕES DE ÁREAS FIBRÓTICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELO TRICRÔMICO DE GOMORI, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE
12
RATOS, EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS .......................................................................
131
TABELA 28 - RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES DE ÁREAS FIBRÓTICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELO TRICRÔMICO DE GOMORI, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS .......................................................................
132
TABELA 29 - EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA & EOSINA DE HARRIS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS .......................................................................
134
TABELA 30 - RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA & EOSINA DE HARRIS .........................................
135
13
LISTA DE ABREVIATURAS µg - Micrograma
µl - Microlitro
µm - Micrômetro
® - Marca Registrada ALR - Aumentador da Regeneração Hepática (Augmenter of Liver Regeneration) ALT - Alanina Aminotransferase APRI - Índice Aspartato Aminotransferase / Plaquetas AST - Aspartato aminotransferase bFGF - Fator Básico de Crescimento Endotelial Vascular BV - Bevacizumabe Ca++ - Cálcio bivalente CD31 - Clone de diferenciação 31 CD34 - Clone de diferenciação 34 CEPA - Comitê de ética em pesquisa em animais cm - Centímetro CMET - Receptor do Fator de Crescimento de Hepatócito COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal CTGF - Fator de Crescimento do Tecido Conjuntivo DNA - Ácido Desoxirribonucleico EGF - Fator de crescimento epidérmico FGF - Fator de crescimento de fibroblasto FIB - Índice de Fibrose Baseado e Quatro Fatores Flt-1 - Precursor 1 do receptor VEGF g - Grama G1 - gap 1 - Pré-síntese G2 - gap 2 - Pós-síntese GGT - Gama Glutamil-transferase GPR - Relação Gama Glutamil-transpeptidase em relação a plaquetas HAC - Hospital e Maternidade Angelina Caron HCV - Vírus da Hepatite C HE - Hematoxilina-eosina HGF - Fator de Crescimento de Hepatócitos IL - Interleucina kD - Kilo-Daltons - Unidade de massa molecular
14
kg - Quilograma Ki-67 - Antígeno Ki-67 M - Mitose MAB - Anticorpo Monoclonal MEC - Matriz Extracelular mg - Miligrama mg/kg - Miligrama por quilograma ml - Mililitro MMP - Metaloproteinases da Matriz NDAPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida NFKB - Fator Nuclear Kappa B nmol/mg - Nanomol por miligrama O2
- Oxigênio ºC - Graus Celsius ON - Óxido nítrico PAF - Fator ativador plaquetário PBS - Solução tampão fosfatos PCNA - Antígeno Nuclear de Proliferação Celular PDGF - Fator de crescimento derivado de plaquetas PDGF - Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas pH - Potencial hidrogeniônico PHx - Hepatectomia Parcial de 2/3 PMN - Polimorfonucleares RNAm - Ácido ribonucléico mensageiro ROC - Receiver Operating Characteristic RTKs - Receptores de Tirosinaquinases S - Replicação do DNA TAP - Tempo de Ativação da Protrombina TGF - Fator de crescimento transformador TGF-β - Fator de Crescimento Transformador Beta TGO - Transaminase glutâmico-oxalacética TIMPs - Inibidores Teciduais das Metaloproteinases da Matriz
TNFα - Fator de necrose tumoral alfa
TNF-α - Fator de Crescimento de Necrose Tumoral Alfa TPO - Trombopoetina TTPA - Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada VEGF - Fator de Crescimento Endotelial Vascular
15
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 17 1.1 OBJETIVO ................................................................................................................ 18 2 REVISÃO DA LITERATURA ...................................................................................... 19 2.1 A REGENERAÇÃO HEPÁTICA ............................................................................... 20 2.2 AVALIAÇÃO DA REGENERAÇÃO HEPÁTICA ....................................................... 25 2.3 ANGIOGÊNESE E VASCULOGÊNESE .................................................................. 30 2.4 FATORES DE CRESCIMENTO NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA ......................... 33 2.4.1 As plaquetas e a regeneração hepática ................................................................ 33 2.4.2 A serotonina e a regeneração hepática ................................................................. 35 2.4.3 O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e a regeneração hepática ..... 36 2.4.4 O fator de crescimento de hepatócito (HGF) e a regeneração hepática ............... 38 2.4.5 O fator de necrose tumoral (TNFα) e a regeneração hepática .............................. 39 2.4.6 Fator de crescimento epidérmico (EGF) e a regeneração hepática ...................... 39 2.4.7 Interleucina 6 (IL6) e a regeneração hepática ....................................................... 39 2.4.8 Fator de Crescimento de Fibroblastos Ácido (FGFα) e a regeneração hepática .. 40 2.4.9 Substância estimuladora hepática (HSS) e a regeneração hepática .................... 40 2.5 MODELOS EXPERIMENTAIS DE HEPATECTOMIAS PARCIAIS .......................... 41 2.5.1 Anatomia do fígado de ratos .................................................................................. 41 2.5.2 Técnicas de ressecção hepática ........................................................................... 44 2.6 O BEVACIZUMABE .................................................................................................. 47 3 MÉTODO ..................................................................................................................... 55 3.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ......................................................................... 55 3.2 EXPERIMENTO ........................................................................................................ 56 3.2.1 Anestesia ............................................................................................................... 57 3.2.2 Hepatectomia parcial ............................................................................................. 57 3.3 TRATAMENTOS ....................................................................................................... 57 3.4 INTERRUPÇÃO DO EXPERIMENTO E COLETA DE AMOSTRAS ........................ 58 3.5 AVALIAÇÕES ........................................................................................................... 58 3.5.1 Avaliação ponderal ................................................................................................ 58 3.5.2 Avaliações bioquímicas séricas ............................................................................. 59 3.5.2.1 Dosagem de Albumina ....................................................................................... 59 3.5.2.2 Dosagem de Bilirrubinas Total, Direta e Indireta ................................................ 59 3.5.2.3 Dosagem de Transaminases glutâmico-oxalacética (TGO) e glutâmico-
pirúvica (TGP) ..................................................................................................... 59
3.5.2.4 Determinação do Índice aspartato-aminotransferase / plaquetas (APRI) .......... 59
16
3.5.3 Avaliações microscópicas ...................................................................................... 59 3.5.3.1 Determinação do Índice Mitótico ........................................................................ 60 3.5.3.2 Avaliação da densidade viabilidade celular pelo antígeno nuclear de
proliferação celular (PCNA) ................................................................................ 61
3.5.3.3 Avaliação da densidade microvascular pelo CD34 ............................................ 62 3.5.3.4 Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático ............................. 63 3.5.3.5 Avaliação histopatológica do parênquima hepático ............................................ 64 3.5.4 Avaliações estatísticas .......................................................................................... 65 4 RESULTADOS ............................................................................................................ 66 4.1 AVALIAÇÃO PONDERAL ......................................................................................... 66 4.2 AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS SÉRICAS ................................................................. 67 4.2.1 Dosagem de Albumina .......................................................................................... 67 4.2.2 Dosagem de Bilirrubinas Total, Direta e Indireta ................................................... 68 4.2.3 Dosagem de Transaminases glutâmico-oxalacética (TGO) e glutâmico-pirúvica
(TGP) ..................................................................................................................... 69
4.2.4 Determinação do Índice aspartato-aminotransferase / plaquetas (APRI) ............. 70 4.3 AVALIAÇÕES MICROSCÓPICAS ........................................................................... 71 4.3.1 Determinação do Índice Mitótico ........................................................................... 71 4.3.2 Avaliação da viabilidade celular pelo antígeno nuclear de proliferação celular
(PCNA) .................................................................................................................. 72
4.3.3 Avaliação da densidade microvascular pelo CD34 ............................................... 73 4.3.4 Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático ................................ 74 4.3.5 Avaliação histopatológica do parênquima hepático ............................................... 75 5 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 76 5.1 O MODELO EXPERIMENTAL .................................................................................. 76 5.2 ANGIOGÊNESE E REGENERAÇÃO HEPÁTICA .................................................... 77 5.3 A VIABILIDADE CELULAR, ANGIOGÊNESE E A FUNÇÃO HEPÁTICA ................ 78 5.4 OS ACHADOS HISTOPATOLÓGICOS E A REGENERAÇÃO HEPÁTICA ............. 81 5.5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................... 84 6 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 85 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 86 ANEXO ........................................................................................................................... 96 1. PARECER DA COMISSÃO DE ÉTICA EM PESQUISAS EM ANIMAIS DE
LABORATÓRIO ........................................................................................................ 96
APÊNDICES ................................................................................................................... 98 1. Protocolo para pesagens de ratos ............................................................................ 98 2. Protocolo para Anestesia em ratos ........................................................................... 100 3. Procedimentos para cirurgias experimentais do laboratório da coordenação de
ensino e pesquisa do Hospital Angelina Caron - Hepatectomia parcial a 70% em ratos ..........................................................................................................................
101
17
4. Procedimentos para interrupção de experimentos e eutanásia ............................... 105 5. Dosagem de Albumina ............................................................................................. 109 6. Dosagem de Bilirrubinas ........................................................................................... 111 7. Dosagem de amino-transaminases glutâmico-oxalacética (AST/TGO) e glutâmico-
pirúvica (ALT/TGP) ................................................................................................... 114
8. Determinação do Índice da relação aspartato aminotransferase / plaquetas (APRI) ...................................................................................................................................
116
9. Determinação do Índice Mitótico .............................................................................. 118 10. Avaliação da viabilidade celular pelo antígeno nuclear de proliferação celular
(PCNA) ..................................................................................................................... 121
11. Avaliação da densidade microvascular pelo CD34 .................................................. 126 12. Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático ................................... 130 13. Avaliação histopatológica do parênquima hepático .................................................. 133
1. Introdução
17
Os produtos biológicos e biotecnológicos têm ocupado um lugar central no
âmbito da pesquisa e do desenvolvimento terapêutico, especialmente a partir da
década de 1980, quando a farmacologia se reinventou com o surgimento de
produtos elaborados por nova rota, a biotecnológica, objetivando oferecer opções
voltadas à medicina personalizada e à terapia direcionada para células tumorais
(SILVA, SILVA e OSORIO-DE-CASTRO, 2016; VIDAL, FIGUEIREDO e PEPE,
2018).
No Brasil a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) distingue seis
principais grupos de produtos biológicos: vacinas, soros hiperimunes,
hemoderivados, biomedicamentos obtidos a partir de fluidos biológicos, tecidos de
origem animal ou a partir de procedimentos biotecnológicos, medicamentos
contendo microrganismos vivos, atenuados ou mortos e anticorpos monoclonais
(mABs). Os mABs são anticorpos derivados de um mesmo clone de linfócito B, cuja
clonagem e propagação se efetuam em linhas de células contínuas e sob elevada
sofisticação tecnológica (ANVISA). Muitos mABs são produzidos para identificar e se
ligar a antígenos específicos de certos tipos de células tumorais e exercer
citotoxicidade seletivamente sobre estas, preservando as células não tumorais,
sendo esta a grande vantagem quando comparados às terapias quimiocitotóxicas
convencionais (REICHERT e DHIMOLEA, 2012). Com o advento destes
medicamentos biológicos, a sobrevida dos doentes aumentou, influenciada também
pelo aprimoramento das técnicas cirúrgicas e das terapias sistêmicas modernas
(BILCHIK e HECHT, 2008).
Entre os biológicos aplicados na terapia anticâncer o bevacizumabe (BV), um
anticorpo da subclasse IgG1, monoclonal humanizado recombinante, com 93% de
sequência de aminoácidos de origem humana e 7% de origem murina, tem como
1. Introdução
18
alvos as isoformas do receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF),
sendo assim classificado como uma droga anti-angiogênica (FOLKMAN, 1995).
O papel bem estabelecido do VEGF na promoção de angiogênese tumoral e
na patogênese de tumores humanos serviu de estímulo para que o BV, um anti-
receptor de VEGF capaz de inibir a angiogênese e consequentemente o crescimento
tumoral, passasse a ser incorporado no tratamento de pacientes, adjuvando outras
opções quimioterápicas em tratamentos pré-operatórios. Entre as indicações
cirúrgicas oncológicas no fígado, se sobressaem as ressecções de metástases em
pacientes portadores de carcinoma colorretal.
O progresso na terapia anti-VEGF revelou paulatinamente seus possíveis
efeitos adversos relacionados ao inadequado fornecimento de sangue para os
tecidos, o que levou à indicação de interrupção do seu uso antes ou depois de
intervenções cirúrgicas. No entanto, estas questões não foram ainda completamente
elucidadas para os diferentes órgãos (PAVLIDIS et al., 2010). Os efeitos da inibição
da angiogênese nos complexos fenômenos inerentes à regeneração hepática não
são bem claros (HURWITZ et al., 2004; FUH et al., 2006; MILLET et al., 2012;
AUSSILHEU et al.,2009; ZORZI et al. 2008; DUPRE et al., 2012).
Considerando que os estudos clínicos não permitem análise precisa da
regeneração hepática e a escassez de estudos experimentais neste domínio
específico, desenvolveu-se o presente estudo com o objetivo abaixo citado.
1.1 Objetivo:
Avaliar a influência da BV na dose de 5mg/kg na regeneração hepática em
ratos Wistar hepatectomizados à 70%, através dos seguintes indicadores: evolução
ponderal dos ratos, índice mitótico, angiogênese, viabilidade celular, histopatologia
do parênquima hepático e avaliação de parâmetros bioquímicos.
2. Revisão da Literatura
19
Não é surpreendente que as vias de sinalização ativadas durante a regeneração do
fígado se assemelhem fortemente às da cicatrização de feridas, observadas em outros
tecidos. A diferença com o processo clássico de cicatrização de feridas é que as alterações
observadas no fígado ocorrem em todo o órgão e que alguns dos sinais podem ser
derivados em parte da circulação periférica. Em um cenário típico de cicatrização de feridas,
a lesão do tecido resulta na ruptura das redes vasculares capilares e extravasamento de
sangue, acompanhada de liberação local de fatores de coagulação, plaquetas, fatores de
crescimento, entre outras. Este não é claramente o caso após hepatectomia a 2/3 na qual
três lobos hepáticos são removidos cirurgicamente sem danificar os dois lobos
remasnescentes.
Mesmo que não haja danos ao tecido remanescente, neste há grandes mudanças
nos padrões de fluxo sanguíneo. Há considerável literatura sugerindo que as alterações
hemodinâmicas precoces após a hepatectomia são importantes e, mesmo não havendo
extravasamento de sangue total, as alterações hemodinâmicas após a hepatectomia
induzem um espectro global de eventos em todo o fígado que se assemelha a uma resposta
cicatricial.
O componente arterial do suprimento de sangue por unidade de tecido hepático não
muda após a remoção de 2/3 do fígado, a distribuição do sangue portal por tecido unitário,
no entanto, triplica e a veia porta continua a transportar todo o fluxo do estômago,intestino,
baço e pâncreas. O fluxo integral agora precisa atravessar um leito capilar cuja seção
transversal é matematicamente até 1/3 do original, Os capilares hepáticos têm células
endoteliais fenestradas que permitem o acesso direto do plasma através das células
endoteliais aos hepatócitos (MICHALOPOULOS, 2007).
2. Revisão da Literatura
20
2.1 A REGENERAÇÃO HEPÁTICA
Desde a antiguidade, já se conhecia o fenômeno da regeneração hepática através
da tragédia grega escrita por Aeschylus, 470 a.C. Neste clássico da mitologia grega,
Prometeu, um titã, filho de Jápeto e irmão de Atlas, foi um defensor da humanidade,
conhecido por sua astuta inteligência, responsável por roubar o fogo de Héstia e o dar aos
mortais. Zeus, que temia que os mortais ficassem tão poderosos quanto os próprios deuses,
além de baní-lo o teria então punido por este crime, deixando-o amarrado a uma rocha no
Monte Cáucaso por toda a eternidade, enquanto um grande abutre comia diariamente seu
fígado (figura 1). Durante a noite o órgão sofria o processo de regeneração, o que
proporcionava ao animal fonte eterna de alimento e também, mantinha Prometeu vivo para
sua tortura eterna (PISTOI, 1996; MICHALOPOULOS, 2007; BARETTA et al., 2015).
FIGURA 1: PROMETEU. ESCULTURA DE NICOLAS-SÉBASTIEN ADAM, 1762, MUSEU DO LOUVRE – PARIS/ FRANÇA.
2. Revisão da Literatura
21
O fígado é um dos órgãos mais complexos do corpo humano e está envolvido em
cerca de 5.000 funções. Ele tem dois suprimentos de sangue diferentes e é composto de
cinco tipos diferentes de células e uma estrutura extracelular complexa. É vulnerável a uma
grande variedade de metabólicos, tóxicos, microbianos, insultos circulatórios e neoplásicos
(BIONDO-SIMÕES et al., 2006; GODOY et al., 2006; MICHALOPOULOS, 2007; MAO e
SCOTT, 2014; BARETTA et al., 2015).
A regeneração do fígado é amplamente estudada através de um procedimento
cirúrgico que remove 2/3 da massa do fígado em roedores (ratos e camundongos), uma
técnica conhecida como “hepatectomia parcial a 2/3 (PHx)”. Devido à estrutura de múltiplos
lóbulos do fígado de roedores, três dos cinco lobos do fígado (representando 2/3 da massa
do fígado) podem ser removidos por um procedimento cirúrgico fácil, sem causar nenhum
dano tecidual aos dois lobos residuais. Os últimos crescem em tamanho para restaurar um
agregado celular equivalente à massa dos cinco lobos originais. O processo, em ratos e
camundongos, é concluído dentro de 5 a 7 dias após a cirurgia (MICHALOPOULOS, 2007).
A regeneração hepática tem início com a proliferação celular iniciada nas vinte e
quatro horas que suscedem a cirurgia. Aproximadamente no oitavo dia ocorre uma onda de
apoptose de células endoteliais, após a qual a proliferação de hepatócitos cessa. O fígado
para de crescer em 10 dias. Contudo, se uma proteína angiogênica, como VEGF ou bFGF,
é administrada sistemicamente, as células endoteliais continuam a proliferar e o fígado
continua a crescer além do seu tamanho normal, Por outro lado, se um inibidor específico da
proliferação endotelial for administrado, a regeneração hepática é evitada e o fígado
permanece a 30% do seu tamanho normal, A descontinuação do inibidor endotelial é
seguida imediatamente pela regeneração hepática completa em 10 dias (GREENE, et al.,
2003).
Estes experimentos indicam que o tecido normal e a regeneração do fígado são
controlados em parte pelo endotélio microvascular. Dada a extensão da proliferação celular
necessária para restaurar a massa original após a hepatectomia, é intuitivo que virtualmente
toda maquinaria celular seja ativada durante a regeneração e isso implica em centenas de
2. Revisão da Literatura
22
caminhos. Estes se inciam por uma ativação inicial da cascata de citocinas nas células de
Kupffer, que estimula o fator de crescimento e as vias metabólicas nos hepatócitos. Outras
células não parenquimatosas (células estreladas, células endoteliais vasculares e biliares)
proliferam após os hepatócitos, presumivelmente respondendo a outro conjunto de sinais
(RIEHLE et al., 2011).
O termo regeneração, que é amplamente aceito, significa apenas a recuperação do
volume do órgão e não a regeneração da parte perdida. O que realmente ocorre é a
hiperplasia global de todo o parênquima. Sabe-se que este é um evento que promove um
crescimento de tecido altamente ordenado e organizado até o fígado atingir o seu peso
original, com uma pequena variação entre 5 e 10% (GREENE et al., 2003; PISTOI, 2006;
BIONDO-SIMÕES et al., 2006; FAUSTO et al., 2006; GODOY et al., 2006; MAO e SCOTT,
2014; BARETTA et al., 2015).
Talvez ainda mais extraordinário do que a capacidade de proliferação dos
hepatócitos seja o fato de que essas células desempenham simultaneamente funções
essenciais para manutenção da homeostase orgânica, como regulação do nível de glicemia,
síntese de proteínas plasmáticas e fatores de coagulação, secreção biliar, ciclo da uréia e
biodegradação de compostos tóxicos (GREENE, et al., 2003; BIONDO-SIMÕES et al.,
2006; BARETTA et al., 2015; KARADENIZ et al., 2019).
Para se estudar o processo regenerativo é essencial que se entenda o ciclo celular.
Ele é constituído de quatro fases distintas: G1, S, G2 e M. A fase G1 ou gap 1 é a fase que
as células preparam a síntese de DNA, e este processo preparatório não é visível ao
microscópio ótico. A fase S se refere à síntese de DNA no ciclo celular. Durante esta fase
ocorre a replicação comossomal de DNA na célula. A fase G2 ou gap 2 é a fase onde a
célula se prepara para a mitose ou para a divisão celular física. A fase M, ou fase mitótica, é
a fase do ciclo celular mais aparente e pode ser facilmente reconhecida ao microscópio
ótico. Transpondo essas informações para a replicação dos hepatócitos, conclui-se que a
cinética da resposta proliferativa inicia-se pela síntese de DNA, que ocorre 12 a 16 horas
após a hepatectomia parcial, sendo o pico máximo observado em 24 a 26 horas após a
2. Revisão da Literatura
23
cirurgia. O aparecimento de mitoses sucede o início da síntese de DNA em seis a oito horas,
atingindo o ápice 48 horas depois da cirurgia (JESUS, WAITZBERG & CAMPOS, 2000;
PISTOI e MORELLO, 1996). Tendo em vista que dois terços do tecido hepático são
ressecados, a restauração do número original de hepatócitos requer, teoricamente, 1,66
ciclos proliferativos por hepatócito residual. Assim, a maioria dos hepatócitos nos lobos
residuais participará de apenas um ou dois eventos proliferativos (MICHALOPOULOS,
2007).
Embora o fígado seja o órgão com maior capacidade de proliferação celular, apenas
0,0012% a 0,01% dos hepatócitos sofrem mitose nos demais momentos da vida. Os
hepatócitos são células de natureza epitelial, altamente diferenciada, que raramente se
divide. Apenas um hepatócito entre 20.000 pode se dividir em algum momento, durante a
vida, sendo que essa divisão pode ocorrer no máximo, uma ou duas vezes para cada célula
Esta baixa taxa de ciclo celular em fígados saudáveis reflete em situações de agressões
hepáticas tóxicas ou ressecções cirúrgicas, quando 3% do hepatócitos sofrem mitose. O
desempenho adequado da regeneração hepática é complexo e dependente da interação de
eventos, que envolve a regulação da matriz extra-celular, espaçamento do intervalo de
junção intercelular, dissolução e ressíntese da membrana altamente especializada dos
hepatócitos, além da liberação e alinhamento de mais de 150 cromossomos, entre os quais
alguns que induzem a mitose (JESUS, WAITZBERG e CAMPOS, 2000; KARADENIZ et al.,
2019).
A evolução das hipóteses referentes aos mecanismos de regeneração hepática pode
ser categorizada em três fases:
1ª) A hipótese original de que um único agente humoral poderia funcionar como uma chave,
capaz de desbloquear todos os eventos necessários para a regeneração do fígado.
2ª) A hipótese de que a ativação de uma via envolvendo múltiplos componentes poderia ser
responsável pela regeneração.
3ª) A hipótese mais recente de que a atividade de 1-3 vias múltiplas são necessárias para a
regeneração do fígado.
2. Revisão da Literatura
24
Esta última formulação ainda é uma simplificação excessiva de uma realidade mais
complexa, pois a regeneração do fígado requer a ativação de múltiplas vias, mas essas vias
não atuam independentemente umas das outras, sendo que uma proposta alternativa seria
que o circuito essencial necessário para a regeneração hepática é composto por três tipos
de vias: citocina, fator de crescimento e redes metabólicas que ligam a função hepática ao
crescimento e à proliferação celular (FAUSTO et al., 2006). Um determinante crítico do
resultado em pacientes submetidos à hepatectomia é o grau de regeneração do fígado que
ocorre após a cirurgia. Estudos em animais demonstraram que a regeneração hepática
depende do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e da angiogênese (VAUTHEY
e ZORZI, 2009).
Em estudos experimentais, as massas hepáticas ressecada e remanescentes podem
ser determinadas através da mensuração e cálculo dos pesos dos fígados através do peso
dos animais. Obviamente, este método não está disponível para a prática clínica. Entretanto,
a tomografia computadorizada e, mais recentemente, a ressonância magnética têm sido
sugeridas como alternativas viáveis para este propósito. O problema é que o peso hepático
varia muito de acordo com o depósito de lipídios, carboidratos e com a presença de células
inflamatórias. Por estas razões, o cálculo da massa do fígado como um marcador de
regeneração hepática esta confinada ao uso em estudos experimentais em animais de
laboratório e raramente representa um parâmetro sólido (ASSY e MINUK, 1997;
BERTICELLI, 2005; BARETTA et al., 2015).
As plaquetas contêm numerosos fatores de crescimento que podem contribuir
teoricamente para a regeneração hepática, havendo aparentemente um único estudo que
contraria tal expectativa, dado que não identificou qualquer correlação entre as plaquetas e
a regeneração hepática do rato, visto que esta ocorreu normalmente em condições de
trombocitopenia. Contudo, grandes avanços técnicos e uso de outras abordagens
experimentais ocorreram desde a publicação desse estudo, e vários estudos mais recentes
demonstraram que a regeneração hepática é claramente influenciada pelo número de
plaquetas (KUWASHIMA et al., 1990).
2. Revisão da Literatura
25
No ano de 2000 surgiu o primeiro artigo dirigido especificamente ao papel das
plaquetas na regeneração hepática. Desde então, os estudos experimentais com plaquetas
evidenciam que elas contribuem expressivamente para a regeneração do órgão, sendo sua
eficácia proporcional à sua quantidade na corrente sanguínea. Tais estudos identificaram
aumentos significativos na velocidade de regeneração do órgão de cobaias portadores de
trombocitose e contagem normal de plaquetas, quando comparadas com trombocitopênicos.
Ainda, alguns autores demonstraram aumento na sobrevida dessas cobaias em relação ao
último grupo (SOBRAL et al., 2016).
2.2 AVALIAÇÃO DA REGENERAÇÃO HEPÁTICA
Nos estudos realizados com hepatectomia a 70%, as provas de função hepática
permanecem dentro dos limites da normalidade. Porém, o estudo de Aguiar e colaboradores
em 2011, mostrou que houve alteração da função hepática no fígado remanescente
relacionada aos níveis de colesterol, proteínas totais, albumina e globulinas e o tempo de
ativação da protrombina (TAP). As transaminases ALT e AST, a fosfatase alcalina, a gama
glutamil transpeptidase, a glicemia, tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA), bem
como a excreção de bilirrubinas, apresentaram valores dentro da normalidade.
Alguns testes bioquímicos também podem ser usados para observar o perfil
hepático, como dosagem da ALT, da AST, relação AST/ALT, gama-GT, fosfatase alcalina,
tempo de protrombina, albumina e bilirrubinas. Contudo, a doença hepática grave ainda
pode apresentar níveis normais das enzimas hepáticas, ou acarretar alterações de 1,5 a três
vezes acima dos níveis de referência (ANTONELLO et al., 2010; AGUIAR et al., 2011,
SILVA et al., 2015). A GGT é considerada como um preditor independente de inflamação
hepática moderada a grave (WU et al.,2018).
A alanina aminotransferase é o marcador sérico mais comum para avaliar a lesão
hepática. Recentemente, no entanto, o papel da ALT na previsão da inflamação do fígado
2. Revisão da Literatura
26
tem sido questionado. Alguns pacientes com doença hepática moderada identificada na
histologia podem apresentar uma ALT de nível normal. Estudos mostraram que, mesmo
quando os pacientes com ALT normal ainda podem ter risco significativamente aumentado
de doença hepática ou progressão da doença hepática. Essa reflexão foi citada por Wu e
colaboradores em 2018, quando compararam diferentes marcadores não invasivos e aplicou
o índice de fibrose baseado em quatro fatores (FIB-4), o índice de transaminase de
aspartato em relação à taxa de plaquetas (APRI), a relação gama-glutamil transpeptidase
em relação a plaquetas (GPR) e a distribuição da relação hemácias-plaquetas (RPR) foram
analisados com curvas ROC (características operacionais do receptor), para avaliar sua
capacidade de diagnosticar corretamente a inflamação do fígado. Em conclusão, o estudo
mostrou que a ALT sérica não é robusta o suficiente para diagnosticar a inflamação do
fígado. O APRI e o GPR parecem ser melhores marcadores para diagnosticar inflamação e
fibrose hepática.
Em estudo semelhante realizado por Zhang e colaboradores em 2016, onde além de
comparar métodos não invasivos, avaliaram a aplicação do método APRI e FIB-4 para
avaliar a ocorrência de fibrose grave na cirrose em pacientes infectados pelo vírus da
hepatite B, sendo que o FIB-4 ficou mais indicado para a previsão de cirrose. Concluíram
que a utilidade clínica do FIB-4 e do APRI para fibrose precisa de mais validação externa em
uma grande população antes de ser usada para predizer a fibrose em paciente com infecção
pelo vírus da hepatite B. Segundo Wai e colaboradores em 2003 o APRI é capaz de
confirmar a existência de fibrose significativa e excluir a cirrose, o que o torna disponível,
como alternativa, na prática clínica.
A contagem de figuras de mitoses coradas pela Hematoxilina-Eosina (HE) é um dos
parâmetros mais utilizados para avaliação da regeneração hepática por ser fácil de
reproduzir com custo baixo, e dessa forma é considerado método de referência para
estudos experimentais, porém há incovenientes como o tempo curto em que ocorre a mitose
no ciclo celular (ASSY e MINUK, 1997; SILVA et al., 2015).
2. Revisão da Literatura
27
ANDIRAN e colaboradores em 2000 utilizaram a contagem da média de mitoses
após contagem de dez campos consecutivos de grande aumento corados pelo HE, e
observaram concordância com demais resultados da literatura. Eles usaram apenas figuras
mitóticas evidentes. SELZNER e CLAVIEN, em 2000, também utilizaram a média da
contagem das figuras de mitose, por campo de grande aumento, corados pelo HE ao
avaliarem a regeneração hepática em ratos obesos.
A maioria das técnicas imuno-histoquímicas são baseadas no uso de anticorpos
contra moléculas endógenas como o Antígeno Nuclear de Proliferação Celular (PCNA), o Ki-
67 e a DNA polimerase alfa, que são os métodos mais utilizados. O PCNA é uma proteína
auxiliar da DNA polimerase delta e seu peso molecular é de 36kD. Em células eucarióticas
ele é essencial para a replicação do DNA. Sua expressão é ciclo celular dependente e
começa a ser detectado ao final da fase G1. Seu pico ocorre na fase S (THEOCHARIS, et
al., 1997; GREENE, et al., 2003).
As técnicas de imuno-histoquímica são amplamente utilizadas para demonstrar
PCNA nos hepatócitos. Os espécimes de fígado são incubados com anticorpo anti-PCNA
monoclonal primário. Em seguida, são titulados com um segundo anticorpo. Estreptovidina
conjugada com hidrogênio peroxidase é aplicada e as células com PCNA positivo coram os
núcleos com coloração marrom-avermelhada. As áreas de tecido são avaliadas em aumento
de 400 vezes no microscópio ótico e são contados, randomicamente, cinco a dez campos,
aproximadamente 1000 células por secção. Núcleos fortemente corados são considerados
em fase G1 ou G2 do ciclo celular (ASSY e MINUK, 1997).
O PCNA tem como vantagens a boa correlação com outros marcadores de
proliferação celular, bem como pode ser usado em material de arquivo, possibilitando
estudos retrospectivos. As desvantagens do PCNA incluem a grande variedade de células
intralobulares, levando a super ou sub-estimativas, dependendo da zona avaliada; alteração
da intensidade da coloração quando a lâmina é exposta ao calor e a falta de consenso sobre
o que considerar positivo, qualquer núcleo corado ou somente aqueles com coloração mais
intensa (ASSY e MINUK, 1997).
2. Revisão da Literatura
28
O PCNA é método aceito e comumente usado para monitorar a atividade
regenerativa, por ser de fácil reprodutibilidade e ter seus resultados comparados aos demais
métodos de avaliação com sucesso (SELZNER e CLAVIEN, 2000). O PCNA tem meia vida
de 20 horas, explicando o porquê ele permanece positivo quando o índice mitótico já está
em declínio (THEOCHARIS et al.,1997).
Considerando que o pico da síntese de DNA ocorre em 24-48 horas, HASHIMOTO e
SANJO em 1997 mostraram aumento do PCNA com 24 horas, em estudo da regeneração
hepática de ratos submetidos à hepatectomia parcial. Estudos demonstraram que o PCNA
pode ser comparado a timedina triciada, método consagrado de avaliação da regeneração
hepática (ASSY et al.,1999)
Em 1994, THEOCHARIS et al., compararam a expressão do PCNA à incorporação
de timedina triciada e atividade da timedinaquinase após hepatectomia parcial em ratos. Os
autores encontraram estreita relação entre a incorporação da timedina e a expressão do
PCNA, sugerindo que o PCNA poderia ser usado, com segurança, como marcador de
regeneração hepática.
Dois estudos avaliando a regeneração hepática em fígados patológicos encontraram
correlação entre o resultado da coloração do PCNA quando comparado com a incorporação
de bromodeoxyuridina (BrdU) (ANDIRAN et al.,2000; SELZNER & CLAVIEN, 2000).
GAGLIO e colaboradores em 2002, mostraram a que os resultados do Ki-67, do
índice mitótico e do PCNA foram semelhantes em estudo de regeneração hepática em
modelo primata não- humano (Macaca mulata) após hepatectomia parcial.,
SELZNER e CLAVIEN (2000) relatam que há quebra no processo de regeneração
em fígados esteatóticos. Prova disso é a redução na expressão do PCNA por estes fígados,
o que indica falência na indução das proteínas do complexo polimerase necessárias para a
síntese de DNA.
Ainda nesta discussão, CORBIN e colaboradores em 2002 demonstraram a
existência de métodos não invasivos capazes de monitorar a atividade e a regeneração
2. Revisão da Literatura
29
hepáticas com igual, ou melhor, credibilidade. Eles usaram a ressonância magnética
associada à espectofotometria com fósforo marcado e compararam com métodos
convencionais de avaliação da função hepática e chegaram a resultados similares, com a
vantagem de poder ser utilizada na prática clínica.
JESUS, WAITZBERG e CAMPOS em 2000 separaram os eventos desencadeados
após hepatectomia parcial de ratos Wistar em dois períodos distintos: o período pré-
replicativo (de 0-14 horas) e o período replicativo (14-48 horas), caracterizando o processo
de regeneração. Em estudos prévios diversos autores confirmaram que o pico de mitoses
ocorre entre 24-48 horas para ratos após hepatectomia parcial. Este dado coincide com o
pico máximo da síntese de DNA nos hepatócitos detectado pela timedina triciada (PISTOI e
MORELLO, 1996; THEOCHARIS et al.,1997).
Para a avaliação da densidade vascular em um tecido, tem sido amplamente
utilizado como indicador, a marcação imunoistoquímica com o anticorpo monoclonal contra
o CD34, que é uma glicoproteína transmembranal, de cadeia única com peso molecular de
116 kDa (GUIMARÃES et al., 2013). É expresso em células imaturas progenitoras, linfóides
e mielóides do tecido hematopoético, células endoteliais capilares, fibroblastos embrionários
e raras células gliais do sistema nervoso e sua função é desconhecida. Tem maior
capacidade de destacar vasos sanguíneos e praticamente não detecta os linfáticos, sendo
expresso tanto em pequenos como em grandes vasos, com a mesma intensidade em
tecidos normais e neoplásicos. O CD34 apresenta alta especificidade, apesar de ter alguma
coloração linfática e estromal, porém, outros anticorpos marcadores podem ser usados para
identificação da microvascularização, como o anti-CD31, anti-FVIII e anti-CD105 (HASAN,
BYERS e JAYSON, 2002; SIEMERINK et al., 2012).
Nakamura e colaboradores em 2016, em estudo com transplante de células CD34 na
regeneração hepática em ratos, revelaram o aumento de células endoteliais nos fígados dos
animais que receberam as células CD34, avaliado por imunohistoquímica com marcação
para PCNA e Ki67. Além disso, fizeram a comparação dose dependente do transplante
autólogo de células CD34 com a marcação das células endotelias, afirmando o melhor
2. Revisão da Literatura
30
desempenho da regeneração hepática pelo aumento de células endoteliais, ou seja,
promoção da angiogênese. Desta forma pode-se avaliar a regeneração hepática quando se
avalia a marcação com anti-CD34 no aspecto pró-angiogênico. Observaram também
aumento das metaloproteinases (MMPs) e redução de Inibidores de MMps. Assim, é
possível considerar que uma possível diminuição da marcação de CD34 reflete na
concentração de MMps no tecido hepático, ou seja, a relação da fibrinólise é diretamente
proporcional a marcação do CD34, sendo o CD34 um marcador de amplo espectro no
estudo da regeneração hepática.
Vários estudos em modelos animais demonstram que o bloqueio do fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF) suprime a proliferação hepática após hepatectomia
parcial (AUSSILHOU et al., 2009).
Um método padrão ouro de avaliação da regeneração hepática ainda não foi
identificado. Todos os métodos apresentam vantagens e desvantagens, e ainda existe muita
discrepância entre eles. Portanto, sempre que possível, deve-se utilizar pelo menos dois
métodos diferentes para avaliar com segurança a regeneração hepática.
“...assim como toda rosa tem seus espinhos, cada método tem suas desvantagens...”
(ASSAY e MINUK, 1997).
2.3 ANGIOGÊNESE E VASCULOGÊNESE
Vasculogênese foi definida como a formação de novos vasos sanguíneos em local
onde esses não existiam. Sua formação deve-se aos estímulos e proliferação dos
angioblastos (células precursoras do endotélio), originários do mesoderma esplâncnico.
Entretanto, a angiogênese foi estabelecida como brotamento de novos vasos a partir de
células endoteliais (CE) diferenciadas a partir de um vaso pré-existente, sendo o processo
desenvolvido em duas fases: de brotamento e de maturação (YOSHIDA, 2005). A
arteriogênese é um processo que consiste no desenvolvimento da circulação colateral,
2. Revisão da Literatura
31
tendo como precursoras as anastomoses vasculares pré-existentes, que se desenvolveriam
mediante estímulos de força de cisalhamento, citocinas, moléculas de adesão, entre outras
(CONWAY, COLLEN e CARMELIET, 2001; AUSSILHOU et al., 2009).
A angiogênese ocorre naturalmente no organismo e é um mecanismo fundamental,
tanto na promoção da saúde quanto no desenvolvimento e progressão de doenças. Atua na
cicatrização de feridas, regeneração e reparo tecidual, vascularização de tecidos isquêmicos
e restabelece o fluxo sanguíneo nos tecidos após a lesão. Nas fêmeas, também ocorre
durante o ciclo reprodutivo mensal (para reconstruir o endométrio, a fim de amadurecer o
óvulo durante a ovulação) e durante a gravidez (para construir a placenta, e a circulação
entre mãe e feto). As principais etapas da angiogênese, a partir de vasos pré-existentes,
incluem a vasodilatação, que em resposta ao óxido nítrico provoca o aumento da
permeabilidade dos vasos preexistentes, induzidos pelo fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF). A seguir ocorre a degradação proteolítica da membrana basal do vaso
original pelas metaloproteinases da matriz extracelular e o rompimento do contato célula-
célula entre as células endoteliais, pelo ativador do plasminogênio. Posteriormente ocorre a
migração das células endoteliais em direção ao estímulo angiogênico, seguida pela
proliferação e maturação das células endoteliais e das células migratórias. Por fim, ocorre a
inibição do crescimento e remodelagem em tubos capilares e o recrutamento de células
periendoteliais (pericitos e células musculares lisas vasculares) para estabilizar o novo vaso
sanguíneo (FOLKMAN, 1995; CARMELIET, 2004; CARMELIET, 2006; ADAMS e ALITALO,
2007; KERBEL, 2008; ROLAND et al., 2009; SOYSAL et al., 2014).
A angiogênese é uma resposta à lesão hepática que leva ao remodelamento
sinusoidal e com outros eventos reestabelecem a matriz extra-celular (MEC).
Consequentemente, muitos potentes mediadores angiogênicos estão envolvidos na
resposta exagerada da cicatrização de feridas à lesão crônica do fígado, levando a um
acúmulo excessivo de matriz extra-celular (MEC). A MEC também pode afetar indiretamente
a função celular liberando citocinas. Estes incluem fator de crescimento transformador β
(TGF-β), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento de
2. Revisão da Literatura
32
hepatócitos (HGF), fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), fator de necrose
tumoral α (TNF-α), fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF) e fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF). A fibrose hepática é um processo dinâmico que
resulta de um desequilíbrio entre a produção e a dissolução da matriz extracelular. O
desenvolvimento de fibrose hepática é orquestrado por muitos tipos de células, incluindo
células estreladas hepáticas. O remodelamento da MEC é fundamental na preservação da
homeostase durante a regeneração hepática. Essa homeostase depende do equilíbrio entre
as metaloproteinases da matriz (MMPs) e seus inibidores teciduais (TIMPs) (ELPEK, 2014).
A compreensão das angiogêneses normal e anormal é necessária para desenvolver
estratégias terapêuticas para combater patologias e estudar a regeneração. Uma vez que a
angiogênese envolve a migração/invasão de células endoteliais para o estroma e ou tecidos
circundantes, proteases, tais como as metaloproteinases da matriz, são criticamente
importantes. Entretanto, há algum tempo ficou claro que o(s) papel(is) das MMPs na
angiogênese é mais complexo do que simplesmente degradar a matriz extracelular (MEC)
para facilitar as células endoteliais invasoras. Várias MMPs também são necessárias para
liberar fatores pro-angiogênicos sequestrados pela MEC, processar fatores de crescimento e
receptores, incluindo integrinas e receptores de adesão, e para gerar compostos
antiangiogênicos endógenos. A MEC atua como um compartimento de sequestro /
armazenamento de fatores de crescimento angiogênico, como o VEGF, o FGF básico
(bFGF) e o TGF1, que podem ser liberados pela degradação proteolítica da MEC. Embora a
degradação dos componentes da MEC para abrir uma avenida para a migração de células
endoteliais seja um requisito essencial para as MMPs na angiogênese, as MMPs contribuem
de muitas maneiras para os processos pró e antiangiogênicos. Na angiogênese, há um
equilíbrio rigidamente controlado entre a sinalização do fator angiogênico, atividade /
sinalização de MMP, inibidores de angiogênese endógena e inibidores de MMP. Isso pode
explicar perfis de fibrose em distúrbios angiogênicos, visto não haver equilibrio (FOLKMAN,
2003; OH et al., 2004; RUNDHAUG, 2005).
2. Revisão da Literatura
33
2.4 FATORES DE CRESCIMENTO NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA
Vários fatores de crescimento estão envolvidos na estimulação do fígado para
regeneração, por exemplo, fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento
epidérmico (EGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator de crescimento
derivado de plaquetas (PDGF). Vários investigadores identificaram o TGF-β1 como o
principal inibidor da regeneração hepática. O conceito atual é que existem redes mediadas
por citocinas e fatores de crescimento que promovem a regeneração de vários tipos de
células intra-hepáticas. Muitos fatores relacionados à regeneração hepática foram
extensivamente estudados, entre os quais a serotonina e as plaquetas fizeram
recentemente avanços. A integração precisa de fatores de crescimento é necessária para a
regeneração completa e sincronizada. A falha em ativar essas cascatas de sinalização pode
resultar em atraso do início da regeneração, recuperação inadequada do volume do fígado
e, eventualmente, sinais clínicos de insuficiência hepática (CLAVIEN et al., 2008; IBRAHIN
et al., 2019).
2.4.1 As plaquetas e a regeneração hepática
Nos últimos cinco anos, vários índices não invasivos foram propostos para prever o
grau de fibrose na hepatite viral. O índice relacionado entre a razão de plaquetas com a
aspartato aminotransferase (APRI) apresenta alto grau de precisão na identificação de
presença de fibrose e cirrose significativa em pacientes com hepatite C crônica
(LAMBERTUCCI, SILVA e ANTUNES, 2007). O teste APRI é capaz de confirmar a
existência de fibrose significativa e excluir a cirrose, o que o torna disponível, como
alternativa, na prática clínica (AMARAL, et al., 2007; ANTONELLO et al., 2010; DERBALA
et al., 2015). Os resultados do estudo de DERBALA e colaboradores em 2015 sugerem que
os marcadores bioquímicos/hematológicos não invasivos como o APRI são sensíveis e
específicos no diagnóstico do grau de fibrose e cirrose em pacientes com coinfecção do
HCV e esquistossomose, em comparação com a biópsia.
2. Revisão da Literatura
34
As plaquetas são partículas discóides não nucleadas que são essenciais para a
hemostasia e a trombose. Além da coagulação, as plaquetas contribuem para a reação
inflamatória após muitas formas de lesão tecidual. O fígado e as plaquetas exibem uma
interconexão muito íntima, embora complexa. O fígado desempenha um papel crítico
durante a síntese de plaquetas de megacariócitos por meio da trombopoietina (TPO). A
TPO, o fator de crescimento hematopoiético mais importante na regulação do
desenvolvimento de megacariócitos e produção de plaquetas, é produzido principalmente no
fígado e rim. Portanto, não se espera que as plaquetas funcionem adequadamente nas
alterações hepáticas (ROZMAN e BOLTA, 2007; CLAVIEN, 2008).
Várias proteínas que induzem efeitos opostos na regeneração hepática estão
presentes nas plaquetas. Por exemplo, as plaquetas abrigam importantes fatores de
crescimento para a execução da regeneração hepática como o HGF. Por outro lado, as
plaquetas contêm TGF-α que é necessário para o término da regeneração hepática. Assim,
é plausível que as plaquetas possam participar da orquestração da regeneração hepática
por meio de estimulação harmonizada e inibição de sinais relacionados ao crescimento
(CLAVIEN, 2008; PIETRAMAGGIORI et al., 2010).
Até 2006, não estava claro se as plaquetas seriam promotoras, inibidoras ou até
mesmo ativas na regeneração hepática. Estudos in vitro demonstraram que as plaquetas
contêm vários fatores de crescimento, que podem, teoricamente, contribuir para o processo
de regeneração hepática. No entanto, o único estudo in vivo sobre o papel das plaquetas na
regeneração hepática em ratos não identificou uma correlação entre as plaquetas e a
regeneração hepática (ROZMAN e BOLTA, 2007).
Com a formação do coágulo durante a cicatrização, as plaquetas fornecem um
arcabouço temporário para o crescimento de células e modulam a angiogênese, através de
uma série complexa e indefinida de eventos mediados por fatores de crescimento e células.
O proteoma de plaquetas é rico em vários fatores pró-angiogênicos e anti-angiogênicos.
Descobertas recentes de que fatores pró-angiogênicos e antiangiogênicos são liberados das
plaquetas de maneira seqüencial podem explicar como as plaquetas afetam a angiogênese
2. Revisão da Literatura
35
e a cicatrização de feridas. Plaquetas quiescentes têm um papel crucial na estimulação da
angiogênese e proliferação celular na cicatrização (PIETRAMAGGIORI et al., 2010)
Em estudo sobre a regeneração do fígado em ratos, observou-se que a
esplenectomia aumenta a contagem de plaquetas e acelera a regeneração do fígado por
meio de um mecanismo pouco claro. Num segundo passo, esgotaram as plaquetas para
menos de 5% aplicando um anticorpo específico para plaquetas. Após 70% da ressecção
hepática, esses ratos exibiram uma regeneração hepática significativamente comprometida,
sugerindo que um fator contido nas plaquetas pode ser necessário para induzir ou manter a
regeneração hepática (LESURTEL et al., 2006). Em outro estudo, camundongos
trombocitóticos exibiram aumento da regeneração do fígado, enquanto um grupo
trombocitopênico mostrou regeneração prejudicada (MURATA et al., 2007).
Matsuo e colaboradores em 2008 relataram que o contato direto entre plaquetas e
hepatócitos é necessário para o efeito proliferativo. Esses autores concluíram que o contato
plaqueta-hepatócito inicia a transdução de sinal envolvido na ativação do fator de
crescimento. HGF, VEGF e fator de crescimento semelhante à insulina foram encontrados
nas plaquetas e contribuem principalmente para a proliferação de hepatócitos. Murata e
colaboradores em 2008 demonstraram que as plaquetas promovem a regeneração hepática
mesmo sob condições de depleção de células de Kupffer, estimulando o HGF.
2.4.2 A serotonina e a regeneração hepática
O papel substancial da serotonina como neurotransmissor no sistema nervoso
central, como um hormônio local no sistema vascular periférico e no trato gastrointestinal e
como um mediador da conexão cérebro-intestino, está bem estabelecido. Com relação ao
fígado, vários estudos já focaram a atenção no notável impacto da serotonina na perfusão
microvascular hepática, no diâmetro dos sinusóides hepáticos, na adesão de plaquetas e
leucócitos ao endotélio sinusoidal, na isquemia hepática, lesão por reperfusão e aloenxerto
de células tumorais no fígado.
2. Revisão da Literatura
36
A serotonina está presente em alta concentração nas plaquetas, onde se acumula a
partir do plasma através de um sistema de transporte ativo (CLAVIEN et al., 2008). Estudos
de Lesurtel e colaboradores em 2006, citados em Rudell, Mann e Ramm em 2008,
identificaram as plaquetas como a principal fonte de serotonina que impulsiona a
regeneração hepática em camundongos hepatectomizados.
Há uma grande variedade de isoformas de receptores de serotonina distribuídas nos
neurônios entéricos, células do músculo liso gastrointestinal e possivelmente em enterócitos,
tecidos imunes e hepatócitos (BONHAUS et al., 1995). Entre eles, sete tipos de receptores
de serotonina foram identificados por Barnes e Sharp em 1999.
2.4.3 O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e a regeneração hepática
O macrófago ativado é a principal célula efetora do processo de reparo tecidual,
degradando e removendo componentes do tecido conjuntivo danificado, como colágeno,
elastina e proteoglicanas. Além desse papel na fagocitose de fragmentos celulares, os
macrófagos também secretam fatores quimiotáticos que atraem outras células inflamatórias
ao local da ferida e sintetizam prostaglandinas, que funcionam como potentes
vasodilatadores, afetando a permeabilidade dos microvasos. Os macrófagos produzem
vários fatores de crescimento, tais como o PDGF, o TGF-β, o fator de crescimento de
fibroblastos (FGF) e o VEGF (SANTOS e CLARK,1999).
O gene VEGF-A humano está organizado em oito exons. Splicing alternativo
(remoção dos introns de uma molécula de RNA pré-mensageiro) de exons resulta na
geração de quatro isoformas principais de VEGF, possuindo, respectivamente, 121, 165,
189 e 206 aminoácidos após a clivagem da sequencial, respectivamente VEGF121,
VEGF165, VEGF189 e VEGF206. O VEGF165 é a isoforma predominante o qual é
segregado, mas uma fração significativa permanece ligada à superfície celular e à matriz
extracelular, em virtude das suas propriedades de ligação à heparina. Existem muitas
evidências para indicar que o VEGF165 é a isoforma fisiologicamente mais relevante. A
atividade característica do VEGF é a capacidade de promover o crescimento de células
2. Revisão da Literatura
37
endoteliais vasculares derivadas de artérias, veias e até linfáticos. O VEGF é essencial para
a vasculogênese e angiogênese embrionária normal, de tal forma que a inativação de um
único alelo de VEGF em camundongos resulta em letalidade embrionária. Existem duas
tirosina-quinases receptoras de VEGF (RTKs), Flt-1, conhecidas também como VEGFR-1 e
KDR, Flk-1 ou VEGFR-2. Concorda-se de que o VEGFR-2 é o principal mediador dos efeitos
mitogênicos, angiogênicos e de melhoramento da permeabilidade do VEGF (FERRARA,
HILLAN e NOVOTNY, 2005; FOLKMAN, 2007; TADO et al., 2014; SHANG et al., 2018).
O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um estimulante primário da
angiogênese e é uma proteína quimiotática de macrófagos. A inibição do VEGF é benéfica
em combinação com quimioterapia para alguns pacientes com câncer de mama. No entanto,
o mecanismo pelo qual a inibição do VEGF afeta o crescimento do tumor parece envolver
mais do que seu efeito sobre as células endoteliais (ROLAND et al., 2009; SHANG et al.,
2018).
O VEGF aumenta a permeabilidade vascular e esta propriedade sustenta papéis
importantes dessa molécula na inflamação e em outras condições patológicas (FERRARA,
HILLAN e NOVOTNY, 2005). O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um dos
principais atores da angiogênese. O bloqueio da atividade do VEGF usando anticorpos
específicos ou outras entidades proteicas para prevenir a ligação e a sinalização do VEGF
através de seus receptores tem sido uma das muitas abordagens para reduzir o crescimento
do tumor. O Bevacizumabe, um anticorpo que se liga ao receptor de VEGF humano com
alta afinidade, foi aprovado para o tratamento de pacientes com câncer colorretal (FUH
et al., 2006; AUSSILHOU et al., 2009).
A ativação da proliferação e angiogênese pelo VEGF é essencial para a regeneração
do fígado e reparo de órgãos, ambos dependentes do suprimento de sangue para os
hepatócitos. A onda inicial de proliferação hepática é seguida pela proliferação de células
endoteliais e penetração de ilhas hepatocelulares avasculares levando à formação de novos
sinusóides (BÖNNINGHOFF et al., 2012).
2. Revisão da Literatura
38
2.4.4 O fator de crescimento de hepatócito (HGF) e a regeneração hepática
O HGF injetado sistemicamente é absorvido principalmente pelo fígado. A injeção de
HGF na veia porta de ratos e camundongos normais causa a proliferação de hepatócitos e o
aumento do fígado. A reserva intra-hepática de HGF é consumida durante as primeiras três
horas após a hepatectomia parcial, seguida de nova síntese de HGF. O HGF exerce um
efeito mitogênico direto nos hepatócitos. O receptor de HGF hepático é ativado 30 a 60
minutos após a hepatectomia parcial (CLAVIEN, 2008).
O HGF está presente na matriz hepática em quantidades relativamente grandes,
como também é encontrado na matriz de outros órgãos, como pulmões, baço, placenta,
cérebro, etc. O HGF injetado sistemicamente é sequestrado pelo fígado mais do que
qualquer outro órgão. A eliminação genética do HGF ou seu receptor (cMet) está associada
à letalidade embrionária envolvendo anormalidades em muitos órgãos, principalmente na
placenta (MICHALOPOULOS, 2007; CLAVIEN et al., 2007).
O HGF foi implicado como envolvido na regeneração do fígado pelas seguintes razões:
1ª) Os níveis de HGF no plasma aumentam 10 a 20 vezes após a PHx .
2ª) O HGF ativo é consumido a partir de reservas intra-hepáticas nas primeiras 3 h após a
PHx, seguido por nova síntese de HGF de 3 a 48 h (PEDIADITAKIS et al., 2001)
3ª) O HGF causa uma forte resposta mitogênica e expansão clonal de hepatócitos em
cultura (BLOCK et al., 1996).
4ª) A injeção de HGF na veia porta de ratos e camundongos normais causa proliferação de
hepatócitos e aumento do fígado (PATIJN et al., 1998).
5ª) O receptor do HGF do fígado (cMet) é ativado pela fosforilação da tirosina entre 30 e 60
minutos após a PHx (STOLZ et al., 1999).
6ª) A eliminação genética direcionada do cMet do fígado é associado com regeneração
muito deficiente ou ausência de resposta (BOROWIAK et al., 2004; MONGA et al.,
2002).
2. Revisão da Literatura
39
2.4.5 O fator de necrose tumoral (TNFα) e a regeneração hepática
Esta é uma proteína conhecida por ter uma variedade de efeitos em muitas células e
tecidos. Ao contrário do que o nome indica, o TNFα pode frequentemente ter efeitos pró-
mitogênicos nas células, dependendo das condições que regulam a ativação do fator
nuclear Kappa B (NFkB) (KIRILLOVA et al, 1999). Se as condições favorecerem a ativação
do NFkB, então o TNFα pode potencializar outros sinais de crescimento administrados
concomitantemente. Alternativamente, se a ativação do NFkB não pode ser mediada pelo
TNFα, então o TNFα pode desencadear uma resposta apoptótica. Anticorpos contra o TNFα
administrado no momento da hepatectomia diminuem a resposta regenerativa.
Camundongos com deleções genéticas do receptor 1 do TNFα (TNFR1) têm resposta lenta
e deficiente após PH. Anticorpos contra o TNFα administrado no momento da hepatectomia
diminuem a resposta regenerativa (JESUS, WAITZBERG e CAMPOS, 2000;
MICHALOPOULOS, 2007).
2.4.6 Fator de crescimento epidérmico (EGF) e a regeneração hepática
Experiências em ratos sugeriram que o EGF pode estar envolvido na regeneração do
fígado. A remoção cirúrgica de glândulas salivares, onde o EGF está presente em altas
concentrações, ou a ligadura de suas veias de drenagem diminui significativamente o pico
de síntese de DNA após hepatectomia parcial e resulta em comprometimento da
regeneração hepática. A injeção exógena de EGF compensa os efeitos da ablação da
glândula salivar e restaura a regeneração hepática. O EGF é normalmente fornecido pelas
glândulas de Brunner do duodeno através da circulação portal para ser depositado na matriz
portal (JESUS, WAITZBERG e CAMPOS, 2000; CLAVIEN et al., 2007; CLAVIEN 2008).
2.4.7 Interleucina 6 (IL6) e a regeneração hepática
Existe abundante literatura documentando o papel crucial da IL6 no início da
resposta de fase aguda nos hepatócitos. A IL6 é produzida por macrófagos hepáticos. Os
2. Revisão da Literatura
40
ratos deficientes em IL6 têm uma regeneração hepática deficiente. Isto foi associado com
ativação deficiente de Stat3(signal transducers and activators of transcription 3) . Outros
estudos mostraram, no entanto, que a regeneração do fígado nesses camundongos é
essencialmente normal, embora haja diminuição da ativação do Stat3 (SAKAMOTO et al.
1999; JESUS, WAITZBERG e CAMPOS, 2000).
A IL6 não é um mitógeno direto para hepatócitos e não aumenta o efeito mitogênico
de outros fatores de crescimento. É, no entanto, um mitógeno direto para as células biliares
(LIU et al. 1998) e tem efeitos importantes sobre a integridade da árvore biliar intra-hepática
regulando a produção de pequenas proteínas ricas em prolina pelos colangiócitos (NOZAKI
et al. 2005; DEMETRIS et al. 2006).
2.4.8 Fator de Crescimento de Fibroblastos Ácido (FGFα) e a regeneração hepática
Também conhecido como fator de crescimento ligante à heparina 1 (Heparin Binding
Growth Factor 1), é secretado por hepatócitos em regeneração, células ovais e de Ito.
Aumenta agudamente por até 24 horas após estímulo, com pico de secreção coincidindo
com o pico de síntese de DNA e permanece elevado durante 7 dias. A elevação dos níveis
de FGFα ocorre após a iniciação de hepatócitos primários, não parecendo ser o
desencadeador do processo regenerativo (JESUS, WAITZBERG e CAMPOS, 2000).
2.4.9 Substância estimuladora hepática (HSS) e a regeneração hepática
Extraído do citosol da célula hepática regenerada, também denominado de
“aumentador da regeneração hepática” (augmenter of liver regeneration – ALR). É
considerado como fator de progressão da replicação, agindo sobre células que estejam
atingindo a fase G1 do ciclo celular. Observam-se valores elevados no fígado de ratos
adultos após 12 horas da hepatectomia com pico máximo em 26 horas e permanecem
elevados por até 72h. No rato, foi comprovada sua atividade inibitória sobre as células
natural killer (NK) presentes no fígado o que poderia impedir a destruição dos hepatócitos
2. Revisão da Literatura
41
nas doenças agudas e, portanto, estimulando a regeneração hepática (JESUS,
WAITZBERG e CAMPOS,, 2000).
2.5 MODELOS EXPERIMENTAIS DE HEPATECTOMIAS PARCIAIS
É impossível instituir regras gerais confiáveis para a validade da extrapolação de
uma espécie para a outra. Isto deve ser avaliado individualmente para cada experimento e
pode, freqüentemente, ser verificado apenas após os primeiros estudos na espécie alvo. A
extrapolação de modelos animais, assim como a própria arte médica continuará sempre
como uma matéria de percepção tardia, destituída de garantias absolutas, embora nós
humanos normalmente demandemos absolutismo da profissão médica e da comunidade de
pesquisa. Ciência é conhecimento em fluxo contínuo e inovador (FAGUNDES e TAHA,
2004).
2.5.1 Anatomia do figado de ratos
O processo de regeneração hepática em roedores e humanos é semelhante e os
resultados obtidos em roedores são aplicáveis ao fígado humano. A hepatectomia a 70% em
ratos é o modelo animal mais valioso e extensivamente estudado para regeneração
hepática.
O processo de regeneração hepática é desencadeado imediatamente após a lesão
e, no rato, a replicação do DNA começa às 16 h após a ressecção. Após uma hepatectomia
de 70% no rato, o peso do fígado remanescente em 24 e 72 horas é de 45 e 70% do peso
original do fígado, respectivamente. Entre 7 e 14 dias, o volume do fígado é de 93%, e no
dia 20 recupera completamente o volume original por hiperplasia dos lobos remanescentes.
Também em humanos, o processo de regeneração ocorre rapidamente. A massa hepática
dobrou aos 7 dias no fígado do doador e 14 dias no receptor após o transplante do lobo
direito. Os fígados doadores e receptores atingiram seu peso original aos 60 dias após a
2. Revisão da Literatura
42
cirurgia. No entanto, apesar da recuperação do peso do parênquima, os processos de
regeneração e remodelação continuam (MARTINS et al. 2008).
O fígado de rato consiste em 4 lobos distintos de tamanhos diferentes. O lobo lateral
esquerdo representa cerca de 30% do peso total do fígado e está localizado na posição
lateral esquerda dorso-caudal ao mediano e cranio-ventral aos lobos caudados e ao
estômago. O pedículo estreito contendo os vasos está ligado à veia cava infra-hepática e à
base da porção esquerda do lobo mediano. Os ligamentos interlobulares conectam o lobo
lateral esquerdo com o lobo caudado superior (MADRIHAMOV et al. 2006; MARTINS et al.
2008).
O lobo mediano representa cerca de 40% do peso total do fígado e consiste em duas
porções, esquerda e direita, separadas por uma fissura profunda. O lobo mediano localiza-
se abaixo do diafragma e é fixado com o ligamento falciforme, que se estende desde o
processo xifoide e diafragma até o fígado, formando a fissura interlobular. A porção
esquerda é menor e representa cerca de um terço do lobo mediano. O lobo mediano
apresenta-se com uma base larga, envolvendo quase a metade da circunferência da veia
cava (MADRIHAMOV et al. 2006; MARTINS et al. 2008).
O lobo hepático direito está localizado no lado direito da veia cava e consiste
também de duas porções distintas, a superior e inferior do lobo direito. O lobo superior
direito (13%) tem o formato de um ovo assentado na veia cava intra-hepática com uma base
larga que se estende até a parte paracaval do fígado. O lobo inferior direito em forma de
pirâmide com a ponta apontando para a veia cava, compreende 6% da massa total do
fígado e está dorsalmente fixado ao diafragma e latero ventral à veia cava (MADRIHAMOV
et al. 2006; MARTINS et al. 2008).
O lobo caudado, localiza-se no lado esquerdo da veia cava abaixo do lobo lateral
esquerdo e representa 7% da massa hepática total. O lobo é dividido em duas porções: lobo
caudado superior e lobo caudado inferior. O lobo caudado superior é conectado ao lobo
lateral esquerdo através de um ligamento interlobular fino e é totalmente coberto pelo
omento menor. A parte inferior do lobo caudado está localizada atrás do estômago, próxima
2. Revisão da Literatura
43
ao pâncreas e ao baço, e é coberta por uma cápsula fibrosa, presa à parede dorsal do
omento menor (MADRIHAMOV et al. 2006; MARTINS et al. 2008).
Baseado na principal bifurcação da veia porta e da artéria hepática, o fígado pode
ser dividido em hemi-fígado direito e esquerdo. O lobo lateral esquerdo, a porção esquerda
do lobo mediano e o lobo caudado pertencem ao hemi-fígado esquerdo, enquanto o hemi-
fígado direito é constituído pelo lobo direito e a porção direita do lobo mediano
(MADRIHAMOV et al. 2006; MARTINS et al. 2008).
A bifurcação principal divide a veia porta na veia porta mediana direita, apoiando a
porção direita do lobo mediano, e a veia porta esquerda, localizada no pedículo do lobo
lateral esquerdo. Distalmente a essa bifurcação, a veia porta esquerda libera a veia porta
mediana esquerda e a veia porta lateral esquerda suprindo o respectivo lobo hepático
(MADRIHAMOV et al. 2006; MARTINS et al. 2008).
O hemi-figado esquerdo é drenado pela grande veia hepática esquerda, coletando
sangue do lobo lateral esquerdo e a porção esquerda do lobo mediano. A veia mediana
esquerda recebe o sangue venoso do território esquerdo do lobo mediano. O ramo mediano
da veia hepática média drena o território mediano intermediário, mas está conectada ao
tronco da grande veia hepática esquerda. Em alguns animais, drena diretamente para a veia
cava. A veia mediana direita drena o pequeno território direito do lobo mediano para a veia
cava (MADRIHAMOV et al. 2006; MARTINS et al. 2008).
A drenagem do hemisférico direito consiste na veia hepática mediana direita drenada
para a veia cava oposta à veia hepática esquerda e caudal à esquerda. O lobo caudado é
drenado por uma veia caudada separada, também drenando para a parte intra-hepática da
veia cava. O fígado paracaval é drenado por múltiplas pequenas veias que entram
diretamente no lado de trás da parte intra-hepática da veia cava (MADRAHIMOV et al.
2006).
A velocidade de regeneração hepática é proporcional à quantidade de tecido
hepático ressecado. Curiosamente, também foi demonstrado que a capacidade regenerativa
dos lobos remanescentes individuais é significativamente diferente. Além disso, ressecções
2. Revisão da Literatura
44
muito grandes (> 85%) ou muito pequenas (<30%) podem resultar em proliferação celular
lenta (MARTINS et al. 2008).
2.5.2 Técnicas de ressecção hepática
Com exceção do mito de Prometeu, o modelo clássico de estudo da regeneração
hepática foi descrito em 1931 no artigo ”Experimental pathology of de liver. Restoration of
the liver of the white rat following partial surgical removal”, onde uma hepatectomia parcial
de 2/3 é realizada no rato. Os pedículos vascular/biliar dos lobos mediano e lateral esquerdo
são ligados. Ambos são ressecados sem prejuízos aos lobos residuais. Não há interferência
com a vascularização/drenagem biliar dos lobos residuais nem reação inflamatória/necrótica
significativa no coto dos lobos ressecados. Foi observado que, de sete a dez dias após
hepatectomia parcial de 2/3. O fígado do rato recupera a sua massa, restabelecendo a
relação normal entre peso do fígado/peso do corpo, que no rato corresponde a 3,58%
(GODOY et al. 2006).
Modelos de roedores de hepatectomia parcial forneceram a abordagem mais
conveniente para o estudo deste processo, dada sua grande semelhança com a situação
humana, ausência de lesão ou inflamação tecidual imediata e definição precisa do ponto
inicial de tempo quando a regeneração hepática é desencadeada (CLAVIEN et al. 2008).
No fígado do rato, como no humano, o segmento hepático ressecado durante a
hepatectomia parcial não se forma de novo. Por definição estrita, não há regeneração
verdadeira, tal como possuem os anfíbios, cuja cauda perdida pode ser reconstituída
integralmente. O fígado recupera sua massa (peso ou volume), mas não recupera sua forma
original. O fígado é o único órgão que possui duas vascularizações sanguíneas distintas:
(i)esplâncnica, a partir da veia porta e (ii) arterial sistêmica, a partir do tronco celíaco
(GODOY et al. 2006; MADRAHIMOV et al. 2006; MELO et al. 2008).
Uma complexa sinalização em cascata inicia-se imediatamente após uma perda
celular, como após uma hepatectomia parcial: mais de 100 genes extremamente precoces
2. Revisão da Literatura
45
são expressos nos hepatócitos dos lobos residuais já no primeiro minuto após hepatectomia
parcial. Todas as funções essenciais à homeostasia são mantidas durante a regeneração.
No fígado normal, as diferentes células parenquimatosas e não parenquimatosas estão em
fase G0 ou fase de repouso em relação ao ciclo celular. São células quiescentes. Ao ciclar,
após hepatectomia parcial, as células hepáticas passarão pelas quatro fases do ciclo
celular: G1, fase S ou fase de síntese de DNA, G2 e mitose. Após ciclarem, retornam ao
estágio G0 ou realizam uma nova divisão celular (GODOY et al. 2006; MELO et al. 2008 ).
Após hepatectomia parcial, a regeneração ocorre graças à proliferação das
diferentes células que compõem os lobos hepáticos residuais: hepatócitos, célula epitelial
biliar, célula endotelial (sinusóide), célula de Kupfer e célula de Ito (célula estrelar). Os
hepatócitos representam 60 a 80% da população celular do fígado. O hepatócito é
tipicamente uma célula quiescente (G0), com vida média de 200 a 400 dias. A proliferação
celular das células parenquimatosas (hepatócitos) ocorre de forma heterogenia em tempo e
localização do hepatócito. A síntese de DNA ocorre em picos, sendo um mais intenso até 33
horas da hepatectomia e um segundo pico menos intenso entre 36 e 48 horas. Entretanto, a
proliferação hepatocelular, também se dá pelas células não parenquimatosas. A síntese de
DNA ocorre 48 horas após hepatectomia parcial nas células epiteliais biliares e células de
Kupffer, e após 96 horas nas células endoteliais (sinusóides) (GODOY et al. 2006; MELO et
al. 2008; ELPEK, 2014).
Ressecções hepáticas em roedores são muito bem toleradas com mortalidade
operatória mínima. Até o momento, quatro técnicas para ressecção hepática em roedores
foram descritas:
1. A técnica clássica (ligadura em bloco na base do lóbulo). Embora seja a técnica mais
comumente utilizada, ela apresenta maior risco de lesões, pois a ligadura em massa
pode comprometer elementos de outros pedículos. O risco de estenose da veia cava e
congestão hepática é particularmente alto quando apenas uma ligadura, tanto para os
pedículos dos lobos lateral esquerdo e mediano, é realizada, devido à compressão da
veia após a ligadura em massa. Esse procedimento pode ser realizado pela técnica
2. Revisão da Literatura
46
convencional (aberta) ou pela técnica laparoscópica. No entanto, a abordagem
laparoscópica não parece fornecer qualquer vantagem sobre outras técnicas. É
demorado e requer equipamento especializado e dispendioso (EULALIO et al. 2018).
2. A técnica de clipe hemostático. Trata-se de uma ligeira modificação da técnica clássica,
em que clipes de titânio são aplicados ao pedículo, ao invés de suturas. Este
procedimento é rápido, mas está associado a complicações semelhantes da técnica de
ligadura em massa. Além disso, preocupações com a interferência no processo de
regeneração foram levantadas, embora isso não tenha sido confirmado em
investigações posteriores (NEVZOROVA, et al. 2015).
3. A técnica de preservação de parênquima orientada para vasos é uma técnica relatada
por Madrahimov e colaboradores em 2006 e não requer ligação prévia no hilo hepático.
Suturas de perfuração sequenciais, proximais à pinça, são posicionadas de acordo com
a anatomia vascular topográfica. Embora essa técnica seja mais rápida do que a técnica
microcirúrgica, descrita a seguir, ela pode causar lesão de outros ramos vasculares
porque os vasos não são visualizados individualmente. Portanto, não é recomendado
para ressecção dos segmentos direito ou esquerdo do lobo mediano.
4. A técnica microcirúrgica orientada para vasos. Essa técnica, primeiramente relatada por
Kubota e colaboradores em 1997, é semelhante à técnica para hepatectomias clínicas.
Os ramos da veia porta e da artéria hepática são ligados antes da ressecção do lobo, e
as veias hepáticas são ligadas dentro do lobo durante a ressecção do parênquima (de
maneira semelhante à técnica de preservação do parênquima). As vantagens desta
técnica são redução do risco de sangramento do coto e redução do risco de constrição
da veia cava. Também é mais apropriado para hepatectomias segmentares, por
exemplo a ressecção da porção direita ou esquerda do lobo mediano, após
delineamento da linha isquêmica após a ligadura. As desvantagens são a exigência de
habilidades e equipamentos microcirúrgicos, risco de lesão da veia porta durante a
dissecção e por consequência mais demorada.
2. Revisão da Literatura
47
2.6 O BEVACIZUMABE
O fígado é o local mais comum de metástase do câncer colorretal, com 25% dos
pacientes apresentando metástases hepáticas no momento do diagnóstico; outros 25% a
45% desenvolvem metástases hepáticas na recorrência da doença. Esses pacientes têm
prognóstico ruim, apesar dos avanços na sobrevida com a quimioterapia. A ressecção
cirúrgica de metástases hepáticas é considerada a única opção de tratamento curativo para
pacientes com metástases hepáticas ressecáveis desconsiderando outros acometimentos
extra-hepáticos. As atuais taxas de sobrevida em 5 anos após a ressecção de metástases
hepáticas são de 25% a 40%. Infelizmente, uma grande proporção de pacientes
(aproximadamente 80%) é considerada irressecável na apresentação devido ao
envolvimento extra-hepático ou insuficiencia do tecido hepático remanescente saudável.
Além disso, aproximadamente 50% dos pacientes apresentam recidiva da doença, que é
confinada ao fígado. A partir disso, o uso do Bevacizumabe é considerado uma boa
alternativa de manejo desses pacientes (GRUENBERGER et al., 2008).
O bevacizumabe é um agente avançado e amplamente utilizado. É um anticorpo
monoclonal humanizado recombinante (IgG1) que se liga ao VEGF, formando uma molécula
complexa e inibe a ligação do VEGF com receptores VEGF de tirosina quinase (VEGFRs),
resultando no bloqueio das vias de sinalização mediadas por VEGF que leva à angiogênese.
Ele se se liga a todas as isoformas biologicamente ativas do VEGF e inibe a ligação desta
citocina aos seus receptores: VEGFR-1 e 2. Neutraliza os efeitos biológicos do VEGF,
incluindo a mitogênese de células endoteliais, o aumento da permeabilidade vascular e a
promoção da angiogênese (BASBUG et al. 2006; VAUTHEY e ZORZI, 2009; PAVLIDIS et
al. 2010; SOYSAL et al. 2014; MACHADO et al. 2015; NAKAMURA et al. 2016; DECKER et
al. 2017; LINDLAY e STEELE, 2019).
O Bevacizumabe (Avastin; Genentech / Roche, São Francisco, CA) é um anticorpo
monoclonal que bloqueia o receptor VEGF, é usado atualmente na terapia direcionada de
2. Revisão da Literatura
48
tumores sólidos, e tem uma meia-vida de 28 dias quando administrado por via intravenosa
(MICHA et al. 2017, BASBUG et al. 2006).
O bevacizumabe é um anticorpo da subclasse IgG1, monoclonal humanizado
recombinante com 93% de sequência de aminoácidos de origem humana e 7% de origem
murina, que se liga a todas as isoformas do receptor do VEGF sendo classificado como uma
droga anti-angiogênica (MACHADO et al. 2015; NAKAMURA et al. 2016).
A observação de que o crescimento tumoral pode ser acompanhado por aumento da
vascularização foi relatada há mais de um século. Em 1939, Ide, Baker e Warren postularam
a existência de um fator estimulante de crescimento de vaso sanguíneo, derivado de tumor,
que poderia servir para fornecer um suprimento neovascular para o tumor em crescimento.
Experimentos realizados em 1968 indicaram que a angiogênese tumoral era mediada por
fatores difusíveis produzidos por células tumorais.
Na sequência da publicação de sua hipótese, Folkman e seus colaboradores
relataram descobertas que foram fundamentais para o avanço das pesquisas neste campo,
incluindo a definição da natureza do switch angiogênico em tumores, aumentando a
consciência da presença de ambos os fatores pró e anti-angiogênicos que medeiam tanto
processos fisiológicos quanto patológicos (FOLKMAN, 1995).
Em 1971, Folkman propôs que a anti-angiogênese poderia ser uma estratégia
terapêutica eficaz para tratar o câncer. É importante ressaltar que estudos recentes
demonstraram que o bevacizumabe, um anticorpo monoclonal anti-VEGF humanizado, em
combinação com quimioterapia, resulta em aumento da sobrevida em pacientes com câncer
colorretal metastático previamente não tratado em relação à quimioterapia isolada, levando
à aprovação do primeiro anti-angiogênico (FERRARA et al. 2005).A era do desenvolvimento
da terapia anti-angiogênica teve início em 1971, com a publicação no New England Journal
of Medicine, de um artigo considerado marco no assunto. Escrito por Moses Judah Folkman
(figura 2), postulou a hipótese de que, “com uma toxicidade mínima, a inibição do
2. Revisão da Literatura
49
crescimento de vasos sanguíneos dentro de um tumor poderia prolongar a
dormência tumoral e melhorar a sobrevida dos pacientes”.
Moses Judah Folkman
Cleveland 24 /02/1933 +Denver 13/01/2008
FIGURA 2 – ILUSTRAÇÃO ORIGINAL PROPOSTA POR FOLKMAN EM 1971 DEMONSTRANDO A ANGIOGÊNESE
TUMORAL.
Embora a angiogênese desempenhe um papel essencial no crescimento tumoral, o
benefício terapêutico proposto pelas drogas anti-angiogênica para tratamento do câncer têm
sido amplamente estudadas com o objetivo de validar e consolidar esta modalidade de
tratamento. Certas drogas anti-angiogênicas, tais como bevacizumabe parecem ter pouco
ou nenhum benefício clínico quando usado como monoterapias para tratar a doença
avançada de certas malignidades como o câncer colorretal, entretanto demonstram
benefício clínico quando em combinação com outros agentes (ZUCKER et al. 1998;
FERRARA et al. 2005; JAIN et al., 2006; KERBEL, 2006; FOLKMAN, 2007; KERBEL, 2008)
O bevacizumabe está aprovado como um agente de primeira linha em terapia
combinada para o tratamento de câncer colorretal metastático. Apesar de prolongar a
sobrevida livre de doença, tem sido associado com várias complicações, principalmente na
cicatrização da ferida cirúrgica. As propriedades anti-angiogênicas do bevacizumabe podem
2. Revisão da Literatura
50
alterar o curso natural do processo cicatricial das feridas, evitando a formação de novos
vasos sanguíneos, assim, limitando a capacidade de transporte de células inflamatórias,
nutrientes e oxigênio aos tecidos (HURWITZ et al., 2004; FOLKMAN, 2007).
Bockhorn e colobaradores em 2007 relataram que o bloqueio do VEGF suprimiu
quase completamente a proliferação de hepatócitos medida pela imunomarcação de Ki67,
24 horas após a hepatectomia em ratos. Da mesma forma, Taniguchi e colobaradores em
2001 relataram uma inibição da atividade proliferativa (imunocoloração de Ki 67) dos
hepatócitos, bem como das células endoteliais 48 h e 96 h após hepatectomia de 70% em
ratos pré-tratados com anti-VEGF. Os resultados de Hubert e colobaradores em 2015
contradizem esses resultados, quando relataram que o Bevacizumabe 5 e 10mg/kg não
alterou significativamente a proliferação precoce de hepatócitos após a hepatectomia em
ratos. Kasuya e colaboradores em 2012 também relataram a ausência de efeito de
Bevacizumabe (4 mg / kg, administrado IP 6 vezes entre o dia 1 e 10 após PH), na
regeneração hepática em camundongos. Em ratos pré-tratados com oxaliplatina e 5-
fluorouracil que exibiram uma resposta proliferativa diminuída após a hepatectomia 70%, os
animais que tiveram esse protocolo associado ao Bevacizumabe tendeu a aumentar a
proliferação de hepatócitos precocemente após a hepatectomia de maneira dose-
dependente, 5 ou 10 mg/kg (HUBERT et al., 2015).
Willet e colobaradores em 2004 demonstraram que a infusão do Bevacizumabe,
diminui a perfusão do tumor, o volume vascular, a densidade microvascular, a pressão do
fluido intersticial e o número de células endoteliais circulantes viáveis em seis pacientes com
câncer colorretal.
Soysal e colobaradores em 2014, em seu estudo com implantes intra-uterinos que
induziram a endometriose, sugere que o anticorpo anti-VEGF Bevacizumabe, é tão eficaz
quanto o agonista de GnRH na regressão das lesões endometrióticas no modelo de
endometriose em ratos Wistar. Um mecanismo possível desse efeito é a indução da
apoptose.
2. Revisão da Literatura
51
Micha e colobaradores em 2017 afirmou que o Bevacizumabe pode ser usado como
um potente medicamento antiadesivo, seja instilado localmente, antes do fechamento
abdominal ou combinado com outras moléculas em filmes anti-adesivos e géis para serem
usados em situações de aderências severas, depois que experimentou em ratos Wistar
após abrasão do colon, como um modelo de promoção de aderências. Esse resultado foi
observado no mesmo modelo de ratos Wistar por Basbug e colobaradores em 2006.
Em um experimento com modelo de artrite em ratos, a concentração de IL-1b, TNF-
a, MMP-1 e MMP-3 foi significativamente maior no grupo que utilizou Bevacizumabe do que
no grupo controle, sendo que o Bevacizumabe obviamente reverteu os altos níveis dessas
citocinas induzidas pela lesão da cartilagem articular esportiva, indicando que
Bevacizumabe exerce um efeito anti-inflamatório através de regulação negativa de fatores
inflamatórios (SHANG et al. 2018).
As complicações relatadas incluem tromboses arteriais, venosas, hipertensão,
proteinúria e perfuração gastrointestinal. Complicações importantes que todos os cirurgiões
precisam estar cientes são suas anormalidades associadas à ferida operatória, como
deiscência, equimoses, sangramento do sítio cirúrgico e infecção (ZAKARIJA e SOFFT,
2005; ELLIS, CURLEY E GROTHEY, 2005; GNETECH, 2017).
Neste contexto, em 2003 Kabbinavar e colobaradores em evidenciaram aumento em
59% do risco de hemorragia pós-operatória em pacientes tratados com Bevacizumabe em
comparação com aqueles tratados com quimioterapia (11%) o que foi atribuído à diminuição
da capacidade das células endoteliais em responder às lesões em vigência da inibição do
VEGF.
Em estudo realizado por Hurwitz e colobaradores em 2004, demonstraram uma
significativa quantidade de sangramento do sítio cirúrgico, equimoses, e deiscência de
pacientes dentro de 60 dias após a cirurgia. Por isso, tem sido sugerido que a cirurgia
eletiva deva ser retardada, pelo menos, 6 a 8 semanas (> 40 dias) após a conclusão da
terapia com Bevacizumabe (meia-vida = 20 dias). Além disso, a reintrodução do
Bevacizumabe pós-operatória deve esperar ≥ 28 dias e a incisão cirúrgica deve ser
2. Revisão da Literatura
52
totalmente curada para evitar maior risco de complicações relacionadas à cicatrização
(ELLIS, CURLEY e GROTHEY, 2005; HURWITZ et al., 2004).
Bilchik e Hecht em 2008 em suas reflexões baseadas em evidências, pontuam as
vantagens de um agente quimioterápico como terapia adjuvante nas ressecções
oncológicas hepáticas, onde a redução da massa e a menor distribuição de micro
metástases são vantajosas, porém o aumento de complicações como esteatose por
exemplo são as desvantagens. Relatou que em estudos clínicos iniciais com Bevacizumabe,
houve aumento da incidência de sangramento, hipertensão, perfurações gastrointestinais e
complicações na cicatrização de feridas. Além disso, em modelos animais, a inibição da
angiogênese resultou em comprometimento da cicatrização, assim, tem sido sugerido que a
inibição dos receptores de VEGF nas células endoteliais pode regular a regeneração
hepática.
Em 2005, estudos de fases II e III em pacientes em quimioterapia e Bevacizumabe
versus quimioterapia isolada para o tratamento do câncer metastático de cólon, compararam
a ocorrência de complicações cicatriciais da ferida operatória, demonstrando segurança no
início ou na reintrodução do bevacizumabe, vinte e oito dias após a cirurgia em pacientes
com câncer colorretal (SCAPPATICCI et al., 2005).
Após numerosos ensaios clínicos, o bevacizumabe mostrou-se seguro, eficaz e
proporciona benefícios significativos no tratamento de vários cânceres. No entanto, a ele
também tem sido associadas complicações que impactam diretamente na tomada de
decisão dos cirurgiões, pois a margem de segurança de seis a oito semanas de interrupção
do tratamento previamente ao ato cirúrgico deve se respeitada. Além disso, para o reinício
do tratamento no pós-operatório com o bevacizumabe em pacientes cirúrgicos, sugere-se
aguardar 28 dias para evitar um aumento do risco de complicações cicatriciais da ferida.
Assim sendo, os efeitos adversos de bevacizumabe devem ser considerados em todos os
pacientes cirúrgicos até que se possa compreender completamente seu impacto sobre a
evolução pós-cirúrgica (GORDON, 2009). Contudo, não foram observadas diferenças
2. Revisão da Literatura
53
significativas relacionadas às complicações ao bevacizumabe em um estudo caso-controle
(n=32) com pacientes submetidos à ressecção hepática (D'ANGELICA et al., 2007).
Gruenberger e colobaradores em 2008 relatam um estudo prospectivo de fase II que
avaliou o impacto do bevacizumabe nas complicações cirúrgicas e na regeneração hepática
após a ressecção de metástases hepáticas do câncer colorretal, onde cinquenta e seis
pacientes receberam bevacizumabe, capecitabina e oxaliplatina, sendo o bevacizumabe
suspenso cinco semanas antes da cirurgia. Não houve aumento de complicações cirúrgicas,
sangramento ou diminuição da função hepática em comparação com controles históricos. As
deficiências do estudo incluem números relativamente pequenos e avaliação da
regeneração hepática definida pelos resultados da tomografia computadorizada e funções
do fígado apenas 3 meses após a cirurgia, um período muito curto para avaliar a capacidade
regenerativa total do fígado. No entanto, esses dados sugerem que o bevacizumab pode ser
administrado com segurança no pré-operatório, levando em consideração a possível
hepatotoxicidade dos outros agentes utilizados.
Em condições fisiológicas a angiogênese influencia a embriogênese, o
desenvolvimento tecidual, a ovulação, a formação do corpo lúteo e o processo de
cicatrização e o bevacizumabe interfere diretamente a densidade vascular cicatricial pelo
bloqueio dos receptores do VEGF, limitando desta forma a densidade vascular tecidual
(FOLKMAN, 2007).
Um estudo que avaliava os efeitos do bevacizumabe na anastomose intestinal foi
realizado em ratos, e não relataram diferenças significativas entre o grupo bevacizumabe e
o grupo controle em relação à pressão de ruptura do cólon, o grau de inflamação, o acúmulo
de fibroblastos, deposição de colágeno ou grau de fibrose. Consequentemente, eles
concluíram que a administração de bevacizumabe não teve efeito significativo na
cicatrização de anastomoses no cólon (NAKAMURA et al. 2016). Entretanto, de acordo com
a investigação de LIN e colobaradores em 1999, bevacizumabe, que é um anticorpo
monoclonal “humanizado” recombinante contra VEGF, pode não se ligar ao VEGF no rato
ou camundongo, mas liga-se ao VEGF no coelho.
2. Revisão da Literatura
54
Bockhorn e colaboradores em 2007 mostraram que a administração exógena de
VEGF aumenta a angiogênese e a proliferação após hepatectomia parcial que está
associada a uma modulação dos genes do ciclo celular. Concomitantemente, o bloqueio do
VEGF endógeno leva a uma diminuição da angiogênese, retardo na proliferação de
hepatócitos e re-expressão de genes de controle do ciclo celular. A possibilidade, quando
dado terapeuticamente, em representar uma estratégia para otimizar a regeneração do
fígado dos pacientes humanos, precisa ser esclarecida.
O status hepático não é prejudicado pelo Bevacizumab, mesmo em altas doses. Da
mesma forma, a regeneração hepática após hepatectomia ampliada em animais tratados
com Bevacizumabe estava bem preservada. Ressecções hepáticas prolongadas podem ser
encorajadas em pacientes tratados com Bevacizumabe devido à sua excelente
tolerabilidade e ao bom estado de regeneração hepática (VALVERDE et al., 2019).
Estudos adicionais são necessários para avaliar a tempo ideal para que o
bevacizumabe seja realizado antes da cirurgia e também para avaliar se pode ser
modificado com base na extensão da hepatectomia planejada. Até que mais dados
prospectivos estejam disponíveis, recomenda-se que o bevacizumabe seja interrompido
antes da quimioterapia citotóxica com a qual é administrado no período mínimo de quatro a
seis semanas e suspenso durante as primeiras semanas de quimioterapia pós-operatória
(BILCHIK e HECHT, 2008).
3. Método
55
3.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este estudo foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Animais
(CEPA) do Hospital e Maternidade Angelina Caron conforme protocolo nº 015/16
CEPA/HAC (anexo 1). Foram obedecidas as normas contidas na Lei Federal n.º 11.794 e
observaram-se os Princípios Éticos na Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA-2000).
Utilizaram-se 32 ratos (Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia) da linhagem
Wistar, com idades entre 112 e 125 dias e pesos de 201,8 ± 9,27 gramas, provenientes do
Biotério da Universidade Federal do Paraná e mantidos durante o experimento nas
dependências da Coordenação de Ensino e Pesquisa do Hospital e Maternidade Angelina
Caron (tabela 1).
TABELA 1 - DEMONSTRATIVO DA ORGANIZAÇÃO DOS GRUPOS DO ESTUDO E PROCEDIMENTOS REALIZADOS:
Grupos Sub-grupos Procedimentos
Controle (C) n=16
Controle 48 n=8
Hepatectomia parcial, tratamento com solução fisiológica e manutenção por 48 horas.
Controle 15 n=8
Hepatectomia parcial, tratamento com solução fisiológica e manutenção por 15 dias.
Bevacizumabe (BV) n=16
BV 48 n=8
Hepatectomia parcial, tratamento com bevacizumabe e manutenção por 48 horas.
BV 15 n=8
Hepatectomia parcial, tratamento com bevacizumabe e manutenção por 15 dias.
Os ratos foram submetidos à triagem através de inspeção da pelagem para
investigação de ectoparasitas, sinais de diarréia e lesões cutâneas.
Foram mantidos em ambiente específico para animais de laboratório com exaustão
forçada de ar (pressão negativa), temperatura controlada entre 19 a 23ºC e ciclos de
iluminação automaticamente regulados a cada 12 horas. Os ratos após a inspeção foram
3. Método
56
separados em grupos de quatro por caixa de polipropileno. As caixas com sepilho eram
substituídas a cada 24 horas e os ratos recebiam ração específica para a espécie (Nuvilab -
Quimitia S.A.®) e água ad libitum. Foram pesados em três momentos, no dia do início do
experimento (T0), quarenta e oito horas de evolução (T48) e quinze dias de evolução (T15),
conforme descrito no apêndice 1.
3.2 EXPERIMENTO
Os procedimentos experimentais foram executados em um único ciclo de atividades,
seguindo os protocolos para anestesia e hepatectomias do Laboratório da Coordenação de
Ensino e Pesquisa do Hospital e Maternidade Angelina Caron (apêndices 2 e 3). Conforme
demonstrado na figura 3, a mesa cirúrgica era montada com proteção esterilizada bem
como os instrumentos e os acessórios e os procedimentos executados em condições de
esterilidade.
Na data dos procedimentos cirúrgicos, os ratos eram pesados em balança analítica
(Coleman® modelo SK280251), separados nos sub-grupos previstos na tabela 1 (apêndice
1).
FIGURA 3 - AMBIENTE CIRÚRGICO DEMONSTRANDO A MONTAGEM DA MESA CIRÚGICA REFERÊNCIA: AUTOR
3. Método
57
3.2.1 Anestesia
A indução anestésica seguiu o protocolo específico disponibilizado no apêndice 2
(tabela 12). Foi utilizada a associação dos anestésicos cloridrato de cetamina (Ketamina-
Agener®) na dose de 80mg/kg e cloridrato de xilasina (Sedanil – solução a 2%®) na dose de
10mg/kg. Previamente à indução anestésica, os ratos foram submetidos à sedação por
inalação de Isoflurano (Isothane-Baxter®) em circuito fechado. E a seguir, injetaram-se os
anestésicos separadamente, por via intramuscular em ambas os membros pélvicos. Fez-se
tricotomia da região torácica e parede abdominal ventral, fixação com fitas adesivas na
prancheta cirúrgica, degermação da área tricotomizada com álcool-iodado e colocação de
campos cirúrgicos fenestrados esterilizados.
3.2.2 Hepatectomia parcial
Conforme descrito no apêndice 3, procedeu-se à laparotomia sub-costal por planos,
liberação dos ligamentos hepáticos e hepatectomia parcial de aproximadamente 70%,
conforme descrito por Martins, Theruvath e Neuhaus (2008). Procederam-se ligaduras dos
pedículos hepáticos com fio de monocril 3.0 e ressecção dos lobos mediano e lateral
esquerdo, seguida de laparorrafia em dois planos (músculo-aponeurótico e pele), com
pontos contínuos utilizando fio prolene 6.0® (Ethicon). Após o fechamento, a ferida cirúrgica
era limpa com solução fisiológica esterilizada (Eurofarma®) e novamente aplicado álcool-
iodado (BRANCO, 2006).
3.3 TRATAMENTOS
Imediatamente após o procedimento cirúrgico e ainda sob plano anestésico, para
analgesia pós-operatória administrou-se por via intraperitoneal Sulfato de Morfina penta-
hidratada (Dimorf®) (tabela 5), na dose de 2mg/kg e 10ml de solução fisiológica por via
subcutânea na região dorsal, para hidratação (INGJATOVIC et al., 2010).
Também se administrou aos ratos do grupo BV, por via intraperitoneal, 5mg/kg de
Bevacizumabe (Avastin®-Roche 100 mg/4 ml) e igual volume de solução salina (Eurofarma®)
aos do grupo controle.
3. Método
58
Mantiveram-se os animais aquecidos até a recuperação anestésica. A seguir,
devolviam-se, os ratos identificados, para as caixas onde permaneceram em regime
alimentar normal.
3.4 INTERRUPÇÃO DO EXPERIMENTO E COLETA DE AMOSTRAS
Nas datas previstas para as aferições (48 horas e 15 dias de evolução), os ratos
foram pesados conforme protocolo descrito no apêndice 1 e a seguir submetidos aos
”Procedimentos para interrupção de experimentos e eutanásia”, (apêndice 4) que inclui
sedação por inalação de Isoflurano (Isothane-Baxter®) em circuito fechado, anestesiados
por injeção intramuscular com cloridrato de cetamina (Ketamina-Agener®) na dose de
100mg/kg e procedida punção exanguinativa e indutora de parada cárdio-respiratória, com a
coleta de 8 a 10 ml de sangue, em tubos para obtenção de soro e encaminhados para as
avaliações bioquímicas séricas.
A seguir, após a confirmação do óbito, realizou-se laparotomia mediana ampla e
ressecção dos lobos hepáticos remanescentes os quais foram colocados em frascos
identificados para fixação em Solução de Paraformaldeído 4%, em PBS pH 7,4, por 24
horas e encaminhados para as avaliações histopatológicas e imunohistoquímicas.
3.5 AVALIAÇÕES
As avaliações utilizadas foram dosagens bioquímicas para avaliar a função hepática
e avaliações histológicas patológicas para avaliar as características microscópicas do
parênquima hepático em regeneração e imunohistoquímicas para avaliar através de
marcadores específicos a viabilidade celular e densidade microvascular.
3.5.1 Avaliação ponderal
As pesagens dos ratos foram feitas no T0 (início do experimento), no T48 (48 horas
de evolução) e no T15 (quinze dias de evolução), conforme descrição no apêndice 1.
3. Método
59
3.5.2 Avaliações bioquímicas séricas
Para as avaliações bioquímicas séricas foram coletadas amostras de sangue dos
ratos conforme descritas no ítem 3.4, em tubos de ensaio hermeticamente fechados à vácuo
e sem anticoagulantes.
3.5.2.1 Dosagem de Albumina
As dosagens de albumina foram realizadas por método espectrofotométrico
automatizado em aparelho modelo Dimension Rxl/ExL-Siemens®, com reagentes
específicos marca Siemens®, (apêndice 5).
3.5.2.2 Dosagem de Bilirrubinas Total, Direta e Indireta
As dosagens de bilirrubinas total e direta foram realizadas por método
espectrofotométrico automatizado em aparelho modelo Dimension Rxl/ExL-Siemens®, com
reagentes específicos marca Siemens®, (apêndice 6) e as dosagens das bilirrubinas
indiretas foram obtidas por cálculos.
3.5.2.3 Dosagem de Transaminases glutâmico-oxalacética (TGO) e glutâmico-pirúvica
(TGP)
As dosagens de transaminases foram realizadas por método espectrofotométrico
automatizado em aparelho modelo Dimension Rxl/ExL-Siemens®, com reagentes
específicos marca Siemens®, (apêndice 7).
3.5.2.4 Determinação do Índice aspartato-aminotransferase / plaquetas (APRI)
As determinações dos índices aspartato-aminotransferase / plaquetas foram
executadas conforme descrição no apêndice 8 (GREENSON et al., 2003) através das
dosagens de TGO, das contagens de plaquetas (executadas automaticamente no
equipamento Cell Dyn Ruby – Abbott®), e do valor máximo de referência para as dosagens
de TGO em ratos Wistar na faixa etária de 120 dias (MELO et al., 2012).
3.5.3 Avaliações microscópicas
Após a fixação das amostras de fígado, foram realizadas secções perpendiculares
com 5µm de espessura. A seguir os cortes foram fixados em lâminas e corados pelo
método hematoxilina-eosina (HE) de Harris para avaliar presença de edema, hemorragia,
3. Método
60
congestão, proliferação ductal, inflamação e também para estabelecer o índice mitótico pela
contagem microscópicas das figuras de mitoses. Empregou-se o método de coloração de
tricrômico de Gomori para avaliar a ocorrência de fibrose e o método imunohistoquímico
com anticorpos monoclonais específicos para avaliar a densidade microvascular pela
marcação com anticorpo monoclonal anti-CD34 e viabilidade celular pela marcação com
anticorpo monoclonal anti-antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA).
3.5.3.1 Determinação do Índice Mitótico
O índice mitótico foi obtido através da contagem de figuras de mitoses em lâminas
com cortes histológicos de amostras de fígado de ratos coradas pela Hematoxilina & Eosina
de Harris (HE) e contadas em microscopia ótica (ASSY e MINUK, 1997; BIONDO-SIMÕES
et al.,2006 e MELO et al., 2003).
Conforme descrito no apêndice 9, as três lâminas com cortes histológicos corados
pela Hematoxilina-Eosina de Harris foram avaliados por dois patologistas independentes,
sendo contado em microscópio óptico Nikon (Eclipse E 200®) sob magnificação de 40x, o
número de figuras de mitoses em dez campos aleatórios (figura 4).
FIGURA 4 – CORTE HISTOLÓGICO (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO CORADO PELA HEMATOXILINA E EOSINA DE HARRIS, APÓS 48 HORAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL, DEMONSTRANDO NOS DETALHES AS FIGURAS DE MITOSES.
REFERÊNCIA: AUTOR
Para a obtenção dos resultados, as leituras individuais foram tabuladas em planilha
Excel e submetidas à validação pela aplicação de critérios estatísticos sendo que se os
3. Método
61
valores das três diferentes leituras não apresentassem diferença significante (p>0,05) então
esses resultados eram considerados válidos e era calculada a média das leituras daquele
critério naquele grupo de ratos. Os valores individuais das leituras estão disponibilizados na
tabela 22. A seguir foram calculadas as médias e os intervalos de confiança 95% de cada
sub-grupo e comparados estatisticamente pelo método de t Student.
3.5.3.2 Avaliação da viabilidade celular pelo antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA)
O antígeno nuclear de proliferação de células (PCNA) é encontrado em todas as
espécies eucarióticas que atua na ativação da DNA-polimerase, que é necessário para a
síntese de DNA durante a replicação, sendo assim reconhecido como marcador de
viabilidade celular (WOJCIECH e ZIEMIENOWICZ, 2013), ou de atividade proliferativa. No
entanto, além da replicação do DNA, outras funções do PCNA se destacam por estarem
associadas a outros processos celulares vitais como remodelação da cromatina, reparo do
DNA, coesão da cromátide irmã e controle do ciclo celular (THEOCHARIS et al.,1981).
FIGURA 5 – CORTE HISTOLÓGICO (100X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO CORADO POR TÉCNICA IMUNOHISTOQUÍMICA COM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, APÓS 48 HORAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL, DEMONSTRANDO NOS DETALHES OS NÚCLEOS POSITIVOS.
REFERÊNCIA: AUTOR
Para a avaliação da viabilidade celular no parênquima hepático de ratos submetidos
à hepatectomia parcial foi empregada técnica imunohistoquímica pela marcação com
anticorpo primário anti-PCNA diluído a 1:100 (marca AbCam, monoclonal de coelho clone
ab18197®) e anticorpo anti PCNA 1:400 (marca Dako, monoclonal de camundongo, clone
3. Método
62
QBEnd10®), (figura 5). As lâminas eram identificadas com o número da caixa seguido da
identificação do rato e da lâmina: 13-SM-L1, 13-SM-L2, 13-SM-L3 conforme descrito no
apêndice 10. Os valores individuais das leituras estão disponibilizados na tabela 23.
3.5.3.3 Avaliação da densidade microvascular pelo CD34
Do material emblocado em parafina foram obtidos cortes de 4µm de espessura
estendidos em lâminas de vidro e submetidos aos anticorpos anti-CD34. A marcação dos
cortes histológicos com anticorpo anti-CD34, permite a quantificação da densidade
microvascular cicatricial. O antígeno CD34 é uma proteína transmembrana encontrada na
superfície de células endoteliais, que atua na ligação com receptores específicos de adesão
celular. O CD34 é expresso difusamente nos microvasos cicatriciais e seus níveis de
expressão podem se correlacionar à qualidade do processo cicatricial (MOLGAARD,
SPURR e GREAVES, 1989).
FIGURA 6 – CORTE HISTOLÓGICO (100X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO CORADO POR TÉCNICA IMUNOHISTOQUÍMICA COM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, APÓS 48 HORAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL.
REFERÊNCIA: AUTOR
Foi empregado o método da imunoperoxidase com o uso da técnica da
estreptavidina-biotina, com controles positivo e negativo, seguindo a especificação do
fabricante (Biotin anti-CD34 antibody clone QBEnd/10®, Dako Corporation Glostrub
Denmark) diluído a 1:350 (HSU, RAINE e FANGER, 1981). As reações foram consideradas
positivas, quando se detectou reação marrom, excluindo-se as prováveis áreas de coloração
3. Método
63
de fundo com padrão de reação nuclear, sendo que qualquer célula endotelial ou grupo de
células endoteliais de coloração marrom, independentemente do tamanho, claramente
separada de outros elementos imunocorados, eram considerados um microvaso (figura 6). A
análise foi realizada por histometria computadorizada, conforme descrito no apêndice 11. Os
resultados foram expressados em densidade tecidual de miocrovasos em uma área de
7.578,94 µ2, como média de três leituras em diferentes campos microscópicos e os valores
individuais das leituras estão disponibilizados na tabela 25.
3.5.3.4 Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático.
As lâminas com cortes histológicos corados pelo Tricrômico de Gomori foram
avaliadas para a pesquisa de áreas fibróticas, caracterizadas pela presença de colágeno
que coravam-se em verde azulado e os demais componentes teciduais em tonalidades
vermelho a laranjadas. Para a obtenção dos resultados, foram procedidas três leituras de 10
campos diferentes em cada lâmina, anotando em protocolo as ocorrências de área fibróticas
(figura 7) (QUARESMA et al., 2006) conforme apêndice 12 e os valores individuais das
leituras estão disponibilizados na tabela 28.
FIGURA 7 – CORTES HISTOLÓGICOS (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO TRATADO PELO BEVACIZUMABE, CORADO PELO MÉTODO TRICRÔMICO DE GOMORI, APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL, DEMONSTRANDO ÁREAS DE FIBROSE NOS DETALHES “A” E “B”.
REFERÊNCIA: AUTOR
3.5.3.5 Avaliação histopatológica do parênquima hepático
A
B
3. Método
64
Para a avaliação histopatológica do parênquima hepático em regeneração foi
utilizada a coloração de Hematoxilina & Eosina de Harris (HE) e as análises foram feitas em
triplicatas por dois avaliadores treinados, não sendo informados dos critérios para as
identificações das lâminas conforme descrito no apêndice 13. Foram avaliadas as seguintes
características histológicas (ROHDEN et al., 2000; QUARESMA et al., 2006):
• Ausência de alterações
• Porcentagens de ocorrências de edema, hemorragia, congestão, proliferação
ductal.
Os valores individuais das leituras estão disponibilizados na tabela 30.
FIGURA 8 – CORTES HISTOLÓGICOS (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO TRATADO PELO BEVACIZUMABE, CORADO PELO MÉTODO HEMATOXILINA E EOSINA DE HARRIS. NO DETALHE “A” APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL OBSERVA-SE HEMORRAGIA E INFLAMAÇÃO INTRAPARENQUIMATOSAS. NO DETLAHE ¨B¨, APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL OBSERVA-SE CONGESTÃO INTRAPARENQUIMATOSAS, E NO DETALHE “C” APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL OBSERVA-SE INTENSA PROLIFERAÇÃO DUCTAL.
REFERÊNCIA: AUTOR
3.5.4 AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS
A B C
3. Método
65
Os resultados foram expressos como média ± intervalo de confiança 95% (IC95%).
Onde:
X= média aritmética, σ= desvio padrão, N= número da amostra.
Empregaram-se os testes de ANOVA e T-Student com p ≤ 0,05 para as
comparações entre os grupos através do software GraphPad InStat®.
4. Resultados
66
4.1. AVALIAÇÃO PONDERAL
Não foram observadas diferenças nas pesagens entre os sub-grupos no início do
estudo (T0) com p = 0,7941. Não ocorreram mortes dos ratos durante o experimento e
houve variação nos pesos conforme os sub-grupos, cujos valores individuais encontram-se
descritos na tabela 10. No gráfico 1 e na tabela 2 pode-se observar a variação das médias
dos pesos, no grupo controle, sub-grupo C48, não houve diferença significante entre T0 e
T48 (p=0,6757). No C15, quando comparados T0 e T48 não houve diferença significante
(p=0,8642), porém houve diferença nas comparações entre T0 e T15 (p=0,0003) e entre T15
e T48 (p=0,0004). No grupo tratado pelo bevacizumabe, BV48, não houve diferença
significante entre T0 e T48 (p=0,4252). No BV15, não houve diferenças significantes quando
comparados T0 e T48 (p=0,6430), T0 e T15 (p=0,4452) e entre T15 e T48 (p=0,7597). Entre
os C15-T15 e BV15-T15 não houve diferenças (p=0,0691).
GRÁFICO 1 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO PONDERAL DOS GRUPOS E SUB-GRUPOS.
TABELA 2 – AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS PESAGENS DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS
Grupos Sub-grupos comparados p
Controle
C48 C48-T0 X C48 - T48 0,6757
C15 C15-T0 X C15-T48 0,8642 X C15-T15 0,0003
C15-T48 X C15-T15 0,0004
Bevacizumabe
BV48 BV48-T0 X BV48 - T48 0,4252
BV15 BV15-T0 X BV15-T48 0,6430 X BV15-T15 0,4452
BV15-48 X BV15-T15 0,7597
4. Resultados
67
4.2. AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS SÉRICAS
4.2.1. Dosagem de Albumina
Conforme demonstrado no gráfico 2 e na tabela 3, não houve diferenças estatísticas
nas dosagens de albumina entre os sub-grupos avaliados em T48 e T15. Os valores
individuais encontram-se descritos nas tabelas 13 e 14.
GRÁFICO 2 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS SÉRICAS DE ALBUMINA DOS GRUPOS E SUB-GRUPOS.
TABELA 3 – AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE ALBUMINA DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS
Sub-grupos comparados Valor de p
C48 X C15 0,6928 X BV48 0,8885 X BV15 0,8107
C15 X BV48 0,7169 X BV15 0,6471
BV48 X BV15 0,7804
4. Resultados
68
4.2.2. Dosagem de Bilirrubinas Total, Direta e Indireta
Conforme demonstrado no gráfico 3 e na tabela 4, não houve diferenças estatísticas
nas dosagens de bilirrubina total, bilirrubina direta e bilirrubina indireta entre os sub-grupos
avaliados em T48 e T15. Os valores individuais encontram-se descritos nas tabelas 15 e 16.
GRÁFICO 3 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS DE
BILIRRUBINAS TOTAL, DIRETA E INDIRETA DOS SUB-GRUPOS.
TABELA 4 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE BILIRRUBINAS TOTAL, DIRETA E INDIRETA DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS
Sub-grupos comparados Valores de p BT BD BI
C48 X C15 0,0809 0,5833 0,4352 X BV48 0,3217 0,5833 0,9557 X BV15 0,7252 0,0000 0,0611
C15 X BV48 0,0152 0,0262 0,4137 X BV15 0,0443 0,0005 0,2275
BV48 X BV15 0,4997 0,1242 0,0503
4. Resultados
69
4.2.3. Dosagem de Transaminases glutâmico-oxalacética (TGO) e glutâmico-pirúvica (TGP)
Conforme demonstrado no gráfico 4 e na tabela 5, houve diminuição estatisticamente
significante na dosagem de transaminase glutâmico-oxalacética (TGO) entre os grupos C48
e C15 (p=0,0002). Nas dosagens da transaminase glutâmico-pirúvica (TGP) ocorreu
aumento significante no C15 em comparação ao C48 (p=0,0169). Os valores individuais
encontram-se descritos nas tabelas 16 e 17.
GRÁFICO 4 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS DE TRANSAMINASES GLUTÂMICO-OXALACÉTICA (TGO) E GLUTÂMICO-PIRÚVICA (TGP) GRUPOS E SUB-GRUPOS.
TABELA 5 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE DE TRANSAMINASES GLUTÂMICO-
OXALACÉTICA (TGO) E GLUTÂMICO-PIRÚVICA (TGP) DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS
Sub-grupos comparados Valores de p TGO/AST TGP/ALT
C48 X C15 0,0002 0,0169 X BV48 0,5892 0,2487 X BV15 0,0029 0,4449
C15 X BV48 0,0014 0,2476 X BV15 0,4732 0,0902
BV48 X BV15 0,1569 0,6506
4. Resultados
70
4.2.4. Determinação do Índice aspartato-aminotransferase / plaquetas (APRI)
Conforme demonstrado no gráfico 5 e na tabela 6, nas determinações dos índices
aspartato-aminotransferase / plaquetas houve diferença significante entre os sub-grupos
C48 e C15 (p=0,0031), C48 e BV 15 (p=0,0135) e C15 e BV 48 (p=0,0415). Contudo, não
houve diferenças significantes nas comparações entre os grupos C48 e BV 48 (p=0,6782),
C15 e BV 15 (p=0,5814), BV48 e BV15 (p=0,1001). Os valores individuais encontram-se
descritos nas tabelas 19 e 20.
GRÁFICO 5 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DO ÍNDICE
ASPARTATO-AMINOTRANSFERASE / PLAQUETAS (APRI) DOS SUB-GRUPOS.
TABELA 6 – AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DETERMINAÇÕES DO ÍNDICE DA RELAÇÃO ASPARTATO-AMINOTRANSFERASE / PLAQUETAS (APRI) DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS
Sub-grupos comparados Valor de p
C48 X C15 0,0031 X BV48 0,6782 X BV15 0,0135
C15 X BV48 0,0415 X BV15 0,5814
BV48 X BV15 0,1001
4. Resultados
71
4.3. AVALIAÇÕES MICROSCÓPICAS
4.3.1. Determinação do Índice Mitótico
Conforme demonstrado no gráfico 6 e na tabela 7, nas determinações dos índices
mitóticos houve diferença significante entre os sub-grupos C48 e C15 (p=0,0016), C48 e BV
15 (p=0,0002), C15 e BV 48 (p=0,0001) e BV48 e BV15 (p=0,0000). Contudo, não houve
diferenças significantes nas comparações entre os grupos C48 e BV 48 (p=0,7816), C15 e
BV 15 (p=0,1576). Os valores individuais encontram-se descritos nas tabelas 21 e 22.
GRÁFICO 6 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS
DETERMINAÇÕES DOS ÍNDICES MITÓTICOS DOS SUB-GRUPOS.
TABELA 7 – AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DETERMINAÇÕES DOS ÍNDICES MITÓTICOS DOS DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS
Sub-grupos comparados Valor de p
C48 X C15 0,0016 X BV48 0,7816 X BV15 0,0002
C15 X BV48 0,0001 X BV15 0,1576
BV48 X BV15 0,0000
4. Resultados
72
4.3.2. Avaliação da viabilidade celular pelo antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA)
Conforme demonstrado no gráfico 7 e na tabela 8, nas avaliações de viabilidade
celular pela pesquisa imunohistoquímica do PCNA, houve diferença significante entre os
sub-grupos C48 e C15 (p=0,0000), C48 e BV 15 (p=0,0001), C15 e BV 48 (p=0,0000), C15
e BV 15 (p=0,0000) e BV48 e BV15 (p=0,0000). Contudo, não houve diferenças significantes
nas comparações entre os grupos C48 e BV 48 (p=0,0561). Os valores individuais
encontram-se descritos nas tabelas 23 e 24.
GRÁFICO 7 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO DA
VIABILIDADE CELULAR PELA PESQUISA IMUNOHISTOQUÍMICA DO PCNA
TABELA 8 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS DA AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR PELA PESQUISA IMUNOHISTOQUÍMICA DO PCNA
Sub-grupos comparados Valor de p
C48 X C15 0,0000 X BV48 0,0561 X BV15 0,0001
C15 X BV48 0,0000 X BV15 0,0000
BV48 X BV15 0,0000
4. Resultados
73
4.3.3. Avaliação da densidade microvascular pelo CD34
Conforme demonstrado no gráfico 8 e na tabela 9, nas avaliações de densidade
vascular pela pesquisa imunohistoquímica do antígeno CD34, não houve diferença
significante entre os sub-grupos C48 e C15 (p=0,8049) e C15 e BV48 (p=0,8644), C15 e BV
48 (p=0,6853). Contudo, houve diferenças significantes nas comparações entre os grupos
C15 e BV 15 (p=0,0162), BV48 e BV15 (p=00080). Os valores individuais encontram-se
descritos nas tabelas 25 e 26.
GRÁFICO 8 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO DA DENSIDADE MICROVASCULAR PELA PESQUISA IMUNOHISTOQUÍMICA DO CD34
TABELA 9 – AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS AVALIAÇÕES DA AVALIAÇÃO DA ANGIOGÊNESE PELA PESQUISA IMUNOHISTOQUÍMICA DO CD34
Sub-grupos comparados Valor de p
C48 X C15 0,8049 X BV48 0,8644 X BV15 0,0101
C15 X BV48 0,6853 X BV15 0,0162
BV48 X BV15 0,0080
4. Resultados
74
4.3.4. Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático.
Conforme demonstrado no gráfico 9, houve ocorrência de fibrose hepática em todos
os ratos do sub-grupo BV15. Os valores individuais encontram-se descritos nas tabelas 27
28.
GRÁFICO 9 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO OCORRÊNCIA DE FIBROSE NO PARÊNQUIMA HEPÁTICO NOS SUB-GRUPOS.
4. Resultados
75
4.3.5. Avaliação histopatológica do parênquima hepático
Conforme demonstrado no gráfico 10, as porcentagens de alterações
histopatológicas do parênquima hepático diferiram entre os sub-grupos. No sub-grupo C48
houve 37,5% de edema, 25% de congestão e 12,5% de proliferação ductal. No sub-grupo
C15, não ocorreu edema, ocorreram 15% de congestão e 37,5% de proliferação ductal. No
sub-grupo BV48, ocorreu 62,5% de edema, 100% de congestão e 12,5% de proliferação
ductal. No sub-grupo BV15 houve 87,5% de edema, 100% de congestão e 37,5% de
proliferação ductal. Os valores individuais encontram-se descritos nas tabelas 29 e 30.
GRÁFICO 10 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO PARÊNQUIMA HEPÁTICO DOS SUB-GRUPOS.
5. Discussão
76
5.1 O MODELO EXPERIMENTAL
A escolha do rato para este estudo foi feita por ser animal de pequeno porte
adaptado ao ambiente laboratorial, aquisição acessível e fácil manejo em alojamento
múltiplo e alimentação específica para espécie, bem como ser possível padronização de
variáveis como raça, idade e sexo (GODOY et al. 2006). A importância dos modelos de
hepatectomia parcial em roedores tem sido ressaltada e bastante utilizada porque estes
propiciam abordagem mais conveniente para o estudo deste processo, dada sua grande
semelhança com a situação humana como ausência de lesão ou inflamação tecidual
imediata e definição precisa do ponto inicial de tempo quando a regeneração hepática é
desencadeada (CLAVIEN et al. 2008, MADRIHAMOV et al. 2006).
No presente estudo foram utilizados 32 ratos da linhagem Wistar, com idades entre
112 a 125 dias e pesos de 201,8 ± 9,27 gramas, separados em quatro grupos com pesos
similares (p=0,7941) o que demonstra a homogeneidade dos grupos no início do
experimento.
O experimento cirúrgico, hepatectomia parcial, foi realizado em todos os ratos em
um único ciclo de atividades por uma equipe treinada para o propósito, sendo os
procedimentos executados em condições de esterilidade. Os princípios do bem estar animal
incluindo o controle da dor e o procedimento de eutanásia (SCHANAIDER e SILVA, 2004)
foram aplicados de acordo com as normativas do Conselho Federal de Medicina Veterinária.
Optou-se pela avaliação dos fígados em regeneração após o tratamento com BV,
nos períodos de 48 horas e 15 dias após a hepatectomia parcial a partir de estudo similar
que avaliou em 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10 e 14 dias (DOGRUL et al., 2010).
A dose empregada foi de 5mg/kg de peso (PAVLIDIS et al., 2010, Hubert et al.,
2015), havendo referências de experimentos em diferentes animais e também diferentes
doses. A dose de 2,5mg/kg foi empregada em ratos para avaliar a indução de aderências
intra-abdominais em modelo experimental de abrasão no ceco e observaram menor
severidade das adesões (INGJATOVIC et.al., 2010). Em coelhos utilizaram doses de
50mg/kg BV, superiores às recomendadas em seres humanos, em modelo de cicatrização
5. Discussão
77
de anastomose intestinal e concluíram que o uso pré-operatório de BV pode afetar
negativamente a resistência da anastomose intestinal (NAKAMURA, 2016).
5.2 ANGIOGÊNESE E REGENERAÇÃO HEPÁTICA
Apesar de décadas de pesquisas dedicadas à regeneração do fígado, a
compreensão da sequência e coordenação dos eventos que controlam o processo tem sido
considerada ainda imprecisa, porém ainda assim, sua importância é reconhecida como vital
para a investigação de possibilidades para a obtenção de benefícios clínicos (MAO et al.,
2014).
A regeneração hepática após hepatectomia experimental parcial a 70% está
associada à angiogênese, como consequencia do aumento da densidade vascular. Inibição
da angiogênese leva ao atraso na regeneração hepática, confirmando que esta é, pelo
menos, parcialmente dependente da angiogênese como evidenciado em estudos com
tratamentos antiangiogênicos com angiostatina e fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF) (DRIXLER et al., 2002).
A recuperação da massa e da função hepática original, após hepatectomia parcial a
70% é extremamente importante após lesões, ressecções e transplantes de doadores vivos.
Requer interação dinâmica de vários tipos de células com destaque especialmente crítico
para as células endoteliais hepáticas sinusoidais (LSEC), secretoras da angiopoietina-2
(Ang-2). Verificou-se que a Ang-2 era regulada para baixo na fase inicial da regeneração do
fígado (dias 0-3) com recuperação dos níveis de Ang-2 durante a fase posterior da
regeneração do fígado (dias 4 a 8). Como a fase inicial corresponde à proliferação de
hepatócitos e a fase posterior de regeneração de células não parenquimatosas (LSEC,
células de Kupffer e células estreladas) e angiogênese, os autores levantaram a hipótese de
que a Ang-2 derivada da LSEC pode ter ações e mecanismos duais durante ambas as fases
da regeneração hepática. Na fase angiogênica, a supra-regulação de Ang-2 provoca a
sinalização de VEGFR-2 para induzir a proliferação de células não parenquimatosas. Assim,
uma única molécula, Ang-2, pode regular a regeneração hepática através de efeitos
5. Discussão
78
específicos do tipo temporal e celular. Está se tornando cada vez mais reconhecido que a
angiogênese - a formação de nova microvasculatura a partir de vasos sangüíneos
preexistentes - é essencial para a regeneração do fígado prosseguir até a conclusão (DING
et al., 2010).
No presente estudo foi empregado o método imunohistoquímico pela
imunomarcação do antígeno CD34 com anticorpo monoclonal anti-CD34 para avaliar a
densidade microvascular (angiogênese) do parênquima hepático após a hepatectomia
parcial nos períodos propostos. O CD34 é considerado como um dos marcadores de
neovascularização, a expressão de células endoteliais CD34 positivas pode desempenhar
um papel importante na compreensão do processo de angiogênese (AMARAPURKAR et al.,
2008).
O CD34 apresenta alta especificidade, apesar de ter alguma coloração linfática e
estromal (HASAN, BYERS e JAYSON, 2002), porém, outros anticorpos marcadores podem
ser usados para identificação da microvascularização, como o anti-CD31, anti-FVIII e anti-
CD105 (VERMEULEN et al., 2002). No presente estudo as avaliações das imunomarcações
com anticorpo monoclonal anti-CD34 não diferiram (p=0,1276) entre os grupos avaliados
nas 48 horas, C48 e BV48, após a hepatectomia, podendo-se concluir que o BV não exerce
efeito antiangiogênico de forma precoce. Contudo, no décimo quinto dia de evolução, houve
diferença significante (p=0,0162) na imunomarcação entre os grupos tratados com BV,
sendo a média do BV15 inferior à média do BV48 o que permite inferir que houve efeito
antiangiogênico.
5.3 A VIABILIDADE CELULAR, ANGIOGÊNESE E A FUNÇÃO HEPÁTICA
A avaliação do PCNA é consagrada na avaliação da viabilidade celular,
considerando a regeneração como um todo, ou seja, incluindo células parenquimais. Gaglio
e colaboradores em 2002 avaliaram a regeneração hepática em primatas não humanos
comparando Ki-67 e PCNA e os resultados foram semelhantes. Utilizaram amostras de
5. Discussão
79
biopsia por laparoscopia nos dias 1, 2, 7, 14, 30 e 60 em cinco animais com cinco anos de
vida, submetidos à hepatectomia de 30 e 60 %. Nesse mesmo estudo, relatam que entre o
14º e 20º dias houve aumento significativo da marcação, com marcações máximas de
PCNA, o que concluiram coincidir com a regeneração hepática máxima.
Assy e colaboradores (1999) relatam em estudo com ratos após hepatectomia em 0,
3, 6, 12, 24, 48 e 96 horas, aumento abrupto em 48 horas dos níveis de proteína PCNA
marcada pelo Western blotting, considerado quatro vezes maiores que os valores de
referência permanecendo até 72 horas pós-hepatectomia. Este resultado foi comparado com
o estudo de Assy e Minuk (1997), quando também avaliaram a regeneração hepática em
hepatectomia através da imunomarcação de PCNA comparada à incorporação de 3H-
timidina no tecido hepático.
No estudo de Hashimoto e Sanjo (1997), houve aumento da expressão de PCNA nas
24 horas, com pico máximo 36 horas pós hepatectomias em 16 ratos, separados em quatro
grupos de quatro animais, sendo o controle, hepatectomias a 35%, 68% e 85%.
No presente estudo houve aumento significante nas avaliações da viabilidade celular
no grupo controle, sub-grupo C15 (p=0,0000) quando comparado ao C48, sendo
considerado o padrão de normalidade para o pós-hepatectomia parcial sem tratamento. Nos
grupos tratados pelo BV houve comportamento contrário nesta avaliação, pois o BV15
demonstrou média significantemente menor que o C48 (p=0,0000) o que pode ser
considerado como efeito do tratamento com BV.
Quando comparadas as avaliações entre os sub-grupos BV48 e BV15 em relação à
avaliação da viabilidade celular pela imunomarcação com anti-PCNA e a avaliação da
angiogênese pelo anti-CD34 pode-se observar nos gráficos 7 e 8 a mesma tendência
dessas aferições, ou seja os sub-grupos BV15 e BV48 apresentaram diminuição quando
comparada em ambas. É sabido que o bloqueio do VEGF induz a supressão completa da
proliferação de hepatócitos bem como das células endoteliais após a hepatectomia parcial
em ratos (BOCKHORN et al., 2007, TANIGUSHI et al., 2001) o que amparam os resultados
acima discutidos.
5. Discussão
80
As funções do fígado são múltiplas e imprescindíveis para a regulação e equilíbrio
homeostático. Alguns testes bioquímicos podem ser usados para avaliar algumas destas
funções, como dosagem da ALT, da AST, relação AST/ALT, gama-GT, fosfatase alcalina,
tempo de protrombina, albumina e bilirrubinas. Contudo, mesmo na doença hepática grave
ainda pode apresentar níveis normais das enzimas hepáticas, ou acarretar alterações de 1,5
a três vezes acima dos níveis de referência (ANTONELLO et al. 2010; AGUIAR et al. 2011,
SILVA et al. 2015).
Aguiar e colaboradores em 2011 apresentaram estudo relatando alterações da
função hepática no fígado remanescente de 50 ratos após hepatectomia de 70% e
submetidos a diferentes graus de plicatura de veia cava inferior supra-hepática. Além da
lesão tecidual hepática pela hepatectomia, ocorreram diferentes graus de lesões causadas
pela hipertensão que os fígados remanescentes sofreram, confirmadas pelos níveis de
colesterol, proteínas totais, albumina e globulinas e o tempo de ativação da protrombina, as
transaminases ALT e AST, a fosfatase alcalina, a gama-glutamil-transpeptidase, a glicemia,
tempo de tromboplastina parcial ativada e a excreção de bilirrubinas apresentaram valores
dentro da normalidade. Os resultados encontrados no presente estudo, são concomitantes,
sem alterações significativas entre todos os grupos na avaliação de albumina, bilirrubinas
totais, TGO e TGP. Em reflexão citada por Wu e colaboradores em 2017, onde mencionam
que, mesmo quando os pacientes com AST normal, considerada marcador sérico na
previsão da inflamação, eles ainda podem ter risco significativamente agravado ou
progressão de doença hepática o que ampara a observação no presente estudo de que
mesmo que o BV tivesse alterado de forma significativa a regeneração, avaliada por todos
os métodos entre os grupos, poder-se-ia ter encontrado parâmetros normais para as
avaliações laboratoriais bioquímicas. O mais surpreendente do processo regenerativo, além
da capacidade proliferativa do hepatócito, é o fato dessas células manterem
simultaneamente todas as funções fundamentais para manutenção da homeostase, como a
regulação do nível glicêmico, síntese de proteínas plasmáticas e fatores de coagulação,
secreção de bile, ciclo da uréia e biodegradação de compostos tóxicos (MICHALOPOLUS,
2007).
5. Discussão
81
5.4 OS ACHADOS HISTOPATOLÓGICOS IMUNOHISTOQUÍMICOS E A REGENERAÇÃO
HEPÁTICA
As avaliações histopatológicas do parênquima hepático (gráfico 10) demonstraram
que as porcentagens de ocorrências dos achados edema, congestão e proliferação ductal
variaram conforme os sub-grupos. Quanto às porcentagens de ocorrência de edema o C48
apresentou 37,5%, BV48 62,5% e BV15 87,5%. Destaca-se o sub-grupo BV15 no qual não
foi evidenciado edema, seria então de inferir que no grupo controle, a reparação
parenquimatosa ocorreu antes do décimo quinto dia neste grupo e no BV15 ainda mantinha
alta porcentagem de edema. Quanto à ocorrência de congestão intra-hepática houve
diminuição entre o C48 (25%) e o C15 (12,5%) o que pode ser considerado que no
transcurso da regeneração no grupo controle houve melhora em relação à ocorrência de
congestão (QUARESMA et al., 2007). Sob esse mesmo aspecto, os grupos tratados pelo BV
não apresentaram melhora, pois a porcentagem de 100% de ocorrência de congestão
permaneceu nos sub-grupos BV48 e BV15. Resultados similares foram observados em
estudo sobre os efeitos do alopourinol na isquemia hepática quando concluíram que a
isquemia transitória normotérmica hepática causa significativas alterações histopatológicas
nos fígados de ratos. e o alopurinol exerceu efeito benéfico em relação à necrose
hepatocitária, o que reforça o envolvimento da enzima xantina oxidase no dano decorrente
da isquemia-reperfusão hepática (RHODEN e colaboradores, 2000).
Os achados histopatológicos anteriormente relatados podem ser justificados pelo
fato de que, após hepatectomia parcial o fluxo portal é o principal fator que contribui para a
resposta regenerativa do fígado. O aumento da perfusão hepática decorre de diferença
pressórica entre a veia porta e artéria hepática na parte remanescente, induzindo a uma
forma de infusão sanguínea nos espaços ajuzantes aos vasos dos lobos remanescentes, o
que pode justificar a ocorrência de congestão e edema após as hepatectomias parciais
(PETROIANU, et al., 2004).
Reforçando ainda os argumentos de Petroianu (2004), definiu-se que a hepatectomia
parcial a 70% é reconhecida como estímulo suficiente para o aumento do fluxo sanguíneo
5. Discussão
82
portal em duas a três vezes o volume basal, fato que conduz à lesão da microcirculação nos
10 minutos após a ressecção dos lobos hepáticos mediano e lateral esquerdo. Com o
aumento do fluxo sanguíneo portal em leito vascular reduzido, o qual provoca aumento da
resistência vascular, evidencia-se elevação na pressão da veia porta em 30 a 40%
caracterizando quadro de hipertensão portal transitória pós-hepatectomia o que caracteriza
a hiperplasia (QUARESMA et al., 2007; AGUIAR et al., 2011).
WU e colaboradores em 2017, em estudo para avaliar fibrose hepática e alterações
bioquímicas em pacientes com hepatite B crônica, aplicaram o teste APRI e dosaram TGP,
TGO, GGT, bilirrubinas e albumina em 323 pacientes, entre junho de 2015 a dezembro de
2016. As alterações dessa rotina laboratorial não foram significantes, mesmo em pacientes
que foram classificados com maior intensidade inflamatória ou em pacientes com diferentes
graus de fibrose. Assim, não era de se esperar alterações significantes no presente estudo,
pois os relatos experimentais de que nas hepatectomias a 70%, as provas de função
hepática permanecem dentro dos limites da normalidade (QUARESMA et al., 2007).
Dentro da mesma linha de investigação, os resultados deste estudo referentes à
expressiva ocorrência de fibrose hepática no grupo BV 15, observado pelo método
histoquímico com a coloração tricrômica de Gomori, não se relacionam aos resultados
obtidos no método APRI, quando neste método não houve significância no grupo BV15 em
comparação ao C48, C15 e BV 48 e assim, de acordo com o estudo de Wu e colaboradores
em 2017, pode-se indiciar a ausência de robustez da dosagem sérica de AST para
diagnosticar a inflamação hepática isolada.
O teste APRI é capaz de confirmar a existência de fibrose hepática significativa
(AMARAL, et al. 2007; ANTONELLO et al. 2010; DERBALA et al. 2015). O fator de
crescimento hematopoiético, mais importante na regulação do desenvolvimento de
megariócitos e produção de plaquetas, é produzido no fígado e no rim, portanto não se
espera que estados hepáticos doentes ou que sofrem injúrias físicas, tenham a quantidade e
função das plaquetas preservadas em todos os momentos, considerando a curta meia vida
das mesmas (ROZMAN & BOLTA, 2007; CLAVIEN, 2008). Portanto a insignificância
5. Discussão
83
estatística quando aplicado o método APRI no grupo BV 15, contracenando com a coloração
de Gomori é um dado que merece nova exploração.
Em estudo realizado por Zhang e colaboradores em 2016, onde além de comparar
métodos não invasivos, avaliaram a aplicação do método APRI e FIB-4 para fibrose grave e
na cirrose em pacientes infectados pelo vírus da hepatite B. Concluíram que a utilidade
clínica do FIB-4 e do APRI para fibrose precisa de mais validações externas em uma grande
população, antes de ser aplicada para predizer a fibrose em paciente com infecção pelo
vírus da hepatite B. O estudo de Murata e colaboradores (2008) relata que o contato direto
entre plaquetas e hepatócitos inicia a transdução de sinal de ativação de fatores de
crescimento como o VEGF. Lesurtel e colaboradores (2006) também referem aumento da
velocidade de regeneração hepática pela presença e homogeneidade das plaquetas. Wai e
colaboradores em 2003, citam que o APRI é capaz de confirmar a existência de fibrose
significativa e excluir a cirrose, o que o torna disponível, como alternativa, na prática clínica.
Assim, no presente estudo, a correlação de plaquetas com a regeneração hepática pela
aplicação do método APRI, parece conflitada com a histoquímica pela coloração tricrômica
de Gomori.
A fibrose hepática é um processo dinâmico que resulta de um desequilíbrio entre a
produção e a dissolução da matriz extracelular (ELPEK, 2014). Na angiogênese, há um
equilíbrio rigidamente controlado entre a sinalização do fator angiogênico, atividade /
sinalização de MMP, inibidores de angiogênese endógena e inibidores de MMP. Isso pode
explicar perfis de fibrose em distúrbios angiogênicos, visto não haver equilibrio (FOLKMAN,
2003; OH et al. 2004; RUNDHAUG, 2005).
Utilizou-se um inibidor de VEGF e observou-se fibrose hepática no grupo BV15, pela
histoquímica com coloração tricrômica de Gomori, bem como alterações significativas para
imunomarcação com anti-PCNA entre os grupos C48 e BV48 (p=0,0561) e entre os grupos
C15 e BV15 (p=0,0000). Observa-se que nesse contexto há quebra no equilíbrio da
angiogênese e muito provavelmente desiquilíbrio no comportamento da matriz através das
atividades das MMPs e inibidores das MMps, resultando em fibrose hepática no grupo
BV15.
5. Discussão
84
5.5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente estudo contribui com algumas questões importantes e promissoras com
relação à regeneração hepática em vigência de tratamento com o BV, o que atualmente é
ainda pouco explorado na literatura especializada.
Entre os resultados obtidos, destacam-se a diminuição na imunomarcação com anti-
CD34 e anti-PCNA o que mostrou que o BV aos quinze dias de evolução exerceu efeito anti-
angiogênico e diminuiu a viabilidade celular. A ocorrência de fibrose nos ratos deste sub-
grupo poderia estar relacionada com os resultados anteriores? Essa indagação pode ser
considerada como perspectiva para proposta futura a partir deste estudo, abordando a
possibilidade de que o fígado regenerado em vigência de angiogênese comprometida
poderia sofrer estresse oxidativo (EO) e ativação de metaloproteinases como causas de
alterações como a fibrose e ainda como evitar essa condição com o uso e antioxidantes ou
inibidores de enzimas ativadoras de EO.
Outra abordagem futura seria ampliar o período observacional superior a quinze dias
para que as avaliações de viabilidade celular e angiogênese possam ser definidas em maior
prazo e ainda se ocorreria a fibrose ora observada.
Bons resultados não encerram os temas, apenas nos direcionam a mais estudos.
6. Conclusões
85
6.1. A evolução ponderal do modelo experimental de hepatectomia parcial em
ratos não sofreu alterações pelo uso do Bevacizumabe na dose de 5mg/kg no
período de 15 dias de avaliação.
6.2. O Bevacizumabe não alterou o comportamento evolutivo dos índices
mitóticos entre as 48 horas e o décimo quinto dia de evolução pós-
hepatectomia.
6.3. O Bevacizumabe diminuiu a densidade microvascular no décimo quinto dia
de evolução pós-hepatectomia.
6.4. O Bevacizumabe diminuiu a viabilidade celular no décimo quinto dia de
evolução pós-hepatectomia.
6.5. O Bevacizumabe ocasionou alterações histopatológicas do parênquima
hepático quanto aos parâmetros edema, congestão e fibrose.
6.6. Não ocorreram alterações funcionais bioquímicas nos parâmetros Albumina,
Bilirrubinas, Transaminases e ínidice APRI, sob a ação do Bevacizumabe.
7. Referências Bibliográficas
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131. QUARESMA, A.B.; D'ACAMPORA, A.J.;TRAMONTE, R.; FARIAS, D.C,; SLOMSKY, J.F.; Histological study of the liver and biochemistry of the blood of Wistar rats following ligature of right hepatic duct. Acta Cir Bras, São Paulo , n. 1,v. 22, p.68-78, 2007.
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137. VERMEULEN, P.B.; GASPARINI, G.; FOX, S.B.; COLPAERT, C.; MARSON, L.P.; GION, M.; BELIËN, J.A.; DE WAAL, R.M.; VAN MARCK, E.; MAGNANI, E.; WEIDNER, N.; HARRIS, A.L.; DIRIX, L.Y. Second international consensus on the methodology and criteria of evaluation of angiogenesis quantification in solid human tumours. Eur J Cancer. Oxford. v.38, n.12, p.1564-79. 2002.
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7. Referências Bibliográficas
96
141. MOREIRA, M.C.; AZEVEDO, I.M.; OLIVEIRA, C.N.; MEDEIROS, A.C. Influência do cólon na regeneração do fígado de ratos submetidos à hepatectomia e colectomia. Rev Col Bras Cir. Rio de Janeiro, v.44, n.5, p.476-481, 2017.
142. MURATA, S.; MATSUO, R.; IKEDA, O.; MYRONOVYCH, A.; WATANABE, M. HISAKURA, K.; NAKANO, Y.; HASHIMOTOI.; OHKOHCHI, N. Platelets promote liver regeneration under conditions of kupffer cell depletion after hepatectomy in mice. World J Surg. New York, n.32,p.1088-10096, 2008.
Documento de consulta:
MINISTÉRIO DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA E INOVAÇÃO. CONSELHO NACIONAL DE CONTROLE DE EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL – CONCEA. Diretriz da prática de eutanásia do CONCEA. Brasília/DF – 2015.
Apêndices
98
APÊNDICE 1
Protocolo para pesagens de ratos
1. Antecedentes
A pesagem correta dos animais de experimentação é um dos elementos imprescindíveis
para que os resultados obtidos sejam confiáveis. Os preceitos básicos a serem
respeitados é utilizar um local específico para pesagem, sem corrente de ventos, rede
elétrica estável ou utilizar um estabilizador, utilizar balança digital analítica, calibrada e
de boa marca disponibilizada sobre uma bancada estável e nivelada e em relação ao
animal este deve ser sedado para que não se movimente durante a leitura da pesagem.
2. Método
2.1. Material
• Balança analítica (Coleman® modelo SK280251)
• Cuba plástica
• Algodão
• Isoflurano (Isothane-Baxter®)
• Sacos plásticos identificados com o símbolo de biossegurança.
• EPIs.
2.2. Técnica
• Preparar o protocolo para registro dos pesos
• Embeber algodão no isoflurano
• Colocar o algodão dentro da cuba plástica
• Colocar o rato a ser pesado e tampar a cuba plástica, observar até a perda de
movimentos do animal.
• Retirar o rato imediatamente da cuba, evitando a evaporação do anestésico
• Trocar a cuba conforme o depósito de resíduos fecais e urina dos ratos
• Trocar o algodão com Isoflurano a cada quatro ratos.
Apêndices
99
3. Resultados
As pesagens foram feitas no T0 (início do experimento), no T48 (48 horas de evolução)
e no T15 (quinze dias de evolução).
Os resultados encontram-se na tabela 2.
TABELA 10 – PESAGENS DOS RATOS
Identificação T0 T48 T15 C
ontro
le (C
)
C48
13
SM 206,8 214,0 --- pescoço 190,3 197,0 ---
dorso 189,6 196,2 --- cauda 212,4 219,8 ---
14
SM 201,7 208,8 --- pescoço 211,2 218,6 ---
dorso 189,9 188,7 --- cauda 215,2 220,1 ---
C15
15
SM 192,8 202,4 204,4 pescoço 212,3 222,9 225,0
dorso 207,6 218,0 220,1 cauda 199,4 209,4 211,4
16
SM 196,7 206,5 208,5 pescoço 196,2 206,0 208,0
dorso 195,9 205,7 207,7 cauda 202,2 212,3 214,3
Beva
cizu
mab
e (B
V) BV48
18
SM 187,5 191,3 --- pescoço 196,4 200,3 ---
dorso 211,8 216,0 --- cauda 212,4 216,6 ---
19
SM 201,7 205,7 --- pescoço 198,3 202,3 ---
dorso 213,4 217,7 --- cauda 218,1 225,7 ---
BV15
20
SM 187,5 190,3 192,2 pescoço 196,4 199,3 201,3
dorso 211,8 215,0 217,1 cauda 212,4 215,6 217,7
21
SM 201,7 204,7 206,7 pescoço 198,3 201,3 203,3
dorso 213,4 216,6 218,7 cauda 218,1 221,4 223,6
TABELA 11 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS PESAGENS DOS RATOS NOS TEMPOS 0, 48HORAS E 15 DIAS.
C48 C15 BV48 BV15 Avaliações T0 T48 T0 T48 T15 T0 T48 T0 T48 T15 Desvio padrão (dp) 10,87 12,07 6,62 6,52 5,95 10,55 11,39 12,59 12,78 12,91 Limite inferior (li 95%) 193,1 194,5 194,9 195,5 210,2 196,1 198,2 196,1 192,7 205,8 Média (mx) 10,87 12,05 6,62 6,51 5,94 10,55 9,80 10,55 13,46 7,74 Limite superior (ls 95%) 211,2 214,7 205,9 206,4 220,2 213,8 214,5 213,8 215,2 218,8
Apêndices
100
APÊNDICE 2 Protocolo para Anestesia em Ratos
TABELA 12 – ORGANIZAÇÃO DOS GRUPOS DE ESTUDO E AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA DAS MÉDIAS DE PESOS
Caixa Ratos Pesos (g) KETAMINA
(ml) XILAZINA
(ml) Dimorf®
(ml) BV (ml)
80mg/kg 10mg/kg 2mg/kg 5mg/kg
Con
trole
(C)
13
SM 206,8 0,3 0,1 0,1 0,21 pescoço 190,3 0,3 0,1 0,1 0,19 dorso 189,6 0,3 0,1 0,1 0,19 cauda 212,4 0,3 0,1 0,1 0,21
14
SM 201,7 0,3 0,1 0,1 0,20 pescoço 211,2 0,3 0,1 0,1 0,21 dorso 189,9 0,3 0,1 0,1 0,19 cauda 215,2 0,3 0,1 0,1 0,22
15
SM 192,8 0,3 0,1 0,1 0,19 pescoço 212,3 0,3 0,1 0,1 0,21 dorso 207,6 0,3 0,1 0,1 0,21 cauda 199,4 0,3 0,1 0,1 0,20
16
SM 196,7 0,3 0,1 0,1 0,20 pescoço 196,2 0,3 0,1 0,1 0,20 dorso 195,9 0,3 0,1 0,1 0,20 cauda 202,2 0,3 0,1 0,1 0,20
Beva
cizu
mab
e (B
V)
18
SM 187,5 0,3 0,1 0,1 0,19 pescoço 196,4 0,3 0,1 0,1 0,20 dorso 211,8 0,3 0,1 0,1 0,21 cauda 212,4 0,3 0,1 0,1 0,21
19
SM 201,7 0,3 0,1 0,1 0,20 pescoço 198,3 0,3 0,1 0,1 0,20 dorso 213,4 0,3 0,1 0,1 0,21 cauda 218,1 0,3 0,1 0,1 0,22
20
SM 187,5 0,3 0,1 0,1 0,20 pescoço 196,4 0,3 0,1 0,1 0,21 dorso 211,8 0,3 0,1 0,1 0,22 cauda 212,4 0,3 0,1 0,1 0,20
21
SM 201,7 0,3 0,1 0,1 0,20 pescoço 198,3 0,3 0,1 0,1 0,19 dorso 213,4 0,3 0,1 0,1 0,20 cauda 218,1 0,3 0,1 0,1 0,21
Legenda:
BV= Bevacizumabe (Avastin® -Pffizer)
Ao serem comparadas estatisticamente, pelo método t Student, as médias e os desvios
padrões entre as pesagens em T0 dos grupos controle e bevacizumabe (tabela 5) obteve-se
o valor de p = 0,7941, considerado não significante.
Apêndices
101
APÊNDICE 3
Procedimentos para cirurgias experimentais do laboratório da coordenação de ensino e
pesquisa do Hospital Angelina Caron - Hepatectomia parcial a 70% em ratos:
1. Antecedentes:
As hepatectomias em roedores são bastante facilitadas, haja vista a lobulação
individualizada do fígado. Em ratos o procedimento é facilitado pela presença de quatro
lóbulos hepáticos independentes. Descrita originalmente em 1931 por Higgins e
Anderson, a ressecção do lobo mediano e do lobo esquerdo correspondem a uma
hepatectomia a 70% e são utilizadas frequentemente como modelo experimental.
Representa um modelo simples de ser realizado devido ao uso de uma única e simples
ligadura de pedículo (MARTINS, THERUVATH e NEUHAUS, 2008; BRANCO 2006).
2. Aspectos anatômicos do fígado de ratos.
De acordo com a ilustração abaixo demonstrada de Kongure, o fígado de rato é dividido
em quatro lobos principais: lobo caudado (CL), lobo hepático direito (RLL), lobo mediano
(ML) e lobo lateral esquerdo (LLL). O CL é dividido em três partes: processo caudado,
lobo anterior (CA) e posterior do caudado (PC). O RLL é dividido em lobo superior direito
(SRL) e lobo inferior direito (IRL). O ML é dividido em duas partes: o lobo mediano direito
(RML) e o lobo mediano esquerdo (LML). Em ratos não existe vesícula biliar e a veia
cava inferior é intra-hepática.
Referência: MARTINS et al., 2005.
Apêndices
102
3. Procedimentos
3.1. Pré-operatório
• 24 horas antes do início do experimento cirúrgico os ratos devem ser
inspecionados individualmente verificando a ocorrência de alopecia,
ectoparasitas, lesões cutâneas, diarréia e conjuntivites.
• Identificar as caixas e cada um dos quatro ratos através da marcação com
solução alcóolica de ácido pícrico a 20% nas posições: cabeça, dorso, cauda
e sem marca.
• Pesagem balança analítica (Coleman® modelo SK280251) e registros em
planilha.
• Calcular as doses dos anestésicos cloridrato de cetamina (Ketamina-Agner®)
80mg/kg e cloridrato de xilazina (Sedanil a 2%®) 10mg/kg.
3.2. Anestesia:
3.2.1. Materiais
• Seringas descartáveis de 1ml tipo insulina.
• Agulhas descartáveis hipodérmicas 26g/½
• Suporte para seringas
• Álcool 70º
• Álcool iodado
• Solução fisiológica
• Compressas
• Gaze cortada
• Cuba para inalação anestésica.
• Isofluorano (Cristália®)
• Ketamina: Ketamino Agner® solução a 10% - 50ml.
• Xilçazina= Sedanil ® solução a 2% - 100ml
• Sulfato de morfina = Dimorf® 02,mg/ml – 1ml
Apêndices
103
3.2.2. Procedimento
• Colocar o rato dentro da cuba com gaze embebida em isofluorano e
aguardar a perda dos reflexos.
• Inocular cada um dos anestésicos previamente aliquotados nas
seringas para cada um dos ratos, nas panturrilhas.
• Aguardar a indução anestésica.
• Proceder a tricotomia ampla do abdômen e tórax com aparelho
cortador de pelos.
• Degermar a área tricotomizada com álcool-iodado
• Colocar os campos cirúrgicos fenestrados esterilizados e gazes
esterilizadas.
3.3. Per-operatório
• O procedimento per-operatório foi realizado conforme descrito por BRITO,
BRITO e MANESCHY ( 2005).
• Proceder incisão abdominal sub-costal por planos, de cerca de três
centímetros de extensão.
• Acessar a cavidade abdominal.
• Localizar o fígado e liberar os ligamentos hepáticos.
• Rebater cranialmente os lobos lateral esquerdo e mediano.
• Proceder ligadura do pedículo hepático com fio poliglactina 3.0 (Vicryl®).
• Ressecar os lobos lateral esquerdo e mediano.
• Proceder inventário da cavidade e hemostasia.
• Fechar a ferida cirúrgica por sutura contínua com fio monofilamentar prolene
4.0 (Ethicon®) nos planos músculo-aponeurótico e cutâneo.
• Limpar a ferida cirúrgica com solução fisiológica e álcool iodado.
• Descartar os materiais perfurocortantes sujos e os fragmentos ressecados de
fígado conforme as normas institucionais de biossegurança.
• Dispensar o instrumental cirúrgico para limpeza e esterilização.
Apêndices
104
3.4. Pós-operatório
• Administrar dipirona por via oral (gavagem), na dose de 20mg/kg e 10ml de
solução fisiológica por via subcutânea na região dorsal e eram mantidos sob
aquecimento até a recuperação anestésica.
• Recolocar os ratos em caixas devidamente identificadas e oferecer ração e
água ad libitum até o sétimo dia de evolução pós-cirúrgica.
Apêndices
105
APÊNDICE 4
Procedimentos para interrupção de experimentos e eutanásia
1. Antecedentes:
Considerar que a eutanásia é uma das práticas mais difíceis e delicadas no contexto de
um experimento in vivo.
Eutanásia, do grego “eu” (bom) e “thanatos” (morte), constitui-se no modo humanitário
de matar o animal, sem dor e com mínimo estresse. É a prática de causar a morte de um
animal de maneira controlada e assistida para alívio da dor ou do sofrimento. Neste
caso, a eutanásia se justifica, para o bem do próprio indivíduo, em casos de dor ou
sofrimento, a partir de um determinado nível, que não podem ser mitigados de imediato,
com analgésicos, sedativos ou outros métodos ou quando o estado de saúde ou bem-
estar do animal impossibilite o tratamento ou socorro (de acordo com o § 1º do art. 14 da
Lei nº 11.794, de 2008).
Um método adequado de eutanásia deve garantir a perda da consciência de forma
rápida, irreversível e desprovida de experiência emocional ou física desagradável, ou
seja, o animal não deve apresentar dor, estresse, apreensão ou ansiedade.
Independente do método de eleição, a inconsciência deve anteceder a parada
cardiorrespiratória, seguida da perda da função cerebral.
Um protocolo adequado de eutanásia deve:
1.1. Tratar o animal com o máximo de respeito;
1.2. Considerar o manejo pré-eutanásia baseado nas características
comportamentais de cada espécie, para minimizar o risco de ansiedade, dor ou
lesões, antes da perda da consciência;
1.3. Prover a morte sem dor e sofrimento físico e mental;
1.4. Produzir imediata perda da consciência, seguido de parada respiratória e
cardíaca e perda da função cerebral;
1.5. Ser apropriado para a espécie, idade e estado de saúde do animal;
1.6. Confirmar a morte após a eutanásia e antes do descarte do cadáver;
Apêndices
106
1.7. Envolver pessoas qualificadas e competentes para realizar o método de forma
efetiva e humanitária, reconhecer a dor e o sofrimento nas espécies em que atua,
reconhecer e confirmar a inconsciência e morte do animal;
1.8. Levar em consideração o impacto psicológico do pessoal envolvido, mas a
prioridade é sempre o bem-estar do animal;
1.9. Ser aprovado pela CEUA da instituição;
1.10. Basear-se na consulta de profissional (is) com experiência na área e nos grupos
taxonômicos em questão, para selecionar o melhor método de eutanásia,
particularmente, se houver pouca informação para a espécie animal envolvida;
ou no caso de instalações animais, de acordo com a resolução normativa no 6, de
10 de julho de 2012, os procedimentos de eutanásia devem ser supervisionados
pelo responsável técnico da instalação animal da instituição.
1.11. Quando do uso de anestésicos inalatórios, garantir a manutenção e calibração
regulares dos equipamentos;
1.12. Realizar um rodízio entre profissionais treinados para este fim para assegurar
que o procedimento seja realizado de forma eficiente e humanitária.
1.13. Atender ao Guia Brasileiro de Boas Práticas para Eutanásia do CFMV (Conselho
Federal de Medicina Veterinária) e a resolução Nº 1.000/2012.
2. Método
Os procedimentos de eutanásias foram realizados conforme “Diretriz da prática de
eutanásia do CONCEA” (Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação. Conselho
Nacional de Controle de Experimentação Animal)
2.1. Material
• Cuba hermética devidamente limpa.
• Anestésicos inalatórios: Halotano ou Sevofluorano (aliquotados em frascos de
vidro com 15 a 20 ml).
• Frasco de vidro com solução de paraformaldeído 4%, em PBS pH 7,4.
• Algodão.
• Seringas de 10 ou 20 ml.
Apêndices
107
• Agulhas 40 x 1,20 (18G 1½).
• Tubos de ensaio com tampa rosca sem anticoagulante
• Sacos plásticos identificados com o símbolo de biossegurança.
• EPIs.
2.2. Técnica
• Embeber algodão com 5ml aproximadamente de um dos anestésicos
inalatórios e colocar no frasco de vidro.
• Colocar o frasco de vidro dentro da cuba e fechá-la por um a dois minutos até
saturar o microambiente.
• Colocar delicadamente um rato de cada vez na cuba e trocar o frasco com
anestésico inalatório a cada procedimentos.
• Fechar a cuba e aguardar o rato perder os reflexos.
• Proceder a punção cardíaca e aspirar o maior volume de sangue rapidamente
até a indução da parada cárdio-respiratória.
• Colocar o sangue em tubos de ensaio com tampa rosca sem anticoagulante
para a obtenção de soro após a retração do coágulo, centrifugação e
separação do sobrenadante.
• Identificar os tubos com o número da caixa seguido da identificação do rato:
13-SM
• Confirmar a morte do rato.
• Transferir o rato morto para mesa cirúrgica e proceder laparotomia mediana
xifo-púbica, inventariar a cavidade abdominal, e ressecar o fígado.
• Retirar rapidamente o excesso de sangue da amostra por lavagem em
solução fisiológica e em seguida colocar cada amostra em um frasco de
vidro, devidamente identificado, com solução de paraformaldeído 4%, em
PBS pH 7,4.
• Identificar os frascos com o número da caixa seguido da identificação do rato:
13-SM
Apêndices
108
• Dispensar as carcaças individualmente em sacos plásticos identificados com
o símbolo de risco biológico e encaminhar em seguida para o setor
responsável por resíduos biológicos.
Apêndices
109
APÊNDICE 5
Dosagem de Albumina
1. Antecedentes
A albumina é a proteína mais abundante no plasma. Sintetizada pelas células do
parênquima hepático, tem meia vida de 15 a 19 dias. Sua função primária é manter a
pressão coloidosmótica do plasma. O fígado é o único órgão capaz de sintetizar albumina.
Cerca de 12% a 20% da capacidade de síntese hepática é disponibilizada para a síntese
desta proteína.
2. Método
Empregou-se o método espectrofotométrico automatizado, que utiliza uma solução de
púrpura de bromocresol (PCG) como corante de ligação. A albumina do soro reage
quantitativamente com a solução formando um complexo albumina–PCG em pH 4,2.
Este complexo é medido como uma reação de ponto final empregando comprimento de
onda de 596/694 nm (SIEMENS, 2008).
2.1. Material
• Amostras de soro de ratos.
• Equipamento Dimension RxL/ExL (Siemens®)
• Reativos específicos para a dosagem automatizada de albumina (Siemens®)
2.2. Técnica
• Registrar a identificação de cada amostra no sistema computadorizado do
equipamento e colocar o tubo com plasma no equipamento e dar início na
opção albumina.
• Programar a leitura espectrofotométrica das amostras e do padrão de
albumina.
• Aguardar a impressão dos resultados.
Apêndices
110
3. Resultados
TABELA 13 – RESULTADOS DAS DOSAGENS SÉRICAS DE ALBUMINA (MG/DL)
Identificação Albumina (mg/dl)
C
13
SM 2,98 pescoço 3,01 dorso 3,06 cauda 2,94
14
SM 3,07 pescoço 2,96 dorso 3,03 cauda 3,26
15
SM 3,27 pescoço 3,4 dorso 3,27 cauda 2,03
16
SM 3,31 pescoço 3,31 dorso 3,37 cauda 2,89
BV
17
SM 3,07 pescoço 3,18 dorso 3,02 cauda 3,11
18
SM 2,97 pescoço 3,04 dorso 2,98 cauda 2,99
19
SM 3,28 pescoço 2,97 dorso 3,34 cauda 3,3
20
SM 2,14 pescoço 3,34 dorso 3,2 cauda 2,41
TABELA 14 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE ALBUMINA DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15
Avaliações C48 C15 BV48 BV15 Desvio Padrão (DP) 3,04 3,11 3,05 3,00 Limite Inferior (LI 95%) 2,96 2,72 2,99 2,61 Média (Mx) 0,10 0,46 0,07 0,47 Limite Superior (LS 95%) 3,12 3,49 3,11 3,39
Apêndices
111
APÊNDICE 6
Dosagem de Bilirrubinas
1. Antecedentes
A bilirrubina é o resultado do metabolismo da porção heme da hemoglobina (80%) e de
outras hemoproteínas como mioglobina, citocromos e catalase (20%). A ruptura das
hemácias senescentes pelo sistema retículo endotelial, que é fagocitada de imediato
pelos macrófagos em muitas partes do organismo, especialmente pelas células de
Kupffer, no fígado, e pelos macrófagos no baço e na medula óssea libera a
hemoglobina, que se decompõem em globina (porção proteica) e heme (complexo
protoporfirina IX e ferro). É então transformada a sua hemoglobina pela heme-oxigenase
em biliverdina, monóxido de carbono e ferro. A biliverdina-redutase converte a biliverdina
em bilirrubina livre, sendo gradualmente liberada dos macrófagos para o plasma. A
bilirrubina livre atravessa facilmente a barreira hematoencefálica, sendo potencialmente
tóxica para o tecido nervoso. O aumento das bilirrubinas, denominado hiperbilirrubinemia
e manifestado clinicamente como icterícia. Nestes últimos, a mensuração da bilirrubina
total e suas frações, direta e indireta são essenciais para o diagnóstico de disfunções
hepáticas. Os métodos existentes determinam a fração que produz cor com a reação de
Van den Bergh em solução aquosa (bilirrubina direta), enquanto a fração que
desenvolve cor com o álcool é chamada bilirrubina indireta. A reação direta ocorre com a
bilirrubina conjugada (diglicuronídeo) solúvel em água. A bilirrubina total compreende a
soma das frações conjugada e não-conjugada.
2. Método
2.1. Material
• Amostras de sangue de ratos colhidos por punção cardíaca em tubos com
anticoagulante
• Equipamento Dimension RxL/ExL (Siemens®)
• Reativos específicos para a dosagem automatizada de bilirrubinas
(Siemens®)
Apêndices
112
2.2. Técnica
• Registrar a identificação de cada amostra no sistema computadorizado do
equipamento.
• Colocar o tubo com soro no equipamento e dar início na opção bilirrubinas
total e direta.
• A diferença entre os valores obtidos das dosagens de bilirrubina total
menos os valores das dosagens de bilirrubina direta constitui os valores
de bilirrubina indireta.
• Programar a leitura espectrofotométrica das amostras e do padrão de
bilirrubina.
3. Resultados
TABELA 15 – RESULTADOS DAS DOSAGENS SÉRICAS DE BILIRRUBINAS (MG/DL)
Bilirrubinas Identificação C48 C15 BV48 BV15
BT
SM 0,19 0,12 0,14 0,07 pescoço 0,15 0,15 0,17 0,09 dorso 0,09 0,46 0,14 0,27 cauda 0,20 0,13 0,11 0,30 SM 0,15 0,20 0,08 0,17 pescoço 0,41 0,58 0,20 0,07 dorso 0,09 0,42 0,10 0,13 cauda 0,09 0,42 0,10 0,13
BD
SM 0,06 0,04 0,08 0,13 pescoço 0,07 0,07 0,14 0,10 dorso 0,09 0,06 0,09 0,09 cauda 0,03 0,04 0,14 0,15 SM 0,04 0,05 0,08 0,12 pescoço 0,05 0,05 0,08 0,09 dorso 0,07 0,11 0,08 0,13 cauda 0,05 0,09 0,08 0,12
BI
SM 0,01 0,14 0,08 0,21 pescoço 0,06 0,03 0,05 0,25 dorso 0,06 0,11 0,04 0,11 cauda 0,07 0,21 0,15 0,03 SM 0,06 0,09 0,05 0,25 pescoço 0,18 0,05 0,05 0,08 dorso 0,03 0,03 0,05 0,08 cauda 0,04 0,03 0,05 0,08
Apêndices
113
TABELA 16 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE BILIRRUBINAS DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15
Avaliações C48 C15 BV48 BV15
Tota
l Desvio Padrão (DP) 0,11 0,18 0,04 0,09 Limite Inferior (LI 95%) 0,08 0,16 0,10 0,08 Média (Mx) 0,17 0,31 0,13 0,15 Limite Superior (LS 95%) 0,26 0,46 0,16 0,23
Dire
ta Desvio Padrão (DP) 0,02 0,03 0,03 0,02
Limite Inferior (LI 95%) 0,04 0,04 0,07 0,10 Média (Mx) 0,06 0,06 0,10 0,12 Limite Superior (LS 95%) 0,07 0,08 0,12 0,13
Indi
reta
Desvio Padrão (DP) 0,05 0,07 0,04 0,09 Limite Inferior (LI 95%) 0,02 0,03 0,03 0,06 Média (Mx) 0,06 0,09 0,07 0,14 Limite Superior (LS 95%) 0,11 0,14 0,10 0,21
Apêndices
114
APÊNDICE 7
Dosagem de amino-transaminases glutâmico-oxalacética (AST/TGO) e glutâmico-pirúvica
(ALT/TGP)
1. Antecedentes
No fígado, em circunstâncias normais, estas enzimas residem dentro das células do
fígado, mas em condições patológicas estas enzimas são liberadas no fluxo sanguíneo.
Elas catalisam a transferência de um grupo alfa-amino de um aminoácido para um alfa-
cetoácido, com a formação de novos alfa-amino e alfa-cetoácido. O fígado produz mais
de 60 destas enzimas e entre as mais sensíveis destas enzimas e as mais
representativas estão as transaminases. Elas incluem a aspartato-aminotransferase
(AST ou TGO) e a alanine-aminotransferase (ALT ou TGP). Estas enzimas normalmente
são contidas dentro das células do fígado. As transaminases catalisam reações
químicas nas células nas quais um grupo de amino é transferido de uma molécula
doadora a uma molécula recipiente.
2. Método
2.1. Material
• Amostras de sangue de ratos colhidos por punção cardíaca em tubos com
anticoagulante
• Equipamento Dimension RxL/ExL (Siemens®)
• Reativos específicos para a dosagem automatizada de transaminases
(Siemens®)
2.2. Técnica
• Registrar a identificação de cada amostra no sistema computadorizado do
equipamento.
• Colocar o tubo com plasma no equipamento e dar início na opção
transaminases.
Apêndices
115
• Programar a leitura espectrofotométrica das amostras e do padrão de TGO e
TGP.
3. Resultados TABELA 17 – RESULTADOS DAS DOSAGENS SÉRICAS DE TRANSAMINASES (MG/DL)
Identificação Aspartato-aminotransferase
(AST ou TGO) Alanine-aminotransferase
(ALT ou TGP) C48 C15 C15 BV15 C48 C15 BV48 BV15
SM 105,10 68,20 90,50 90,10 154,90 325,20 315,60 210,00 pescoço 98,30 62,90 88,70 59,70 161,90 367,00 242,80 187,90 dorso 161,60 78,80 95,20 89,20 222,50 244,10 436,70 292,70 cauda 107,60 70,00 72,40 53,70 175,60 180,60 262,90 332,80 SM 92,30 53,90 98,20 68,00 127,70 300,10 307,30 400,50 pescoço 100,40 50,60 154,40 41,30 134,00 476,80 296,30 154,00 dorso 98,40 52,00 107,80 63,80 303,20 347,60 142,10 192,50 cauda 99,30 78,32 104,70 96,20 358,60 327,30 96,21 145,60
TABELA 18 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS
DOSAGENS SÉRICAS DE TRANSAMINASES DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15
Avaliações C48 C15 BV48 BV15
AST
Desvio Padrão (DP) 22,19 11,36 24,0 19,63 Limite Inferior (LI 95%) 89,32 54,84 81,43 53,84 Média (Mx) 107,9 64,34 101,5 70,25 Limite Superior (LS 95%) 126,4 73,84 121,5 86,66
ALT
Desvio Padrão (DP) 84,34 87,19 106,1 92,06 Limite Inferior (LI 95%) 134,3 248,2 173,8 162,5 Média (Mx) 204,8 321,1 262,5 239,5 Limite Superior (LS 95%) 275,3 394,0 351,2 316,5
Apêndices
116
APÊNDICE 8
Determinação do Índice da relação aspartato aminotransferase / plaquetas (APRI)
1. Antecedentes
O índice da relação aspartato-aminotransferase sobre plaquetas (APRI) é um marcador
de fibrose hepática o qual considera o resultado do nível da transaminases TGO (ou
AST) e o número de plaqueta e o valor de referência (máximo)* para a faixa etária do
rato (MELO, 2012). O resultado da divisão é então dividido pelo número de plaquetas e
depois esse novo resultado é multiplicado por 100, conforme fórmula abaixo.
2. Método
2.1. Material
• Dosagens de tranasminsase glutâmica oxalacética
• Contagens de plaquetas
2.2. Técnica
• Proceder aos cálculos conforme a fórmula abaixo:
Determinação do Índice da relação aspartato-aminotransferase/plaquetas
(APRI)
=
[(Dosagem de TGO ÷
LSNTGO*)
X 100]
Contagem de plaquetas x 10-3/mm3
3. Resultados
TABELA 19 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DOS
ÍNDICES ASPARTATO-AMINOTRANSFERASES DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15
Avaliações C48 C15 BV48 BV15
Desvio Padrão (DP) 0,03 0,03 0,05 0,03 Limite Inferior (LI 95%) 0,11 0,06 0,09 0,06 Média (Mx) 0,13 0,08 0,13 0,09 Limite Superior (LS 95%) 0,16 0,10 0,17 0,12
Apêndices
117
TABELA 20 – RESULTADOS DAS DETERMINAÇÕES DOS ÍNDICES DA RELAÇÃO ASPARTATO AMINOTRANSFERASE / PLAQUETAS (APRI) CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS
Identificação TGO LS TGO* Plaquetas APRI
C48
SM 105,10 131,7 785,15 0,10 pescoço 98,30 131,7 569,41 0,13 dorso 161,60 131,7 658,36 0,19 cauda 107,60 131,7 721,76 0,11 SM 92,30 131,7 654,49 0,11 pescoço 100,40 131,7 556,65 0,14 dorso 98,40 131,7 654,41 0,11 cauda 99,30 131,7 410,09 0,18
C15
SM 68,20 131,7 795,19 0,07 pescoço 62,90 131,7 576,70 0,08 dorso 78,80 131,7 666,78 0,09 cauda 70,00 131,7 808,37 0,07 SM 53,90 131,7 733,03 0,06 pescoço 50,60 131,7 541,15 0,07 dorso 52,00 131,7 654,48 0,06 cauda 78,32 131,7 415,34 0,14
BV48
SM 90,50 131,7 805,37 0,09 pescoço 88,70 131,7 584,08 0,12 dorso 95,20 131,7 675,32 0,11 cauda 72,40 131,7 818,72 0,07 SM 98,20 131,7 742,41 0,10 pescoço 154,40 131,7 548,07 0,21 dorso 107,80 131,7 662,85 0,12 cauda 104,70 131,7 420,65 0,19
BV15
SM 90,10 131,7 634,49 0,11 pescoço 59,70 131,7 656,65 0,07 dorso 89,20 131,7 454,41 0,15 cauda 53,70 131,7 510,09 0,08 SM 68,00 131,7 751,91 0,07 pescoço 41,30 131,7 613,84 0,05 dorso 63,80 131,7 742,40 0,07 cauda 96,20 131,7 655,23 0,11
Apêndices
118
APÊNDICE 9
Determinação do Índice Mitótico
1. Antecedentes:
A determinação do índice mitótico foi empregada com o objetivo de quantificar a
replicação celular no parênquima hepático, como indicativo da regeneração hepática
após hepatectomias parciais. Foi obtida através da contagem de figuras de mitoses em
duas lâminas com cortes histológicos de amostras de fígado de ratos coradas pela
Hematoxilina & Eosina de Harris (HE) e contadas em microscopia ótica (ASSY e MINUK,
1997; BIONDO-SIMÕES et al.,2000).
2. Método
2.1. Material
• Corante Hematoxilina de Harris
• Corante Eosina
• Soluções de álcool etílico a 70%, 80%, 90% e 100%.
2.2. Técnica
• Armazenar em cápsulas histológicas e progressivamente desidratadas, em
banhos de uma hora em cada uma das quatro crescentes concentrações de
álcool etílico a 70%, 80%, 90% e 100%.
• Diafanizar através de dois banhos de uma hora de duração em xilol.
• Submeter a dois banhos de parafina a 58-60°C e incluir em formas de blocos.
• Cortar em micrótomo para a obter de cortes de 5 µm de espessura e montá-
los em lâminas previamente limpas, desengorduradas e banhadas em
solução fixadora de albumina.
• Remover a parafina seguida da hidratação dos cortes de tecido por 24 horas
em estufa a 56ºC e submeter a uma sequência de banhos em xilol por 10
minutos, álcool absoluto por 10 minutos, álcool 90% por cinco minutos, 80%
por cinco minutos, 70% por cinco minutos e água por cinco minutos.
Apêndices
119
• Corar em Hematoxilina de Harris por um minuto e meio, lavar em água
corrente por 30 minutos, corar em eosina por 30 segundos, lavar rapidamente
em água e desidratadas em série crescente de álcoois a 70%, 80%, 90% e
100%.
• Diafanizar as lâminas em xilol e montá-las com bálsamo sintético e lamínula.
• Identificar as lâminas com o número da caixa seguido da identificação do rato
e da lâmina: 13-SM-L1, 13-SM-L2, 13-SM-L3.
2.3. Leituras
• As contagens das lâminas foram executadas em triplicatas por dois leitores
independentes, em microscópio óptico Nikon (Eclipse E 200®) sob
magnificação de 40x, para a contagem do número de figuras de mitoses em
dez campos aleatórios.
3. Resultados
Os resultados foram obtidos após a validação dos resultados das três contagens que
não demonstrassem diferenças estatísticas (p>0,05) para os sub-grupos. Era então
calculada a média das contagens para cada rato (M) e a média final (MF) entre as três
lâminas. A seguir eram calculadas as médias e os intervalos e confiança 95% e comparados
os resultados dos sub-grupos pelo teste t-Student.
TABELA 21 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS
CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE FIGURAS DE MITOSES EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA E EOSINA EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS
Avaliações C48 C15 BV48 BV15 Desvio Padrão (DP) 2,37 1,23 1,69 0,44 Limite Inferior (LI 95%) 2,69 -0,07 3,55 -0,09 Média (Mx) 4,68 0,96 4,96 0,27 Limite Superior (LS 95%) 6,66 1,98 6,37 0,64
Apêndices
120
TABELA 22 – RESULTADOS DAS CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE FIGURAS DE MITOSES EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA E EOSINA EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS
Grupos Identificação Figuras de mitoses em 10 campos aleatórios
Lâmina 1 Lâmina 2 Lâmina 3 MF L1 L2 M L1 L2 M L1 L2 M
Con
trole
(C)
13
SM 3 4 3,5 4 4 4 4 6 5 4,2 pescoço 2 5 3,5 2 5 3,5 3 4 3,5 3,5 dorso 0 3 1,5 1 4 2,5 0 2 1 1,7 cauda 4 3 3,5 3 2 2,5 2 1 1,5 2,5
14
SM 6 5 5,5 7 3 5 5 4 4,5 5,0 pescoço 11 9 10 9 10 9,5 8 7 7,5 9,0 dorso 6 5 5,5 4 4 4 3 5 4 4,5 cauda 5 9 7 6 8 7 5 9 7 7,0
Validação (p) 0,6101 0,7139 0,4358 ---
15
SM 0 0 0 0 0 0 2 3 2,5 0,83 pescoço 0 2 1 2 1 1,5 1 0 0,5 1,00 dorso 5 0 2,5 5 4 4,5 5 4 4,5 3,83 cauda 0 3 1,5 1 2 1,5 0 0 0 1,00
16
SM 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 pescoço 0 0 0 0 0 0 1 0 0,5 0,17 dorso 0 0 0 0 0 0 1 0 0,5 0,17 cauda 2 1 1,5 1 0 0,5 0 0 0 0,67
Beva
cizu
mab
e (B
V)
Validação (p) 0,8718 0,7590 0,6575 ---
17
SM 7 3 5 6 2 4 8 8 8 5,7 pescoço 3 5 4 2 5 3,5 0 0 0 2,5 dorso 5 2 3,5 6 1 3,5 5 6 5,5 4,2 cauda 3 0 1,5 5 1 3 7 6 6,5 3,7
18
SM 8 3 5,5 6 2 4 4 4 4 4,5 pescoço 7 9 8 8 10 9 7 8 7,5 8,2 dorso 8 5 6,5 6 4 5 6 5 5,5 5,7 cauda 7 4 5,5 6 2 4 5 8 6,5 5,3
Validação (p) 0,0950 0,0871 0,7781 ---
19
SM 1 3 2 0 0 0 0 0 0 0,7 pescoço 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 dorso 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 cauda 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0
20
SM 4 3 3,5 0 0 0 0 0 0 1,2 pescoço 1 0 0,5 1 0 0,5 0 0 0 0,3 dorso 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 cauda 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0
Validação (p) 1,0000 0,3343 --- --- Legenda: L1= leitor 1, L2= Leitor 2, M= média das contagens entre leitores. MF= Média das contagens das três lâminas
Apêndices
121
APÊNDICE 10
Avaliação da viabilidade celular pelo antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA)
1. Antecedentes
Para a avaliação da viabilidade celular no parênquima hepático de ratos submetidos à
hepatectomia parcial foi empregada técnica imunohistoquímica pela marcação do antígeno
nuclear de proliferação celular (PCNA), o qual é um marcador de atividade proliferativa
(THEOCHARIS et al.,1994).
O anticorpo monoclonal reage com um gene nuclear de célula em proliferação e também
conhecido como PCNA ou DNA polimerase. O PCNA é um anel trimérico de 36 kD que atua
como um grampo deslizante de ADN-polimerase expresso no núcleo de todas as células em
proliferação.
Uma função primordial do PCNA é estimular o aumento da capacidade de
processamento da polimerase do DNA durante o alongamento da fita principal. O PCNA é
um marcador da síntese de DNA e é altamente conservado na maioria das espécies,
destacando a reatividade muito ampla desse anticorpo (WOJCIECH e ZIEMIENOWICZ,
2013; PAULO et al.; 2013). As lâminas eram identificadas com o número da caixa seguido
da identificação do rato e da lâmina: 13-SM-L1, 13-SM-L2, 13-SM-L3 (KASUYA et al., 2012,
PAULO et al., 2013).
2. Método:
2.1. Material
• Foi empregado o marcador Biotin anti-PCNA antibody clone PC10 (DAKO®).
2.2. Técnica
• As amostras foram fixadas em paraformaldeído 4%, em PBS, pH 7,4, por 24
horas.
• Posteriormente, as amostras foram desidratadas em concentrações
crescentes de etanol, diafanizadas em Xilol e incluídas em parafina. Cortes
Apêndices
122
de 3µm das amostras foram depositados em lâminas carregadas
positivamente.
• Posteriormente, as lâminas foram processadas no “Autostainer de
imunohistoquímica” (Leica Bond Max®), onde os cortes foram
desparafinizados em xilol, reidratados em concentrações decrescentes de
etanol para a imunohistoquímica, os cortes histológicos reidratados foram
incubados com 3% H2O2 em metanol para o bloqueio da peroxidase
endógena.
• A recuperação antigênica foi realizada em tampão Citrato de Sódio 10mM, pH
6,0, à 95ºC, por 20 minutos.
• Possíveis ligações não específicas, bem como radicais aldeídicos livres foram
bloqueados pela incubação de cinco minutos com PBS contendo 1% de BSA
e por PBS contendo 0,1M de Glicina, respectivamente.
• Posteriormente, os cortes foram incubados por 12 horas à 8ºC com o
anticorpo primário a 1:100 (marca AbCam, monoclonal de coelho clone
ab18197®) e anticorpo anti-PCNA 1:400 (marca Dako, monoclonal de
camundongo, clone QBEnd10®).
• Após a incubação do anticorpo primário as lâminas foram lavadas em três
banhos de PBS por 5 minutos cada banho, e a após isto foi incubado o
polímero Refine Polymer (Leica®) por 30 minutos.
• Posteriormente, foi realizada a revelação da ligação dos anticorpos primários
foram realizadas com DAB (tetra-hidrocloreto de 3,3’-diaminobenzidina) (DAB
substrate Kit, Leica), com posterior contra-coloração com o corante de
Hematoxilina.
• A seguir, os cortes foram desidratados em bateria crescente de etanol e
depois xilol, com isso as lâminas permanentes foram montadas com Entellan
(Merck®).
• Identificar as lâminas com o número da caixa seguido da identificação do rato
e da lâmina: 13-SM-L1, 13-SM-L2, 13-SM-L3.
Apêndices
123
3. Leituras:
As reações foram consideradas positivas, quando se detectava reação marrom,
excluindo-se as prováveis áreas de coloração de fundo, independentemente do tamanho
e mesmo separadas dos vasos adjacentes ou de outros elementos imunocorados e
foram desconsideradas as prováveis áreas de coloração de fundo.
A avaliação da imunomarcação foi baseada na porcentagem de núcleos positivos dos
hepatócitos. As seções foram contadas em alta potência (400x) aleatoriamente em 100
células em cada sub-grupo. Todos os sub-grupos foram examinados cegamente por dois
observadores independentes.
Apêndices
124
4. Resultados
TABELA 23 – RESULTADOS DAS CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE CÉLULAS MARCADAS PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS
Grupos Identificação
Contagem de células marcadas pelo anticorpo monoclonal anti-PCNA em 100 campos aleatórios
Lâmina 1 Lâmina 2 Lâmina 3 MF L1 L2 M L1 L2 M L1 L2 M
Con
trole
(C)
13
SM 32 42 37,0 30 25 27,5 45 44 44,5 36,33 pescoço 46 36 41,0 48 39 43,5 33 28 30,5 38,33 dorso 33 25 29,0 29 34 31,5 36 29 32,5 31,00 cauda 30 28 29,0 19 22 20,5 25 15 20 23,17
14
SM 27 25 26,0 28 25 26,5 18 26 22 24,83 pescoço 34 32 33,0 31 27 29,0 33 32 32,5 31,50 dorso 57 48 52,5 62 59 60,5 52 49 50,5 54,50 cauda 44 52 48,0 34 28 31,0 39 31 35 38,00
Validação 0,7208 0,6744 0,5362 ---
15
SM 84 78 39,0 45 63 54,0 62 59 60,5 51,17 pescoço 25 66 33,0 56 54 55,0 54 49 51,5 46,50 dorso 27 58 29,0 82 72 77,0 45 62 53,5 53,17 cauda 59 49 24,5 65 56 60,5 54 52 53 46,00
16
SM 63 62 31,0 63 48 55,5 71 69 70 52,17 pescoço 56 62 31,0 47 49 48,0 64 58 61 46,67 dorso 74 59 29,5 52 52 52,0 63 64 63,5 48,33 cauda 67 71 35,5 48 53 50,5 60 73 66,5 50,83
Validação 0,4499 0,7958 0,6908 ---
Beva
cizu
mab
e (B
V)
18
SM 34 44 22,0 41 53 47,0 39 44 41,5 36,83 pescoço 22 32 16,0 36 48 42,0 28 39 33,5 30,50 dorso 17 15 7,5 37 49 43,0 41 55 48 32,83 cauda 63 59 29,5 52 36 44,0 61 43 52 41,83
19
SM 47 53 26,5 28 25 26,5 32 44 38 30,33 pescoço 39 28 14,0 39 35 37,0 59 63 61 37,33 dorso 40 33 16,5 42 45 43,5 50 39 44,5 34,83 cauda 23 32 16,0 36 25 30,5 36 44 40 28,83
Validação 0,8543 0,8924 0,5597 ---
20
SM 55 62 31,0 41 56 48,5 58 66 62 47,17 pescoço 63 52 26,0 61 48 54,5 49 53 51 43,83 dorso 46 69 34,5 32 49 40,5 69 55 62 45,67 cauda 33 58 29,0 59 52 55,5 58 62 60 48,17
21
SM 34 64 32,0 50 53 51,5 64 69 66,5 50,00 pescoço 41 28 14,0 36 33 34,5 73 81 77 41,83 dorso 29 33 16,5 59 62 60,5 44 53 48,5 41,83 cauda 33 32 16,0 44 57 50,5 56 49 52,5 39,67
Validação 0,284 0,4958 0,6831 --- Legenda: L1= leitor 1, L2= Leitor 2, M= média das contagens entre leitores. MF= Média das contagens das três lâminas
Apêndices
125
TABELA 24 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE CÉLULAS MARCADAS PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS
Avaliações C48 C15 BV48 BV15 Desvio Padrão (DP) 4,58 2,82 2,68 3,52 Limite Inferior (LI 95%) 34,31 47,40 39,53 23,69 Média (Mx) 37,48 49,35 41,39 26,13 Limite Superior (LS 95%) 40,65 51,31 43,25 28,57
Apêndices
126
APÊNDICE 11
Avaliação da densidade microvascular pelo CD34
1. Antecedentes
Para a avaliação da densidade microvascular do parênquima hepático de ratos
submetidos à hepatectomia parcial foi empregada técnica imunohistoquímica pela
marcação do receptor CD34, o qual é expresso difusamente nos microvasos cicatriciais,
com um anticorpo monoclonal específico, o anti-CD34 e seus níveis de expressão se
permitem a quantificação da densidade microvascular cicatricial (MOLGAARD, SPURR e
GREAVES, 1989; HSU, RAINE e FANGER, 1981). As lâminas eram identificadas com o
número da caixa seguido da identificação do rato e da lâmina: 13-SM-L1, 13-SM-L2, 13-
SM-L3.
2. Método:
2.1. Material
• Foi empregado o marcador Biotin anti-CD34 antibody clone PC10 (DAKO®)
conforme técnica descrita por HSU, RAINE e FANGER (1981).
2.2. Técnica
• As amostras foram fixadas em paraformaldeído 4%, em PBS, pH 7,4, por 24
horas.
• Posteriormente, as amostras foram desidratadas em concentrações
crescentes de etanol, diafanizadas em Xilol e incluídas em parafina. Cortes
de 3µm das amostras foram depositados em lâminas carregadas
positivamente.
• Posteriormente, as lâminas foram processadas no “Autostainer de
imunohistoquímica” (Leica Bond Max®), onde os cortes foram
desparafinizados em xilol, reidratados em concentrações decrescentes de
etanol para a imunohistoquímica, os cortes histológicos reidratados foram
Apêndices
127
incubados com 3% H2O2 em metanol para o bloqueio da peroxidase
endógena.
• A recuperação antigênica foi realizada em tampão citrato de sódio 10mM, pH
6,0, à 95ºC, por 20 minutos.
• Possíveis ligações não específicas, bem como radicais aldeídicos livres foram
bloqueados pela incubação de cinco minutos com PBS contendo 1% de BSA
e por PBS contendo 0,1M de glicina, respectivamente.
• Posteriormente, os cortes foram incubados por 12 horas à 8ºC com o
anticorpo primário anti-PCNA1:100 (marca AbCam, monoclonal de coelho
clone ab18197®) e anticorpo anti CD34 1:300 (marca Dako, monoclonal de
camundongo, clone QBEnd10®).
• Após a incubação do anticorpo primário as lâminas foram lavadas em três
banhos de PBS por 5 minutos cada banho, e a após isto foi incubado o
polímero Refine Polymer (Leica®) por 30 minutos.
• Posteriormente, foi realizada a revelação da ligação dos anticorpos primários
foram realizadas com DAB (tetra-hidrocloreto de 3,3’-diaminobenzidina) (DAB
substrate Kit, Leica), com posterior contra-coloração com o corante de
Hematoxilina.
• A seguir, os cortes foram desidratados em bateria crescente de etanol e
depois xilol, com isso as lâminas permanentes foram montadas com Entellan
(Merck®).
• Avaliação por histometria computadorizada
Apêndices
128
3. Resultados
TABELA 25 – RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES HISTOMÉTRICAS DAS MARCAÇÕES PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS
Grupos Identificação Lâmina 1 Lâmina 2 MF
Con
trole
(C)
13 SM 322,71 323,58 323,15 pescoço 460,59 461,84 461,22 dorso 334,36 335,27 334,82 cauda 300,60 301,41 301,01
14 SM 279,69 280,45 280,07 pescoço 349,54 350,48 350,01 dorso 576,71 574,18 575,45 cauda 448,50 446,54 447,52
Validação (p) 0,9980 --- 15 SM 574,63 572,11 573,37
pescoço 444,40 444,93 444,67 dorso 522,90 523,53 523,22 cauda 427,93 428,44 428,19
16 SM 571,66 574,86 573,26 pescoço 444,58 447,07 445,83 dorso 523,12 526,05 524,59 cauda 427,08 429,48 428,28
Validação (p) 0,9684 ---
Beva
cizu
mab
e (B
V)
17 SM 527,73 525,42 526,58 pescoço 430,85 428,97 429,91 dorso 323,99 322,57 323,28 cauda 462,43 460,40 461,42
18 SM 335,70 334,23 334,97 pescoço 301,79 300,47 301,13 dorso 280,81 279,58 280,20 cauda 350,93 349,40 350,17
Validação (p) 0,9702 --- 19 SM 321,16 322,96 158,45
pescoço 458,38 460,95 234,17 dorso 332,76 334,62 333,69 cauda 299,15 300,83 299,99
20 SM 278,35 279,91 279,13 pescoço 347,86 349,81 255,84 dorso 569,60 572,79 204,51 cauda 442,98 445,46 320,22
Validação (p) 0,9665 --- Legenda: L1= leitor 1, L2= Leitor 2, M= média das contagens entre leitores. MF= Média das contagens das três lâminas
Apêndices
129
TABELA 26 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS AVALIAÇÕES HISTOMÉTRICAS DAS MARCAÇÕES PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS
Avaliações C48 C15 BV48 BV15 Desvio Padrão (DP) 101,15 129,76 86,84 59,87 Limite Inferior (LI 95%) 454,25 488,71 436,13 302,24 Média (Mx) 384,15 398,79 375,95 260,75 Limite Superior (LS 95%) 314,06 308,87 315,78 219,26
Apêndices
130
APÊNDICE 12
Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático.
1. Antecedentes:
Para a avaliação de ocorrência de áreas fibróticas nas amostras de fígados dos ratos foi
empregada a coloração tricrômica de Gomori para diferenciar o colágeno em verde
azulado dos demais componentes tecidual em tonalidade vermelho a laranjada. As
lâminas eram identificadas com o número da caixa seguido da identificação do rato e da
lâmina: 13-SM-L1, 13-SM-L2, 13-SM-L3.
2. Método
2.1. Material
• Cromotrope 2R 0,6g
• Fast Green 0,3g
• Ácido acético 1ml
• Ácido fosfotúngstico 0,8g
• Água destilada q.s.p. 100ml
2.2. Técnica
• Desparafinar e hidratar;
• Corar em hematoxilina por tempo normal;
• Lavar em água;
• Solução de Gomori por uma hora;
• Lavar rapidamente em água de torneira
• Desidratar, clarear e montar.
3. Leituras
• As análises das lâminas foram feitas em microscópio ótico convencional com
objetivas de 10x e 40x, por avaliadores treinados, não sendo informados dos
critérios para as identificações das lâminas.
Apêndices
131
• Para as avaliações das áreas fibróticas foram procedidas avaliações em 10
campos aleatórios de cada uma das três lâminas coradas pelo método de
tricrômico de Gomori.
• O número de áreas fibróticas era anotado em protocolo de 0 (ausência) e o
número de áreas pesquisadas em 10 campos.
• Para a conclusão era considerado negativo para fibrose a ausência nas três
lâminas avaliadas e positivo para uma ou mais ocorrências em cada uma das
três lâminas.
4. Resultados
TABELA 27 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS AVALIAÇÕES DE ÁREAS FIBRÓTICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELO TRICRÔMICO DE GOMORI, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS
Avaliações C48 C15 BV48 BV15 Desvio Padrão (DP) 0 0 0 0,16 Limite Inferior (LI 95%) 0 0 0 0,29 Média (Mx) 0 0 0 0,43 Limite Superior (LS 95%) 0 0 0 0,57
Apêndices
132
TABELA 28 – RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES DE ÁREAS FIBRÓTICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELO TRICRÔMICO DE GOMORI, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS
Grupos Identificação L1 L2 L3 Conclusão
Con
trole
13
SM 0 0 0 N pescoço 0 0 0 N dorso 0 0 0 N cauda 0 0 0 N
14
SM 0 0 0 N pescoço 0 0 0 N dorso 0 0 0 N cauda 0 0 0 N
15
SM 0 0 0 N pescoço 0 0 0 N dorso 0 0 0 N cauda 0 0 0 N
16
SM 0 0 0 N pescoço 0 0 0 N dorso 0 0 0 N cauda 0 0 0 N
Beva
cizu
mab
e
17
SM 0 0 0 N pescoço 0 0 0 N dorso 0 0 0 N cauda 0 0 0 N
18
SM 0 0 0 N pescoço 0 0 0 N dorso 0 0 0 N cauda 0 0 0 N
19
SM 6 8 5 P pescoço 5 5 5 P dorso 2 4 3 P cauda 4 1 0 P
20
SM 6 5 7 P pescoço 5 4 5 P dorso 2 3 3 P cauda 4 5 6 P
Legenda: N: negativo para pesquisa de fibrose; P: positivo para fibrose
Apêndices
133
APÊNDICE 13
Avaliação histopatológica do parênquima hepático
1. Antecedentes:
Para a avaliação histopatológica do parênquima hepático de ratos submetidos à
hepatectomia parcial foi empregada a coloração de Hematoxilina e Eosina de Harris
para avaliar presença de edema, hemorragia, congestão, proliferação ductal (ROHDEN
et al., 2000). As lâminas eram identificadas com o número da caixa seguido da
identificação do rato e da lâmina: 13-SM-L1, 13-SM-L2, 13-SM-L3.
2. Método
2.1. Material
• Corante Hematoxilina de Harris
• Corante Eosina
• Soluções de álcool etílico a 70%, 80%, 90% e 100%.
2.2. Técnica
• Após a fixação em formol 4% tamponado por no mínimo 24 horas, as
amostras foram processadas por técnicas histológicas de rotina e coradas
pela HE.
• Armazenar em cápsulas histológicas e progressivamente desidratadas, em
banhos de uma hora em cada uma das quatro crescentes concentrações de
álcool etílico a 70%, 80%, 90% e 100%.
• Diafanizar através de dois banhos de uma hora de duração em xilol.
• Submeter a dois banhos de parafina a 58-60°C e incluir em formas de blocos.
• Cortar em micrótomo para a obter de cortes de 5 µm de espessura e montá-
los em lâminas previamente limpas, desengorduradas e banhadas em
solução fixadora de albumina.
• Remover a parafina seguida da hidratação dos cortes de tecido por 24 horas
em estufa a 56ºC e submeter a uma sequência de banhos em xilol por 10
Apêndices
134
minutos, álcool absoluto por 10 minutos, álcool 90% por cinco minutos, 80%
por cinco minutos, 70% por cinco minutos e água por cinco minutos.
• Corar em Hematoxilina de Harris por um minuto e meio, lavar em água
corrente por 30 minutos, corar em eosina por 30 segundos, lavar rapidamente
em água e desidratadas em série crescente de álcoois a 70%, 80%, 90% e
100%.
• Diafanizar as lâminas em xilol e montá-las com bálsamo sintético e lamínula.
2.3. Leituras
• As análises das lâminas foram executadas em triplicatas por avaliadores
independentes, em microscópio óptico Nikon (Eclipse E 200®) sob
magnificação de 10 e 40x.
3. Leituras
• As análises das lâminas foram feitas por dois avaliadores treinados, não
sendo informados dos critérios para as identificações das lâminas.
• Para as avaliações histopatológicas foram avaliadas as seguintes
características histológicas:
• Ausência de alterações.
• Edema, hemorragia, congestão, proliferação ductal e inflamação.
• Para a obtenção dos resultados os valores individuais das três leituras
para cada critério foram avaliados.
4. Resultados
TABELA 29 – DEMONSTRATIVO DAS PORCENTAGENS DAS AVALIAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA & EOSINA DE HARRIS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS
• Grupos C48 C15 BV48 BV15 Achados E C PD E C PD E C PD E C PD Porcentagens 37,5 25 12,5 0 12,5 37,5 62,5 100 12,5 87,5 100 37,5
• Legenda:
E: edema / C: congestão / PD: proliferação ductal
Apêndices
135
TABELA 30 – RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA & EOSINA DE HARRIS
Ratos Edema Congestão Proliferação ductal L1 L2 L3 C T L1 L2 L3 C T L1 L2 L3 C T
Con
trole
(C)
SM + - - P
3
- + + N
2
- - - N
1
pescoço - - - N + + + P - - - N dorso - - - N - - - N - - - N cauda - + + P - - - N - - - N SM - - - N - - - N - - P pescoço - - - N - - - N - - - N dorso - - - N - + + P - - - N cauda + - + P - - - N - - - N
0
0
pescoço - - - N - - + P - + - P dorso - - - N - - - N - - N cauda - - - N - - - N - + + P SM - - - N - - - N - - - P pescoço - - - N - - - N - - - N dorso - - - N - - - N - - + N cauda - - - N - - - N - - - N
Beva
cizu
mab
e (B
V)
SM - - - N
5
+ + + P
8
- - - N
1
pescoço - - - N + + + P - - - N dorso + + + P + + + P - - - N cauda + + + P + + + P - - - N SM + - - N + + + P + - + P pescoço + + + P + + + P - - - N dorso + + + P + + + P - - - N cauda + + + P + + + P - - - P SM - - - N
7
+ + + P
8
- - - N
3
pescoço + + + P + + + P - - - N dorso - + + P + + + P + + + P cauda + + + P + + + P - - - N SM - + + P + + + P - - - N pescoço + - + P + + + P - - - N dorso + + + P + + + P + - + P cauda + + + P + + + P - + + P
Legenda:
N: negativo, P: positivo, T: totais, L1= leitor 1, L2= Leitor 2, L3= Leitor 3 C= Conclusão., T=
totais de positividades para fibrose hepática.