UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de Pós-Graduação em Fármaco e Medicamentos
Área de Produção e Controle Farmacêuticos
Desenvolvimento de Métodos para Análise do Besilato de Anlodipino
para inclusão da Monografia na Farmacopéia Brasileira
Helen Dutra Leite
Dissertação para obtenção de Grau de
MESTRE
Orientadora:
Prof1. Titular Érika Rosa Maria Kedor-Hackmann
São Paulo
2009
DEDALUS - Acervo - CQ
11111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111
30100015115
Ficha Catalográfica Elaborada peJa Divisão de Biblioteca e
Documentação do Conjunto das Químicas da USP.
Leite, Helen Dutra L533d Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de
anlodipino para inclusão da monografia na farmacopéia brasileira / Helen Dutra Leite. -- São Paulo, 2009.
103p.
Dissertação (mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas de São Paulo. Departamento de Farmácia.
Orientador: Kedor-Hackmann, Érika Rosa Maria
1. Fármaco: Controle de qualidade 2. Cromatografia em líquido de alta eficiência: Análise química: Farmacologia 3. Espectrofotometria no visível: Análise de drogas I. T. 11. Kedor-Hackmann, Érika Rosa Maria, orientador.
615.19015 CDD
Helen Dutra Leite
Desenvolvimento de Métodos para Análise do Besilato de Anlodipino para Inclusão
da Monografia na Farmacopéia Brasileira
Comissão julgadora
da
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre
Profl. Titular Érika Rosa Maria Kedor-Hackmann
Orientador/Presidente
1 ° Examinador
2° Examinador
São Paulo
Março 2009
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AGRADECIMENTOS
A minha maravilhosa família que tanto me apo~ou e
soube entender minha ausência durante
todo esse tempo. marido (Carlos),
Mãe (Maria da Penha Dutra)
Irmã (Luciene),Sérgio (cunhado),
sobrinhos (Sérgio e Luana)
e cachorrinhos Meg e Bidu.
À minha querida orientadora Profa. Érika Rosa
Maria Kedor-Hackmann pelos ensinamentos,
apo~o, paciência e dedicação
dispensados que tornou possível
a realização deste sonho.
AGRADECIMENTOS
Ao programa de Pós-Graduação de F ármaco e Medicamentos
do Departamento de Farmácia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Universidade de São Paulo.
À Profa. Ora. Maria Inês Rocha Miritello Santoro, pelos
ensinamentos, oportunidade de aprendizado e sugestões, muito
importantes para realização deste trabalho.
Aos Professores Maria Aurora Prado, Anil Kumar Singh, Jorge
Luis Seferin, pelo apoio.
A pesquisadora pós Doutora Fernanda Calheta Vieira Portaro e
a professora pós doutora Silvia Helena Pires Serrano pela grande
contribuição na banca de qualificação.
A banca examinadora: profl. Doutora Eliane Maria de Almeida
Orsine e a profa . Doutora Magali Benjamim de Araújo.
Aos queridos alunos do Laboratório de Controle Físico-Químico
da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São
Paulo: Angel, Carla, Cibele, Daniela, Fábio, Helena, Ivani, Joyce,
Mariana, Ricardo, Pedro, Renata, Ricardo e Vanessa.
Aos funcionários Regina Rojas, Iria da Silva, Elizabete Paiva,
Elaine Ychico, Jorge Lima, Raquel, Leila Bonadio, Adriana e Angelo.
Ao laboratório Medley® pelo fornecimento de matéria-prima e
amostras de anlodipino besilato
Enfim, a todos que contribuíram para realização deste trabalho.
Muito Obrigada!!!!
RESUMO
o objetivo desta pesquisa foi desenvolver e validar métodos analíticos para o
fármaco besilato de anlodipino (ABC) em comprimidos. O método
espectrofotométrico no ultra violeta e o método por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) desenvolvidos foram considerados simples, exatos e precisos.
Foram analisadas amostras contendo 5 mg,1 O mg e uma amostra formulada de 5mg
de ABC/comprimido. Para o método espectrofotométrico, a primeira diluição das
amostras foi feita em metanol e as subseqüentes em água. A leitura foi efetuada a
364,4 nm. A linearidade para ABC foi estabelecida na faixa de 41,0-61,0 mg/mL e o
coeficiente de correlação foi R= 0,9996. O limite de detecção e o de quantificação
foram respectivamente 0,54 e 1,8 mcg/mL. A exatidão e a precisão foram 98,99% e
0,37%, respectivamente. Nas análises por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE), foram utilizadas as seguintes condições: coluna LiChrospher ® 100 RP-18
Merck ® (250 mm x 4,6 mm, 5IJm), fase móvel constituída por metanol: água: (35:65)
com 1 % de TEA e pH ajustado para 5.0 com ácido fosfórico; fluxo de 1,0 mUmin;
detecção UV a 238 nm e temperatura de 22 ±1°C.Tempo de retenção (RT) ABC foi
de 3,7 mino Foi obtida linearidade no intervalo de 50 a 350 mcg/mL e coeficiente de
correlação = 0,9999. O limite de detecção e o de quantificação foram
respectivamente de 2,26 mcg/mL e 7,52 mcg/mL. A exatidão foi de 100,18% e a
precisão foi de 0,37% para a CLAE. Ambos os métodos podem ser usados na rotina
de análise para o controle de qualidade de comprimidos contendo ABC.
Palavras-chave: Validação. Besilato de anlodipino. CLAE. Espectrometria.
ABSTRACT
The objective of this research was to develop and validate analytical methods for the
amlodipine besylate (ABC) determination in tablets. Simple, accurate and precise
spectrophotometric and HPLC methods were validate for ABC determination in
samples containing 5.0 and 10.0 mg of ABC / tablet. For the spectrophotometric
method, the first dilutions of samples were made in methanol and the consecutive in
distilled water. Determination was made at 364.4 nm. Linearity was in the range of
41.0-61.0 IJg/mL and r= 0.9996. The detection and quantitation limits were
respectively, 0.54 IJg/mL and 1.80 IJg/mL. Accuracy and precision were respectively,
98.99% and 0.37%. For HPLC analysis, the following conditions were used: a
LiChrospher ®1 00 RP-18 Merck® (250 mm x 4,6 mm, 5!-!m) column; methanol: water
with 1 % of triethylamine adjusted to pH 5.0 with phosphoric acid (35:65), as mobile
phase; a flow rate of 1.0 mL /min; UV detection at 238 nm and temperature of 22
±1 °C . Retention time was 3.7 mino Linearity was in the range of 50.0 - 350.0 IJg/mL
and r = 0.9999. The detection and quantitation limits were respectively, 2.26 IJg/mL
and 7.52 IJg/mL. Accuracy and precision were respectively, 100.18% and 0.37%.
Both methods can be used in routine analysis for quality control of tablets containing
ABC.
Key-words: Validation. Amlodipine besilate. HPLC. Spectrophotometric.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura da molécula do besilato de anlodipino ........ ....... ........ ... .... .... .. .. . 27
Figura 2. Espectro de absorção da solução do placebo em MeOH/H20 5:95, na
primeira diluição e na segunda diluição somente água ... ...... ..... .. ...... .... ........... ....... 61
Figura 3. Espectro de absorção da solução padrão na concentração de 49mcg/mL
em MeOH/H20 5:95, na primeira diluição e na segunda diluição somente água ..... 62
Figura 4. Cromatograma da amostra de solução do padrão do besilato de
anlodipino. Condições cromatográficas: fase móvel metanol e água (35:65v/v), À
210 nm, Coluna C18 Synergi hydro RP, Phenomenex®, 250 x 4,6 mm, fluxo
1 mLlmin concentração 24 mcg/mL ......... ... ............. ... ....... ............. ..... ... .. ... .. ..... ..... . 63
Figura 5. Cromatograma de uma solução do padrão do besilato de anlodipino de
concentração 24 mcg/mL.Condições cromatográficas:fase móvel metanol e água
(35:65v/v), À 238 nm Coluna LiChrospher ® 100RP-18 (5jJm) Merck®;fluxo
1mLlmin e tempo de retenção 3,7min ... .. .. ........ ............. ........ ......... ........................ 65
Figura 6. Curva analítica para a determinação de besilato de anlodipino, nas
concentrações de 41 mcg/mL, 45 mcg/mL, 49 mcg/mL, 53 mcg/mL, 57 mcg/mL,
61 mcg/mL em metanol:água destilada (5:45v/v). Equação da reta
a=O,0118x+O,005 R2=O,9995 ..... ........ ................ ......................... .. ............ ....... ...... ... 67
Figura 7. Espectro de absorção das soluções padrão nas concentrações de 41
mcg/mL, 45 mcg/mL, 49 mcg/mL, 53 mcg/mL, 57 mcg/mL, 61 mcg/mL das
soluções padrão de besilato de anlodipino em metanol e H20 (5:45v/v) .......... ... ... 68
Figura 8. Espectro de absorção das soluções (padrão+amostra) nas
concentrações de 22,5 mcg/mL, 22,5 mcg/mL, 45 mcg/mL, 49 mcg/mL e 53
mcg/mL da solução padrão de besilato de anlodipino em metanol 5:95 MeOH/H20,
na primeira diluição e na segunda somente água .. .... ... .. ... ............ ........... ........ ....... 70
Figura 9. Espectro de absorção das soluções da amostra de comprimido de
besilato de anlodipino 5 mg nas concentrações de 49 mcg/mL em metanol 5:95
MeOH/H20, na primeira diluição e na segunda somente água ........ .. ... ......... ..... ..... 73
Figura 10. Espectro de absorção das soluções da amostra de comprimido de
besilato de anlodipino 5 mg nas concentrações de 49 mcg/mL em metanol 5:95
MeOH/H20, na primeira diluição e na segunda somente água .. ...... ... ....... .... ..... ..... 77
Figura 11. Gráfico da linearidade das concentrações de 50 mcg/mL, 100 mcg/mL,
150 mcg/mL, 200 mcg/mL, 250 mcg/mL, 300 mcg/mL, e 350 mcg/mL, da solução
padrão de besilato de anlodipino sendo utilizados 5mL de metanol para a diluição
e o restante de fase móvel ............................................ ............................. .............. 78
Figura 12. Cromatogramas desenvolvidos em coluna LiChrospher® 100RP-18
(5IJm) Merck®.Amostras de 0,5 mcg/mL de besilato de anlodipino em H20 (a), em
H20 2 (b), em NaOH (c) e em HCI (d) todos com a segunda diluição com fase
móvel (35:65 MeOH/H20 TEA 1 %. acidificada com ácido fosfórico para um pH
5,0), concentração final 22 mcg/mL e comprimento de onda de 238nm .................. 78
Figura 13. Cromatogramas desenvolvidos em coluna LiChrospher® 100RP-18 (5IJm)
Merck®. Amostras de 0,5 mg/mL de besilato de anlodipino em H20(a), em H20 2 (b),
em NaOH (c) e em HCI (d) todos com a segunda diluição com fase móvel (35:65
MeOH/H20 TEA 1 % acidificada com ácido fosfórico para um pH 5,0), concentração
final 22 mcg/mL e comprimento de onda de 238nm .................... ... ...................... ..... 88
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Parâmetros de conformidade do sistema e recomendações .......... ....... ... 31
Tabela 2. Resultados experimentais, da solução padrão besilato de anlodipino,
utilizados na curva analítica pelo método espectrofotométrico ............ .......... .......... 67
Tabela 3. Análise estatística dos resultados obtidos na determinação da curva
analítica de besilato de anlodipino. Leituras efetuadas em comprimento de onda
364,4nm. Intervalo de concentração 41-61mcg/mL .. ............ ........... .... ... ............ .. ... 68
Tabela 4. Resultados experimentais obtidos na recuperação, de solução padrão
de besilato de anlodipino adicionada as soluções amostra de besilato de
anlodipino 5 mg (A), 10 mg (8), e formulado 5 mg (C) empregando o método
espectrofotométrico ................................................ ...... ......................... ... ......... .... ... 71
Tabela 5. Resultados experimentais, das soluções da amostra de besilato de
anlodipino, utilizados para precisão do método espectrofotométrico em metanol
5:95 MeOH/H20, na primeira diluição e na segunda diluição somente água para a
amostra de 5 mg (A) .... .. .. ... ....... .... ...... ... ................... .. ... ................................... ..... .. 72
Tabela 6. Resultados experimentais, das soluções das amostras de besilato de
anlodipino, utilizados para precisão do método espectrofotométrico em metanol
5:95 MeOH/H20, na primeira diluição e na segunda diluição somente água para a
amostra de 10 mg (8) .... ....... .. ....... ... ..... ... ... ................. ... ... ...... ......... ....... ...... ....... ... 73
Tabela 7. Resultados experimentais, das soluções das amostras de besilato de
anlodipino, utilizados para precisão do método espectrofotométrico em metanol
5:95 MeOH/H20, na primeira diluição e na segunda diluição somente água para a
amostra de 5 mg (C) formulado ........ ......... ... .. .. ...... ...... ....... ... ....... ... .............. ........ .. 74
Tabela 8. Resultados obtidos na determinação do teor de besilato anlodipino nas
amostras 5 mg (A), 10 mg (8) e formulado 5 mg (C), intra-dia e inter-dia
empregando o método espectrofotométrico ... ...... ... ... .... ... ....... ........ .. .. ....... ... .. ........ 74
Tabela 9. Resultados experimentais, das soluções da amostra de besilato de
anlodipino, em metanol 5:95 MeOH/H20, na primeira diluição e na segunda
diluição somente água, utilizados para robustez do método espectrofotométrico .... 76
Tabela 10. Análise estatística dos resultados obtidos na determinação da curva
analítica pelo método cromatográfico de besilato de anlodipino. Leituras efetuadas
em comprimento de onda 238nnm. Intervalo de concentração 50-350 mcg/mL ..... 79
Tabela 11. Resultados experimentais, da solução padrão besilato de anlodipino,
utilizados na curva analítica pelo método cromatográfico ...... ...... .......... .. .............. .. 79
Tabela 12. Resultados experimentais obtidos na recuperação, de solução padrão
de besilato de anlodipino adicionada as soluções amostra de besilato de
anlodipino, 5 mg (A), 10 mg (B), e formulado 5 mg (C) empregando o método
cromatográfico ................................. .... ........................... ..... .......................... ........... 82
Tabela 13. Resultados experimentais, das soluções da amostra de 5 mg (A) de
besilato de anlodipino, utilizadas para precisão do método cromatográfico em
metanol 5:95 MeOH/H20, na primeira diluição fase móvel (35:65 MeOH/H20,
tampão TEA a 1 % acidificada com ácido fosfórico pH 5,0) ...................................... 83
Tabela 14. Resultados experimentais, das soluções da amostra de 10 mg (B) de
besilato de anlodipino, utilizadas para precisão do método cromatográfico em
metanol 5:95 MeOH/H20, na primeira diluição fase móvel (35:65 MeOH/ H20,
tampão TEA a 1 % acidificada com ácido fosfórico pH 5,0) ... .. .... ............................. 84
Tabela 15. Resultados experimentais, das soluções da amostra de 5 mg (C)
formulado de besilato de anlodipino, utilizadas para precisão do método
cromatográfico em metanol 5:95 MeOH/H20, na primeira diluição fase móvel
(35:65 MeOH/H20, tampão TEA a 1% acidificada com ácido fosfórico pH 5,0) ..... . 84
Tabela 16. Resultados obtidos na determinação do teor de besilato de anlodipino
nas amostras 5 mg (A), 10 mg (B) e formulado 5 mg (C), intra-dia e inter-dia
empregando o método cromatográfico .......... ........................................................... 85
Tabela 17. Resultados experimentais, das soluções da amostra de besilato de
anlodipino, em metanol 5:95 MeOH/H20. Volume injetado de 10mcL . .. .. ............... 86
98····················· ··l::>w9 ap opelafu! awnlo/\ ·ozH/Hoall\l 96:9 louelaw wa 'ou!d!pOIUe
ap Olel!saq ap eJlSOWe ep saQ5nlos sep 'S!elUawpadxa sopellnsaCj ·8 ~ elaqel.
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Parâmetros de validação da ANVISA e do INMETRO . ...... .. ...... ............. 32
Quadro 2. Parâmetros avaliados na robustez .......... ... .. .. .. ..... .... ......... ... .. ................ .40
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
ACN Acetonitrila
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CE Capilary Electrophoresis
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
°C Grau Celsius
EPA Environmental Protection Agency
FDA Food and Drug Administration
9 Grama
HPLC High Performance Liquid Chromatography
ISO/IEC International Standardization Organization / international
Electrotechnical Commission
LO
LQ
MeOH
MEKC
mL
pH
SD
Limite de Detecção
Limite de Quantificação
Metanol
micellar electrokinetic chromatography
Mililitro
Logarítmo negativo da atividade do íon hidrogênio
"Standard Deviation" (Desvio Padrão)
SOJl!IOJ~!V\1 lrl
EpUO 8p OlU8W!Jdwo:) y
18J\!S!/\ SI/\
El810!J\EJlln /\n
E!80do::>EWJE4d S8lElS p8l!Un dSn
EU!WEI!l8Pl. V31.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................. 21
1.1 Objetivo geral ...................... ........... .... .. ... ................ .. .................. ...... .. .. ........ 23
1.1.1 Objetivos específicos ................................................................................ 23
2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................... 24
2.1 PROPRIEDADES FARMACOLÓGiCAS ...... ................ ... .. ... ...... .. ............ .... . 24
2.1.1 Mecanismo de ação ........................ ... ............................. .. ....... ... ............ .. . 24
2.1.2 Absorção destino e excreção ...... ........ .. .... ......... ... ............ ................... .. ... 25
2.1.3 Farmacocinética .......................... .. ..... ...... ........................................... .... . 26
2.1.4 Toxicidade e respostas indesejadas ................................... .. .. .... .............. 26
2.2 CARACTERíSTICAS DO FÁRMACO ................................... ~ ...................... 26
2.3 FORMAS FARMACÊUTICAS COMERCIALIZADAS ... ..... ....... .............. .. ... . 28
2.4 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALíTICOS .... .... ......................................... 29
2.4.1 Especificidade .......... .... .............. ..... ...... .................................. .................. 33
2.4.2 Linearidade ........ .... .... .... ..... .. .......... ................... .............. ..................... ... . 34
2.4.3 Intervalo ................ ........................................ ...... ..................................... 36
2.4.5 Limite de detecção (Sensibilidade) ........... .... .. ........................................ . 36
2.4.6 Limite de quantificação ... .... ...... .................... ... ......... .. .... .... .... .......... ....... 37
2.4.7 Exatidão ........................ .. ........... ... ........... ........................... ............... .... ... 37
2.4.8 Precisão .................................................................................................... 38
2.4.9 Robustez ......................................................................... .. .. ...... ............... 39
2.5 MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO BESILATO
DE ANLODIPINO ... .. .... ... ... .. .... ... .. .................... .... ..... ...... ... .. .. .. ......... ... ...... 40
2.5.1 Cromatografia líquida de alta eficiência ............ .... ................. .... ... ... ... ..... .40
2.5.1.1 Composição do cromatógrafo .......... ...... ... .. .... ...... .. .............. .. ........... .... .41
2.5.1.2 Medições fundamentais .......... ..... ........ ..... ................ .......... .... ...... .... ... . .43
2.5.1 .3 Fases estacionárias e principais mecanismos de separação ...... .. ... .... .44
2.5.1.4 Seletividade da fase móvel ................................................................... .44
2.5.1.5 Método da Farmacopéia Britânica ...... .......... ....... .... ............. ................ .45
2.5.1.6 Métodos por cromatografia líquida de alta eficiência .. ....... .... .... ... ..... ... .45
2.5.2 Espectrometria de massa .... ................ ....... ......................................... .... .47
2.5.2.1 Método por espectrometria de massa ...... ............................................. .48
2.5.3 Eletroforese .............................................................................................. .49
2.5.3.1 Método por eletrocinética micelar .................... ...... .. .. ... .... .................... . 50
2.5.4 Espectrofotometria ... ... ...... .. ............ .. ........ ..... ... .. ..... .. ... ........... .. .......... ..... 51
2.5.5 Método por Espectrofotometria ... .......... .... .... ..... .. .. ....... ................ ... .. .... ... 52
2.5.6 Outros métodos de quantificação e identificação ............................ ... ... .... 53
3 JUSTIFICATIVA ...... .. ........ ....... ...................... ....................... .... ...... . 55
4 MATERIAL E MÉTODOS ...... ... ........... .. ................. .......................... 56
4.1 Material .......................... ................. .... ............... ..... ......... ..... .......... .... .. ......... 56
4.1.1 Solventes e reagentes .................. ........... ......... ........ ........ .. .... ..................... 56
4.1.2 Substância química de referência ............... ..... .... ........ .... ...... .. ...... ............. 57
4.1 .3 Amostras .. ...... ... ........... ............. ................................. ... .. ......... ..... ...... ...... .. 57
4.1.4 Equipamentos e acessórios ... .. ........ ... .............. ... .................. ..................... 58
4.2 MÉTODOS ANALíTiCOS ..... .. ... .......... ... ....... ... ........... .............. .................... . 60
4.2.1 Espectrofotometria com detector visível ... ....... ...... ... .... ................. .. ... ......... 60
4.2.2 Ensaios realizados no cromatógrafo CG .... .. ......... .... .... ... ........ ................... 62
4.2.3 Ensaios realizados no cromatógrafo Shimadzu .. .. .... .. .............. ......... ........ 63
4.2.3.1 Ensaios realizados com a coluna Lichrospher® 100rp-18 (5IJM)
Merck®; fluxo 1mUmin concentração 200 mcg/mL. ......... ..... ................... 64
5 RESULTADOS ................................................................................. 66
5.1 RESULTADOS OBTIDOS POR ESPECTROFOTOMETRIA ........................ 66
5.1.1 Identificação ............ ................................................................................... 66
5.1.2 Linearidade ................................................................................................ 66
5.1.3 Limite de detecção e limite de quantificação .............. ................................ 66
5.1.4 Exatidão ............................................................................. ....... ... ............. . 69
5.1.5 Precisão ............................................. ........... ............................................. 72
5.1.6 Robustez ................. ............ ........... ............................................................ 75
5.2 CROMATOGRAFIA LíQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) ..................... 77
5.2.1 Linearidade ................ ................................................................................ 77
5.2.2 Limite de detecção e limite de quantificação .............................................. 80
5.2.3 Exatidão .................. ........ ..................................................... .... .................. 80
5.2.4 Precisão ..................................................................................................... 83
5.2.5 Robustez ........ ........................ .................. .. ................................................ 85
5.2.6 Teste de estresse .................... .... ... ............................................................ 86
6 DiSCUSSÃO .................................................................................... 89
6.1 Identificação ....................................... ................. .......................................... 91
6.2 Doseamento ........ .................................................................... ...................... 91
6.3 Metodologia analítica .................................................................................... 92
6.3.1 Curva analítica ...... ..................... ...................... .......................................... 92
6.3.1.2 Determinação do teor de besilato de anlodipino nas amostras manipuladas
e industrializadas ....................................................... ................................ 93
6.3.1.3Teste de recuperação ... ............... .................................... ........................ 93
6.3.1.4Limite de detecção e quantificação ......... .... ............ .......... ..... ....... ....... ... . 94
6.3.1.5Robustez ...................................... ............................................................ 94
6.3.2 Método cromatográfico ............. .. ... ... .... ................ .............. ....................... 95
6.3.2.1 Construção da curva analítica ...... .................. .. ........ ......... ......... ....... ... .... 96
6.3.2.2 Determinação do teor nas amostras manipuladas e industrializadas .. ... 96
6.3.2.3Teste de recuperação ......... ............ .............. ... ..... .............. ........... ..... ..... 96
6.3.2.4Limite de detecção e quantificação ................ ................... ....................... 97
6.3 2.5 Robustez ..... ... ........... ... .... .......... ....... ... .. .. .. .. ... ....... ..... .. .. .... .... ............. ... 97
7 -CONCLUSÃO .................................................................................. 98
REFERÊNCiAS ................................................................................... 99
ANEXOS .......................................................................... ~ ................ 103
2]
1 INTRODUÇÃO
o crescente surgimento de novos fármacos, sejam eles sintéticos ou não,
traz a necessidade do desenvolvimento de novos métodos analíticos, uma vez que a
análise dessas substâncias precisa ser confiável e reprodutível. Alguns desses
métodos já estão descritos em farmacopéias, seja a brasileira ou internacionais.
Porém como boa parte dos fármacos ainda não consta nesses compêndios oficiais,
a validação torna-se cada vez mais freqüente e necessária.
A importância da validação em análise química tornou-se mais acentuada a
partir da constatação, na década de setenta, da enorme variabilidade de resultados
obtidos em análise toxicológica de amostras submetidas a estudos interlaboratoriais
por órgãos do governo americano (CHASIN, 1994). A partir de iniciativas de
instituições do governo americano, como o Food and Drug Administration (FDA) e a
Enviromental Protection Agency (EPA), e a partir de resultados de estudos para
assegurar a integridade dos dados laboratoriais, criou-se o sistema denominado
ISO/IEC-25 (do inglês International Standardization Organization Ilnternational
Electrotechnical Commission) (ISO, 1990), cujo objetivo principal é a padronização
dos resultados dos laboratórios, para que o resultado possa ser reproduzido em
outros laboratórios e ser internacionalmente aceito.
O Brasil, país que tem como órgão regulador a ANVISA (AGÊNCIA
NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2003), possui uma legislação específica
para validação de métodos analíticos, RE 899 de 29 de maio de 2003, a qual coloca
como objetivo para validação de métodos analíticos a demonstração de que o
método é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinação
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
22
qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias em
produtos farmacêuticos .
Como a exigência de mercado por produtos de qualidade está cada vez mais
ostensiva, aumentou a necessidade da inserção de métodos analíticos na
Farmacopéia Brasileira, código oficial farmacêutico do país, cuja função é
estabelecer requisitos de qualidade a que os medicamentos devem obrigatoriamente
obedecer. Esses requisitos incluem todas as substâncias empregadas na fabricação
dos medicamentos.
Como o besilato de anlodipino é um dos próximos medicamentos a ser
incluído na Farmacopéia Brasileira, este trabalho será de grande valia para a
comissão do referido código.
o medicamento em estudo é um anti-hipertensivo classificado no grupo dos
bloqueadores seletivos do canal de cálcio.
Os métodos de análise hoje existentes são muitos, como espectrofotometria
uv-vis, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), eletroforese capilar (CE),
infravermelho, porém são objetos de estudo dessa dissertação somente os dois
primeiros, pois grande maioria dos laboratórios possuem os equipamentos
necessários para a aplicação dos mesmos e como o objetivo é disponibilizar
métodos Farmacopéicos acessíveis, somente os dois primeiros serão
disponibilizados. Para tal serão analisados os parâmetros de validação exatidão,
linearidade, robustez, precisão, limite de quantificação e limite de detecção.
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1.1 OBJETIVO GERAL
o objetivo desta pesquisa foi desenvolver e validar métodos analíticos para a
quantificação do medicamento besilato de anlodipino, de modo a inseri-lo, sob a
forma de monografia de matéria-prima e de produto acabado, na Farmacopéia
Brasileira, já que, a necessidade de produtos de qualidade é cada vez maior, tanto
na fabricação de fórmulas magistrais como de medicamentos industrializados.
1.1.1 Objetivos específicos
• Desenvolver e validar método por espectrofotometria de absorção no
VisíVEL.
• Desenvolver e validar método por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) para produto formulado no laboratório da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da Universidade de São Paulo e em produto acabado do laboratório
Medley®.
• Executar os testes de estresse em meio ácido básico, ácido e com peróxido.
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2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS
2.1.1 Mecanismo de ação
Os bloqueadores de canal de cálcio, grupo ao qual pertence o fármaco
besilato de anlodipino, são assim chamados porque agem primariamente, embora
não exclusivamente, inibindo o fluxo de cálcio extracelular para o interior das células
através de canais lentos das membranas celulares ( KLlNKENBERG, R.; STREEL.;
B.; CECCATO, A,2003). Do bloqueio do canal de cálcio resultam redução na
concentração do mesmo dentro da célula e dilatação das artérias e arteríolas
periféricas e vasos cerebrais. Os bloqueadores seletivos do canal de cálcio se
dividem em dois grupos dihidropiridínicos e diversos.
Dihidropiridínicos: são assim chamados, por terem, na sua estrutura, um anel
diidropiridínico substituído ligado a um anel fenila contendo um ou dois átomos ou
grupos.
O anlodipino é um dihidropiridínico com absorção lenta e efeito prolongado,
com uma meia-vida plasmática de 35 a 50 horas .Produz vasodilatação arterial
periférica e dilatação coronariana (GILMAN,;et ai, 1996).
Os dihidropiridínicos são diésteres do ácido 3,5 piridinodicarboxílico. Esses
fármacos são seletivos para a musculatura lisa vascular comparada com o miocárdio
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e, atuam, portanto, primariamente como vasodilatadores. A redução da resistência
vascular periférica total é resultado da vasodilatação. São seletivos para a
musculatura lisa vascular comparada com o miocárdio atuando primariamente como
vasodilatadores. A vasodilatação promove a diminuição da resistência vascular
periférica. Possuem efeito anginoso ocasionado pela dilatação dos vasos periféricos,
que reduzem a pressão sistêmica (KOROLKOVAS, 2005; ZANINI, 1995).
o principal uso dos medicamentos bloqueadores dos canais de cálcio é o
controle da angina pectoris e da hipertensão (MARTINDALE, 2002). Em alguns
casos são empregados em arritmias cardíacas.
2.1.2 Absorção, destino e excreção
Durante a administração oral repetida a meia vida e a biodisponibilidade
aumentam devido à saturação do metabolismo hepático. Os metabólitos são
fracamente ativos ou inativos. Nos pacientes com cirrose hepática, a
biodisponibilidade e a meia-vida dos dihidropiridínicos estão aumentadas e as
dosagens devem ser reduzidas de acordo. As meias vidas apresentam-se maiores
em pacientes idosos (GILMAN, et ai, 1996).
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2.1.3 Farmacocinética
Administrado por via oral, ou intravenosa, atinge concentração plasmática
máxima em 5,6 a 6,4 horas. Sofre biotransformação intensa, apresentando como
metabólitos, principalmente derivados piridínicos, com atividade mínima.É excretado
pela urina, principalmente na forma de metabólitos (KOROLKOVAS, 2005).
2.1.4 Toxicidade e respostas indesejadas
Os efeitos colaterais mais comuns são ocasionados pela vasodilatação
excessiva. Tais efeitos expressam-se como tonturas, hipotensão, cefaléia, rubor,
náuseas, constipação, tosse, edema periférico e pulmonar e sibilo (é um ruído
característico da asma brônquica) (GILMAN,;et ai, 1996).
2.2 CARACTERíSTICAS DO FÁRMACO
Algumas características do fármaco de nome químico 5-metil-3-etil- 2-(2-
aminoetóximetil)-4-(2-clorofenil)-1.,4dihidro-6-metil-3,5-piridinacarboxilato
benzenosulfonato são: fórmula molecular: C2oH25CIN205 C6H60 3S (NIAZI, 2004),
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massa molar: 567,1 g/mol (NIAZI, 2004), nome oficial: anlodipino besilato (PEREIRA,
2003; SWISS PHARMACEUTICAL SOCIETY, 2000; REMINGTON, 2000).
• O produto Referência comercializado por laboratório Pfizer® é o Norvasc®
(DEF,2004).
• O nome da substância segundo a Denominação Comum Brasileira (DCB) é
besilato de anlodipino e sua solubilidade está descrita como levemente solúvel em
água e álcool isopropílico, pouco solúvel em álcool dihidratado e facilmente solúvel
em álcool metílico (BRITISH, 2005; NIAZI, 2004; SUSAN, 2001).
• Está descrito como pó branco a quase branco (BRITISH, 2005; NIAZI, 2004).
• O besilato de anlodipino, matéria-prima, está descrito na British
Pharmacopoeia, 5a Ed.2005 (BRITISH, 2005).
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O ~ "-- " IH" C/ ......... /~~O C~ 3, " ~/ ;3,
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Figura 1- Estrutura química do besi/ato de anlodipino
* carbono quirálico
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2.3 FORMAS FARMACÊUTICAS COMERCIALIZADAS
O fármaco é comercializado na forma racêmica, assim como a maioria dos
fármacos quirais obtidos por vias sintéticas, seja por razões econômicas ou
dificuldades de ordem prática nos processos de produção. O racemato é uma
mistura contendo quantidades iguais dos dois enantiômeros (BONATO; JABOR E
GAITANI, 2005). Enantiômeros são isômeros que se apresentam estruturalmente
como imagens refletidas no espelho. Apresentam propriedades químicas idênticas,
diferindo na interação com reagentes opticamente ativos e, em especial na
medicina, com algumas enzimas e membranas, assim como com alguns receptores
biológicos. A uma mistura de partes iguais de enantiômeros dá-se o nome de
racemato e a conversão de um enantiômero a um racemato chama-se racemização
(THOMPSON; JUDITH, 2006). As substâncias compostas por dois isômeros a partir
do denominado centro quiral, sendo um dextrógiro e o outro levógiro. Podem
apresentar atividade biológica diferente (BERMUDEZ; BAR RAGAT , 1996).
LUKSA e colaboradores isolaram os dois enantiômeros de anlodipino
utilizando uma coluna preparativa quiral chiral GGP e obtiveram sais de
benzenosulfonato de anlodipino isentos de racemização. Os enantiômeros puros
foram analisados em relação à sua pureza e atividade óptica por CLAE e
eletroforese capilar (LUKSA, et al,1997).
Atualmente, a tendência a produzir alterações nas misturas racêmicas vem
crescendo em importância. Um exemplo é a comercialização do analgésico
ibuprofeno, sob várias marcas e por várias empresas como mistura racêmica.
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o desenvolvimento do (S)-( + )-enantiômero o transformou em produto a ser
comercializado como medicamento de venda livre ("over-the-counter" ou OTC)
(BERMUDEZ; 1996).
É apresentado para a via oral sob as seguintes formas farmacêuticas:
cápsulas e comprimidos de 2,5 mg, 5 mg e 10 mg. E ainda pode estar associado a
outros fármacos como atenolol, atorvastatina, valsartan, losartan e enalapril.
o besilato de anlodipino está disponível em 88 países e sobre ele já foram
feitos mais de 700 estudos médicos. No Brasil, é comercializado por mais de 30
laboratórios como genérico, similar ou de referência, portanto a importância desse
trabalho.
2.4 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALíTICOS
Validação significa provar e documentar resultados que indiquem que o
método é confiável, dentro dos limites estabelecidos, conseguindo-se com sua
aplicação os resultados desejados (GIL, 2007).
O objetivo de uma validação é demonstrar que o método é apropriado para a
finalidade pretendida, ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou
quantitativa de fármacos e outras substâncias em produtos farmacêuticos. A
validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda
às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos
resultados. Para tanto, deve apresentar precisão, exatidão, linearidade, limite de
detecção e limite de quantificação, especificidade, reprodutibilidade, estabilidade e
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recuperação adequadas à análise. Desse modo, é importante ressaltar que todos os .
equipamentos e materiais devem apresentar-se devidamente calibrados e os
analistas devem ser qualificados e adequadamente treinados (ANVISA, 2003).
Estudos de validação de método dependem fundamentalmente da
determinação dos parâmetros totais de desempenho do método. Esses parâmetros
são obtidos durante o desenvolvimento do método e estudos interlaboratoriais ou
segundo protocolos de validação interna (ELLlSON; ROSSLEIN; WILLlAMS, 2002).
o analista deve obter resultados que sejam os mais próximos possíveis dos
valores verdadeiros através da utilização correta de métodos analíticos. O nível de
confiança (que é uma faixa de valores no qual existe uma determinada probabilidade
de se encontrar um certo valor de uma variável) que os analistas podem ter nos
resultados é relativamente pequeno se eles não conhecerem a exatidão e a precisão
do método que usaram, e se não tiverem consciência das fontes de erros que
podem afetar os resultados (VOGEL, et ai, 2002).
Todo laboratório envolvido com o controle de qualidade precisa garantir que
suas análises sejam corretas, exatas e precisas. Para isso, medidas de qualidade
devem ser efetuadas como o teste do equipamento (instrumento e computador); a
validação do método no equipamento testado e o teste de adequação do sistema
(system suitability), envolvendo o equipamento e os métodos validados (LANÇAS,
2004).
A conformidade do sistema pode causar dúvidas quanto aos resultados e, por
isso, deve-se levar em consideração, que a resolução e a repetitividade do sistema
sejam adequadas para a análise a ser realizada. Assim, a conformidade do sistema
deve ser verificada antes que o desenvolvimento do método e a validação tenham
sido completados. E, ainda, considerar o sistema como um todo incluindo, além do
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sistema de quantificação, seja ele cromatográfico, espectrofotométrico, entre outros,
a calibração e manutenção dos equipamentos e instrumentos utilizados em todo o
procedimento analítico, dentro das especificações. Neste caso, a conformidade do
sistema baseia-se em que os componentes eletrônicos, equipamento de
quantificação, operações analíticas e amostras constituem um sistema que pode ser
avaliado como um todo (RIBANI et aI., 2004).
TABELA 1
Parâmetros de conformidade do sistema e recomendações.
Parâmetro
Fator de retenção (k)
Repetitividade (RSD) Resolução (Rs)
Fator de alargamento (TF)
Fonte: USP, 30.
Recomendação
o pico deve estar bem separado de outros picos e do pico correspondente ao tempo de retenção de um composto não retido (tM), k > 2
RSD < 1 % para n > 5 Rs > 2 entre o pico de interesse e o interferente potencial mais próximo (impureza, produto de degradação)
TF:5 2
Validar significa confiabilidade analítica no método escolhido ou desenvolvido,
para se obter um resultado. Não existe um modelo pronto de como fazer validação.
o analista deve validar o método de acordo com a literatura utilizada e as suas
necessidades (LEITE, 2002).
Podem ser utilizadas .Farmacopéias como a USP (United States
Pharmacopoeia), conferências como o ICH (International Conference on
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Harmonization), normas como as do INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia,
Normalização e Qualidade Industrial) artigos de revisão, Guias de validação como o
da ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) entre outras.
o guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos anexo a
resolução 899 de 29 de Maio de 2003 avalia que uma metodologia será considerada
validada se atender os parâmetros descritos na tabela 1. O INMETRO possui outros
parâmetros descritos no quadro 1.
QUADRO 1
Parâmetros de validação da ANVISA e do INMETRO.
Especificidade e Seletividade
Linearidade
Intervalo
Especificidade e Seletividade
Linearidade
Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho
Sensibilidade
Limite de detecção (sensibilidade) Limite de detecção
Limite de quantificação Limite de quantificação
Exatidão Exatidão e tendência (bias)
Precisão Repetibilidade (precisão intra-corrida) Precisão intermediária (precisão inter -corrida) Reprodutibilidade (precisão interlaboratorial)
Robustez
Fonte: ANVISA, 2003; INMETRO, 2007.
Precisão Repetitividade Precisão Intermediária Reprodutibilidade
Robustez
Incerteza de medição
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A Farmacopéia Brasileira é uma entidade que faz parte da ANVISA, portanto
os parâmetros analisados serão os que constam na RE 899 de 29 de Maio de 2003.
2.4.1 Especificidade
Uma amostra, de maneira geral, consiste dos analitos a serem medidos, da
matriz, e de outros componentes que podem ter algum efeito na medição, como
impurezas mas que não são desejáveis quantificar.Quando o método produz
resposta para uma substância dentre várias existentes na amostra é chamado
específico, e quando o método responde a várias substâncias e consegue responder
a uma de cada vez é chamado seletivo.
A especificidade de um método, em uma análise cromatográfica, deve levr em
conta parâmetros tais como: resolução, retenção relativa (fator de separação), fator
de capacidade (fator de retenção), fator de simetria e número de pratos teóricos
(INMETRO, 2007).
Esse ensaio é muito útil para o teste de identificação. É necessário
demonstrar a capacidade de seleção do método entre compostos com estruturas
semelhantes que podem estar presentes. Isto deve ser confirmado pela obtenção de
resultados positivos (preferivelmente em relação ao material de referência
conhecido) em amostras contendo o fármaco, comparativamente com resultados
negativos obtidos com amostras que não contém o fármaco, mas compostos
estruturalmente semelhantes (ANVISA, 2007).
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertacão de mestrado. FCF/USP. 2009
34
A especificidade para análise quantitativa (teor) e análise de impurezas, pode
ser determinada pela comparação dos resultados obtidos de amostras contaminadas
com quantidades apropriadas de impurezas ou excipientes e amostras não
contaminadas, para demonstrar que o resultado do teste não é afetado por esses
materiais. Quando a impureza ou o padrão do produto de degradação não estiverem
disponíveis, pode-se comparar os resultados do teste das amostras contendo
impurezas ou produtos de degradação com os resultados de um segundo
procedimento bem caracterizado (por exemplo metodologia farmacopéica ou outro
procedimento validado). Estas comparações devem incluir amostras armazenadas
sob condições de estresse (por ex. luz, calor umidade, hidrólise ácida/básica,
oxidação).
A linearidade, a exatidão e a precisão estarão seriamente comprometidas se
a seletividade não for assegurada (RIBANI, 2004).
2.4.2 Linearidade
É a continuidade na curva de calibração, em que a resposta do método que
corresponde de forma diretamente proporcional a concentração da amostra em
exame. Para a determinação da linearidade é necessário uma curva de calibração
(GIL, 2007). O número de pontos necessários em uma curva de calibração não
precisa ser superior a 6 segundo estatísticos dedicados a problemas analíticos. Isto
porque a faixa de confiabilidade a nível de 95% de confiança de uma curva de
calibração não diminui de maneira significativa quando o analista utiliza mais que
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35
seis pontos. No entanto, o alargamento da faixa de confiabilidade aumenta
acentuadamente quando menos de seis pontos são usados para a curva de
calibração (VALENTE, 2001).
A proporcionalidade visual da curva de calibração implica que os resultados
dos testes deverão ser tratados por métodos estatísticos apropriados para
determinação do coeficiente de correlação (r), intersecção com o eixo Y, coeficiente
angular e desvio padrão relativo. Se não houver relação linear, realizar
transformação matemática. ° critério mínimo aceitável do coeficiente de correlação
(r) deve ser = 0,99 (ANVISA, 2007).
Um gráfico é construído com as respostas da análise no eixo y e as
concentrações correspondentes em escala logarítmica no eixo x. A linha obtida deve
ser horizontal sobre toda a faixa linear. São desenhadas outras linhas horizontais
paralelas no gráfico, para 95 e 105% da linha da faixa linear. Conclui-se que o
método é linear até o ponto onde a resposta relativa intercepta a linha de 95 ou
105% (RIBANI et. ai, 2004).
Os fatores limitantes do limite inferior e superior da faixa de concentração são
respectivamente os valores dos limites de detecção e de quantificação e o sistema
de resposta do equipamento de medição.
A faixa linear de trabalho de um método de ensaio é o intervalo entre os
níveis inferior e superior de concentração do analito no qual foi demonstrado ser
possível a determinação com a precisão, exatidão e linearidade exigidas, sob as
condições especificadas para o ensaio. A faixa linear é definida como a faixa de
concentrações na qual a sensibilidade pode ser considerada constante e é
normalmente expressa nas mesmas unidades do resultado obtido pelo método
analítico (INMETRO, 2007).
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36
2.4.3 Intervalo
o intervalo especificado é a faixa entre os limites de quantificação superior e
inferior de um método analítico. Para o teste de teor a faixa de linearidade deve
estar compreendida entre 80-120% do valor teórico (ANVISA, 2003).
2.4.5 Limite de detecção (sensibilidade)
Capacidade de um método de avaliar baixas concentrações. O limite de
detecção do equipamento (LOE) é definido como a concentração do analito que
produz um sinal de três a cinco vezes a razão sinallruído do equipamento. O limite
de detecção do método (LO) é definido como a concentração mínima de uma
substância medida e declarada com 95% ou 99% de confiança de que a
concentração do analito é maior que zero (INMETRO, 2007). É aplicado para
ensaios limite calculado pela fórmula:
DP x3 b
op= desvio padrão
b= inclinação da reta
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37
2.4.6 Limite de quantificação
o limite de quantificação é um parâmetro determinado, principalmente, para
ensaios quantitativos de impurezas, produtos de degradação em fármacos e
produtos de degradação em formas farmacêuticas e é expresso como concentração
do analito (por exemplo, porcentagem p/p ou p/v, partes por milhão) na amostra
(ANVISA, 2007). É aplicado para testes de teor. Pode ser calculado pela fórmula:
DP xIO b
op= desvio padrão
b= inclinação da reta
2.4.7 Exatidão
Parâmetro que relaciona os resultados encontrados pelo método proposto
com um valor conhecido (padrão). Deve-se usar concentrações conhecidas de
padrão e comparar com a amostra. A exatidão é calculada como porcentagem de
recuperação da quantidade conhecida do analito adicionado à amostra, ou como a
diferença porcentual entre as médias e o valor verdadeiro aceito, acrescida dos
intervalos de confiança. A exatidão do método deve ser determinada após o
estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo,
sendo verificada a partir de, no mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o
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intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta,
com 3 (três) réplicas cada. A exatidão é expressa pela relação entre a concentração
média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente
(ANVISA, 2007). Tal parâmetro está relacionado com a seletividade, linearidade do
método, validade dos padrões utilizados, calibração dos instrumentos e condições
da recuperação. Pode ser calculado pela fórmula:
Exatidão = concentração média experimental x100 Concentração teórica
2.4.8 Precisão
A precisão é a repetibilidade dos resultados obtidos em uma série de análises
de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Esta é considerada em três
níveis.
Repetibilidade (precisão intra-corrida): concordância entre os resultados dentro de
um curto período de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação. Na
repetibilidade do método é verificado por, no mínimo, 9 (nove) determinações,
contemplando o intervalo linear do método, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa,
média e alta, com 3 (três) réplicas, cada ou mínimo de 6 determinações a 100% da
concentração do teste;
Precisão intermediária (precisão inter-corridas): concordância entre os resultados do
mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou
equipamentos diferentes. Para a determinação da precisão intermediária
recomenda-se um mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes.
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39
Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial): concordância entre os resultados
obtidos em laboratórios diferentes como em estudos colaborativos, geralmente
aplicados à padronização de metodologia analítica, por exemplo, para inclusão de
metodologia em farmacopéias. Estes dados não precisam ser apresentados para a
concessão de registro. A precisão de um método analítico pode ser expressa como
o desvio padrão ou desvio padrão relativo (coeficiente de variação) de uma série de
medidas. A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (OPR) ou
coeficiente de variação (CV%), segundo a fórmula,
DPR DP
CMD xlOO
em que, DP é o desvio padrão e CMO, a concentração média determinada.
o valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia
empregada, a concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do
método, não se admitindo valores superiores a 5%.
2.4.9 Robustez
Relaciona a capacidade do método de ser afetado por pequenas variações,
indica sua confiança durante o uso normal.Os principais parâmetros que podem
resultar em variação na resposta do método estão relacionadas no quadro 2:
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QUADRO 2
Parâmetros avaliados na robustez
Fonte: ANVISA, 2003.
Estabilidade das soluções analíticas
Tempo de extração
Variação do pH da solução
· Temperatura
· Diferentes fabricantes de solventes
riação do pH da fase móvel
Variação na composição da fase móvel
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
· Temperatura
· Fluxo da fase móvel
· Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
'Temperatura
Velocidade do gás de arraste
40
2.5 MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO BESILATO DE
ANLODIPINO
2.5.1 Cromatografia líquida de alta eficiência
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um importante membro de
toda família de técnicas de separação, uma vez que consegue separar misturas que
contêm um grande número de compostos similares.
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
41
A CLAE utiliza instrumentos que podem ser totalmente automatizados. É um
tipo de cromatografia líquida que emprega colunas recheadas com materiais
especialmente preparados e uma fase móvel, eluída sob altas pressões. A técnica
tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande
variedade de compostos presentes em diversos tipos de amostras, em escala de
tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e detectabilidade
(COLLlNS, 2006).
A cromatografia líquida apresenta vantagens em relação aos outros métodos
de análise pois o procedimento é simples e razoavelmente rápido; exige
conhecimento do efeito das variáveis cromatográficas sobre as interações
intermoleculares, que conduzem à separação. Necessita, portanto, para uma
utilização eficiente, de bastante experiência por parte do analista. A análise
instrumental permite maior resolução, automação de operações, registro e
processamento da informação obtida, são requeridas apenas pequenas quantidades
de material. O método tem sido utilizado com êxito na separação e isolamento de
grupos de metais difíceis de tratar pela análise qualitativa de rotina (cromatografia
por troca iônica) e ainda o isolamento de frações enriquecidas em certos analitos
para posterior recristalização, purificação e análise (AQUINO, 2003).
2.5.1.1 Composição do cromatógrafo
O cromatógrafo a líquido é constituído por reservatórios de solvente, filtros,
bombas, misturador para fase móvel, amortecedores de pulso, pré-coluna, injetor,
forno da coluna, detectores e sistema de tratamento dos sinais (SOARES, 2006).
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42
• reservatórios de solvente: são recipientes para a fase móvel;
• filtros : são colocados nos reservatórios de solventes, na saída das bombas e
na tubulação do instrumento (filtro de linha) para evitar a entrada de partículas que
poderiam causar entupimento ou formação de depósitos em razão de produtos de
corrosão das bombas;
• sistemas de bombeamento: são usadas para levar a fase móvel até a coluna;
• misturador da fase móvel: usado para homogeneizar as diferentes
quantidades de solventes utilizados na fase móvel;
• amortecedores de pulso: instalado entre a bomba e o injetor para manter a
fase móvel sem pulsos;
• pré-coluna: manter a fase móvel saturada com sílica, evitando a dissolução do
empacotamento quando sua base for de sílica ou de sílica modificada, prolongando
o tempo de uso da coluna;
• Injetor: pode ser manual ou automático;
• forno da coluna: permite manter a temperatura controlada, quando
necessário;
• detectores: dispositivos sensíveis que emitem um sinal proporcional à
concentração;
• sistema de tratamento de sinais: registram os sinais do detector. Podem ser
integradores ou microcomputadores que registram e realizam cálculos.
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43
2.5.1.2 Medições fundamentais
Tempo de retenção: tR tempo que leva um composto qualquer para eluir
(sair) da coluna por unidade de tempo. Inclui o tempo em que passou sendo
arrastado pela fase móvel e o tempo que passou retido na fase estacionária. Se um
composto apresenta o mesmo tempo de retenção nas mesmas condições (fase
móvel, fase estacionária, temperatura, e vazão) que outro composto pode se tratar
de compostos iguais, porém se o tempo de retenção não for o mesmo certamente
são compostos diferentes (SOARES, 2006).
Tempo morto: T m ou to = tempo que um composto que não possui afinidade
com a fase estacionária leva para percorrer a coluna. Geralmente é expresso em
minutos. É representado pela primeira perturbação na linha de base (SOARES,
2006).
Volume morto: Vm ou Vo = o volume de fase móvel que cabe em uma coluna,
geralmente expresso em mL ou cm3. Pode ser calculado dividindo-se a vazão da
fase móvel pelo tempo morto. A vazão é fixada pelo analista, mas, pode ser medida
coletando-se a fase móvel em uma proveta, por um determinado período de tempo
(SOARES, 2006).
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
44
2.5.1.3 Fases estacionárias e principais mecanismos de separação
o tamanho e a forma da partícula usada como fase estacionária ou como
suporte para a fase estacionária, vai afetar a quantidade de amostra que pode ser
separada no processo cromatográfico (SOARES, 2006).
Os adsorventes mais utilizados em cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) são a sílica e a alumina. A sílica suporta pH entre 2 e 8, enquanto a alumina
deve ser usada com valores de pHs entre 2 e 12. A sílica é o material mais utilizado
em CLAE.
De acordo com os solventes utilizados como fase móvel, pode-se classificar
tal fase como reversa e normal.
A fase reversa caracteriza-se por presença de água e solventes miscíveis em
água e a fase estacionária é mais apoiar que a fase móvel. A fase normal utiliza-se
de solventes apoiares e a fase estacionária é mais polar que a fase móvel.
2.5.1.4 Seletividade da fase móvel
Para um bom resultado a substância analisada deverá ser solúvel na fase
móvel e a viscosidade do solvente também deverá ser observada, pois compostos
muito viscosos apresentaram altas pressões mesmo em fluxos baixos.
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
45
2.5.1.5. Método da Farmacopéia Britânica
A Farmacopéia Britânica V edição descreve a análise quantitativa do besilato
de anlodipino.
Método para determinação da concentração:
Fase móvel: 15 volumes de acetonitrila R, 35 volumes de metanol e 50
volumes da solução 7 ml de trietilamina R em um litro de água, e ajustar o pH 3,0±
0,1 com ácido fosfórico R.
Detecção: comprimento de onda 237 nm UV
Injeção: 10 mel, injeção da solução teste e soluções de referência.
Tempo de retenção: cerca de 7 min
2.5.1.6 Métodos por cromatografia líquida de alta eficiência
• Malesuik e colaboradores utilizaram coluna RP18 usando uma fase móvel
composta de 0,1% (v/v) de ácido ortofosfórico (pH 3,0) e acetonitrila (60 + 40, v/v)
em uma taxa de fluxo de 1,0 mUmin, nas concentrações de 10-30 mcg/mL. Foi
obtido desvio padrão menor que 2% e exatidão maior que 98%. Este método pode
ser usado para quantificar o besilato de anlodipino presente em cápsulas e
comprimidos (MAlESUIK et al., 2006).
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
46
• WU, PAN e ZENG desenvolveram um método para quantificação do besilato
de anlodipino. em coluna C18 com fase reversa e uma fase móvel composta do
tampão fosfato e acetonitrila (45:55, v/v, pH 4,5) com detecção UV 250 nm. O
propranolol foi usado como o padrão interno. A curva padrão mostrou-se linear sobre
a escala da concentração de 0,2 - 30,0 mcg/mL (r=0.9993), e os limites da
determinação eram 20 ng/mL. (WU ; PAN; ZENG, 2003).
• Zarghi e colaboradores descreveram um método que permite a medida do
besilato de anlodipino em plasma humano para um limite detectável mínimo de 0,2
ng/mL. O método envolve o procedimento simples, baseado em uma etapa da
extração e recuperação analítica de aproximadamente 97%. Coluna de Nucleosil C8,
comprimento de onda em 239 nm. A fase móvel é uma mistura do tampão de
dihidrogenofosfato de sódio 0,01 M e acetonitrila (63:37, v/v) ajustado para um pH
de 3,5 em uma taxa de fluxo de 1,5 mUmin. (ZARGHI et aI., 2005).
• O besilato de anlodipino em soro humano pode ser quantificado pela coluna
C18 e uma fase móvel de tampão fosfato de sódio (pH 2,5) que contém 1 mUL de
metanol e trietilamina, e um de fluxo de 2,8 mUmin. O propranolol foi usado como o
padrão interno. A curva padrão se apresenta linear na faixa de 0,25-16 ng/mL do
besilato de anlodipino. O método apresenta boa reprodutibilidade e bom coeficiente
de variação, mais ou menos de 12% para todos os resultados (BAHRAMI, 2004).
• A separação de estereoisômeros do besilato de anlodipino por HPLC foi
realizada com uma coluna (AGP). A preparação apropriada da amostra e o uso de
uma técnica de coluna-switching conduziram a uma separação de enantiômeros.
Uma coluna quiral-AGP 150x1 ° mm foi usada para separar os enantiômeros do
anlodipino racêmico . Para 16 mgde uma mistura racêmica do besilato de anlodipino
foram encontrados 10,4 mg da forma dextrógira O (+), em 20 mL de etanol 20% e
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
........,.BIBLIOTECA Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Universidade de São P;lU!O
47
7,2 da forma L (-), em 20 mL de etanol 20%. O anlodipino racêmico foi preparado
dissolvendo a substância padrão pura em 20 mL de etanol 20%.
A fase móvel para a separação quiral de enantiômeros do anlodipino foi um
tampão de acetato de 10 mM (pH 4.5) com 1 % (v/v) de propanol.
Foi usada uma coluna analítica quiral de AGP (ChromTech, Hcegersten,
Sweden) 150 x 4,0 mm I.D . O fluxo foi de 0,9 mUmin A separação foi realizada
acima de 30°C. O primeiro detector ('\=240 nm) foi usado somente para testar o
sistema, ajustando-se o comprimento de onda conforme a estabilização.
Após a separação dos diasterosisômeros, uma coluna analítica simetria C8 de
4 mm (Waters®) foi usada na segunda etapa.
A fase móvel foi tampão de acetato de 10 mM, (pH 4,5) e acetonitrila (55: 45,
v/v). A temperatura estabiliza em 30°C e em 240 nm no detector UV (LUKSA et
al.,1997).
2.5.2 Espectrometria de massas
A espectrometria de massas é um método para identificar os diferentes
átomos que compõem uma substância. Um espectrômetro de massa bombardeia
uma substância com elétrons para produzir íons, ou átomos eletricamente
carregados. Os íons atravessam um campo magnético cujas trajetórias apresentam
curvas diferentes, dependendo de suas massas. O campo separa os íons em um
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48
padrão chamado espectro de massa. A massa e a carga dos íons podem ser
medidas por sua posição no espectro.
A espectrometria de massas fragmenta um composto isolado por técnicas
como a cromatografia gasosa ou líquida, coleta os fragmentos que possuem carga e
fornece um histograma (representação gráfica de retângulos justapostos) (SOARES,
2006).
A técnica de impacto de elétrons (E I) mais utilizada consiste em um
espectrômetro de massa bombardeando moléculas na fase de vapor com um feixe
de elétrons de alta energia; o resultado do impacto dos elétrons é registrado como
um espectro de íons separados na base de acordo com a razão massa carga (m/z).
(SllVERSTEIN,1994).
2.5.2.1 Método por espectroscopia de massa
Massaroti e colaboradores desenvolveram um método por espectroscopia de
massa para a determinação do besilato de anlodipino. Foi utilizado um sistema lC
Agilent munido de bomba isocrática. A solução padrão possuia concentração de 100
mcg/ml de besilato de anlodipino em acetonitrila. Foram utilizados fase móvel
composta por ácido fórmico 0,1% (v/v) em acetonitrila e água (80:20 v/v), uma
coluna C18 (50X20 mm) Phenomenex®, fluxo 0,5 mUmin, injeção 15 mcl e
encontrado um tempo de retenção de 1,9 mino A temperatura variou 100 a 300°C. A
curva possuía pontos com as concentrações de 0,2 mcg/ml, 0,5 mcg/ml, 1,0
mcg/ml, 5,0 mcg/ml e 10 mcg/ml (MASSAROTI et aI., 2005).
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
49
2.5.3 Eletroforese
As técnicas eletroforéticas empregadas em controle de qualidade são a
eletroforese em gel e a eletroforese capilar. Ambas empregam a aplicação de uma
diferença de potencial sobre uma solução ou gel onde se encontra solubilizado o
analito. Essa diferença de potencial faz com que os elementos carregados migrem
em direção ao pólo de carga oposta. Caso o analito apresente carga ele poderá
migrar sozinho para o eletrodo. Caso seja neutro, precisará formar um complexo
com algum elemento carregado que servirá como um carreador. O dodecil sulfato de
sódio (SDS) é muito utilizado na forma de micelas carregadas.
A eletroforese emprega géis dispostos em placas. As placas são mantidas na
horizontal e os eletrodos mantidos na extremidade da placa de gel. Devido à baixa
resistência elétrica, voltagens muito altas, superiores a 200 volts, não podem ser
aplicadas, pois aqueceria muito o sistema. Uma saída para o problema foi o
surgimento da eletroforese capilar (CE), que possui capilares ocos suportando uma
voltagem de até 30 kvolts (GIL, 2007).
Na eletroforese capilar (EC), a solução contendo eletrólitos e moléculas
neutras é movida através do capilar, impulsionada pelo fenômeno denominado
eletrosmose. O chamado fluxo eletrosmótico é causado pela carga que se forma na
parede do capilar e mesmo capilares de teflon exibem esse fenômeno. No caso de
capilares de sílica fundida, a superfície de contato com o líquido contido no capilar
contém grupos silanol (Si-OH), que podem sofrer ionização formando grupos
silanoato (SiO-) (SOARES, 2006).
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
50
2.5.3.1 Método por cromatografia eletrocinética micelar (mekc)
A cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) é uma adaptação da
eletroforese capilar, principalmente empregada na análise eletrocinética de
compostos neutros, mas é também eficaz na separação de compostos iônicos que
tem mobilidades eletroforéticas similares.
A MECK requer a adição de surfactantes carregados, formando micelas, para
que os eletrólitos retornem com um nível maior do que a concentração crítica da
micela. As micelas têm sua própria mobilidade eletroforética, que é diferente da fase
aquosa que a envolve.
A MEKC foi executada em um sistema electroforético capilar HP CE equipado
com um detector UV.
A solução padrão foi preparada dissolvendo o besilato de anlodipino em
acetonitrila e água (50:50, v/v) na concentração de 1000 mcg/mL. A solução padrão
foi diluída em tampão de borato de 50 mM e pH 8,2, contendo 20 mM de dodecil
sulfato de sódio. Todas as soluções foram preparadas nos balões volumétricos de
vidro âmbar devido à fácil fotodegradação do anlodipino, e armazenadas sob
refrigeração.
As amostras foram injetadas pela pressão (4 s, 50 mbar) em um capilar de
sílica fundida (serviços compostos do metal, Worcester, Inglaterra) de 58.5 cm x75
!-Im 1.0.X375 !-Im 0.0. com uma faixa de detecção de 50 mcg/mL. A temperatura
capilar foi mantida constante a . 23,0 ±0,01 DC e uma tensão de +25 quilovolts
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
51
(corrente, 30 IJA) foi aplicada. O detector UV foi ajustado entre 200 a 236 nm. A
temperatura foi mantida em 25,0±0,1 °C (LUKSA et aI., 1997).
2.5.4 Espectrofotometria
A espectrometria de absorção molecular está baseada na medida da
transmitância T ou absorbância A de soluções contidas em células transparentes
tendo percorrido um caminho óptico (EWING, 1997).
A absorção molecular na região ultravioleta ou visível do espectro depende da
estrutura eletrônica da molécula. A absorção de energia é quantizada, e conduz a
passagem dos elétrons de orbitais do estado fundamental para orbitais em um
estado excitado de maior energia (SILVERSTEIN, 1994).
As informações estruturais fornecidas por um espectro no ultravioleta e no
visível são mais do tipo negativo, ou seja, mais por exclusão do que afirmação.
Quando não há absorção entre 220 e 800nm, o composto não contém cromóforos
de conjugação, ou anel benzênico, ou grupos do tipo cetônico, aldeído, nitro, ou
halogênios (SOARES, 2006).
A absorção de radiação eletromagnética vai ser observada quando a radiação
atravessar uma solução que contenha moléculas capazes de absorvê-Ia. A absorção
será diretamente proporcional ao número de centros absorventes (SKOOG, 2002).
Esse comportamento possibilita a quantificação de compostos e é descrito
pela Lei de Beer: "Incrementos sucessivos no número de moléculas de igual poder
de absorção, situadas no percurso do feixe de radiação monocromática, absorvem
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52
iguais porções da energia radiante que as atravessa". A absorbância é proporcional
ao número de partículas que efetivamente absorvem a radiação em um determinado
comprimento de onda. Desta forma a lei de Beer permite medir a concentração de
duas substâncias na mesma amostra desde que não haja interação entre as
mesmas (SOARES, 2006).
Um espectro de ultravioleta que abrange a faixa de comprimento de onda
entre 200-380 nm é produzido na forma de um gráfico onde o eixo x representa as
concentrações estudadas, e o eixo y as absorbâncias do composto em análise.
Compara-se o resultado da leitura do padrão com o resultado da leitura da amostra.
É um método de fácil execução, rápido, e de baixo custo (HARRIS, 2005).
2.5.4.1 Método por espedrofotometria
BASAVAIAH e colaboradores desenvolveram um método baseado na
redução de ferro (111) por parte dos fármacos estudados em meio ácido e
subseqüente interação de ferro (11) com ferricianeto para formar azul prussiano. O
produto apresenta absorção máxima a 760 nm. Concentração de 5-15 mcg/mL de
besilato de anlodipino, 2 mL FeCI3 (0,2%) e de ferricianeto (0,2%) foram adicionados
a cada balão, bem misturado e deixados em repouso durante 10 mino Por último, 1,0
mL de H2S04 10M foi adicionado a cada balão e o volume completado para 10mL
com água. A absorvância da solução resultante foi medida a 760 nm mediante um
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53
branco preparado de forma semelhante (BASAVAIAH, K.; CHANDRASHEKAR, U. ;
PRAMEELA, H.C., 2003).
2.5.5 Outros métodos de quantificação e identificação do besilato de anlodipino
Quantificação
Rahman e Nasrul realizaram metodologia baseada em reação de
complexação de transferência da carga do anlodipino besilato com 2,3-dicloro 5,6-
diciano 1,4 benzoquinona (DDQ) para dar um produto colorido com absorbância
máxima a 580 nm (RAHMAN; NASRUL, 2003).
• O besilato de anlodipino foi determinado através da interação com ácido
ascórbico em uma solução com N, N-dimetilformamida (DMF) apresentando
absorbância máxima em 530 nm. Sob as circunstâncias experimentais otimizadas,
as concentrações das amostras foram de 1,0 a 125,0 e 10,0 a 140,0 mcg/mL com
DDQ e ácido ascórbico, respectivamente. Ambos os métodos foram aplicados com
sucesso para a análise do besilato de anlodipino em formulações farmacêuticas
(RAHMAN; NASRUL, 2003).
• Foi verificada a interação do besilato de anlodipino com tetrahidrato de
heptamolibdato de amônio, resultando na formação do azul de molibdênio (Àmax
825 nm). Os resultados dos procedimentos propostos foram validados
estatisticamente e comparados com aqueles obtidos pelo método de referência. Os
métodos propostos foram aplicac:lOS com sucesso à determinação do besilato de
anlodipino em comprimidos (RAHMAN, 2004).
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
54
Identificação
• O besilato de anlodipino pode ser identificado dissolvendo-se 5 IJg em solução
de 1 % de Hei 0,1 M em metano!. Completa-se o volume para 100 mL com a solução
ácida. Efetuar a leitura entre 300 nm e 400 nm. A solução mostra absorção máxima
em 400 nm (BRITISH, 2005).
• Absorção espectrofotométrica no infravermelho comparada com o padrão
(teste A).
• Examinar cromatogramas obtidos no teste A para relatar substâncias na luz
ulltravioleta 366nm.
• Dissolver 5.0 mg de besilato de anlodipino em solução 1 % v/v de ácido
clorídrico 0,1 M em metanol e diluir para 100 mL com a mesma solução ácida. Ao
examinar entre 300 nm e 400 nm, a solução mostra absorção máxima em 360 nm. A
absorbância máxima específica é de 113 a 121 (PHARMACOPOEIA E, 2004;
PHARMACOPOEIA B.2005.)
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na FarmacoDéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
55
3 JUSTIFICATIVA
A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas através
de métodos precisos, exatos, reprodutíveis e robustos, tem aumentado nos últimos
anos. A legislação em vigor e o mercado cada vez mais competitivo e exigente,
tornam obrigatória a validação de métodos analíticos.
A Farmacopéia Brasileira, carente de novas monografias, necessita que
sejam inseridos novos fármacos assim como métodos de análise, portanto a
importância deste trabalho, cujo objetivo é a inserção da monografia do besilato de
anlodipino no referido compêndio.
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
56
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL
Todos os reagentes e solventes utilizados foram de grau analítico.
4.1.1 Solventes e reagentes
• Matéria-prima do besilato de anlodipino
• Amostras de comprimidos de 5 mg e 10 mg, doadas pelo laboratório
Medley® ,amostra e placebo;
• Acetonitrila (Merck®) grau cromatográfico;
• Ácido fosfórico;
• Água destilada;
• Água ultrapurificada através do sistema Mili-Q® Plus; com resistividade
igual a 18,2 Ocm a 25°C;
• Metanol (Merck®) grau cromatográfico;
• Metanol grau espectrofotométrico;
• Soluções tampão fosfato pH 4,0 e 7,0 (Digimed®);
• Trietilamina (TEA);
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4.1.2 Substância química de referência
Substância química de referência besilato de anlodipino lote AB21821 L T05,
teor 99,6%.
o fármaco empregado como substância química de referência, assim como
as amostras utilizadas nessa dissertação foram gentilmente cedidos por laboratório
farmacêutico.
4.1 .3 Amostras
Foram utilizadas amostras de comprimidos de 5 mg e 10 mg, doadas pelo
laboratório Medley® e amostra e placebo preparados no Laboratório de Controle de
Qualidade da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo
cujas fórmulas são descritas a seguir:
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
Formulado de besilato de anlodipino de 5 mg
Excipiente Quantidade
%P/P
Estearato de magnésio 2,33
Celulose microcristalina 7,69
Fosfato dibásico de Cálcio 5,64
Besilato de anlodipino 5,0
Amido glicolato de sódio qsp 100g
Placebo
Excipiente Quantidade
%P/P
Estearato de magnésio 2,33
Celulose microcristalina 7,69
Fosfato dibásico de Cálcio 5,64
Amido glicolato de sódio qsp 100g
4.1.4 Equipamentos e acessórios
• Aparelho de ultra-som, Thornton®, modelo T-14;
• Agitador mecânico modelo 103 (Nova Ética®);
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58
59
• Balança Analítica - Marca Sartorius®, capacidade 100 g, precisão ±
0,0001 ;
• Cromatógrafo a líquido CG 480C. com válvula injetora com volume fixo
de 20 IJL, detector UV, modelo CG 435, Integrador CG modelo 200;
• Sistema cromatográfico HPLC 10 vp Shimadzu®: degaseificador DGU-
14A; bomba binária LC-10ADvp; injetor automático com Loop de 50IJL Sil-10ADvp;
compartimento de coluna CTO-10ACvp; detector de arranjo de diodos UV-Vis SPD-
M10Avp; controlador do sistema SCL-10Avp; software LC Workstation Class-Vp
5.1.2; computador com Windows Millennium;
• Espectrofotômetro ultravioleta/visível Shimadzu® UV - 1601, munido de
cubetas de quartzo, de 1 cm de caminho óptico e acoplado a computador e
impressora Epson - FX 850;
• Coluna LiChrospher® 1 00RP-18 (5IJm) Merck®;
• Coluna Synergi hydro RP, Phenomenex®, 250 x 4,6 mm
• Medidor de pH Digimed®, modelo TE-91;
• Balança analítica eletrônica BG-2000 Gehaka®;
• Aparelho MiliQ-Plus, Milipore® para obtenção da água purificada;
• Membranas filtrantes HV 0,451Jm de poro e 13 mm de diâmetro
(Milipore®);
• Vidraria usual do laboratório;
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacooéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertacão de mestrado, FCF/USP, 2009
BIBLIOTECA, 60 Faculdade de Ciências Farmacêuticas
" Universidade de São Paulo
4.2 MÉTODOS ANAlÍTICOS
4.2.1 Espectrofotometria no visível
Ensaios preliminares
Pesou-se analiticamente 50 mg de besilato de anlodipino padrão e transferiu-se
para balão volumétrico de 50 mL. Utilizou-se 5 mL de metanol para dissolver o
~ fármaco e a seguir o volume foi completado com água destilada. Transferiu-se 2,45
~ ~ mL para balão volumétrico de 50 mL, completando-se o volume com água destilada,
sendo a concentração final 49 mcg/mL.
Fez-se varredura na região de 190-500 nm para o placebo e o padrão. A substância
apresentou melhor absorção em 364,40 nm. O placebo não apresentou absorbância
sig n ificativa.
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
1..000.,.--,...---------.------------,------------.
I]J
'ü C
<I]J
1: o V) .l:l I]J
o.oJl j~\WA. ~ . 190.0 300.0 ~oo,o
comprimento de onda (nm)
500.r3
61
Figura 2- Espectro de absorção da solução do placebo em MeOH/H20 5:95, na primeira diluição e na segunda diluição somente água.
Do balão de 50 mL contendo a solução padrão de 1 mg/mL transferiu-se 6
alíquotas (2,05 mL; 2,25 mL; 2,45 mL; 2,65 mL; 2,85 mL; 3,05 mL) para diferentes
balões volumétricos de 50 mL completando-os com água destilada. Foram obtidas
soluções com concentração de 41 mcg/mL, 45 mcg/mL, 49 mcg/mL, 53 mcg/mL, 57
mcg/mL e 61 mcg/mL do padrão de besilato de anlodipino.
Desenvolvimento de métodos para análise do besi lato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
1.000,,-------,---------,--------,--------,----------,
cu 'u c
'cu -<:l o (j)
-<:l cu
0,0001 ----260,0 300,0 350,0 400,0
comprimento de onda (nm)
450,0 500,0
62
Figura 3- Espectro da solução padrão na concentração de 49 mcg/mL em MeOH/H20 5:95, na primeira diluição e na segunda diluição somente água.
4.2.2 Ensaios realizados no cromatógrafo CG
Ensaio 1. Testou-se a amostra de besilato de anlodipino padrão no
cromatógrafo CG a líquido CG 480C com válvula injetora com volume fixo de 20
mcl, detector UV, modelo CG 435, integrador CG modelo 200 utilizando a fase
móvel tampão fosfato e acetonitrila (45:55), pH 4,5 (acidificado com ácido fosfórico),
comprimento de onda 250 nm, detector UV, fluxo de 1 mUmin e coluna C18. A
substância apresentou um tempo de retenção de 3,2 mino
o teste foi repetido com fase móvel metanol e água em diversas proporções
(60:40; 65:35; 55:45), mas sem tampão; a concentração usada de padrão de
besilato de anlodipino foi de 30,0 mcg/mL.
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63
Em algumas injeções a água da fase móvel também foi acidificada para pH
3,5 com ácido fórmico, mas não se observou alterações significativas.
Também foi testada uma fase móvel composta de trietilamina 0,1% em água
e álcool isopropílico (65:35 v/v), coluna C18 e comprimento de onda 220 nm. Não foi
obtido cromatograma satisfatório.
4.2.3 Ensaios realizados no cromatógrafo Shimadzu
Condições: coluna C18 Synergi hydro RP, Phenomenex®, 250 x 4,6 mm, fase
móvel metanol e água nas proporções (25:75, 30:70, 35:65, 20:80 v/v) e solução
acidificada com ácido fosfórico pH 2,0. A melhor relação estabelecida foi de 35:65v/v
com um tempo de retenção 4,45 min para um To de 2,44 mino
~
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.0 ~ Relention TIme
1 j
30 ~ 1 i
20i 1 -1 j
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Figura 4 - Cromatograma da solução padrão do besilato de anlodipino de concentração 24 mcglmL. Condições cromatográficas: fase móvel metanol e água (35:65v/v), detecção "A 210 nm, coluna C18 Synergi hydro RP, Phenomenex®, 250 x 4,6 mm, fluxo 1 mUmin.
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4.2.3.1 Ensaios realizados com a coluna LiChrospher® 100RP-18 (5Ilm) Merck®:
condições: fluxo de 1 mLlmin e concentração de 200 mcg/mL.
Ensaio 1 Tampão (800 mL de água + 7mL de trietilamina) acidificado para pH 3,0
com ácido fosfórico, ACN e metanol (50:35:15) v/v, Iv =238nm, tempo de retenção 10
min, to = 1,33 minutos
Ensaio 2 Tampão (800 mL de água + 7 mL de trietilamina) acidificado para pH 3,0
com ácido fosfórico e metanol (45:55) v/v, Iv = 238nm, tempo de retenção 9,22 min,
to =1,33 minutos
Ensaio 3 Tampão (800 mL de água + 7mL de trietilamina) acidificado para pH 3,0
com ácido fosfórico e metanol (35:65) v/v, Iv = 238nm, tempo de retenção 3,41 min,
to =1,23 minutos
Ensaio 4 Tampão (800 mL de água + 8 mL de trietilamina) acidificado para pH 3,0
com ácido fosfórico e metanol (35:65) v/v, Iv = 238nm, tempo de retenção 3,58min, to
=1,25 minutos
Ensaio 5 Tampão (800 mL de água + 8 mL de trietilamina) acidificado para pH 5,0
com ácido fosfórico e metanol (35:65) v/v, Iv = 238nm, tempo de retenção 3,58min, to
=1,25 minutos
o método de escolha foi o ensaio 5, pois a solução é menos ácida
danificando menos a coluna.
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120 1424 ,58
100 A 80
::::J 60 <I: E
40
20
O ) ~
1 0,0 0 ,5 1,0 1,5 2,0 2 ,5 3,0 3 ,5 4,0 4,5 5 ,0
Minutes
Figura 5- Cromatograma de uma solução do padrão do besilato de anlodipino de concentração 24 mcg/mL. Condições cromatográficas: fase móvel metanol e água, com TEA 1 % acidificada com ácido fosfórico pH 5.0, (35:65v/v), detecção f.. 238 nm Coluna LiChrospher® 100RP-18 (5Ilm) Merck®;fluxo 1 mUmin e tempo de retenção 3,7min.
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66
5 RESULTADOS
5.1 RESULTADOS OBTIDOS POR ESPECTROFOTOMETRIA
5.1.1 Identificação
O resultado realizado para identificação do besilato de anlodipino, segundo a
British Farmacopoeia, mostrou-se satisfatório apresentando absorbância máxima a
360 nm.
5.1.2 Linearidade
É a capacidade de uma metodologia analítica demonstrar que os resultados
obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro
de um intervalo especificado (ANVISA, 2003). Foi determinada por meio de curvas
padrão, obtidas em 6 níveis de concentração: 41 mcg/mL, 45 mcg/mL, 49 mcg/mL,
53 mcg/mL, 57 mcg/mL, 61 mcg/mL.
As soluções foram preparadas em triplicata e os seguintes resultados foram
encontrados:
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TABELA 2
Resultados experimentais da solução padrão besilato de anlodipino, utilizados na curva anaítica pelo método espectrofotométrico.
41 0,4827 0,4850 0,4830 0,4835 0,00125
45 0,5332 0,5313 0,5326 0,5323 0,00097
49 0,5778 0,5850 0,5750 0,5791 0,00020
53 0,6261 0,6202 0,6202 0,6222 0,00055
57 0,6761 0,6747 0,6732 0,6747 0,00025
61 0,7222 0,7218 0,7214 0,7217 0,00021
MÉDIA 0,59679 0,00044
* Média de três determinações para cada concentração
LINEARIDADE
LINEARIDADE
.!!! 0,75
o 0,7 c <IV
0,65 ..c ... o 0,6 1/1 ..c « 0,55
0,5
0,45
40 45 50 55 60 65
Concentração mcg/mL
Figura 6 - Curva analítica para determinação de besilato de anlodipino, nas concentrações de 41, 45, 49, 53, 57 e 61 mcg/mL em metanol : água destilada (5:45v/v).Equação da reta a= 0,0118x + 0,005 R2=0,9995.
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68
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comprimento de onda (nm)
Figura 7- Sobreposição dos espectros de absorção das soluções padrão nas concentrações de 41 , 45, 49, 53, 57 e 61 mcglmL de besilato de anlodipino em metanol e água (5:45).
TABELA 3
Análise estatística dos resultados obtidos na determinação da curva analítica de besilato de anlodipino. Leituras efetuadas em comprimento de onda 364,4nm.
Intervalo de concentração 41-61 mcg/mL
Coeficiente de correlação 0,9995
Inclinação da reta 0,0119
Teste F 2,4769
Desvio padrão relativo 0,007372
LD (mcg/mL) 0,5407
LQ (mcg/mL) 1,803
Coeficiente linear 19717,12
Erro padrão 0,002145
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. 5.1.3 Limite de detecção e limite de quantificação
L· ·t d d t - DP 0,002145 I L Iml e e e ecçao = - x3 = x3 = 0,5407 mcg m b 0,0119
L· ·t d t·f· - DP ·0,002145 ° 80 I L Iml e e quan Ilcaçao = -xl0 = xl = 1, 3 mcg m b 0,0119
Em que OP = desvio padrão
b = coeficiente linear
5.1.4 Exatidão
A exatidão foi determinada através de teste de recuperação em três
concentrações distintas. Quantidades conhecidas de padrão foram adicionadas a
quantidades fixas de amostras e fez-se o cálculo de recuperação de padrão
adicionado.
Exatidão = [(LTL~LA)xCp ]7PAXI00%
em que L T é o valor da leitura total, LA é o valor de leitura da amostra, LP é o valor
de leitura do padrão e PA é a quantidade de padrão adicionado.
Para a preparação das soluções-mãe de padrão e de amostras de besilato de
anlodipino adotou-se o seguinte procedimento:
Para a preparação das soluções padrão de besilato de anlodipino, pesaram-
se 50 mg de matéria-prima de besilato de anlodipino, transferiram-se para um balão
de 50 mL, adicionou-se 5 mL de metanol e completou-se o volume com água e
filtrou-se, em seguida (solução-mãe padrão, 1 mg/mL).
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No caso dos comprimidos, pesaram-se massas equivalentes a 50 mg de
besilato de anlodipino e transferiram-se para balões de 50 mL. Adicionaram-se 5 mL
de metanol e completou-se o volume água (soluções-mãe das amostras, 1 mg/mL).
Foram, então, preparadas as soluções em triplicata contendo padrão e
amostra de besilato de anlodipino, conforme a tabela 4. As diluições foram feitas
com água destilada.
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comprimento de onda (nm) GO.O 5'10.('
Figura 8- Espectro de absorção das soluções (padrão+amostra) nas concentrações de 22,5; 22,5; 45; 49 e 53 mcg/mL da solução padrão de besilato de anlodipino MeOH/H20 5:95, na primeira diluição e na segunda diluição somente água.
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TABELA 4
Resultados experimentais obtidos na recuperação de solução padrão de besilato de anlodipino adicionada às soluções amostra de besilato de anlodipino 5 mg(A), 10 mg (8), e formulado 5 mg (C) empregando o método espectrofotométrico.
22,5 22,5 0,2661
22,5 22,5 0,2596
A 22,5 22,5 45 0,5276 22,66 100,7
26,5 22,5 49 0,5725 26,45 99,8
30,5 22,5 53 0,6199 30,44 99,8
22,5 0,2610
B 22,5 22,5 45 0,5216 22,03 97,9
26,5 22,5 49 0,5702 26,13 98,6
30,5 22,5 53 0,6135 29,6 97
22,5 0,2605
C 22,5 22,5 45 0,5240 22,25 98,9
26,5 22,5 49 0,5718 26,31 99,3
30,5 22,5 53 0,6142 29,92 98,01
* Média de três determinações para cada concentração
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5.1.5 Precisão
Foi utilizado o ponto médio da linearidade. Foram analisadas 10 amostras
durante três dias consecutivos nas concentrações de 49 ~g/mL das amostras 5 mg
(A) , 10 mg (B) e formulado 5 mg (C) . As amostras foram obtidas pesando-se 1,426
mg correspondente ao peso médio de 20 comprimidos de 5 mg. Transferiu-se para
balão volumétrico de 100 mL, acrescentou-se 5 mL de metanol e completou-se o
volume com água destilada.O procedimento para a obtenção das soluções na
concentração de 49 mg/mL é o mesmo descrito na linearidade. Os resultados dos
comprimidos analisados, 5 mg (A) , 10 mg (B) e formulado 5 mg (C), estão
apresentados nas tabelas 5, 6, e 7 respectivamente.
TABELA 5
Resultados experimentais das soluções da amostra (A) de besilato de anlodipino, utilizados para determinação da precisão do método espectrofotométrico MeOH/H20 5:95 na primeira diluição e na segunda diluição somente água para a amostra de 5 mg (A).
49 0,5747 0,000737
49 0,5752 0,005237
49 0,5775 0,000400
49 0,5756 0,004053
49 0,5784 0,001266
49 0,5751 0,000954
49 0,5726 0,001952
49 0,5768 0,001450
49 0,5758 0,002281
Média 0,5759 0,001457
DPR(%) 0,3518
* Média de três determinações para cada concentração
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comprimento ae onaa lnm)
46C.O
73
Figura 9- Espectro de absorção das soluções da amostra de comprimido de besilato de anlodipino 5 mg (A) nas concentrações de 49 mcg/mL em metanol 5:95 MeOH/H20, na primeira diluição e na segunda diluição somente água.
TABELA 6
Resultados experimentais das soluções da amostra 10 mg (B) de besilato de anlodipino, utilizados para determinação da precisão do método espectrofotométrico MeOH/H20 5:95 na primeira diluição e na segunda diluição somente água para a amostra de 10 mg (B).
Concentração de leitura mcglmL
49
49
49
49
49
49
49
49
49
49
Média
DPR(%)
Amostra B*
0,5760
0,5759
0,5764
0,5757
0,5727
0,5746
0,5749
0,5741
0,5758
0,5762
0,5752
0,3936
Desvio padrão em relação as três medidas
0,001365
0,004822
0,003356
0,000346
0,002848
0,002470
0,002800
0,002811
0,000473
0,001350
0,002264
* Média de três determinações para cada concentração
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TABELA 7
Resultados experimentais das soluções da amostra de 5 mg (C) formulada de besilato de anlodipino, utilizados para determinação da precisão do método espectrofotométrico MeOH/H20 5:95, na primeira diluição e na segunda diluição somente água.
49 0,5767 0,001250
49 0,5781 0,001656
49 0,5765 0,003925
49 0,5752 0,002011
49 0,5775 0,003669
49 0,5744 0,001762
49 0,5768 0,004058
49 0,5761 0,000173
49 0,5741 0,005300
Média 0,5760 0,002611
DPR(%) 0,04532
* Média de três determinações para cada concentração
TABELA 8
São apresentados resultados obtidos na determinação do teor de besilato de anlodipino nas amostras 5 mg (A), 10 mg (8) e formulado 5 mg (C) , intra-dia e inter-dia empregando o método espectrofotométrico.
Dia 1 5,04±0,02 9,79±0,04 4,95±0,02
DPR (%) 0,31 0.40 0,36
Dia 2 4,99±0,03 9.86±0,03 4.97±0,01
DPR (%) 0,57 0,26 0,22
Dia3 4,99±0,02 9,7±0.04 4,9±0,01
DPR (%) 0,46 0,43 0,16
tt-:dia;~ ,~~
DPR (%) 0,08 0,58 0,23
*Média aritmética dos valores ( n=10)
** ANOVA (n=10)
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A precisão foi calculada através do desvio padrão dividido pela concentração
média determinada.
P . - - DP 1000/ 0,001457 + 0,002264 + 0,002611 1000/ 03662°/ reclsao--- x /0 = X /0 = , /0 CMD 0,5759 + 0,5752 + 0,5760
em que, DP é o desvio padrão e CMD a concentração média determinada. O valor
máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a
concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do método, não
se admitindo valores superiores a 5% (ANVISA, 2003).
5.1.5 Robustez
A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir
a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança
durante o uso normal.
Durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se considerar a avaliação
da robustez. Constatando-se a susceptibilidade do método a variações nas
condições analíticas, estas deverão ser controladas e precauções devem ser
incluídas no procedimento (ANVISA, 2003).
Preparou-se três amostras do padrão de besilato de anlodipino na mesma
concentração 49 mcg/mL. Pesou-se analiticamente 50 mg do padrão, transferiu-se
para um balão volumétrico de 50 mL e completou-se o volume com metanol. Uma
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alíquota de 2,45 mL foi retirada e transferida para um balão volumétrico de 50 mL e
o volume completado com água destilada. A variação feita foi a mudança de
fabricante do solvente de metano!.
TABELA 9
Resultados experimentais das soluções da amostra de besilato de anlodipino, MeOH/H20 5:95, na primeira diluição e na segunda diluição somente água, utilizados para robustez do método espectrofotométrico.
49 0,5835
49 0,5925
DP
Média 0,5844
* Média das três determinações
DP 00043 robustez = - - X IOO% = ' X IOO% = 0,7358%
CMD 0,5844
0,001909
0,000424
0,004277
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77
OSOlr==T' ~-.-~-\ i \ r~\~=~-
1 \ /1 \ g i . \
~ \ j l \ \ \
\ / . \ \ .'-....--'. \ \
o.oo=" ~ 200.0 ;>(1( .0 300.0 .10UlI ~w.o ~oc.jjI
comprimento ae onaa lnm)
Figura 10- Espectros de absorção, registrados consecutivamente, das soluções padrão de besilato de anlodipino na concentração de 49 mcg/mL MeOH/H20 5:95 na primeira diluição e na segunda diluição somente água.
5.2 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
5.2.1 Linearidade
A linearidade foi calculada a partir do preparo de amostras da solução padrão.
Pesou-se 50 mg de padrão de besilato de anlodipino e diluiu-se em balão de 50 mL
com 5 mL de metanol e o restante com fase móvel (35:65 MeOH/H20, trietilamina a
1 %, acidificada com ácido fosfórico para um pH5.0) Retirou-se 6 alíquotas de
0,5mL; 1,OmL; 1,5mL; 2,0 mL; 2,5 mL; 3,0 mL e 3,5 mL e transferiu-se para um
balão volumétrico de 10 mL obtendo-se concentrações de 50 mcg/mL, 100 mcg/mL,
150 mcg/mL, 200 mcg/mL, 250 mcg/mL, 300 mcg/mL e 350 mcg/mL,
respectivamente.
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LINEARIDADE 8000000 r' ............... _, .............. ,." .. ~,:.: ....................... " •... : ······················,···,:····· .... - ...... _·:··:~· .. :C·'E;:.,,;.
7000000 1-~.;o,-.::.......-:-:--:--'-74:---~-~
6000000 1-.;..,...;l~.........,+----~+--------.-::--+-'iíI
.~ 5000000 1--·-~....,.,...~+-~-"-:-----·...-=""'M'~c.4--::7~ (.)
,; 4000000 'j." . ~ ;,,, I ..c ~~OOOOO y / fi)
..c 2000000 « 1000000 1~6
50 100 150 200 250 300 350 Concentração mcg/rnL
78
Figura 11- Gráfico da linearidade. Concentrações entre 50 mcg/mL e 350 mcg/mL, da solução padrão de besilato de anlodipino sendo utilizados 5mL de metanol para a diluição e o restante de fase móvel.
! ~)0 1
1')('1 i ! ~--------,----------r---------r--------Ir--------Ir--------lr--------,----------r--------. c· 1 2 3 4 5 6 a 9
Uinul'7..
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H·-j I I I I I I I I
~--------.----------r---------r--------IÕ--------_r--------,---------.----------r--------~ c· 1 2 3 4 5 6 a 9
Minulv..
(a)
mAU
(b)
Figura 12- Cromatogramas da solução padrão (a), e da amostra (b). Concentração de 200 mcg/mL. Condições cromatográficas: fase móvel MeOH e H20 , com TEA 1% acidificada com ácido fosfórico pH 5.0, (35:65 v/v).Coluna LiChrospher® 100RP-18 (5j..lm) Merck®,detecção 238nm e fluxo de 1,OmL /min .
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79
TABELA 10
Análise estatística dos resultados obtidos na determinação da curva analítica de besilato de anlodipino. Leituras efetuadas em comprimento de onda 248 nm.
I 50-350 mcg/mL
" 0,9999
54947
3,4032
0,547
2,6
8,68
19708
16396
TABELA 11
Resultados experimentais da solução padrão de besilato de anlodipino, utilizados na curva analítica pelo método cromatográfico.
50 950519 5975,76
100 1910943 310,42
150 2881121 6219,00
200 3877140 5050,86
250 4872923 13048,95
300 5851310 13454,83
350 6854955 31382,81
Média 6118,619929
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80
5.2.2 Limite de detecção e limite de quantificação
L· 't d d t - DP 14819 / L Iml e e e ecçao = - x3 = - - x3 = 2,27 mcg m b 19704
L· 't d t'f' - DP 1481 9 10 / L Iml e e quan I Icaçao =- x l0 = --x = 7,521 mcg m b 19704
DP = desvio padrão
b = coeficiente linear
5.2.3 Exatidão
A exatidão foi determinada através de teste de recuperação em três
concentrações distintas. Quantidades conhecidas de padrão foram adicionadas a
quantidades fixas de amostras e calculou-se a recuperação de padrão adicionado
pela expressão:
Exatidão = [(LTL~LA)xCp l~PAXIOO%
em que L T é o valor da leitura total, LA é o valor de leitura da amostra, LP é o valor
de leitura do padrão e PA é a quantidade de padrão adicionado.
Para a preparação das soluções-mãe de padrão e de amostras de besilato de
anlodipino adotou-se o seguinte procedimento:
Para a preparação das soluções padrão de besilato de anlodipino, pesaram-
se 50 mg de matéria-prima de besilato de anlodipino, transferiu-se para um balão de
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81
50 mL, adicionou-se 5 mL de metanol , completou-se o volume com água e filtrou-se,
em seguida (solução-mãe padrão, 1 mg/mL).
Para os comprimidos, pesou-se massas equivalentes a 50 mg de besilato de
anlodipino e transferiu-se para balões de 50 mL. Adicionaram-se 5 mL de metanol e
completou-se o volume com água (soluções-mãe das amostras, 1 mg/mL).
Foram, então, preparadas as soluções em triplicata contendo padrão e
amostra de besilato de anlodipino, conforme a tabela 6. A primeira diluição foi feita
com 5 mL de metanol e o restante completou-se com água. E a segunda diluição
com fase móvel constituída de MeOH e H20 , com TEA 1 % acidificada com ácido
fosfórico pH 5.0, ( 35:65 v/v).
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82
TABELA 12
Resultados experimentais obtidos na recuperação de solução padrão de besilato de anlodipino adicionada as soluções amostra de besilato de anlodipino 5 mg(A), 10 mg (B), e formulado 5 mg (C) empregando o método cromatográfico.
75 75 1416005
75 75 1335398
A 75 75 150 2743663 74,59 99,45
125 75 200 3705151 125,51 100,41
175 75 250 45993683 172,57 98,6
75 75 1357433
B 75 75 150 2773360 74,99 99,99
125 75 200 3735995 125,99 . 100,79
175 75 250 4728002 178,52 102,01
75 75 0,2605
C 75 75 150 0,5240 22,25 98,9
125 75 200 0,5718 26,31 99,3
175 75 250 0,6142 29,92 98,01
* Média de três determinações para cada concentração
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83
5.2.4 Precisão
Foi utilizado o ponto médio da linearidade. Foram preparadas 10 amostras
durante três dias consecutivos na concentração de 200 mcg/mL das amostra de 5
mg (A), 1 O mg (B) e 5 mg ( C) formulado de besilato de anlodipino.
As amostras foram obtidas pesando-se 1460,4 mg do pó da apresentação de
10 mg que corresponde a 50 mg de besilato de anlodipino. Transferiu-se para
balão volumétrico de 100 mL acrescentou-se 5 mL de metanol e completou-se o
volume com água destilada.O procedimento para a obtenção da solução na
concentração de 200 mcg/mL é o mesmo descrito na linearidade. Os resultados
estão apresentados nas tabelas 13,14 e 15.
TABELA 13
Resultados experimentais das soluções da amostra de 5 mg (A) de besilato de anlodipino, utilizadas para precisão do método cromatográfico MeOH/H20 5:95, na primeira diluição, e fase móvel (35:65 MeOH/H20, tampão TEA a 1 % acidificada com ácido fosfórico pH 5,0) posteriormente.
4025532 2827,72 200
4013473 1317,34 200
4077026 1927,573 200
4066629 6804,489 200
4083854 2607,103 200
4034248 22,62742 200
4036847 27311,29 200
4080425 18053,85 200
4041902 47936,18 200
4011411 262,3366 Média
4047134 10907,05 DPR(%)
0,2695 * Média das três determinações
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TABELA 14
Resultados experimentais das soluções da amostra de 10 mg (8) de besilato de anlodipino, utilizadas para precisão do método cromatográfico MeOH/H20 5:95, na primeira diluição e fase móvel (35:65 MeOH/H20 , tampão TEA a 1% acidificada com ácido fosfórico pH 5,0) posteriormente.
Amostra . Desvio padrão três
-""':>."-'X
3913922 4022,73
200 3908764 8963,993
200 3871527 29110,88
200 3946228 2879,339
200 3963412 1412,092
200 3951565 6583,871
200 3861324 11775,45
200 3851427 24222,65
200 3826403 28852,79
200 4206802 3597,759
Média 3930137 12142,15
DPR(%) 0,3089
* Média das três determinações
TABELA 15
Resultados experimentais das soluções da amostra de 5 mg (C) formulado de besilato de anlod ipino, utilizadas para precisão do método cromatográfico MeOH/H20 5:95, na primeira diluição e fase móvel (35:65 MeOH/H20 , tampão TEA a 1 % acidificada com ácido fosfórico pH 5,0) posteriormente.
200 3993853 2742,2
200 3952051 58329,9
200 3810725 12506,6
200 3831431 9233,4
200 3905619 4988,6
200 3805011 1055,7
200 3911716 314,7
200 3869015 37288,6
200 3951481 23650,6
200 3859174 2076,1
Média 3889007 15218,6
DPR(%) 0,3913
* Média das três determinações
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85
TABELA 16
São apresentados resultados obtidos na determinação do teor de besilato de anlodipino nas amostras de 5 mg (A), 10 mg (B) e formulado 5 mg (C) , intra-dia e inter-dia empregando o método cromatográfico.
DPR (%)
Dia 2 5,23±0,04 10,30±0,19 5,10±0,00
DPR (%) 0,67 0,18 0,02
Dia 3 5,20±0,04 10,02±0,15 4,95±0,01
DPR (%) 0,83 1,47 0,03
I
DPR (%) 0,03 0,69 0,75
*Média aritimética dos valores ( n=10)
** ANOVA (n=10)
precisão do método de acordo com as amostras A., B, e C=
DF xl00%= 10907,05+12142,155+15218,6 xI00%=03224% CMD 4047134+3930137+3889007 '
5.2.5 ROBUSTEZ
A robustez foi medida utilizando-se a concentração de 200 mcg/ml. Variou-se o
volume injetado de 20 mcl para 10 e para 5 microlitros e os resultados foram os
seguintes.
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TABELA 17
Resultados experimentais das soluções da amostra de besilato de anlodipino em MeOH/H20 5:95. Volume injetado 10meL.
Concentração de "Amostra 10 'rTicL Desyio padrão e' leitura mcg/mL . ,~ inj~tados ;~~~,: , r~lâçãó!~trê
medi(Jas 200 3972903 725,52
200 3818727 2755,47
200 3810845 3307,59
Média 3867491 2262,86
DPR(%) 0,06
TABELA 18
Resultados experimentais das soluções da amostra de besilato de anlodipino em MeOH/H20 5:95. Volume injetado 5 meL.
200 1896054 54,44722
200 1905118 825,1936
200 1921104 11881,52
Média 1907425 4253,719
DPR (%) 0,223
5.2.6 Teste de estresse
Em quatro balões volumétricos (1, 2, 3, 4) de 25 mL colocou-se 12,5 mg de
besilato de anlodipino e diluiu-se com 25mL de metanol chegando-se a uma
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concentração de 0,5 mg/mL. Transferiu-se para quatro balões volumétricos (5), (6),
(7) e (8) de 10 ml , 1 ml da solução 0,5 mcg/ml e a seguir completou-se o volume
(5) com H20, (6) com H202, (7) com NaOH 1 M e (8) HCI 1 M .Os quatro frascos
foram mantidos em banho maria a 80°C por 4h. De cada frasco retirou-se uma
amostra de 220 mcl e transferiu-se para balões volumétricos de 5 ml (9, 10, 11 e
12), os quais foram completados até o menisco: solução contendo (35:65
MeOH/H20, TEA 1 %. acidificada com ácido fosfórico para um pH 5.0). As soluções
resultantes foram analisadas por HPlC em coluna LiChrospher® 100RP-18 (5IJm)
Merck®,detecção 238nm e fluxo de 1,Oml /min,sendo a concentração final de 22
mcg/mL. Os cromatogramas obtidos estão apresentados na figura 13.
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
88
30 .
(a) ~"J .
1')
Figura 13- Cromatogramas desenvolvidos em coluna LiChrospher® 100RP-18 (5iJm) Merck®. Amostras de 0,5 mg/mL de besilato de anlodipino em H20(a), em H20 2 (b), em NaOH (c) e em HCI (d) todos com a segunda diluição com fase móvel (35:65 MeOH/H20 TEA 1 % acidificada com ácido fosfórico para um pH 5,0), concentração final 22 mcg/mL e comprimento de onda de 238nm.
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
89
6 DISCUSSÃO
A Farmacopéia Brasileira quarta edição busca inserir novos fármacos. Antes
de iniciar este trabalho de pesquisa a Farmacopéia Brasileira foi consultada para
que fossem informados quais seriam os fármacos de interesse para desenvolver
uma monografia. Três foram sugeridos e o escolhido foi o besilato de anlodipino.
Trata-se de uma molécula de pKa básico, classificada como antipertensivo,
mais especificamente, bloqueador do canal de cálcio.
As amostras usadas para o desenvolvimento do trabalho foram besilato de
anlodipino 5 mg (A), 10 mg (B) e amostra formulada no próprio laboratório (C)
equivalente a 5 mg. Os parâmetros avaliados, linearidade, limite de detecção, limite
de quantificação, precisão, exatidão, recuperação e robustez, estão de acordo com a
resolução da ANVISA 899 de 29 de Maio de 2003. Dois métodos forám otimizados e
validados.
Foram avaliados seis parâmetros para a validação do método
espectrofotométrico no visível: Linearidade, limite de detecção, limite de
quantificação, precisão exatidão, recuperação e robustez. Para o método
desenvolvido através do espectrofotômetro no visível, a varredura mostrou que a
substância possui absorção máxima em comprimento de onda de 364,4 nm. Para
comprimento de onda de 240 nm UV também foi observada absorbância da
substância em estudo, mas não foi utilizada visto que, é uma região menos
específica que o comprimento de onda 364,4 nm. O método apresentou ótimo
coeficente de correlação, r =0,9999 e limite de quantificação e detecção 1,8 mcg/mL
e 0,541 mcg/ mL, respectivamente.
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
90
Utilizando o cromatógrafo CG os resultados obtidos não foram satisfatórios,
pois, foram quase os mesmos de TO (tempo da amostra não retida) . O tempo de
retenção obtido = 3,18 min, não foi suficiente para haver separação. E o
equipamento não estabiliza não estabiliza em comprimentos de onda baixos como
240 nm e como o comprimento de onda de escolha foi 238nm, não foi possível a
utilização do referido equipamento.
Para o cromatógrafo Shimadzu foi possível obter tempos de retenção em
torno de 3,57 min para um TO de 1,23. O método cromatográfico de escolha para a
validação consiste em coluna C18 Coluna LiChrospher ® 100RP-18 (5\-lm) Merck®,
fase móvel metanol e água (35:65v/v), À 238 nm, fluxo 1 mUmin e concentração 200
mcg/mL. Através dos cálculos pode-se confirmar que o método é exato, preciso e
robusto.
Trabalhar-se-á com metanol e água na composição da fase móvel com a
trietilamina a 1 %(TEA). Esta possui fundamental importância para proporcionar a
saída do fármaco da coluna C18 LiChrospher® 100RP-18 (5\-lm) Merck® pois o
besilato de anlodipino é um composto básico, e após vários testes apenas com
metanol/água e metanol/ acetonitrila contatou-se que a molécula não consegue eluir
num tempo ideal. A escolha da coluna c18 deveu-se a mesma ser bastante comum
em métodos de análise tornando, portanto, o método bastante acessível, uma vez
que o objetivo é inserí-Io na Farmacopéia Brasileira. Mas não sendo necessária para
métodos com a coluna C18 Synergi hydro RP, Phenomenex®, 250 x 4,6 mm.
A coluna C18 synergi hydro RP (coluna capeada) conseguiu reter melhor o
anlodipino besilato quando testada no cromatógrafo Shimadzu, porém o método foi
validado com a coluna LiChrospher® 100RP-18 (5\-lm) Merck®, pois possui um custo
muito menor.
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira . Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
91
o método validado apresentou em seus cromatogramas um pico muito
caudado que justifica-se para solutos básicos em presença de silanóis.
6.1 Identificação
Primeiramente a amostra foi identificada pelo método espectrofotométrico no
visível descrito nas Farmacopéias Britânica 2005 e Européia 2004. Observou-se que
a amostra apresentou absorção máxima em 360 nm, como descrito nestas
farmacopéias.
6.2 Doseamento
A determinação do besilato de anlodipino como matéria-prima foi realizada
utilizando o método espectrofotométrico e o cromatográfico, sendo que os resultados
foram satisfatórios para ambos.
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
92
6.3 Metodologia analítica
o besilato de anlodipino é facilmente solúvel em metano!. Outros solventes
foram utilizados, porém em ambos os métodos foi necessário solubilizar o fármaco
em metanol para, a seguir, usar outro solvente de escolha.
6.3.1 Curva analítica
As concentrações utilizadas para determinação da curva analítica para
desenvolvimento e validação do método espectrofotométrico (41-61 mcg/mL) foram
escolhidas a partir de testes com várias concentrações, a partir da absorbância da
concentração de 45 mcg/mL que foi em torno de 0,5 justificam-se as concentrações.
A curva deve ser obtida com no mínimo cinco pontos (ANVISA), O coeficiente de
correlação (r) deve ser calculado para que se tenha uma estimativa da qualidade
da curva obtida, pois quanto mais próximo de 1,0, menor a dispersão do conjunto de
pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados
(RI BANI , 2004).
A figura 7 apresenta a sobreposição dos espectros obtidos para a curva de
calibração nas concentrações de 41-61 mcg/mL. A representação gráfica da curva
analítica está apresentada na figura 6. Verifica-se boa linearidade com coeficiente de
regressão 0,9995. Realizou-se a leitura a 364,4nm e a medida em que se
aumentava a concentração também aumentava a amplitude de maneira
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira . Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
93
proporcional, apresentando um coeficiente de correlação próximo de 1. A ANVISA
recomenda um coeficiente de correlação igual a 0,99 e o INMETRO um valor acima
de 0,90 (RIBANI, 2004).
6.3.1 .2 Determinação do teor de besilato de anlodipino nas amostras manipuladas e
industrializadas
A aplicação do método espetrofotométrico no visível foi satisfatório. O
coeficiente de variação (desvio padrão relativo) que indica a preCisão do método
está dentro das normas estabelecidas (menor que 2%). Foram efetuadas 10 leituras
com concentrações de 49 mcg/mL durante três dias consecutivos. O desvio padrão
foi calculado e, ainda, as médias dessas absorbâncias. Pelo método ANOVA
calculou-se a precisão intra-dia.
6.3.1.3 Teste de recuperação
O teste de recuperação demonstra a exatidão de um método analítico. A
exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo
método em estudo em relação ao valor verdadeiro. Várias metodologias para a
determinação da exatidão estão disponíveis. Executou-se a metodologia analítica
proposta na análise de uma substância de pureza conhecida , padrão de referência
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
94
(ANVISA, 2003). Adicionou-se quantidade conhecida de padrão (22,5 mcg/mL) a
amostras de (22,5, 26,5 e 30,5 mcg/mL). A tabela 4 mostra os resultados obtidos no
teste de recuperação nas amostras pesquisadas. Pode-se observar que os
resultados apresentam pouca dispersão estando entre 97,0 e 100,7%.
6.3.1.4 Limite de detecção e quantificação
o limite de detecção é calculado como sendo correspondente à concentração
que produziria um valor do sinal medido 3 vezes maior que o nível de ruído médio,
medido com a solução de controle ou branco (LEITE, 2002) .0 limite de quantificação
é a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com
precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas
(ANVISA, 2003). Os limites de detecção e quantificação foram respectivamente 0,54
mcg/mL e 1,8 mcg/mL.
6.3.1.5 Robustez
Durante o desenvolvimento da metodologia deve-se considerar a avaliação da
robustez. Constatando-se a susceptibilidade do método a variações nas condições
analíticas, estas deverão ser controladas e precauções devem ser incluídas no
procedimento (ANVISA, 2003). Segundo a ANVISA diferentes parâmetros podem
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
95
ser avaliados para o método espectrofotomértrico, como temperatura, diferentes
fabricantes de solventes, variação do pH da fase móvel e'variação na composição
da fase móvel. A variação feita foi a mudança de fabricante do solvente de metanol.
Não foram observadas mudanças significativas tabela 9.
6.3.2 Método cromatográfico
o segundo método desenvolvido foi a cromatografia líquida de alta eficiência
com detector UV, fase reversa, coluna LiChrospher® 1 00RP-18 (5I..lm) Merck®, fluxo
de 1 mUmin, concentração de 200 mcg/mL, correspondente ao ensaio n 5.
Com o propósito de desenvolver uma metodologia simples, rápida, de baixo
custo e toxicidade, optou-se por utilizar metanol e água como fase móvel por sua
fácil obtenção. Porém somente com água e metanol não foi possível obter um pico
com boa assimetria. Portanto ao invés da água foi usado um tampão contendo TEA
a 1 % com pH corrigido para 5,0 com ácido ortofosfórico.
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
96
6.3.2.1 Construção da curva analítica
A curva analítica foi construída no intervalo de 50 a 350 mcg/mL Obteve-se
boa linearidade pois o coeficiente de correlação foi de 0,9999.
6.3.2.2 Determinação do teor nas amostras manipuladas e industrializadas
A determinação do teor é expresso através da precisão e neste trabalho foi
calculado em três dias consecutivos para cada amostra com, no mínimo, dez
repetições. O desvio padrão relativo calculado para cada amostra ficou entre 0,01 e
1,47 %. Desta forma pode-se concluir que o método é preciso.
6.3.2.3 Teste de recuperação
A tabela 12 mostra os resultados obtidos no teste de recuperação das
amostras pesquisadas. A análise foi executada acrescentando-se quantidades iguais
de solução padrão (75 mcg/mL) a diferentes concentrações de amostra (75 mcg/mL,
125 mcg/mL e 175 mcg/mL). Os valores encontrados ficaram entre 98 e 102%
significando um método exato. Na maioria dos procedimentos analíticos de
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97
validação, valores de recuperação dentro da faixa 70~ 120% são aceitos (LANÇAS,
2004).
6.3.2.4 limite de detecção e limite de quantificação
Quando são realizadas medidas em amostras com baixos níveis do analito ou
de uma propriedade, como por exemplo, análise de traços, é importante saber qual o
menor valor de concentração do analito ou da propriedade que pode ser detectado
pelo método: tem~se portanto o limite de detecção (lO). O limite de quantificação
(lO) pode ser definido como a menor concentração do analito que pode ser
determinada com um nível aceitável de exatidão e precisão. Os valores obtidos para
o limite de detecção e quantificação foram respectivamente 2,27 e 7,5 mcg/mL.
6.3.2.5 Robustez
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas, temperatura, fluxo da fase móvel e
diferentes lotes ou fabricantes de colunas.
A robustez para o método cromatográfico foi analisada injetando~se diferentes
volumes para análise no cromatógrafo. A quantidade padronizada no método foi de
20 mcl e as variações de injeção foram para 10 mcl e 5 mcL. Mudanças
significativas não foram observadas.
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
98
7 CONCLUSÃO
Nos testes preliminares pode-se perceber que para o método cromatográfico
a TEA (trietilamina) apresentou fundamental importância para eluição do besilato de
anlodipino na coluna LiChrospher® 100RP-18 (5I..lm) Merck®;uma vez que somente
com metanol e acetonitrila não foi possível a saída do fármaco.
° método validado por HPLC comparado aos já existentes foi de grande valia pois
trabalhou-se com metanol e tampão (35:65 MeOH/H20, tampão TEA a 1 %
acidificada com ácido fosfórico pH 5,0), sendo que os já existentes apresentam
porcentagem de solvente orgânico e tempo de retenção maiores, em torno de 7
minutos e além de trabalharem com metanol usam também acetonitrila (USP, 31) e
Bristish Pharmacopoeia, 2005)
Para o método espectrofotométrico a vantagem em relação aos métodos já
propostos foi a não utilização de ácidos, mas somente metanol e água, sendo que a
quantidade de metanol utilizada foi de somente 5% na primeira diluição.
Desta forma o trabalho foi de grande valia pois os métodos validados utilizam
solventes menos tóxicos, apresentam menor custo e ainda, para a cromatografia,
um tempo de análise menor.
Desenvolvimento de métodos para análise do besilato de anlodipino para inclusão da monografia na Farmacopéia Brasileira. Helen Dutra Leite - Dissertação de mestrado, FCF/USP, 2009
REFERÊNCIAS
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MONOGRAFIA DO BESILATO DE ANLODIPíNO
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Estrutura química do besilato de anlodipino
* carbono quirálico
C2oH25CIN205 C6H60 3S (NIAZI, 2004;BRITISH, 2005).
nome químico 5-metil-3-etil- 2-(2-aminoetóximetil)-4-(2-c1orofenil)-1 ,4dihidro-6-metil-3,5-piridinacarboxilato benzenosulfonato são: fórmula molecular:
DESCRiÇÃO
Caracteres físicos. PÓ branco a quase branco.
Solubilidade. Pouco solúvel em água, facilmente solúvel em metanol, ligeiramente
solúvel em etanol , pouco solúvel em 2 propanol.
IDENTIFICAÇÃO
Dissolver 5 mg em solução1 % (v/v) de ácido clorídrico 0,1 mol/L em metanol e diluir
para 100 mL com a mesma solução. Examinar entre 300nm e 400nm. A solução
mostra absorbância máxima a 360nm. A absorbância específica no comprimento de
onda máximo é de 1,13 a 1,21.
DOSEAMENTO
A.Por espectrofotometria de absorção no visível:
Dissolver 50 mg de besilato de anlodipino em 5 mL de metanol e completar o volume
com água destilada em um balão de 50mL.Preparar uma amostra na concentração
de 49 mcg/mL. Efetuar leitura a 364nm e comparar com padrão.
B. Por Cromatografia líquida de alta eficiência empregando cromatógrafo provido de
detector espectrofotométrico ajustado em 238nm; Coluna de sílica i2,5x4,6x5j.Jm,
detecção 238nm . A fase móvel é composta de (35:65 MeOH/H20 , tampão TEA a
1 % acidificada com ácido fosfórico pH 5,0). Ajustar o fluxo do solvente
parai ,0mLlmin.
Preparar as seguintes soluções:
Solução(1 ):pesar quantidade de comprimidos, previamente pulverizados, contendo
50mg de besilato de anlodipino e transferir para um balão de i00mL. Completar o
volume com o solvente empregado como fase móvel. Preparar uma solução com
concentração final de 200mcg/mL, usar fase móvel como diluente.
Solução (2):dissolver 50mg de padrão e completar para 100mL com fase
móvel.Preparar uma solução final de 200mcg/mL, usar fase mmóvel como diluente.
Injetar 20mcL de solução (2) e determinar a assimetria do pico no cromatograma
obtido. Utilizando a fórmula:T=W/2f, em que :T corresponde ao fator de assimetria.
Deve ser, no máximo, 2,5W. W corresponde à largura do pico, em mm, medida em
altura de 5% da altura total , f é a distância em mm a 5% da altura entre a frente do
pico e a perpendicular que passa pelo ponto máximo. Injetar separadamente 20mcl
de cada solução e calcular o conteúdo de besilato de anlodipino a partir das áeras
obtidas nos cromatogramas das soluções (1) e (2) .
EMBALAGEM E ARMAZENAMENTO
Em recipientes perfeitamente fechados e protegidos da luz.
CLASSE TERAPÊUTICA
Antihipertensivo
~.\:r AOAC INTERNATIONAl
May1.2008 The Scientific AssiJciation Dedicated to Analytical Exceflence®
Erika Rosa Maria Kedor-Hackmann Av. Prof. Uneu PreStes 580 São Paulo Brazil, 05508-900
ABSTRACT TITlE:
• :...,A!!!tIº!!l~t~OI~?TIIl!Jl°N(~ __
ASSIGNED POSTER SESSION:
Dear Dr. Kedor Hackmann:
Determination of amlodipine besylate in tablets by spectrophotometry and high performance liquid cromatography H.D. leite, P.L García, J.M. Alves, M.M.Santoro, E.R. Kedor-
. Hackm;:mn, • UniversityofSãõ' Pauio~Sao pauio, Sãõ·pãliiõ, ' BRAZll Pharmaceutical Analysis, Authenticity and Safety
lhank 'you for submitting an abstract for post~r presentation at the 2008 AOAC INTERNATIONAl Annual Meeting. lhe meeting will take place September 21-24, 2008 at the Hyatt Regency Dallas in Dallas, Texas, USA. 00 behalfof AOAC INTERNATIONAl, I would like to cordially invite you to present your poster at this year's
. meeting.
Please note the poster session(s) that you have been assigned, copied above on this letter. At this time, your abstract .has been accepted for publication in the Pre/iminary Programo The program is mailed to the Association'sconstituency in mid-June and provides a preview of the Annual Meeting technical programo
Poste r authors whose abstracts are accepted for publication in the Final program will be notified of their final acceptance no later than August 7, 2008. The Final Program for the 2008 AOAC INTERNATIONAL Annual Meeting will be distributed to ali Meeting registrants upon check-in in Dallas, and will include a fuU abstract !isting and author index of ali Poster Presentations accepted for the Annual Meeting. A final poster listing, including assigned poster numbers and detailed presentation information, will be made available by August 7, 2008.
AOAC INTERNATIONAl invites and welcomes scientists from every Pilrt of theworld to attend andparticipate in the At:l~ua: M~ting. Tofind out ifYQU needa Visé'l .or qualify.for theredticedmeeting fee forregistrants from deve1opingcountdes, the AOAC meetings websitenowincludes information regarding lriternational Travei, with links to the Wortd Bank list of developing countrie;:; and comprehensive information on obtaining a Visa. For more detailed information on the meeting, including hotel information, visit the 122nd AOAC Annual Meeting & Exposition website via www.aoac.org. Please allow ample time for visa processing. as the application process can take several months in somecountries.
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Sincerely,
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