FACULDADE DE ODONTOLOGIA “DR. MÁRIO LEITE BRAGA” DE PRESIDENTE PRUDENTE
ANÁLISE DA VIABILIDADE CELULAR DO Bifidobacterium animalis subsp.
lactis HN019 EM SOLUÇÃO SALINA.
DISCENTES: BIANCA CRISTINA TIOSSO DA SILVA ÉDER DA SILVA DÓLENS YARA LOYANNE DE ALMEIDA SILVA LEVI
PRESIDENTE PRUDENTE – SP 2017
RESPONSÁVEL: PROFª. DRA. LUCIANA PRADO MAIA COLABORADORA: PROFª. DRA. FABIANA GOUVEIA STRAIOTO
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 4
2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 7
3 MATERIAL E MÉTODO .............................................................................................. 8
4 FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS ............................................................. 11
5 RESULTADOS ESPERADOS ................................................................................... 12
REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 13
RESUMO
ANÁLISE DA VIABILIDADE DO Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 EM SOLUÇÃO SALINA.
Introdução: Os probióticos são microrganismos vivos que conferem benefícios a
saúde quando consumidos em quantidades adequadas, sendo indicados para
prevenir e tratar doenças. Os efeitos do uso de probióticos na saúde bucal vêm
sendo investigados, porém, estudos in vitro são necessários para estabelecer
protocolos de utilização dessa nova abordagem terapêutica. Objetivo: O objetivo do
estudo será analisar a viabilidade celular de microrganismos do gênero
Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (B. lactis) HN019 presentes em solução salina
em condições de armazenamento laboratorial (4oC) e em condições do biotério
(temperatura ambiente). Material e Métodos: Este estudo será in vitro, cego,
totalmente aleatorizado, realizado em triplicata, em 3 experimentos independentes.
Cepas liofilizadas de B. lactis HN019 serão reativadas e posteriormente mantidas
em solução salina em temperatura ambiente, a 4oC e 37oC por 48 horas. Será
realizado monitoramento do padrão de crescimento por meio de leitura da turbidez e
contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). O crescimento do
microrganismo será monitorado a cada 1 hora por meio de leitura do comprimento
de onda e realização de diluição seriada do inóculo a cada leitura. Forma de Análise dos Resultados: Os dados referentes aos valores de turbidez e sua
relação com o número de UFC serão tabulados e a escolha do teste estatístico será
definida após a análise exploratória dos dados. O nível de significância de 5% será
utilizado nas análises. Resultados Esperados: Espera-se com este estudo obter
padronização para utilização de bactérias probióticas do gênero Bifidobacterium
animalis subsp. lactis HN019 em estudos in vivo em animais.
Palavras-chave: Bactérias, Probióticos, Meios de Cultura.
4
1 INTRODUÇÃO
O probiótico é definido como um suplemento alimentar contendo microrganismos
vivos, os quais afetam beneficamente o hospedeiro, melhorando o balanço da microbiota
intestinal, normalmente são indicados para prevenir e tratar doenças. Podendo ser
encontrados em alimentos industrializados presentes no mercado, como leites fermentados e
iogurtes, alimentos fermentados de forma caseira como as coalhadas, queijos, bebidas
frutais. A fermentação usando probióticos é utilizada para a preservação de uma série de
produtos agrícolas sem processar, como cereais, raízes, tubérculos, frutas e hortaliças, leite,
carne, peixe, entre outras1,2. Possui características potencializadoras da redução de riscos
de doenças crônicas, além de proporcionar saúde e bem-estar3.
Durante a última década, a identificação de bactérias associadas à saúde e
potencialmente benéficas que podem residir no sulco gengival e na cavidade oral tem sido
tema de numerosos estudos focados na prevenção e tratamento de doenças4. O consumo de
probióticos pode modificar a flora bacteriana e modular a resposta imunológica5. Pesquisas
mostram a eficácia do probiótico favorecendo a atividade fagocítica inespecífica dos
macrófagos alveolares, sugerindo uma ação sistêmica por secreção de mediadores que
estimulariam o sistema autoimune, atuando, também, no equilíbrio da microbiota intestinal,
alívio da constipação, imunomodulação, prevenção do câncer de cólon, prevenção de
eczemas atópicos, atividade supressiva contra patógenos gastrintestinais, prevenção de
patologias do trato urogenital feminino, desordens intestinais, entre outros, levando a um
aumento da resistência contra a infecção2,6. Esses microrganismos possuem fonte de
compostos bioativos que apresentam promissores efeitos benéficos no metabolismo ósseo e
muscular1,5. Sua colonização no trato gastrintestinal através da competição por sítios de
adesão, restabelece a microflora intestinal após danos quimioterápicos6. Embora resultados
promissores tenham sido relatados na literatura, é importante lembrar que os achados
obtidos sobre os probióticos não podem ser generalizados, uma vez que dependem da
dosagem, frequência e via de administração2.
Estudos clínicos sugerem que os probióticos são seguros para a saúde e podem ter
efeitos positivos sobre a saúde bucal. A maioria dos estudos envolvendo sua utilização na
saúde bucal concentram-se em medidas que visam diminuir a quantidade de Streptococcus
5
mutans, cuja presença é considerada um importante fator de risco para o desenvolvimento
de cárie7. Na doença periodontal, os probióticos podem minimizar a aderência de bactérias
patogênicas, assim como seu estabelecimento, multiplicação e integração. Além de modular
a resposta imune-inflamatória desencadeada pelos patógenos periodontais6,8. Os principais
microrganismos utilizados como probióticos são bactérias dos gêneros Lactobacillus,
Enterococcus, Bacillus e Bifidobacterium6,9–11. Até o momento, estudos que investigaram os
efeitos dos probióticos sobre doenças periodontais utilizaram principalmente
microorganismos do gênero Lactobacillus8. No entanto, surgiram relatos que identificaram os
Lactobacillus associados com condições clínicas patológicas, como bacteremia12 e,
ocasionalmente, endocartite e abscesso13, apesar de ser improvável que os Lactobacillus
fossem os agentes causais nesses casos13. De qualquer forma, essas observações,
juntamente com a emergência de cepas resistentes à vancomicina na prática clínica14,
resultaram em uma preocupação quanto a segurança do seu uso. Nesse contexto, outros
potenciais probióticos merecem ser investigados.
A Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (B. Lactis) possui propriedades
imunomodulatórias e antimicrobianas15, geralmente está presente na microbiota intestinal, e
apresenta um relacionamento simbiótico com o hospedeiro16. Alguns estudos demonstraram
que a B. Lactis pode diminuir o crescimento de Streptococcus mutans sem causar efeitos
adversos, contribuindo na prevenção da cárie dentária17. Pode também inibir o crescimento
de periodonto patógenos na cavidade oral18, reduzir a quantidade de biofilme bacteriano nas
superfícies dentárias, bem como o índice de placa e o índice gengival em indivíduos
saudáveis6, sendo considerada um probiótico promissor. Apesar das evidências, são poucos
os estudos que têm avaliado os efeitos da suplementação probiótica com bactérias do
gênero Bifidobacterium na periodontite.
O microrganismo B. lactis HN019 (Dupont® de Nemoursand Company, Wilmington,
DE, EUA) foi introduzido mais recentemente como probiótico, sendo comercializado como
um ingrediente para suplementação dietética e produtos fermentados e está disponível em
diferentes produtos (formato de liberação, dose, combinado com outros ingredientes ativos.
O B. lactis HN019 foi isolado de um iogurte comercial e mantido como cepa e consiste em
um bastonete Gram-positivo com morfologia irregular19. Estudos in vitro reportaram
6
propriedades anti-infecciosas e de melhora na resposta imunológica20–23, além de não
exibirem toxicidade oral ou patogenicidade em ratos ou humanos20,24.
Considerando que os B. lactis possam ser um importante aliado na prevenção e no
tratamento de doenças bucais, a determinação de um protocolo de manutenção destes
microrganismos viáveis para desenvolvimento de estudos experimentais em animais que
visem garantir a reprodutibilidade, qualidade dos ensaios e a credibilidade dos resultados é
de suma importância para a estruturação dos futuros pilares da terapia probiótica.
Previamente à utilização desse microorganismo probiótico em estudos experimentais em
animais, é importante padronizar as condições de manutenção e armazenamento da solução
contendo probiótico, considerando a necessidade de otimização de tempo dos experimentos
e uso racional do microrganismo com finalidade de reduzir custos.
7
2 OBJETIVO
O objetivo do estudo será analisar a viabilidade celular de microrganismos do gênero
Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (B. lactis) HN019 presentes em solução salina em
condições de armazenamento laboratorial (4oC), em condições do biotério (temperatura
ambiente) e em condições de cultivo normal (37oC).
8
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Desenho experimental Este estudo será in vitro, cego (um dos pesquisadores criará um código de
identificação dos grupos experimentais que será desconhecido pelos operadores), totalmente
aleatorizado. Com objetivo de garantir a reprodutibilidade e padronização dos experimentos,
os mesmos serão realizados em quadruplicata, em 3 experimentos independentes (ou seja,
realizados em dias diferentes) (n=12). Cepas liofilizadas de B. lactis HN019 serão reativadas
e resuspendidas em solução salina em temperatura ambiente, a 4oC e 37oC por 48hs. Será
realizado monitoramento do padrão de crescimento por meio de leitura da turbidez e
contagem de Unidades Formadoras de Colônia (UFC).
3.2 Reativação dos Microrganismos Cepas de estoque liofilizadas de B. lactis HN019 (HOWARUTM Bifido, E. I. Dupont® de
Nemoursand Company) serão reativadas em 10 ml de caldo MRS (Man Rogosa and Sharpe,
Difco, Sparks, MD, USA. Deste caldo serão coletadas alçadas para serem semeadas em
placa de petri, contendo Agar MRS enriquecido com L-cisticina (Difco), pela técnica do
esgotamento, a fim de isolar colônias e verificar sua pureza. Estas placas serão
armazenadas por 48h a 37ºC em condições anaeróbicas para favorecer o crescimento da
colônia, decorrido esse tempo a placa contendo a cultura será armazenada em resfriamento
a 2ºC25.
3.3 Monitoramento da viabilidade celular: Para a análise de viabilidade celular da população bacteriana B. lactis HN019 em
salina será realizada curva de crescimento por meio de mensurações sequenciais (intervalos
de 1 hora) da turbidez de solução contendo microrganismo em espectrofotômetro com
comprimento de onda igual a 600nm25. Para cada hora de leitura será realizada a
quantificação de UFC estabelecendo a relação do valor da leitura de espectrofotometria x
número de células durante 48 horas de acordo com as seguintes condições experimentais:
• Grupo 1: solução salina em temperatura ambiente
• Grupo 2: solução salina a 4oC
9
• Grupo 3: solução salina em 37oC em anaerobiose (controle)
Para início do experimento colônias do microrganismo serão individualmente
ressuspensas 1,5 x 108 unidades formadoras de colônia (UFC)4 em 10 ml de salina e
armazenado de acordo com a condição experimental de cada grupo. A suspensão será
agitada por 15 segundos e a turbidez imediatamente verificada por meio de
espectrofotômetro (DU®-65, Beckman, Coulter Inc., Fullerton, CA, USA) a 600 nm.
Dessa forma será possível determinar o período que a cepa em questão entra na fase
estacionária, a qual é caracterizada por diminuição significativa da taxa de crescimento
devido às condições limitantes do meio. As células continuam metabolizando e se dividindo,
mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de
morte celular, o que mantém constante o número de células viáveis na população. A curva
de crescimento atinge um platô. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a
taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou
incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente
desfavoráveis.
3.4 Quantificação de Microrganismos A quantificação do microrganismo será por meio da contagem de UFC e os valores
obtidos por espectrometria. A suspensão após a leitura em espectrofotômetro contendo os
microrganismos será vortexada por 1 minuto e a suspensão será diluída serialmente até a
proporção de 1:100.000.000 (10-8) em solução salina. Para isto, uma amostra inicial de cada
repetição de grupo experimental (100 μL) obtida em cada 1 hora de crescimentos dos grupos
experimentais deverá ser diluída de forma seriada em microtubos com salina contendo 900
μL de solução salina estéril. O processo será repetido no mínimo em 6 diluições para que a
concentração de microrganismos diminua, dando origem a colônias suficientemente
separadas, possibilitando assim a contagem. Para a determinação do número de
microrganismos da amostra original multiplica-se o número de colônias formadas a partir da
amostra diluída, pelo volume de diluição. Uma diluição é uma expressão de concentração,
não de volume.
As diluições serão semeadas em placas de petri contendo o meio de cultura Agar
MRS para determinação do microrganismo. A semeadura será realizada pela deposição de
10
alíquotas (20 μL) destas diluições em duplicata nas placas. As placas serão incubadas em
estufa a 37º C por 48h em anaerobiose. As unidades formadoras de colônia (UFC) serão
contadas nas diluições que permitam a visualização das colônias isoladas e os resultados
serão expressos em UFC/ml. (Figura 1)26. .
Figura 1: Placas após semeadura e crescimento dos microrganismos para contagem e
cálculo das UFC/ml.
11
4 FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS
Os dados referentes aos valores de turbidez e sua relação com o número de UFC
serão tabulados e a escolha do teste estatístico será definida após a análise exploratória dos
dados. Se observada distribuição normal, será utilizado Teste T para comparações entre os
grupos. No caso de distribuição não-normal será utilizado o teste de Mann Whitney. O nível
de significância de 5% será utilizado nas análises.
12
5 RESULTADOS ESPERADOS
Espera-se com este estudo determinar por quanto tempo o microrganismo probiótico
B. lactis HN019 ficará viável em solução salina em condições de armazenamento
laboratoriao (4oC) e em condições do biotério (temperatura ambiente), com finalidade de
obter padronização e eficiência da aplicação desses microrganismos para estudos in vivo em
animais, estabelecendo assim, um protocolo para execução de pesquisa com estes
microrganismos na instituição.
13
REFERÊNCIAS 1. Santos FL, Ferreira MA, Pires EA, Oliveira FS de, Silva CFG, Vieira RB. Análise das
patentes de tecnologias relacionadas aos probióticos, prebióticos e simbióticos no
Brasil. Brazilian J Food Technol. 2014;17(3):252–8.
2. Ranadheera RDCS, Baines SK, Adams MC. Importance of food in probiotic efficacy.
Food Res Int. 2010;43(1):1–7.
3. Haytac MC, Kunin AA, Belenova IA. Probiotics and oral-periodontal health. EPMA J.
2014;5(Suppl 1):A125.
4. Messora MR, Pereira LJ, Foureaux R, Oliveira LFF, Sordi CG, Alves AJN, Npimoga
MH, Nagata MJH, Ervolino E, Furlaneto FAC. Favourable effects of Bacillus subtilis and
Bacillus licheniformis on experimental periodontitis in rats. Arch Oral Biol. 2016;66:108–
19.
5. Aljewicz M, Cichosz G. The effect of probiotic Lactobacillus rhamnosus HN001 on the
invitro availability of minerals from cheeses and cheese-like products. LWT - Food Sci
Technol. 2015;60(2):841–7.
6. Whitford EJ, Cummins AG, Butler RN, Prisciandaro LD, Fauser JK, Yazbeck R,
Lawrence A, Cheah KY, Wright TH, Lymn KA, Howarth GS. Effects of Streptococcus
thermophilus TH-4 on intestinal mucositis induced by the chemotherapeutic agent 5-
Fluorouracil (5-FU). Cancer Biol Ther. 2009;8(6):505–11.
7. Toiviainen A, Jalasvuori H, Lahti E, Gursoy U, Salminen S, Fontana M, Flannagan S,
Eckert G, Kokaras A, Paster B, Söderling E. Impact of orally administered lozenges with
Lactobacillus rhamnosus GG and Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 on the
number of salivary mutans streptococci, amount of plaque, gingival inflammation and
the oral microbiome in healthy adults. Clin Oral Investig. 2015;19(1):77-83.
8. Dhingra K. Methodological issues in randomized trials assessing probiotics for
periodontal treatment. J Periodontal Res. 2012;47(1):15–26.
9. Teughels W, Durukan A, Ozcelik O, Pauwels M, Quirynen M, Haytac MC. Clinical and
microbiological effects of Lactobacillus reuteri probiotics in the treatment of chronic
periodontitis: A randomized placebo-controlled study. J Clin Periodontol.
2013;40(11):1025–35.
14
10. Bron PA, Van Baarlen P, Kleerebezem M. Emerging molecular insights into the
interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nat Rev Microbiol.
2011;10(1):66–78.
11. Tekce M, Ince G, Gursoy H, Dirikan Ipci S, Cakar G, Kadir T, Ylmaz S. Clinical and
microbiological effects of probiotic lozenges in the treatment of chronic periodontitis: A
1-year follow-up study. J Clin Periodontol. 2015;42(4):363–72.13.
12. Bayer AS, Chow AW, Betts D, Guze LB. Lactobacillemia--report of nine cases.
Important clinical and therapeutic considerations. Am J Med. 1978;64(5):808–13.
13. Gasser F. Safety of Lactic Acid Bacteria and Their Occurrence in Human Clinical
Infections. Bull Inst Pasteur. 1994;92(1):45–67.
14. Johnson AP, Uttley AHC, Woodford N, George RC. Resistance to vancomycin and
teicoplanin: An emerging clinical problem. Clinical Microbiology Reviews.
1990;3(3):280-91.
15. Wibowo N, Bardosono S, Irwinda R. Effects of Bifidobacterium animalis lactis HN019
(DR10TM), inulin, and micronutrient fortified milk on faecal DR10TM, immune markers,
and maternal micronutrients among Indonesian pregnant women. Asia Pac J Clin Nutr.
2016;25(Suppl 1):S102–10.
16. Hojo K, Mizoguchi C, Taketomo N, Ohshima T, Gomi K, Arai T, et al. Distribution of
salivary Lactobacillus and Bifidobacterium species in periodontal health and disease.
Biosci Biotechnol Biochem. 2007;71(1):152–7.
17. Lee DK, Park SY, An HM, Kim JR, Kim MJ, Lee SW, Cha MK, Kim AS, Chung MJ, Lee
KO, Ha NJ. Antimicrobial activity of Bifidobacterium spp. isolated from healthy adult
Koreans against cariogenic microflora. Arch Oral Biol. 2011;56(10):1047–54.
18. Jäsberg H, Söderling E, Endo A, Beighton D, Haukioja A. Bifidobacteria inhibit the
growth of Porphyromonas gingivalis but not of Streptococcus mutans in an in vitro
biofilm model. Eur J Oral Sci. 2016;124(3):251–8.
19. Sanders ME. Summary of probiotic activities of Bifidobacterium lactis HN019. J Clin
Gastroenterol. 2006;40(9):776–83.
20. Arunachalam K, Gill HS, Chandra RK. Enhancement of natural immune function by
dietary consumption of Bifidobacterium lactis (HN019). Eur J Clin Nutr. 2000;54(3):263–
7.
15
21. Gill HS, Rutherfurd KJ, Prasad J, Gopal PK. Enhancement of natural and acquired
immunity by Lactobacillus rhamnosus (HN001), Lactobacillus acidophilus (HN017) and
Bifidobacterium lactis (HN019). Br J Nutr. 2000;83(2):167–76.
22. Gill HS, Rutherfurd KJ, Cross ML, Gopal PK. Enhancement of immunity in the elderly
by dietary supplementation with the probiotic Bifidobactedum lactis HN019. Am J Clin
Nutr. 2001;74(6):833–9.
23. Prasad J, Gill H, Smart J, Gopal PK. Selection and characterisation of Lactobacillus and
Bifidobacterium strains for use as probiotics. Int Dairy J. 1999;8(12):993–1002.
24. Zhou JS, Shu Q, Rutherfurd KJ, Prasad J, Gopal PK, Gill HS. Acute oral toxicity and
bacterial translocation studies on potentially probiotic strains of lactic acid bacteria.
Food Chem Toxicol. 2005;38(2–3):153–61.
25. Liu C, Zhang ZY, Dong K, Guo XK. Adhesion and immunomodulatory effects of
bifidobacterium lactis HN019 on intestinal epithelial cells INT-407. World J
Gastroenterol. 2010;16(18):2283–90.
26. Straioto FG, Ricomini Filho AP, Fernandes Neto AJ, del Bel Cury AA.
Polytetrafluorethylene added to acrylic resins: Mechanical properties. Braz Dent J.
2010;21(1):55–9.