FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA
“Eficacia antimicrobiana in vitro del extracto etanólico de propóleo sobre
cepas de Streptococcus pyogenes”
TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE MÉDICO
CIRUJANO
AUTOR
RANDY BRYAN ESCUDERO FARRO
ASESORES
DR. SANTIAGO BENITES CASTILLO
DRA. AMALIA VEGA FERNÁNDEZ
LÍNEA DE INVESTIGACIÓN
ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y TROPICALES
TRUJILLO – PERÚ
2016
ii
PÁGINAS PRELIMINARES
PÁGINA DEL JURADO
Eficacia antimicrobiana in vitro del extracto etanólico de propóleo sobre
cepas de Streptococcus pyogenes.
Mg. Jaime Polo Gamboa
PRESIDENTE DEL JURADO
Dr. Miguel Ibañez Reluz
SECRETARIO DEL JURADO
Dra. Amalia Vega Fernández
VOCAL DEL JURADO
.
FECHA DE SUSTENTACIÓN Y APROBACIÓN:
07/12/16
iii
DEDICATORIA
En primera instancia agradecer a Dios
sobre todas las cosas, además de permitir
lograr nuestras ansiadas metas que nos
hemos plasmado desde que iniciamos
esta aventura.
A las personas que me dieron la vida, mis
padres, Pamela y Elmer que son mi motor
y fuerza día a día, ya que sin su apoyo
incondicional no hubiese hecho realidad
ningún sueño.
En mención honrosa agradecer a todos
mis hermanos, de la cuales mi hermana
Darsy quien tiene como hija mi mayor
motivo de superación y de no rendirme
por nada del mundo, gracias por estar
presente en este mundo Valeria.
iv
AGRADECIMIENTO
En primer lugar me encantaría agradecer
de corazón a mi asesor de Tesis Dr.
Benitez Castillo Santiago y Dra Vega
Fernandez Amalia, gracias a su esfuerzo
y dedicación.
Me siento feliz de haber encontrado a
personas que con su manera de trabajar
me han apoyado demasiado con sus
conocimientos y orientaciones siendo
unos de los pilares fundamental para la
realización de este trabajo.
Gracias a esto estoy muy agradecido de
antemano y solo encontrado admiración
hacia ustedes durante todo el periodo del
desarrollo.
v
DECLARATORIA DE AUTENTICIDAD
Yo Randy Bryan Escudero Farro con DNI Nº 71880417, interno de medicina del
Hospital Regional Docente Trujillo por lo que ha de cumplir con el Reglamento de
Títulos de la Universidad Cesar Vallejo, Facultad de Ciencias Médicas de la
Escuela de Medicina humana, declaro bajo juramento doy mi palabra que este
trabajo es veraz y autentico.
Esta investigación ha sido realizada para la obtención de un título profesional no
ha sido antes sustentada por otra persona.
Por lo cual bajo toda la responsabilidad ante cualquier plagio, ocultamiento u
omisión sobre la información brindada en mi trabajo, seré sometido a las reglas
académicas.
____________________________
Randy Bryan Escudero Farro
vi
PRESENTACIÓN
Últimamente la medicina alternativa tiene mucho prioridad sobre los tratamientos
de miles de enfermedades, que fueron descubierto hace muchos años y
trasmitidos de generaciones en generaciones.
En cuanto al propóleo, un producto que últimamente está siendo investigado por
sus variados fines terapéuticos, el cual es recolectado de los panales de abejas
debido a que es la combinación de varios materiales de recolección de ellas que
sirve principalmente para cubrir los agujeros de sus colmenas con la finalidad de
evitar cuerpos extraños ingresen a esta.
Este producto que tiene efectos medicinales de los cuales están en estudio contra
varios microorganismos, uno es el Streptococcus pyogenes, siendo el principal
patógeno de infecciones a la garganta produciendo faringoamigdalitis, cuya
consecuencia de no ser tratadas puede llegar a presentar complicaciones como
fiebre reumática, nefritis estreptocócica, entre otras. Por ello nos planteamos este
interrogante ¿El extracto etanólico de propóleo tiene eficacia antimicrobiana in
vitro sobre cepas de Streptococcus pyogenes?, para poder observar la eficacia
del extracto etanólico de propóleo sobre cepas de Streptococcus pyogenes se
realizará mediante un diseño experimental, donde habrá post prueba como control
vii
INDICE
CARÁTULA ...................................................................................................................... 1
PÁGINAS PRELIMINARES ............................................................................................... ii
PÁGINA DEL JURADO .................................................................................................. ii
DEDICATORIA .............................................................................................................. iii
AGRADECIMIENTO ...................................................................................................... iv
DECLARATORIA DE AUTENTICIDAD .......................................................................... v
PRESENTACIÓN .......................................................................................................... vi
INDICE ......................................................................................................................... vii
RESUMEN ...................................................................................................................... viii
ABSTRACT ...................................................................................................................... ix
I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................10
1.1. Realidad problemática .......................................................................................11
1.2. Trabajos previos ................................................................................................12
1.4. Formulación del problema .................................................................................17
1.5. Justificación del estudio .....................................................................................17
1.6. Hipótesis ............................................................................................................18
1.7. Objetivos ...........................................................................................................18
II. MÉTODO ..................................................................................................................19
2.1. Diseño de investigación .....................................................................................19
2.2. Variables, Operacionalización ...........................................................................19
2.3. Población y muestra ..........................................................................................21
2.4. Criterios de selección ........................................................................................21
2.5. Técnicas e instrumentos de recolección de datos ..............................................22
2.7. Aspectos éticos .................................................................................................25
I. RESULTADOS .........................................................................................................26
II. DISCUSIÓN ..............................................................................................................30
III. CONCLUSIONES .................................................................................................33
IV. RECOMENDACIONES .........................................................................................34
V. REFERENCIAS ........................................................................................................35
VI. ANEXOS ...............................................................................................................40
FICHA DE RECOLECCIÓN DE DATOS ......................................................................40
MATRIZ DE CONSISTENCIA ........................................ ¡Error! Marcador no definido.
viii
RESUMEN
Se ha determinado la eficacia antibacteriana de las distintas concentraciones de
extractos etanólicos de propóleo los cuales fueron extraídos de la región de
Lambayeque (Bosque seco de Pomac) obteniéndose por el centro de apicultura
“Honey Bee”, en Trujillo. Se utilizó cepas de Streptococcus pyogenes, Gram
positivo. Se empleó el mediante el método kirby Bauer el crecimiento bacteriano,
donde se medirá a través de observación de la presencia o ausencia, donde con
una concentración al 60% llegó a ser eficaz, con una actividad antibacteriana
significativamente dependiente de su concentración de extracto. Además se
encontró una concentración mínima inhibitoria de 806 ug/uL. En conclusión los
extractos etanólicos de propóleo tienen una actividad antimicrobiana
significativamente, la cual ha dependido de su concentración de extracto.
Palabras claves: Extracto etanólico, Kirby Bauer, concentración mínima inhibitoria
ix
ABSTRACT
It has been determined the antibacterial efficacy of different concentrations of
ethanol extracts of propolis which were extracted from the region of Lambayeque
(dry forest Pomac) obtained by the central beekeeping "Honey Bee" in Trujillo.
Streptococcus pyogenes strains, Gram positive was used. We used the by kirby
Bauer bacterial growth method, which will be measured through observation of the
presence or absence, where a concentration of 60% became effective, with
antibacterial activity significantly dependent on the concentration of extract. It was
further found an MIC of 806 ug / uL. In conclusion ethanolic extracts of propolis
have significantly antimicrobial activity, which depended on the concentration of
extract.
Keywords: Ethanolic extract, Kirby Bauer, minimum inhibitory concentration
x
11
I. INTRODUCCIÓN
1.1. Realidad problemática
El Streptococcus pyogenes (GAS), es el germen responsable más frecuente de
las faringitis según un estudio realizado en el 2004 en la ciudad de Buenos Aires,
de las cuales las infecciones respiratorias agudas ocupan el principal motivo de
consultas en todo el mundo en los servicios de bajo nivel.1,2
De acuerdo a los resultados del Centro de Control y la Prevención de
Enfermedades (CDC), aproximadamente 9,000-11,500 casos de enfermedad
invasiva por GAS de los cuales 3.2 a 3.9/100.000 habitantes se ha producido
cada año en los Estados Unidos. Más de 10 millones de infecciones por GAS no
invasivos (infecciones de garganta y superficiales de la piel) se producen
anualmente. En todo el mundo, las infecciones por GAS y sus secuelas post-
infecciosas como la fiebre reumática y cardiopatía, las cuales contribuyen a unos
500 000 decesos por año, si bien los datos no son concluyentes, se considera que
todas las frecuencias de todas las formas de infección de esta bacteria son 10
veces mayor en países en vías de desarrollo.3
La faringoamigdalitis aguda estreptocóccica es muy frecuente en menores de 18
años pero además se encuentra en adolescentes y adultos, con una declinación
importante en los mayores de 35 años.4
A nivel nacional las estadísticas en el año 2010 ubicó a las infecciones
respiratorias agudas entre las morbilidades más frecuentes, la cuales representa
un 19,2 % de las atenciones por el Sistema Integral de Salud (SIS) con un total de
5’943,551, en las cuales incluía los diagnósticos de “faringitis agudas y amigdalitis
agudas”.5
Para ella, el tratamiento de elección sigue siendo la penicilina, su alternativa en
pacientes alérgicos es la eritromicina. En los tratamientos orales se utilizan hasta
10 días para poder llegar a la eliminación de GAS, de los cuales no están exentos
de eventos adversos y requiere de alguna supervisión médica.6
12
En los últimos años la medicina alternativa complementaria es una de la más
utilizada a nivel mundial debido sus fines terapéuticos, por lo que es una
alternativa a los diversos medicamentos usados actualmente. La OMS promueve
el uso de la medicina tradicional para satisfacer sus necesidades sanitarias
primarias debido a que esto genera un menor costo en uso de las terapias. En
uno de sus resultados en el año 2000 indico que un promedio de 80% de la
población africana usó tal medicina; siendo Etiopía el país con mayor consumo
(90%).7
El propóleo tiene una posible eficacia, que no está completamente definida por
falta de evidencia sobre su efecto contra el GAS. En relación al tratamiento para
esta enfermedad, existen terapias farmacológicas y no farmacológicas, dentro de
estos últimos están los remedios caseros y/o medicina alterativa complementaria
(MAC).En Lima aproximadamente el 70% la utilizó alguna vez y otro en provincias
estimo que casi la mitad de los usuarios conocen de alguna terapia tradicional y
una tercera la ha utilizado alguna vez en su vida para el tratamiento de la
faringitis, por lo cual consideramos que sería una buena propuesta como
alternativa en la faringitis estreptocócica el uso de propóleos. A pesar de que el
tratamiento es respaldado por estudios, la variedad de compuestos que se
encuentran en el mercado para combatir este problema prevalente de atención
básica, nos induce una pequeña duda sobre la mejor opción disponible y ventajas
o desventajas relativas de cada uno de ellos.6, 8,9
1.2. Trabajos previos
Torban T et al.10 (2014, Turkey); determinaron la actividad antibacteriana de
propóleo contra bacterias aisladas. Recolectaron propóleo procedente del pueblo
de Konya (Turquía) y Moscov (Rusia), además cultivaron 32 cepas de cada uno,
Staphylococcus aureus meticilino resistente (MSRA), staphylococcus aureus
meticilino sensible (MSSA), S. pyogenes, E. coli. Se halló una concentración
mínima inhibitoria (CIM) de >16,384 ug/mL. No se encontró una diferencia
estadísticamente significativa para la CIM, Gram positivas y Gram negativas para
ambas muestras de propóleo (p<0,001). Resultó que dicho extracto es más eficaz
13
en contra las bacterias Gram positivas que las Gram negativas. Concluyeron que
el propóleo tiene alta actividad antibacteriana in vitro contra el S. pyogenes.
Shinhorini W et al.11 (2014, Brasil); Evaluaron la actividad antimicrobiana in vitro
del propóleo contra algunas cepas bacterianas. Se obtuvo extracto etanólico de
propóleo con una dilución hasta 70% propóleo y 30% de alcohol, además de las
cepas Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Escherichia coli, en las
cuales se encontró cierta sensibilidad al extracto de propóleo. Para el control, se
utilizó agar Muller Hinton de alcohol a concentración 30%. La eficacia
antibacteriana de propóleo era 91% de los Streptococcus pyogenes; 80% de los
Staphylococcus aureus y 61,6% para Escherichia coli. Se concluyó por lo tanto
que las bacterias Gram positivas son más susceptibles a la acción antibacteriana
del propóleo lo que probablemente es debido a los flavonoides, ácidos aromáticos
y ésteres presentes en la resina, que actúan sobre la estructura de la pared
celular bacteriana de estos microorganismos.
Serra J et al.12 (2012, España); hallaron la actividad antimicrobiana de 19
extractos de propóleo preparados en diferentes disolventes etanol y propileno
glicol (EEP / PEP) de diferentes zonas de España contra bacterias y hongos
aislados utilizando método de difusión en agar. Los resultados revelaron que
ambos tipos de extractos de propóleo mostraron un efecto antimicrobiano
altamente sensible acción contra las bacterias Gram positivas y hongos, con un
efecto moderado contra Streptococcus pyogenes, (CIM de 17 al 26 mg / mL),
contra las bacterias Gram-negativas fue Salmonella enterica (CIM 0,6 a 1,4 mg /
mL) y contra Helicobacter pylori (CIM de 6 a 14 mg / mL), mientras que E. coli fue
resistente. Se concluyó que los propóleos vascos tenían una fuerte y dependiente
de la dosis actividad contra la mayoría de las cepas microbianas probadas, sin
diferencias entre el disolvente empleado.
Hendi N et al.13 (2011, Iraq); examinaron las actividades antimicrobianas del
extracto etanólico contra algunas bacterias aisladas por el método de difusión en
disco en agar, se recolectó propóleo en la región de Museiab (Iraq), del cual se
preparó extracto etanólico y extracto acuoso; además cultivaron varias cepas de
14
S. aureus, S. pyogenes, E. coli, H. pylori entre otras. Los resultados mostraron
gran diferencia significativa (p≤0,05) entre ambos resultados. Siendo las
concentraciones mínimas inhibitorias para el S. pyogenes en la concentraciones
del extracto etanólico de propóleo al 10%, 20% y 30% con una CIM de 1280, 1280
y 640 ug/mL respectivamente. Este estudio concluyó que extracto etanólico de
propóleo fue más activo que el extracto acuoso de propóleo para las diferentes
bacterias.
Ophori E. et al.14 (2010, Nigeria); investigaron los agentes bacterianos de la
infección del tracto respiratorio superior (URTI) y la susceptibilidad de los aislados
a propóleo. Determinó la susceptibilidad de los agentes bacterianos aislados por
el extracto propóleo, del pueblo de Delta (Nigeria) para poder producir el extracto
etanólico del propóleo con alcohol al 70% en diluciones distintas entre ellas: 0.5,
1, 2, 4,8 y 10 ug/mL cuadriplicando las muestras y teniendo como control solución
etanólica de alcohol; además se recolecto muestras de infecciones respiratorias
de las cuales se obtuvo 52 cultivos de Haemophilus influenzae, 48 de Klebsiella
pneumoniae, 30 de S. pneumoniae, 5 S. pyogenes. El extracto de propóleo
mostró eficacia contra K. pneumoniae, S. pneumoniae, M. catarrhalis y S.
pyogenes; M. catarrhalis y S. pyogenes fueron menos sensible con una MIC de
0,5 y 8,0 ug / mL, respectivamente. Se concluyó que el extracto etanólico del
propóleo tiene eficacia antimicrobiana. Su halo de inhibición fue de 10 mm a la
concentración de 25%.
Bini P et al.15 (2010, Brasil); realizaron un estudio con el fin de establecer una
preparación de extracto método para mostrar mayor actividad antibacteriana.
Obtuvieron el propóleo de Ibaiti (Brasil) con lo que preparó un extracto acuoso de
propóleo y de este se determinó el contenido de flavonoides totales, además de
cepas de microorganismos como Streptococcus mutas, Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes, Enterobacter aerogenes, Salmonella typhimurium y
Pseudomonas aeruginosa. La mayoría de cepas de bacterias dentro de ellas S.
pyogenes mostraron MIC de 36 ug / mL, mientras Staphylococcus aureus mostró
una CIM de 9 ug / mL. En conclusión el extracto etanólico de propóleo tiene
15
actividad antibacteriana para Gram positivas y negativas, sugiere que esta
sustancia es una mezcla activa compuestos bactericidas.
Oliveira A et al.16 (2010, Brasil); investigaron la composición química de extracto
etanólico de propóleo de Brasil y la susceptibilidad de Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes y Escherichia coli a esta
sustancia. Recolectaron el propóleo de Rio de Janeiro, además se obtuvo cepas
de E. coli, S. aureus y S. pyognes. Se halló actividad antibacteriana del propóleo
contra E. coli y S. pyogenes y S. aureus, siendo el primer estudio que muestra
que el propóleo tiene eficacia contra estas bacterias. S. pyogenes siendo para las
cepas de S. pyogenes la zona de inhibición entre 14 y 18 mm. Se halló una
diferencia significativa con un p<0,05. Además el estudio reportó la presencia de
linalol, metilo hidrocinamato, hidrocinamato etilo, α-ylangene y γ-elemene en
extracto etanólico de propóleo. Además, el estudio ha demostrado también la
actividad antibacteriana contra las bacterias Gram negativas (E. coli) y Gram
positivas (S. aureus, S. epidermidis, S. pyogenes).
1.3. Teorías relacionadas al tema
El Streptococo del grupo A mayormente conocido como Streptococcus Pyogenes
es uno de los principales patógenos en las enfermedades de la faringitis y de la
piel como impétigo y pioderma. Es una bacteria Gram positiva en forma de
cocoide que cuando crece produce cadenas; su virulencia depende de la proteína
M, aparte tiene gran cantidad de enzimas y toxinas incluidas las toxinas
eritrogénicas. 3
Streptococcus pyogenes (GAS) produce faringoamidalitis, escarlatina, celulitis,
erisipela, glomerulonefritis, fascitis necrotizante, fiebre reumática y mionecrosis.
Se encuentra en la piel y mucosas como huésped. Para su cultivo requiere
productos de sangre produciendo una zona completa de hemolisis por lo que se
clasifica como beta hemolítico.17
16
Se ha podido observar en España un aumento de la resistencia del GAS a los
macrólidos. En el último estudio SAUCE, se observa que el 27,6% de las cepas
aisladas en adultos, y el 22,9% en niños son resistentes a la eritromicina.18
El propóleo es una sustancia oscura y viscosa de consistencia resinosa elaborado
por las abejas que proviene de los exudados de árboles que es de color
anaranjado rojizo, siendo este muy variable de acuerdo a su procedencia, tiene el
fin de tapar las grietas y orificios de su colmena con el objetivo de impedir el paso
de corrientes de aire o de intrusos, ayuda aislando las partículas extrañas que se
encuentran dentro y produce una estabilización de esta.19
El uso del propóleo tiene una larga historia, que cuenta desde la data del antiguo
Egipto, en donde se usaba en terapias medicinales e integrante de los ungüentos.
Luego en la edad media y renacimiento se hace referencia sobre su utilización en
la guerra de los Bóer como antiséptico, en el cual era mezclado con vaselina. A
mediados del siglo XX, Prokopóvich demostró la efectividad comparada con la
cocaína y novocaína como anestésico local. Posteriormente los científicos
Derevich y Popescu en el año 1965 demuestran un efecto positivo sobre las
células tumorales. Actualmente es poco usado, pero es aplicado en una variedad
de terapias contra distintas enfermedades ya sea bacteriana o víricas.20
La composición del propóleo es de un origen principalmente vegetal con un 50%,
cera en 30%, sustancias de regurgitaciones glandulares segregadas por las
abejas y polen un 20%. Se han identificado más de 300 constituyentes del
propóleo, dentro de los cuales una gamma de variedad son componentes
fenólicos, principalmente de tipo flavonoide, además de la crisina y galangina,
pinocembrina, quetonas, vitaminas, cumarinas, y terpenoides.21
Tiene bastantes propiedades dentro de las cuales tenemos: antinflamatorias,
anestésicas, antivirales, bacteriostáticas y bactericidas. Se puede usar en formas
de ungüento o extracto alcohólicos para avanzar el proceso de cicatrizar. Estas
propiedades dependen mucho de la procedencia y mes de donde es extraído el
propóleo, siendo de mayor productividad el mes de julio hasta noviembre.22
17
La actividad bactericida y bacteriostática del propóleo es controversial, debido a
las diferentes composiciones que dependen del lugar de donde se extrae. Se
señala a sus principales componente a la galangina y pinocembrina, unas
hidroxiflavonas que tiene excelentes resultados frente a las infecciones por
bacterias gram positivos entre ellas los cocos, bacilos y anaerobios; por lo cual
posee una actividad antiséptica como remedio de boca, encías y estomatitis;
donde se utiliza como enjuague o aplicaciones locales con pequeñas torundas.
Dentro de las reacciones adversas por propóleo tenemos el eczema de los
apicultores siendo una afección rara, que no afecta más de 1 en 2000 según
Chauvin y para Caillas, que aún no ha sido certificada por el sesgo en los estudios
realizados. 23
La penicilina G sódica es un antibiótico que pertenece al grupo de la penicilina
betalactámica semisintética, con actividad bactericida, sensible a la degradación
por beta-lactamasas.24
1.4. Formulación del problema
¿El extracto etanólico de propóleo tiene eficacia antimicrobiana in vitro sobre
cepas de Streptococcus pyogenes?
1.5. Justificación del estudio
La escasez y antigüedad de estudios a nivel mundial, y la percepción de que por
conocimiento popular, la administración de propóleo en pacientes con infecciones
respiratorias altas causadas por GAS, especialmente en pacientes pediátricos,
resulta recomendable como alternativa a fármacos antibióticos que necesitan de
prescripción y supervisión médica y evaluación periódica y que luego de un
tiempo deviene en resistencia a múltiples bacterias, nos motivaron a realizar la
presente investigación.
18
El no encontrar antecedentes de investigación con el uso de propóleo a nivel local
para comprobar su eficacia y pudiendo disponer de los recursos humanos y
financieros hemos deseado profundizar sobre la incógnita ya planteada y
desarrollar la presente investigación.
Los resultados de ser satisfactorios, pudieran ser utilizados para llevar a cabo
otros estudios a fin de aportar bases científicas para aplicar posteriormente con
éxito una terapia alternativa, fomentar el progreso de la ciencias e incrementar el
consumo del propóleo, masificando su empleo en hospitales y nosocomios sobre
todo como coadyuvante de las infecciones respiratorios de naturaleza crónica que
se asocien a estas infecciones, hasta poder observar si existen o no reacciones
adversas.
1.6. Hipótesis
H1: El extracto etanólico de propóleo tiene eficacia antimicrobiana in vitro
sobre cepas de Streptococcus Pyogenes
H0: El extracto etanólico de propóleo no tiene eficacia antimicrobiana in vitro
sobre cepas de Streptococcus Pyogenes
1.7. Objetivos
1.7.1. General
Determinar la eficacia antimicrobiana del extracto etanólico de propóleo sobre
cepas de Streptococcus pyogenes.
1.7.2. Específicos
Identificar la concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto etanólico de
Propóleo sobre cepas de Streptococcus Pyogenes
Valorar el crecimiento bacteriano de cepas de Streptococcus pyogenes frente
al extracto etanólico de propóleo a diferentes concentraciones (60%, 70%,
80%, 90%) por el método de Kirby y Bauer.
19
II. MÉTODO
2.1. Diseño de investigación
Experimental con comparaciones múltiples
RG1: X1 - O1
RG2: X2 - O2
RG3: X3 - O3
RG4: X4 - O4
RGi: Xi - Oi
RGi+1: Xi+1 - Oi+1
RGi+2 Xi+2 - Oi+2
Dónde:
R: Asignación al azar
G: Placas Petri con Streptococcus pyogenes
Xi: i – ésimo tratamiento con Propóleo
Xi+1: tratamiento con penicilina
Xi+2: tratamiento con etanol al 70%
Oi: i – ésima observación post tratamiento con Propóleo
Oi+1: observación post tratamiento con penicilina G sódica
Oi+2: observación post tratamiento con etanol al 70%
2.2. Variables, Operacionalización
Variable independiente:
Extracto etanólico de propóleo
A las diferentes concentraciones: 90%, 80%, 70% y 60%
Variable dependiente:
Eficacia antimicrobiana
Mediante el antibiograma y Concentración mínima inhibitoria
20
2.2.1. Operacionalización de variables
Variable Definición
conceptual
Definición
operacional
Definición
operacional Indicadores
Escala de
medición
Variable
independiente:
Etanólico de
Propóleo
Extracto obtenido
a partir de
propóleo en
bruto, luego
combinado con
etanol, seguida
de la eliminación
de dicho solvente
por rotavapor.25
Extracto
etanólico del
Propóleo
Se hará la
medición
mediante la
ficha de
observación,
teniendo en
cuenta la
concentración
del extracto
etanólico de
Propóleo.25
90%
80%
70%
60%
Cuantitativa
discreta
Variable
dependiente
Eficacia
antimicrobiana
Interferencia en
el crecimiento y
la supervivencia
de los
microorganismo
mediante una
interacción
específica con
algunos de sus
componentes
celulares.25
Antibiograma
Medición del
diámetro del
halo de
inhibición de
los discos en
la prueba de
difusión en
disco, según
el estándar
CLSI_M100-
S24.26 Será
eficaz cuando
sea sensible
Resistente:
diámetro
inferior a 24
mm
Sensible:
diámetro
superior o
igual a 24
mm
Cualitativa
ordinal
Concentración
mínima
inhibitoria
Observación
del
crecimiento
bacteriano en
la prueba de
micro dilución
en tubo
según el
estándar
CLSI_M100-
S24.26 Será
eficaz cuando
haya
ausencia de
crecimiento
Presencia
Ausencia
Cualitativa
nominal
21
2.3. Población y muestra
2.3.1. Población:
El universo estuvo constituido por las cepas de Streptococcus pyogenes
obtenidas en el laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias
Médicas de la Universidad César Vallejo.
2.4. Criterios de selección
Los criterios de Inclusión:
Cepas de Streptococcus pyogenes de contenido puro.
Cultivos de Streptococcus pyogenes conservados sin daño externo
Los criterios de exclusión:
Cultivos de Streptococcus pyogenes contaminadas
Cepas de Streptococcus pyogenes que no pudieran ser reconstituidas en
medio de cultivo
Unidad de análisis:
La unidad de análisis será cada una de las cepas Streptococcus pyogenes
cultivadas.
Unidad Muestral:
La unidad muestral lo conformó la relación de placas Petri establecidas
estadísticamente.
2.4.1. Muestra Experimental:
Se determinó mediante esta fórmula:
𝑛 =2(𝑍𝛼
2⁄ +𝑍𝛽)2𝜎2
(�̅�1 − �̅�2)2
Dónde:
𝑍𝛼2⁄= 1.96; con un nivel de confianza del 95%
𝑍𝛽= 0.84; con una potencia del 80%
𝜎 = 40.8 variabilidad según muestra piloto
�̅�1= 24; halo promedio de inhibición según muestra piloto al 90%
�̅�2= 18; halo promedio de inhibición según muestra piloto al 70%
22
n = 28 x 5 repeticiones
n = 140 repeticiones
2.5. Técnicas e instrumentos de recolección de datos
2.5.1. Técnicas: Observación directa de campo – Experimental; Se observó los
cultivos de las cepas con Streptococcus pyogenes en la cual se le añadió
las distintas soluciones de extracto de propóleo, se midió el halo de
inhibición y la CIM.
2.5.2. Procedimiento:
2.5.2.1. Extracción y conservación del propóleo
Se usó propóleo en bruto procedente del distrito de Chepén en La Libertad
extraído el mes noviembre en una cantidad de 500 gramos, almacenándolo
posteriormente en frascos de vidrios transparentes cubriéndolos con las bolsas
oscuras y así evitar influencias ambientales sobre las propiedades del producto.
2.5.2.2. Preparación del extracto etanólico de propóleo en el laboratorio
Se transportó hacia el laboratorio de la Facultad de Ciencias Médicas de la
Universidad Cesar Vallejo, donde se eliminó las impurezas con pinzas estériles,
se lavó con agua hervida a temperatura ambiental, después se dejó secar a
temperatura ambiente y una vez seca, se cortó con la finalidad de obtener
partículas uniformes, 150 gramos de propóleo, luego se sometió a un proceso de
extracción exhaustiva con 200 ml de etanol al 96% a reflujo en un equipo de
soxhlet durante 1 hora y media, al cabo de este tiempo se filtró a través de papel
de filtro Whatman Nº 40 dando tres filtrados, se realizó nuevamente y se reunió
ambos, se obtuvo el extracto final.
2.5.2.3. Determinación del rendimiento y las diferentes diluciones
Su determinación del rendimiento de sustancias solubles totales se realizó cuando
los extractos de propóleo se colocaron en el matraz de un rotavapor tipo Büchi y
se esperó hasta la evaporación hasta la desaparición del solvente. El sólido
obtenido se sometió a secado en estufa a 70 °C durante 2 horas, para obtener el
denominado extracto seco total.
23
Con la siguiente ecuación se halló el rendimiento: Rendimiento (%) = P.100/m,
siendo P el peso de extracto seco (g) y m es el peso de muestra (g). Luego, se
pesó el extracto seco obtenido y con base a este resultado se preparó distintas
concentraciones de 60%, 70%, 80 % y 90% en alcohol de 70 %.
2.5.2.4. Obtención y preparación de las cepas
La bacteria se obtuvo de 7 pacientes portadores de S. pyogenes mediante un
hisopado faríngeo, los cuales se guardó en bolsas estériles. Estas fueron llevadas
al laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Médicas de la
Universidad César Vallejo para su procesamiento. Se cultivó con medio agar
sangre a 37°C por 48 horas en tubos de ensayo, luego se diluyó hasta alcanzar la
turbidez del tubo 0,5 de la escala de Mac Farland.
Se sembró con un hisopo estéril, el cual fue embebido en las placas del cultivo
preparado, se colocó a una distancia de 10 cm de la llama de un mechero, luego
se sembró en placas Petri de 15 cm cada una con contenido de agar sangre
hisopando uniformemente sobre toda la superficie del agar y girando cada placa
30°C por 10 veces.
2.5.2.5. Descripción del efecto bactericida técnica de Kirby y Bauer
Para lo cual se preparó 4 diluciones de extracto etanólico de propóleo a las
concentraciones de 60%, 70%, 80%, 90%, en dichas diluciones se conservó a
4°C para dicho estudio microbiológico. Luego de realizó el sembrado de las cepa
de Streptococcus pyogenes en placas Petri de 15 cm, donde se hizo la prueba de
susceptibilidad usando el método de Kirby Bauer (difusión en discos), por lo cual
se preparó discos de papel filtro estériles (diámetro 6mm) los que fueron
sumergidos en cada una de las concentraciones de extracto etanólico de
propóleo; y después, con aguja estéril fueron colocados sobre los cultivos de
Streptococcus Pyogenes en placas Petri, preparados previamente. Se utilizó un
grupo control positivo con penicilina G sódica y un control negativo con alcohol al
70%. Luego las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas. La lectura se
realizó pasadas las 24 horas, midiendo los halos de inhibición (susceptibilidad) de
24
cada una de las concentraciones, donde se incluyó el área del disco de papel de
filtro con una regla milimetrada procediéndose de igual manera con ambos
controles, donde se le colocó 5 uL de los distintas concentraciones de propóleo.
Al final se empleó en cada caso la escala de Duraffourd para determinar
cualitativamente el efecto inhibitorio in vitro, según diámetro de inhibición.
Es resistente cuando el diámetro menor a 24 mm.
Es sensible cuando el diámetro superior o igual a 24 mm.
2.5.2.6. Descripción de efecto concentración mínima inhibitoria (CMI) de la
técnica de microdiluciones
Este método permitió determinar la concentración mínima inhibitoria del extracto
siguiendo las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standars Institute
(CLSI_M100-S24). Por lo que se usó diluciones seriadas (1/10), con una solución
fosfato salina tamponada (PBS 1X), que oscilan entre 900 a 600ug/ul para el caso
del extracto etanólico del propóleo. Para la realización del experimento se utilizó
placas de microtiter de 96 pocillos, a cada pocillo se le adicionó 10μL de cada
dilución y 2 μL de suspensión bacteriana (0.5 Mc. Farland) de las bacterias S.
pyogenes. Las placas que contienen la mezcla se incubarón en condiciones de
anaerobiosis controlada a 37°C durante 72 horas y se observó mediante la
técnica de densidad óptica. Mientras que la CMI para la penicilina es 12 ug/mL
según el CLSI. 25, 26, 27,28, 29, 30
2.5.3. Instrumento: Ficha de observación de campo; fue en donde se registraron
todos los datos importantes extraídos en el laboratorio (ANEXO 1).
2.6. Métodos de análisis de datos
Luego de la utilización del instrumento, los archivos se almacenaron de manera
automatizada, en una laptop CORE i5, usando los siguientes Software:
Procesador de texto Microsoft Word 2013, Microsoft Excel, Programa Estadístico
SPSS 23,0.
El análisis de la información se le realizó mediante estadística descriptiva (en
gráficos de cajas en Microsoft Excel), la estadística inferencial para la
comprobación de la hipótesis y el cumplimiento de los objetivos.
25
Para el análisis estadístico se empleó la prueba de análisis de varianza (ANOVA)
y se aplicó prueba no paramétrica t3 de Dunnett, por comprobarse que se tratan
de datos con varianzas diferentes.
2.7. Aspectos éticos
El personal de limpieza almacenara en bolsas de residuos de acuerdo a su
clasificación en el medio ambiente dispuesto, limpiar y desinfectar el ambiente y
recipientes luego su evacuación de los residuos para su disposición final según
los procedimientos del laboratorio.
26
I. RESULTADOS
A continuación se muestran los resultados en tablas y figuras.
Tabla 01. Eficacia de la concentración del extracto etanólico del propóleo
sobre cepas de Streptococcus pyogenes mediante el método Kirby bauer
Concentración del extracto etanólico del
propóleo
Cepas sensibles al extracto
etanólico de propóleo
Cepas resistentes al
extracto etanólico de
propóleo
Total de cepas utilizadas
n % n % n %
90,0 % 13 46 15 54 28 100
80,0 % 0 0.0 28 100.0 28 100
70,0 % 0 0.0 28 100.0 28 100
60,0 % 0 0.0 28 100.0 28 100
Fuente: Resultados de laboratorio
La eficacia del extracto de propóleo fue de un 46% con la concentración
máxima utilizada al 90%, siendo eficaz en casi la mitad. En concentraciones
del 60% al 80% se observaron 0 cepas sensibles al extracto etanólico del
propóleo. Esta información se puede visualizar en la figura 1.
27
Tabla 02. Concentración mínima inhibitoria del extracto etanólico de propóleo
sobre cepas de Streptococcus pyogenes mediante el método de
microdiluciones
Concentraciones de extracto etanólico de
propóleo
Cepas sensibles al extracto etanólico de
propóleo
El porcentaje de cepas sensibles al extracto etanólico de propóleo
90,0 % 28 100,0 %
80,0 % 22 79,0%
70,0 % 4 14,0 %
60,0 % 0 0,0 %
Penicilina 28 100,0 %
Negativo 0 0,0 %
Fuente: Resultados de laboratorio
El extracto etanólico de propóleo al 90% fue eficaz sobre las cepas de
Streptococcus pyogenes en un 100%, siendo al 70% de concentración su
eficacia de 14% sobre el total de las cepas. El cuadro muestra que la
penicilina fue eficaz en el 100% de las cepas. Muestra una CMI 806 ug/mL.
Esta información pone en evidencia en la figura 2.
28
Tabla 03. Resumen estadístico descriptivo del halo de inhibición del extracto etanólico de propóleo sobre cepas de Streptococcus pyogenes
Concentración
N Media Desviación
típica Error típico
Mínimo Máximo
90% 28 23.1 1.38 0.26 21 26
80% 28 19.7 1.02 0.19 17 21
70% 28 15.6 0.63 0.12 14 16
60% 28 12.2 0.72 0.14 10 14
Penicilina 28 24.7 0.61 0.12 24 26
Total 140 19.1 4.75 0.40 10 26
Fuente: Resultados de laboratorio
La Penicilina tuvo una media del halo de inhibición sobre las cepas de
Streptococcus pyogenes de 24.7, mientras el que más se acercó fue el
extracto etanólico al 90% con una media de 23,1. Se puede evidenciar
intervalos cortos, con error menor a 0,5. Esta se visualiza en la figura 3.
29
Tabla 04. ANOVA del halo de inhibición del extracto etanólico de propóleo sobre cepas de Streptococcus pyogenes
Fuente de Variación Suma de cuadrados gl Media
cuadrática F Sig.
Inter-grupos 3028.0 4 757.01 891.71 0.00000
Intra-grupos 114.6 135 0.85
Total 3142.7 139
Fuente: Resultados de laboratorio
La diferencia de medias es muy significativa entre las diferentes
concentraciones sobre el halo de inhibición. Siendo las máximas en el grupo
de penicilina, seguida del grupo de concentración de extracto etanólico al 90%.
Esta información se puede visualizar en la figura 4.
30
II. DISCUSIÓN
Para entender los resultados se debe aclarar que se concibe por CMI el valor
mínimo de dilución que inhibió parcial o totalmente el desarrollo de las
bacterias sobre las cepas de Streptococcus pyogenes, entonces de acuerdo
con los resultados obtenidos, de acuerdo a esto se puede ver cuál es la
diferencia entre ambas concentración mínima inhibitoria.
Las diferencias entre los estudios que se encuentran como antecedentes
dependen de la posibilidad de bacterias ATCC y bacterias silvestres extraídas
de pacientes como en nuestro caso, además la eficacia del extracto etanólico
de propóleo se ha visto la eficacia dependiendo de la geografía de donde se
extraen debido a que a la distintas concentraciones de flavonoides que se
encuentran en cada uno.
La concentración mínima inhibitoria de la penicilina G sódica sobre las cepas
de Streptooccus pyogenes de acuerdo al Clinical and Laboratory Standars
Institute es de 12 ug/mL, mientras que en nuestro trabajo sale 806 ug/mL,
mostrando una gran diferencia significativa, por lo que es necesario mucho
más cantidad de este extracto para poder ser eficaz.
De forma similar con el estudio realizado por Shinhorini (2014) quien reporta
una eficacia del 91% sobre Streptococcus pyogenes a una concentración del
70%, muestra una similitud a nuestro estudio quien reporta una eficacia al 90%
de un 46%, en dicho estudio enfatiza como principal a los flavonoides como
principio activo, donde este extracto fue eficaz para bacterias Gram positivas.
En el siguiente estudio de Torban et al (2014) quien reporta una concentración
inhibitoria mínima para S. Pyogenes > 16,384 ug/mL donde se utilizó bacterias
extraídas de pacientes, donde muestra una concentración mucho mayor que
en nuestro estudio, ambos estudios muestran similitudes en efecto sobre
dichas cepas extraídas de pacientes, mostrando eficacia sobre las cepas
Gram positivas.
31
Serra et al (2012) por su parte reporta una CIM para Streptococcus pyogenes
de 17 al 26 ug/mL, siendo diferente a los resultados que encontramos en
nuestra investigación, se asemeja mucho a los de Clinical and Laboratory
Standars Institute que es 12 ug/mL, mostró una gran eficacia sobre las cepas;
mientras que en nuestro trabajo se halló una eficacia al 90% del extracto
etanólico
Hendi et al (2011) demostró que el extracto etanólico de propóleo es eficaz en
la erradicación de S pyogenes en concentraciones desde 10 al 30%, este
resultado si bien al igual que el nuestro encuentra eficacia entre del propóleo
en la eliminación de S. pyogenes, difiere en las concentraciones, es importante
señalar aquí que las cepas bacterianas son oriundas de Irak lo cual puede
relacionarse con la diferencia de resultados obtenidos. Además según su
concentración minima inhibitoria muestra una variación debido a que es mucho
menor la concentración de extracto etanólico de propóleo
Otro estudio que encuentra propiedades antimicrobianas del extracto de
propóleo fue el estudio realizado por Ophori et al (2010), pero encuentra que
es mucho más eficaz como antimicrobiano contra Haemofilus influenzae,
klepsiela neumoniae, S. neumoniae, M. catarralis y finalmente S. pyogenes
quienes fueron menos sensibles con una MIC de 8,0 ug/mL, es importante
señalar que el estudio de Ophori se realizó en Nigeria, con cepas también
diferentes a las nuestras. Comparando además el halo de inhibición mostro
10 mm debido a su porcentaje de concentración, mientras que en el trabajo a
una concentración de 90%, encontramos una media de 24,7 mm.
Bini et al (2010) en Brasil determinaron que el contenido de flavonoides totales
(propóleo de Ibaiti) encontrando de las cepas de Streptococcus pyogenes
mostraron MIC de 36ug/mL, concluyendo que el extracto etanólico de propóleo
tiene actividad antibacteriana contra gram positivas y gram negativas, estos
resultados solo coinciden en la actividad anti Streptococcus pyogenes del
propóleo.
32
Otro estudio realizado en Brasil por Oliveira et al (2010) reporto que la
susceptibilidad de Streptococcus pyogenes presento un halo en la zona de
inhibición entre 14 y 18 mm solo ante el extracto etanólico en una
concentración de 50%, en nuestro estudio se encontró una variación entre 10
a 23 mm, pero con diferentes concentraciones que varían de 60 a 90%.
33
III. CONCLUSIONES
El estudio concluye afirmando que:
El extracto etanólico de propóleo tiene eficacia antimicrobiana sobre cepas de
Streptococcus pyogenes.
La concentración mínima inhibitoria del extracto etanólico de propóleo sobre
cepas de Streptococcus pyogenes es de 806 ug/dL.
Mediante el método kirby Bauer a diferentes concentraciones del extracto
etanólico de propóleo mostró sensibilidad a la concentración de 90%,
demostrando una diferencia significativa.
34
IV. RECOMENDACIONES
A las personas que tienen un espíritu investigador, se desearía que se amplíen
los tipos de muestra de diferentes lugares para demostrar su eficacia y ver la
variabilidad del efecto del propóleo sobre distintos microorganismos.
Utilizar propóleos de diferentes lugares, además de controles positivos con
otros antibióticos para así poder demostrar su eficacia.
35
V. REFERENCIAS
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40
VI. ANEXOS
ANEXO 1
FICHA DE RECOLECCIÓN DE DATOS
TITULO:
EFICACIA ANTIMICROBIANA IN VITRO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE
PROPÓLEO SOBRE CEPAS DE Streptococcus pyogenes
GENERALIDADES:
Se utilizara cuatro diluciones de 90%, 80%, 70% y 60% de extracto etanólico de
propóleo y dos controles, uno positivo que será penicilina g sódica 100ug y uno
negativo de etanol al 70%.
VARIABLE DEPENDIENTE:
Inhibición del crecimiento bacteriano
VARIABLE INDEPENDIENTE:
Concentración del extracto etanólico de Propóleo
Nº de
repeticiones
Diluciones
90% 80% 70% 60% Control Positivo
Control Negativo
1
2
3
4
5
…
28
Promedio
41
Anexo 02: DATOS RECOLECTADOS PARA CMI
CONCENTRACIONES 10ul controles
CODIGO 9000ug 8000ug 7000ug 6000ug POSITIVO
100ug NEGATIVO
1 + + - - + -
2 + + - - + -
3 + + - - + -
4 + + - - + -
5 + + - - + -
6 + + + - + -
7 + + - - + -
8 + + - - + -
9 + + - - + -
10 + + - - + -
11 + + - - + -
12 + + - - + -
13 + + - - + -
14 + + - - + -
15 + - - - + -
16 + + - - + -
17 + - - - + -
18 + + - - + -
19 + - - - + -
20 + + + - + -
21 + + - - + -
22 + + - - + -
23 + + - - + -
24 + - - - + -
25 + - - - + -
26 + + + - + -
27 + + + - + -
28 + - - - + -
CMI: 806ug/dL
42
Anexo 03: DATOS RECOLECTADOS DEL DIAMETRO DE HALO (mm)
DIAMETRO DE HALO (mm)
CONCENTRACIONES %
CODIGO
90 9000ug
80 8000ug
70 7000ug
60 6000ug
CONTROL POSITIVO
CONTROL NEGATIVO
1 25 21 16 12 25 0
2 23 20 15 14 24 0
3 24 21 16 12 25 0
4 24 20 15 10 25 0
5 26 20 16 12 25 0
6 22 21 15 12 25 0
7 23 20 14 12 24 0
8 24 20 16 12 24 0
9 21 21 16 12 24 0
10 23 20 16 13 25 0
11 23 19 16 12 25 0
12 21 20 16 12 25 0
13 23 19 16 12 25 0
14 22 20 16 12 25 0
15 25 19 16 12 25 0
16 24 19 15 12 26 0
17 24 20 16 13 24 0
18 24 20 15 12 24 0
19 23 19 16 12 24 0
20 22 20 15 13 24 0
21 21 18 16 12 24 0
22 21 17 16 12 25 0
23 23 20 15 12 24 0
24 25 18 16 13 25 0
25 23 20 16 13 25 0
26 24 20 15 12 24 0
27 24 21 16 13 25 0
28 21 18 14 11 26 0
Promedio 23.1 19.7 15.6 12.2 24.7 23.1
43
Figura 1. Diagrama de barras de la Eficacia de la concentración del extracto
etanólico del propóleo sobre cepas de Streptococcus pyogenes.
13(46,0%)
15(54,0%)
90,0% 80,0% 70,0% 60,0% 90,0% 80,0% 70,0% 60,0%
0% 0% 0% 0% 0% 0%
Sensible Resistente
44
Figura 2. Diagrama de barras sobre concentración mínima inhibitoria del
extracto etanólico de propóleo sobre cepas de Streptococcus pyogenes.
Fuente: datos de la investigación.
28(100%)
22(79%)
4(14%)
0
28(100%)
0
0 5 10 15 20 25 30
"90,0 %"
"80,0 %"
"70,0 %"
"60,0 %"
Penicilina
Negativo
45
Figura 3. Diagrama de Boxplot (caja t bigote) que muestra resumen
estadístico descriptivo del halo de inhibición del extracto etanólico de propóleo
sobre cepas de Streptococcus pyogenes. Fuente: Datos de la investigación.
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
"90 %" "80 %" "70 %" "60 %" Penicilina
46
Figura 4. Diagrama de dispersión que muestra resumen estadístico
descriptivo del halo de inhibición del extracto etanólico de propóleo sobre
cepas de Streptococcus pyogenes. Fuente: Datos de la investigación.
0
5
10
15
20
25
30
90% 80% 70% 60% Penicilina