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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
RICARDO VIEIRA REICHELT
ESTUDOS DE DEGRADAÇÃO FORÇADA: CONSIDERAÇÕES ANALÍTICAS DA VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA NA ANÁLISE DE MEDICAMENTOS
Porto Alegre
2014
RICARDO VIEIRA REICHELT
ESTUDOS DE DEGRADAÇÃO FORÇADA: CONSIDERAÇÕES ANALÍTICAS DA VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA NA ANÁLISE DE MEDICAMENTOS
Trabalho de conclusão de curso apresentado como requisito para obtenção do grau de Bacharel em Farmácia, pela Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.
Orientador: Prof. Dr. Pablo Machado
Porto Alegre
2014
“De um certo ponto adiante não há mais retorno. Esse é o ponto que deve ser
alcançado.”
Franz Kafka
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer, primeiramente, aos meus pais Maria Eugênia e
Marco Ântonio por terem me dado o direito à vida. A única forma que eu tenho de
demonstrar minha gratidão é sempre dando meu melhor em tudo que faço. A Analú
Oliveira dos Santos, mãe do meu filho, Théo, os quais amo incondicionalmente. Só
posso agradecer por teres me tirado do fundo de um poço escuro e trazido de volta,
quando nada mais parecia fazer sentido. A minha vó Lourdes por me dar conforto e
acolhimento quando eu saí de casa sem rumo. Ao Sr. André Palácio por me ensinar
o significado de responsabilidade e liberdade.
A todos os meus amigos que hoje, mesmo longe, me incentivaram a
continuar em frente. Aos meus irmãos de sempre, Victória, Guilherme e Gustavo.
Aos professores e funcionários do LAIF que me acolheram de uma forma paternal
dando-me uma oportunidade única de conhecimento.
E a Deus, a quem me refugiei nos momentos mais difíceis.
RESUMO
Estudos de degradação forçada são métodos complementares delineados para
produzir um método indicador de estabilidade. Os insumos farmacêuticos ativos e os
produtos acabados são forçados em condições mais extremas que os testes de
estabilidade de longa duração. Em dezembro de 2013, a ANVISA regulamentou a
RDC 58/2013 que irá tornar obrigatório os estudos de degradação forçada. No
entanto a legislação não especifica as condições a serem empregadas. Os guias
disponíveis para a montagem das estratégias dos estudos são vagos, e não
oferecem um padrão de condições analíticas. Este guia tem como objetivo auxiliar
na escolha das condições de degradação desde os estudos preliminares até a
interpretação dos resultados encontrados.
Palavras-chave: degradação forçada, ANVISA, HPLC
ABSTRACT
Keywords:.forced degradation, ANVISA, HPLC
Forced degradation studies are complementary methods designed to produce a
stability indicator method. The active pharmaceutical ingredients and drug products
are forced into the most extreme conditions than the long term stability test. In
December 2013, with the publication of RDC 58/2013, in two years, ANVISA will
becomes mandatory forced degradation studies. However the legislation does not
specify the conditions to be employed. The guides available for conducting the
strategies of the studies are vague and do not provide a standard of analytical
conditions. This guide aims to assist since choosing the conditions of degradation
studies until the interpretation of results.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Publicações sobre degradação forçada entre 2008 e 2012......................13
Figura 2 – Modelo sugerido para estudos de degradação forçada por
hidróliseácida/básica..................................................................................................15
Figura 3 – Sequência da reação em cadeia mediada por radicais livres..................16
Figura 4 - Mecanismo de formação de radicais peróxidos através do AIBN.............18
Figura 5 – Formação de radicais hidroxila a partir do peróxido de hidrogênio..........18
Figura 6 – Modelo sugerido para degradação forçada por oxidação........................19
Figura 7 – Oxidação de transferência de elétrons mediada por metais....................20
Figura 8 - Degradação do fenoprofeno sob radiação UV..........................................22
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Compostos nitrogenados comumente utilizados para produção de
radicais livres nos testes de degradação forçada......................................................17
Tabela 2 - Critérios de notificação, identificação e qualificação dos produtos de
degradação em medicamentos..................................................................................23
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................12
2. ESTUDOS PRELIMINARES DE DEGRADAÇÃO FORÇADA..............................13
3. ESCOLHA DAS CONDIÇÕES DE DEGRADAÇÃO.............................................14
3.1 Condições de hidrólise ácida/básica................................................................14
3.2 Condições de oxidação.....................................................................................15
3.2.1 Reações induzidas por radicais (oxidação).......................................................16
3.2.2 Reações mediadas por peróxidos.....................................................................18
3.2.3 Reações de transferência de elétrons...............................................................19
4. CONDIÇÕES DE FOTOESTABILIDADE..............................................................20
4.1 Fontes de luz.......................................................................................................21
5. CONSIDERAÇÕES ANALÍTICAS NA VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA..........22
6. CONCLUSÃO........................................................................................................24
REFERÊNCIAS.........................................................................................................25
12
1 INTRODUÇÃO:
O estudo de estabilidade de insumos é um dos itens mais importantes para
garantir a eficácia e a segurança das moléculas. Esta segurança é determinada pelo
perfil farmacológico-toxicológico da substância, assim como os efeitos adversos
causados por impurezas nos produtos acabados (BAERTSCHI, 2005). Guias
internacionais como o ICH foram criados com a intenção de direcionar o trabalho
das empresas que desenvolvem novas drogas e produtos, uma vez que o
conhecimento da estabilidade da molécula é essencial para o desenvolvimento da
formulação a ser usada bem como as condições de estocagem (ALSANTE et al.,
2007)
O estudo de degradação forçada é uma ferramenta complementar utilizada
para prevenir problemas de estabilidade, desenvolver métodos analíticos e
identificar rotas de degradação. Além disso, permite diferenciar produtos de
degradação do ativo daqueles que são gerados na formulação do produto acabado.
As análises desenvolvidas e validadas devem promover degradação em extensão
suficiente a fim de permitir a avaliação da formação de produtos de degradação. É
importante salientar que, os produtos de degradação sob condições de estresse
podem ser classificados como ‘’potencial’’, pois podem ou não ser formados sob
condições de estocagem. (BAERTSCHI, 2011).
Jain et al. publicaram uma revisão que descreve os avanços recentes nos
estudos de impurezas em medicamentos entre 2008 e 2012 sob uma perspectiva
analítica. O estudo mostra o crescente interesse nas análises de degradação
forçada, as quais tendem a aumentar nos próximos anos devido ao maior rigor dos
órgãos reguladores. A figura 1 mostra o número de publicações de estudos de
degradação forçada e perfil de impurezas.
No final de 2013, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
publicou a RDC 58/2013, que estabelece parâmetros de notificação, identificação e
qualificação de produtos de degradação em medicamentos. (BRASIL , 2013). No
entanto, assim como nos guias internacionais, a política adotada nos testes de
degradação forçada da ANVISA não especifica como conduzir os ensaios em
relação à preparação das amostras bem como as condições necessárias para as
degradações.
Deve ser considerada, também, a análise crítica dos perfis de degradação
das moléculas, as quais incluem a verificação da pureza cromatográfica do pico do
13
insumo, balanço de massas e fatores que podem interferir na estabilidade do
medicamento.
Figura 1 – Publicações sobre degradação forçada entre 2008 e 2012.
FONTE: JAIN et al., 2013
Este artigo tem como objetivo criar um guia científico para auxiliar no
desenvolvimento, execução e interpretação dos estudos de degradação forçada.
2 ESTUDOS PRELIMINARES DE DEGRADAÇÃO FORÇADA
Os estudos de degradação forçada são delineados para produzir testes
indicadores de estabilidade em condições extremas e para simular possíveis
produtos de degradação durante a produção e estocagem do produto. Segundo a
RDC nº 58/2013 as amostras a serem testadas devem ser submetidas às condições
de hidrólise ácida e básica, oxidação, fotólise e íons metálicos (BRASIL , 2013).
O objetivo é atingir, no mínimo, 10% do insumo degradado devendo-se,
porém, estabelecer um limite de degradação, uma vez que, ao estressar em excesso
uma molécula, pode haver a perda dos produtos primários. Os problemas
relacionados à estabilidade encontrados durante o estudo irão formar a base do
desenvolvimento na otimização do estudo indicador de estabilidade (BRASIL, 2013).
A estratégia inicial é semelhante para o insumo ativo e o produto acabado. A
estrutura molecular do insumo ativo se torna peça chave no delineamento do estudo,
pois a partir dela podemos deduzir se o composto irá absorver radiação UV para ser
detectada. A presença de grupos funcionais ionizáveis fornece uma informação
valiosa na predição do comportamento da molécula (BAERTSCHI, 2005).
14
O método mais utilizado na literatura é o de cromatografia líquida de alta
eficiência de fase reversa (RP-HPLC) com detector de arranjo de fotodiodos (PDA)
(CARTENSEN et al., 2000). O método cromatográfico ideal deve mostrar junto com
o insumo ativo principal todos os produtos de degradação, baseando-se na lei da
conservação de massas, isto é, qualquer perda do insumo ativo, em área
cromatográfica, será convertida em produtos de degradação em proporções iguais.
De fato, torna-se praticamente impossível um método cromatográfico que possa
cumprir fielmente tais requisitos. (BAERTSCHI, 2005)
3 ESCOLHA DAS CONDIÇÕES DE DEGRADAÇÃO
A escolha da concentração inicial do ativo a ser degradada deve ser de 1.0
mg/mL. (BAERTSCHI, 2005, ALSANTE et al. 2003) Se a solubilidade for uma
limitação, inerente à própria molécula pode-se utilizar metanol em quantidades
variadas. Testes devem ser realizados nas concentrações em que o insumo ativo vai
estar presente na formulação final. Outro aspecto prático é que amostras que
necessitam de grandes concentrações de ácido, álcali e agentes oxidantes para os
testes de estresse, são recomendadas a serem reduzidas a níveis toleráveis pela
coluna para serem injetados. Recomenda-se diluição com a fase móvel utilizada
(BAERTSCHI, 2011).
3.1 Condições de hidrólise ácida/básica
Condições ácidas, básicas e neutras devem ser empregadas para produzir
reações hidrolíticas. Isso é especialmente importante quando o composto a ser
testado possui grupos funcionais ionizáveis. As reações de degradação dependem
de uma variedade de fatores como a constante dielétrica, a polaridade do solvente e
a energia de superfície (BAERTSCHI, 2005). A figura 2 mostra um exemplo de
delineamento do estudo hidrolítico sob condição ácida e básica.
Muitos insumos ativos apresentam problemas de solubilidade em
concentrações analíticas. Logo, para analisar as características de hidrólise, pode
ser necessária a adição de um co-solvente para facilitar a dissolução. Os solventes
mais comuns utilizados nas análises são o metanol e acetonitrila. (ALSANTE et
al.,2003)
Um cuidado necessário a ser considerado é de que o metanol possui
potencial de participação na química de degradação da molécula atuando como
15
agente nucleofílico, portanto deve ser utilizado com ressalvas. A acetonitrila, por ser
considerada inerte, é recomendada. A neutralização da solução antes da injeção do
HPLC não é recomendada devido à possibilidade de precipitação ou de reações
secundárias.
Figura 2 - Modelo sugerido para estudos de degradação forçada por
hidrólise ácida/básica.
* em área cromatográfica degradada do insumo ativo.
FONTE: Adapatado de SINGH et al., 2000
3.2 Condições de oxidação
Reações de oxidação são um dos mais comuns mecanismos de degradação
de medicamentos e insumos. Existem três rotas de degradações principais a
considerar para testes de estresse: oxidação induzida por radicais, oxidação
mediada por peróxidos e oxidação por transferência de elétrons. (BOCCARDI et. al,
2005). As impurezas presentes sejam no insumo ativo, sejam no produto acabado,
são as principais causas de oxidação nas condições normais de estocagem.
16
O objetivo principal dos ensaios forçados é acelerar o processo natural de
oxidação e identificar impurezas que podem ser formadas durante testes acelerados
e de longa duração.
3.2.1 Reações induzidas por radicais (autoxidação)
As reações de autoxidação possuem um mecanismo complexo que consiste
em uma reação em cadeia mediada por radicais livres, divididas em três etapas. A
figura 3 mostra, em termos gerais, o processo de oxidação a partir de um iniciador.
Figura 3 – Sequência da reação em cadeia mediada por radicais livres
FONTE: BOCCARDI et al. 2005
Para formação de radicais livres na simulação de autoxidação são utilizados
compostos nitrogenados (Tabela 1). Originalmente, esta prática foi sugerida por
Boccardi et al. A molécula mais utilizada e popularmente conhecida é a
azobisisobutironitrila (AIBN). (BOCCARDI et al. , 2005) Os autores demonstraram
que estes iniciadores de radicais baseados em compostos nitrogenados são
capazes de produzir produtos de degradação primários observados nos estudos de
estabilidade de longa duração.
A Figura 4 mostra o mecanismo de formação de radicais livres através do
AIBN. Ao aquecer a amostra a 40ºC o AIBN expele o nitrogênio da sua estrutura
gerando carbonos reativos que rapidamente são oxidados por oxigênio molecular,
formando um radical peróxi que mimetiza o processo de autoxidação em condições
de estocagem (BOCCARDI et al., 2005).
17
A quantidade de iniciadores nitrogenados adicionados deve ser
aproximadamente 10 vezes a concentração de amostra.
Tabela 1 – Compostos nitrogenados comumente utilizados para produção de radicais livres nos testes de degradação forçada.
FONTE: Adaptado de BOCCARDI et al., 2005
Nome químico Estrutura química Solubilidade
em água
em água
em água
em água
em metan
ol
em metan
ol
18
Figura 4 - Mecanismo de formação de radicais peróxidos através do AIBN.
FONTE: BOCCARDI et al., 2005
3.2.2 Reações mediadas por peróxidos
As análises de degradação forçada envolvendo peróxidos, juntamente com
os estudos com iniciadores de radicais irão formar uma base mais completa da
susceptibilidade da molécula à oxidação. O peróxido de hidrogênio é o composto
mais empregado nos testes (PORTER et al., 1995)
As reações de oxidação com a utilização de peróxido de hidrogênio são
relativamente rápidas à temperatura ambiente, logo não é necessário aquecer as
amostras testadas. Ao elevar a temperatura de reação pode ocorrer a formação de
radicais hidroxilas, que são indesejados, pois são mais fortes e não seletivos, que
reagem muito rapidamente em solução levando a resultados diferentes em relação
ao peróxido de hidrogênio (BOCCARDI et al., 2005). A figura 5 mostra a formação
de radicais hidroxilas através do calor.
Figura 5 – Formação de radicais hidroxila a partir do peróxido de hidrogênio.
FONTE: BOCCARDI et al., 2005
As concentrações de peróxido utilizadas nos ensaios podem variar de 0,1 a
30%. Temperaturas de, no máximo, 40ºC são utilizadas para acelerar a reação. Um
período de 24h é suficiente para demonstrar a degradação com peróxido de
hidrogênio. A figura 6 mostra uma sugestão de delineamento de estudo de oxidação.
19
Quando é necessário estressar uma molécula com peróxidos em uma ampla
faixa de pH, deve-se levar em consideração o solvente utilizado. O metanol é o
solvente de escolha. A acetonitrila, em soluções de pH elevado, reage com o
peróxido de hidrogênio, formando um radical instável que não ocorre no processo
natural de oxidação.
Figura 6 -
Modelo sugerido para degradação forçada por oxidação * em área cromatográfica
degradada do insumo ativo.
FONTE: Adapatado de SINGH, 2000
3.2.3 Reações de transferência de elétronsO mecanismo de oxidação por transferência de elétrons ocorre na presença
de metais. A exposição de insumos a metais de transição tais como cobre e/ou ferro
podem levar à oxidação. A concentração de metal adicionada deve ser de 1 ppm de
Cu(II)Cl2 ou Fe(III)Cl3 (ALSANTE et al., 2007).
20
A figura 7 mostra o mecanismo de oxidação do arzoxifeno na presença do
íon cobre. O íon se complexa com a amina da acetonitrila, utilizada como diluente.
Na segunda reação ocorre a transferência de elétrons do oxigênio da molécula,
gerando um radical que ataca a estrutura interna, formando dímeros.
Figura 7 – Oxidação de transferência de elétrons mediada por metais.
FONTE: BAERTSCHI et al., 2011
Estes metais podem ser encontrados em vidrarias ou estar presentes em
impurezas dos solventes utilizados nas análises por HPLC. É importante haver um
procedimento padrão de limpeza das vidrarias que evitem quaisquer contaminações
que possam comprometer a qualidade dos ensaios. (DOTTERER et al., 2010)
4 CONDIÇÕES DE FOTOESTABILIDADE
A fotoestabilidade de insumos e produtos acabados pode ter impacto sobre
o prazo de validade, manuseio, estocagem e até a segurança do produto devido à
fototoxicidade e fotogenotoxicidade. Em 1998, com a implementação do ICH Q1B,
que define os parâmetros para condução dos estudos de degradação forçada, houve
um avanço significativo na padronização dos procedimentos em relação às outras
condições. (ICH, 1996)
No Brasil, a ANVISA publicou a RDC nº 45/2012, que segue os mesmos
padrões do ICH para a condução dos estudos de fotoestabilidade. A molécula deve
ser exposta a uma mistura de UV-B (280-320 nm), UV-A (320-400 nm) e luz visível
(400-800nm) em proporções variadas. (BRASIL, 2012) No entanto, a absorção de
21
luz pela molécula não leva, necessariamente, a fotodegradação. Em alguns casos, o
excipiente absorve radiação e transfere a energia para o insumo ativo, podendo
gerar degradação indireta. Os testes devem ser realizados na embalagem primária e
secundária e, quando em solução, utilizar uma amostra controle, protegida da fonte
de luz. A acetonitrila é o solvente indicado, pois o metanol pode produzir artefatos de
degradação a partir de radicais metóxi formados devido à exposição à luz
(BAERTSCHI, 2005). A figura 8 mostra um exemplo de fotodegradação e o
mecanismo proposto do medicamento fenoprofeno, a partir da radiação UV. O
tempo de exposição deve ser suficiente para haver uma degradação entre 10 e 20%,
no qual, dependendo da susceptibilidade da molécula a decomposição, pode variar
significativamente. (BAERTSCHI, 2011)
Quando os testes são feitos no produto acabado, tanto o insumo ativo como
os excipientes podem levar à degradação. É recomendado expor o placebo nas
mesmas condições e tempo para verificar uma possível interferência no método de
identificação (ALSANTE et al.. 2007).
4.1 Fontes de luz
Como citado anteriormente, a molécula deve ser estressada numa faixa de
luz de 400 a 800 nm, as quais compreendem o espectro de luz UV e vísivel.
Entretanto, é dificil predizer qual parte do espectro é mais destrutivo para uma
molécula específica. Logo, fontes de luz com diferentes distribuições de intensidade
no espectro podem levar a fotodegradações com perfis diferentes. (BAERTSCHI,
2011).
A RDC nº 45/2012 da ANVISA especifica que a exposição mínima de 1,2
milhões de lux/h integrados a uma energia UV de aproxidamente 200 watt h/m² para
testes confirmatórios (BRASIL, 2012), que são os mesmos parâmetros sugeridos
pelo ICH Q1B. O guia fornece duas opções de fontes de luz, as quais devem possuir
o certificado da ISO 10977 (1993) (ICH, 1996). É necessário manter um controle de
temperatura para garantir que não haja degradação térmica. Pode-se utilizar papel
alumínio para proteger as amostras-controle deste efeito, colocando-as junto à
amostra testada, sob o mesmo tempo e intensidade de exposição, garantindo assim
que, caso haja, a degradação existente seja resultado da exposição à luz.
22
Figura 8 – Degradação do fenoprofeno sob radiação UV. Abaixo é mostrado
o mecanismo proposto que leva a instabilidade da molécula.
FONTE: BAERTSCHI et al., 2011.
5 CONSIDERAÇÕES ANALÍTICAS NA VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA
Como descrito anteriormente, a cromatografia líquida de alta eficiência com
detector de arrranjo de fotodiodos é preferencialmente utilizada para o
desenvolvimento de um método indicador de estabilidade. A vantagem deste tipo de
detector é dar o poder ao analista de fazer uma varredura em uma ampla faixa do
espectro UV em uma única análise.
De acordo com o FDA, o método indicador de estabilidade é um
procedimento analítico capaz de discriminar o insumo ativo de quaisquer produtos
de degradação. Além disso, deve ter uma sensibilidade suficiente para detectar e
quantificar estes produtos (FDA, 1987). A necessidade de notificação, identificação e
qualificação do(s) produto(s) de degradação no decorrer do estudo de estabilidade
do medicamento deverá ser avaliada com base nas informações descritas na RDC
58/2013, conforme mostra a tabela 2.
23
Tabela 2: Critérios de notificação, identificação e qualificação dos produtos
de degradação em medicamentos.
Fonte: BRASIL, 2013
Para a avaliação dos produtos de degradação pode-se utilizar o cálculo do
balanço de massa, que nada mais é que quantificar os picos de degradação e então
comparar com a perda da quantidade de amostra do composto original. O balanço
de massa é aceito quando totalizar aproximadamente 100%, ou seja, a diminuição
da potência do composto original é convertida em produto de degradação
quantificável (ITO, 2012).
O conhecimento das propriedades físico-químicas do insumo ativo é o ponto
de partida do processo de desenvolvimento do método. O objetivo principal é obter
uma condição de separação capaz de determinar o maior número de picos possíveis
em uma análise. As variáveis mais comuns de separação incluem o tipo de solvente,
o pH da fase móvel, o tipo de coluna utilizada e a temperatura do forno. Deve-se
variar drasticamente estas condições para forçar mudanças no perfil de separação
dos picos (DOLAN, 2002).
Para obter um pH baixo ou intermediário na solução, pode-se usar tampão
fosfato na faixa de pH entre 2.5 – 6.5. Se o método for analisar a amostra acoplado
um detector de espectrometro de massas é importante selecionar tampões que
sejam compatíveis com o equipamento, como, por exemplo, 0,1% de ácido
trifluoroacético (pH ~ 1,9) e acetato de amônia para pH elevado. A temperatura da
coluna é uma ótima ferramenta para a seletividade do método, principalmente
quando utilizada uma eluição gradiente (DOLAN, 2002).
A validação de metodologia deve seguir os parâmetros da RE nº 899/2003
(BRASIL, 2003).
24
6 CONCLUSÃO
Os estudos de degradação forçada são parte importante no delineamento do
estudo indicador de estabilidade. Entretanto, é importante ressaltar que os produtos
de degradação forçada são ‘’potenciais’’ podendo, ou não, formar-se nas condições
normais de estocagem. Tanto os guias internacionais como a RDC 58/2013,
recentemente publicada pela ANVISA, não especificam como conduzir os ensaios, a
exceção dos testes de fotoestabilidade. O objetivo de qualquer estratégia usada
para degradação forçada é produzir uma degradação de 10-20% da concentração
inicial, para poder observar-se todos os produtos primários. Com o maior rigor dos
órgãos regulatórios, fica provada a necessidade de um maior entendimento da
condução de ensaios forçados, bem como o desenvolvimento de estudos
indicadores de estabilidade.
25
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