FLÁVIO ROBERTO GUERRA SEABRA
ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS
METALOPROTEINASES DA MATRIZ (MMP-1, MMP-2 E
MMP-9) NA DOENÇA PERIODONTAL
NATAL - RN
2006
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
CURSO DE DOUTORADO EM PATOLOGIA ORAL
ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS
METALOPROTEINASES DA MATRIZ (MMP-1, MMP-2 E
MMP-9) NA DOENÇA PERIODONTAL
Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UniversidadeFederal do Rio Grande do Norte, como parte dosrequisitos para a obtenção do Grau de Doutor emPatologia Oral.
Doutorando: Flávio Roberto Guerra SeabraOrientadora: Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz
NATAL/RN
2006
3
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Setorial de Odontologia
Seabra, Flávio Roberto Guerra . Análise imuno-histoquímica das metaloproteinases da matriz ( MMP-1,MMP-2 eMMP-9) na doença periodontal / Flávio Roberto Guerra Seabra. –Natal,RN,2006.
100f.
Orientador: Lélia Maria Guedes Queiroz.
Tese (Doutorado em Patologia Oral) –. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro deCiências da Saúde. Departamento de Odontologia.
1. Doença periodontal - Tese. 2.Periodontite- Tese. 3. Metaloproteinases da matriz imuno-histoquímica -Tese. I. Queiroz,Lélia Maria Guedes. II. Título.
Black D64RN/UF/BSO
4
Dedicatória
5
DEDICATÓRIAS
A DEUS,Por demonstrar tão claramente sempre estar presente nos momentos mais
importantes da minha vida, não permitindo que eu Te esqueça,
A meus pais, Eduardo e Zélia,
Pelos seus exemplos de conduta que me fizeram quem eu sou
A Bárbara,
Pelo constante apoio em todos os momentos da minha vida e decisões
importantes que tomamos juntos, pela ajuda direta em vários momentos deste
trabalho e pelo amor que temos um pelo outro que me faz dizer que por você...
A João Victor,
Pessoa mais importante e ao mesmo tempo mais divertida da nossa vida. Por tudo
o que tem nos ensinado nos últimos quatro anos e por ser tão inteligente, alegre e
companheiro.
6
Agradecimentos
7
AGRADECIMENTOS
A meus sogros Nogueira e Marialba e meus cunhados Diego e Lucas pelaconvivência de constante amizade e respeito.
À minha orientadora Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, pela constantedisposição em ajudar e orientar.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, Dra. LéliaBatista de Souza, Dra. Roseana de Almeida Freitas, Dr. Leão Pereira Pinto,Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Dra. Hébel Cavalcanti Galvão,
À Profa. Dra. Rejane Andrade de Carvalho pelo incentivo.
Aos professores Tasso Gadelha, Lecy Fernandes e Maria Alice Fuscella,diretores do Curso de Odontologia da Universidade Potiguar durante o períododeste Doutorado, por terem dado condições para que eu pudesse cursá-lo.
Aos Professores da disciplina de Periodontia da UnP, Odilon de Amorim GarciaFilho, Carlos Sarmento, Euler Dantas, José Nazareno Júnior e JanaínaLemos e da Disciplina de Cirurgia, Fernando Maia, Fernando Pinto, MariaAuxiliadora, Lourdes Arruda e José Sandro por entenderem as minhasausências quando necessário.
Às colegas Éricka, pela ajuda de sempre não só nesse trabalho mas em váriosmomentos em que precisei e Ruthinéia, que cedeu material para parte daamostra utilizada neste trabalho
Aos meus colegas de turma, Simone, Manuel e Sormani.
Aos colegas de disciplinas durante o curso, Gustavo, Márcia, Márcio, Rivadávio,Rosilene, Andréa, João, Karuza, Cassiano, Danielle, George, Igor, Fernanda,Carmem, Antônio Luiz, Roberta, Marta e Claudine.
Aos funcionários da Disciplina de Patologia Oral, Gracinha, Sandra, Canindé,Hévio e Idelzuíte.
Aos colegas do CAMS-TRE-RN, Dra. Salete, Dr. Tércio, Dr. Carlos Augusto eDr. Francisco Morais
Aos colegas da Clínica Carlos Alexandre Câmara, Dr. Carlos Alexandre, Dr.Jolber, Dra. Juliana, Dra. Tamara, Edna, Kelly, Márcia e Mônica.
Em especial ao Prof. Damásio, que cedeu as instalações do laboratório deHistologia da UnP para a análise das lâminas utilizadas neste trabalho.
8
Resumo
9
RESUMO
A destruição tecidual observada na doença periodontal é causada, principalmente,
por componentes do hospedeiro que têm sua produção estimulada pelos produtos
liberados pelas bactérias. As Metaloproteinases da Matriz ou MMPs, enzimas
relacionadas à degradação de matriz extracelular em processos tanto fisiológicos
quanto patológicos são consideradas as principais responsáveis pela perda
tecidual característica da doença periodontal, e o entendimento de como isso
ocorre pode ter uma série de implicações benéficas em relação à prevenção, ao
diagnóstico e ao tratamento desta doença. Neste trabalho foi estudada a
expressão imuno-histoquímica da MMP-1, da MMP-2 e da MMP-9 em gengivas
clinicamente diagnosticadas com doença periodontal. A MMP-1 teve expressão
significativamente maior que as outras duas nos casos de gengivite tanto no
epitélio (p=0,0008) quanto no tecido conjuntivo (p=0,0049). Na periodontite, a
MMP-1 e MMP-9 tiveram expressões significativamente maiores que a MMP-2
tanto no epitélio (p<0,0001) quanto no conjuntivo (p=0,0002). A MMP-1 e MMP-9
mostraram maior expressão na periodontite que na gengivite sendo a MMP-1
apenas no tecido conjuntivo (p=0,03) e a MMP-9 no epitélio (p=0,003) e no
conjuntivo (p=0,04). Concluiu-se portanto que a MMP-1 apresenta forte expressão
em todos os estágios da doença peridontal, aumentando no tecido conjuntivo no
caso de progressão para periodontite, podendo portanto ter um papel crucial na
degradação de tecido conjuntivo e perda óssea observada na doença desde os
estágios iniciais de gengivite até a progressão para periodontite. A MMP-9, é
expressa mais na periodontite que na gengivite, tanto no epitélio quanto no
conjuntivo significando que esta enzima pode ter importância na progressão da
gengivite para a periodontite atuando na reabsorção óssea observada na doença
periodontal.
Palavras-chave: Doença periodontal, Periodontite, Metaloproteinases da Matriz,
Imunohistoquímica.
10
Abstract
11
ABSTRACT
The tissular destruction found in periodontal diseases is caused mainly by
components of the host that have its production stimulated by the products of the
microorganisms present on the plaque. Matrix Metalloproteinases (MMPs), a class
of enzymes involved both in physiologic and pathologic extracellular matrix
degradation are considered the main responsible for the characteristic tissular loss
in periodontal disease, and the understanding of how this happens can have a
series of beneficial implications for prevention, diagnosis and treatment of this
illness. The aim of this work was to study the immunohistochemical expression of
MMP-1, MMP-2, and MMP-9 in fragments of gingival biopsies with clinical
diagnose of periodontal disease. MMP-1 has expressed significantly more than the
others MMPs in gingivitis both in the epithelium (p=0,0008) and connective tissue
(p=0,0049). In periodontitis, both MMP-1 and MMP-9 has expressed significantly
more than MMP-2 in the epithelium (p<0,0001) and in the connective tissue
(p=0,0002). MMP-1 and MMP-9 presented more expression in periodontitis than in
gingivitis but MMP-1 only in the connective tissue (p=0,03) and MMP-9 in the
epithelium (p=0,003) and in the connective tissue (p=0,04). In conclusion, these
results indicate that the MMP-1 presents high expression in every stages of the
periodontal diseases, and increases its expression in the connective tissue when
the gingivitis evolves to periodontitis. Therefore, it may have an important role in
connective tissue degradation and bone loss observed in disease, since early, in
gingivitis, until late stages, in periodontitis, of the periodontal disease. MMP-9 has
expressed more in periodontitis than in gingivitis, both in epithelium and in
connective tissue. It means that this enzyme may have some importance in the
progression of gingivitis to periodontitis by acting in bone resorption observed in
this desease.
Key-words: Periodontal disease, Periodontitis, Matrix metalloproteinases,Immunohistochemistry
12
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
Quadro 1 Especificidade, recuperação antigênica, diluição etempo de incubação dos anticorpos utilizados
54
Figura 1 Figura 1. Localização do processo inflamatório emespécimes com diagnóstico clínico de periodontite.Inflamação considerada perivascular e justa-epitelial(A e B) correspondendo a um quadro histológico demenor gravidade que a inflamação difusa (C e D).(H/E, 40x em A e C e H/E, 200x em B e D)
61
Figura 2 Figura 2. Caracterização do tipo celular predominanteno infiltrado inflamatório em lâminas com diagnósticoclínico de periodontite, evidenciando em A uminfiltrado predominantemente Linfocitário e em B umconsiderado Linfo-plasmocitário. (H/E, 200x)
63
Figura 3 Figura 3. Análise da marcação imuno-histoquímicapara as MMP-1 no tecido epitelial de revestimento,onde em A é demonstrada uma marcaçãoconsiderada forte (++) em B uma marcaçãoconsiderada fraca (+) e em C ausência de marcação(-). (SABC, 200x)
65
Figura 4 Figura 4. Análise da marcação imuno-histoquímicapara as MMP-1 no tecido conjuntivo, onde em A édemonstrada uma marcação considerada forte (++)em B uma marcação considerada fraca (+) e em Causência de marcação (-). (SABC, 200x)
66
Figura 5 Figura 5. Análise da marcação imuno-histoquímicapara as MMP-1 evidenciando um neutrófilo marcado(Setas). (SABC, 200x)
68
Figura 6 Figura 6. Análise da marcação imuno-histoquímicapara as MMP-1 evidenciando células endoteliaismarcadas (Setas). (SABC, 400x)
68
Figura 7 Figura 7. Análise da marcação imuno-histoquímicapara as MMP-1 evidenciando plasmócitos (setaverde), linfócitos (seta vermelha), fibroblastos (setapreta) e macrófagos (seta azul) marcados. (SABC,400x)
68
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Total de casos analisados. Natal/ RN, 2006 60
Tabela 2. Associação entre o tipo de doença periodontaldiagnosticada e a localização da inflamação. Natal/ RN,2006.
60
Tabela 3. Associação entre o tipo de doença periodontaldiagnosticada e o tipo de infiltrado inflamatóriopredominante. Natal/ RN, 2006
62
Tabela 4. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-1 no epitélio. Natal/ RN, 2006
64
Tabela 5. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-1 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, 2006
67
Tabela 6. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celularencontrado no tecido conjuntivo gengival para a MMP-1. Natal/ RN, 2006
67
Tabela 7. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-2 no epitélio. Natal/ RN, 2006
69
Tabela 8. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-2 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, 2006
70
Tabela 9. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celularencontrado no tecido conjuntivo gengival para a MMP-2. Natal/ RN, 2006
70
Tabela 10. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-9 no epitélio. Natal/ RN, 2006
71
Tabela 11. Gradação da marcação imuno-histoquímica para MMP-9 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, 2006
71
Tabela 12. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celularencontrado no tecido conjuntivo gengival para a MMP-9. Natal/ RN, 2006
72
Tabela 13. Média dos postos e significância estatística damarcação imuno-histoquímica para a MMP-1, MMP-2 eMMP-9 em gengivite. Natal/ RN, 2006
72
Tabela 14. Média dos postos e significância estatística damarcação imuno-histoquímica para a MMP-1, MMP-2 eMMP-9 em periodontite. Natal/ RN, 2006
73
14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
oC Graus Célcius
µm Micrometro
AAP American Academy of Periodontology
ADAMs Adamalisinas
AE Elastase ativa
AMP Adenosina monofosfato
BB-94 Batimastat
bFGF FGF básico
Ca Cálcio
cAMP AMP cíclico
CCN Fator de crescimento de tecido conjuntivo
ConA Concavalina A
Cys Cisteína
E-α-1 PI Complexo Elastase-inibidor de proteinase α-1
EGF Fator de crescimento epitelial
ELISA Enzyme-linked immunossorbent assay
FGF Fator de crescimento para fibroblastos
H2O2 Peróxido de hidrogênio
IFNγ Interferon-γ
IL Interleucina
kDa KiloDálton
LPS Lipopolissacarídeo
MEC Matriz extracelular
ml mililitro
mm milímetro
mM milimolar
MMP Metaloproteinase da Matriz
MMPs Metaloproteinases da Matriz
15
MT-MMP Metaloproteinase da matriz ligadas à membrana
MT-MMPs Metaloproteinases da matriz ligadas à membrana
nm Nanômetro
OPG Osteoprotegerina
PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas
PGE2 Prostaglandina E2
pH Potencial hidrogeniônico
PMN Polimorfonucleares
RANKL Ligante do receptor ativador do fator nuclear κB
RNA Ácido ribonucléico
RNAm RNA mensageiro
RT-PCR Real-time polymerase chain reaction
SABC Estreptavidina-biotina
SPARC Proteína secretada ácida rica em cisteína
TA Temperatura ambiente
TGF Fator de crescimento transformador
TIMP Inibidor tecidual de metaloproteinases
TIMPs Inibidores teciduais de metaloproteinases
TNF Fator de Necrose Tumoral
TSP Trombospondina
VEGF Fator de crescimento vascular endotelial
Zn Zinco
16
Sumário
17
SUMÁRIO
1 Introdução _________________________________________________ 18
2 Revisão da Literatura ________________________________________ 21
2.1 Doença Periodontal ______________________________________ 22
2.2 Matriz Extracelular _______________________________________ 28
2.3 Metaloproteinases da Matriz (MMPs) ________________________ 31
2.4 MMPs na Doença Periodontal ______________________________ 42
3 Proposição_________________________________________________ 51
4 Material e Métodos __________________________________________ 53
4.1. CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO___________________________ 54
4.2. POPULAÇÃO ___________________________________________ 54
4.3. AMOSTRA______________________________________________ 54
4.4. ANÁLISE MORFOLÓGICA_________________________________ 55
4.5 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO ___________________________ 55
4.6. MÉTODO DE ANÁLISE DAS CÉLULAS IMUNOMARCADAS _____ 58
4.7. TRATAMENTO ESTATÍSTICO ______________________________ 60
4.8 IMPLICAÇÕES ÉTICAS____________________________________ 60
5 Resultados_________________________________________________ 62
5.1 Resultados clínicos e morfológicos _________________________ 63
5.2. Resultados imuno-histoquímicos __________________________ 67
6 Discussão _________________________________________________ 77
7 Conclusões ________________________________________________ 92
Referências bibliográficas______________________________________ 94
ANEXO 1 ___________________________________________________ 100
ANEXO 2 ___________________________________________________ 101
ANEXO 3 ___________________________________________________ 102
ANEXO 4 ___________________________________________________ 103
ANEXO 5 ___________________________________________________ 104
18
Introdução
19
1 INTRODUÇÃO
A periodontite não é uma doença exclusiva do nosso tempo. Já foram
detectadas reabsorções ósseas em fósseis de humanos que viveram na era
paleolítica e em múmias da civilização egípcia que viveram há 4.000 anos.
(GOLD, 1985)
Considera-se que os microorganismos presentes no biofilme dentário,
principalmente os localizados no ambiente sub-gengival, constituem o principal
agente etiológico extrínseco das doenças periodontais inflamatórias, pois
substâncias produzidas no biofilme dentário têm a capacidade de penetrar na
gengiva saudável através dos epitélios juncional e sulcular devido à relativa
permeabilidade destes.
Na década de 80 os estudos sobre história natural da doença periodontal
nos mostraram que apesar da periodontite sempre ter início com uma gengivite,
em alguns casos a gengivite pode permanecer indefinidamente sem evoluir para a
periodontite. No entanto, a periodontite, quando ocorre, não ocorre de maneira
semelhante em todos os indivíduos e nem mesmo nos dentes de um mesmo
indivíduo. No estabelecimento da periodontite, parecem ter importância outros
fatores que, somados à ação dos microorganismos, determinam a evolução da
condição de gengivite para uma doença periodontal inflamatória que atinge tecidos
de suporte. Esses fatores estão relacionados aos chamados fatores etiológicos
secundários da doença periodontal, assim como à resposta de defesa do
hospedeiro aos agentes agressores provenientes do biofilme dentário.
Podemos descrever a doença periodontal como a reação do organismo, no
intuito de protegê-lo de agressores externos, tentando mantê-los sempre o mais
longe possível do meio interno. Dessa forma, se há o acúmulo de biofilme na
superfície do dente, e este representa um agente com potencial agressor muito
forte, o organismo reage tentando mantê-lo no meio externo. Para isso, lança mão
de meios que o permitam levar o epitélio juncional mais para apical, para
20
distanciar-se do agente agressor, com isso tem lugar todo o processo biológico
que culmina com a reabsorção do osso alveolar e perda do dente.
Isso se dá inicialmente pela destruição do tecido conjuntivo gengival, onde
participam principalmente colagenases como a MMP-1, e pela migração apical do
epitélio juncional, onde se acredita ser necessária a degradação da membrana
basal deste epitélio, papel muito bem desempenhado pelas MMP-2 e MMP-9
semelhantemente ao que foi demonstrado em neoplasias (NABESHIMA et al.
2002).
Assim, considera-se que a destruição que tem lugar no tecido conjuntivo
gengival e no osso alveolar é muito mais causada por componentes teciduais
produzidos pelo próprio hospedeiro que por componentes produzidos e liberados
pelas bactérias do biofilme, sendo esta uma das explicações para o fato da
periodontite ocorrer de forma tão diferente entre os indivíduos.
Sendo as metaloproteinases da matriz (MMPs) as enzimas responsáveis
pela degradação da matriz extracelular e do componente orgânico do osso,
considera-se que estas tenham papel crucial na doença periodontal inflamatória
crônica destrutiva e possivelmente um papel na explicação do por quê nem toda
gengivite evoluirá para uma periodontite. Neste trabalho, estudaremos através de
análise imuno-histoquímica a presença e o papel destas MMPs (MMP-1, MMP-2 e
MMP-9) na doença periodontal, objetivando determinar se a expressão e/ou
distribuição destas enzimas nas diferentes células e tecidos encontrados em
gengivas inflamadas influem na diversidade de apresentação clínica desta doença.
21
Revisão da Literatura
22
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Doença Periodontal
A doença periodontal tem uma alta prevalência na população mundial, com
quase 20% das pessoas de 30 a 39 anos acometidas por periodontite nos Estados
Unidos, chegando a valores próximos a 50% das pessoas na faixa etária de 50 a
59 anos. Na Europa e América do Sul, tem-se valores semelhantes e no Brasil,
1,19% dos indivíduos apresenta bolsas de 4 a 5 mm já na idade de 15 a 19 anos.
(ALBANDAR, 2002; GJERMO et al. 2002; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004;
SHEIHAM; NETUVELI, 2002).
Socransky e Haffajee (2002), descrevem as infecções bacterianas em
várias classes que são as infecções agudas, como os abscessos, as crônicas,
como a tuberculose, as tardias, como a febre reumática e as causadas por
biofilmes bacterianos como a doença periodontal.
Armitage, (1999) e Tunes et al., (2005), descreveram a atual classificação
das doenças periodontais preconizada pela Academia Americana de
Periodontologia (AAP) substituindo a classificação de 1989. As doenças gengivais
são consideradas em duas categorias onde a primeira abrange as doenças
induzidas por biofilme dentário (ou placa bacteriana), ou seja, as gengivites, que
engloba a chamada gengivite induzida exclusivamente por placa, as gengivites
modificadas por fatores sistêmicos, as gengivites modificadas por medicamentos e
as gengivites modificadas por deficiências nutricionais. A segunda categoria das
doenças gengivais inclui as lesões gengivais não induzidas por placa como as de
origem viral, fúngica, genética, relacionadas a desordens sistêmicas como o
líquen-plano (classificada anteriormente como gengivite descamativa) as
traumáticas e outras. As periodontites são classificadas em Periodontite Crônica,
conhecida anteriormente como Periodontite do Adulto, a Periodontite Agressiva,
conhecida anteriormente como Periodontite Juvenil e a Periodontite como
23
Manifestação de Doenças Sistêmicas, que abrange as condições que no passado
eram relacionadas no item Periodontites Pré-puberais.
Sabe-se hoje que a doença periodontal é causada principalmente por
bactérias localizadas no biofilme dentário (SOCRANSKY; HAFFAJEE, 2002;
TODESCAN, 2001; WILLIAMS et al.,1992), e que possui ainda como fatores
etiológicos secundários, várias condições locais como fatores de retenção de
placa, ou sistêmicas, como hábito de fumar e presença de diabetes, que
modificam o curso da doença facilitando a sua instalação e/ou acelerando a sua
progressão (BEZERRA et al., 2003; MALDONADO et al., 2004; PASSANEZI et al.
2005; TODESCAN, 2001; WILLIAMS et al., 1992).
HAAKE et al. (2004), chama a atenção para o fato de que se sabe desde a
década de 70 que, segundo a hipótese da placa específica, a petogenicidade do
biofilme dentário depende da presença e aumento de microorganismos
específicos.
Enquanto na saúde periodontal observa-se maior proporção de bactérias
Gram-positivas, na gengivite, a proporção entre Gram-positivas e Gram-negativas,
assim como entre aeróbios e anaeróbios encontra-se mais equilibrada e na
periodontite já se observa uma alta proporção de anaeróbios, chegando a 90%, e
de Gram-negativos, chegando a 75%. As bactérias mais cultivadas em sítios com
periodontites são: o Porphyromonas gingivalis, a Tannerella forsythia e o
Actinobacillus actinomycetemcomitans (HAAKE et al. 2004b).
Socransky e Haffajee (2002) associam as bactérias encontradas
freqüentemente no biofilme dentário em vários grupos distintos diferenciados por
cores. Os colonizadores iniciais são agrupados nos complexos azul, amarelo,
verde e púrpura e correspondem a bactérias como as Actinomyces, os
componentes do gênero Streptococcus, as espécies de Capnocytophaga, o
Actinobacillus actinomycetemcomitans sorotipo A e a Veilonella parvula, todas
consideradas não patogênicas ou de baixa patoenicidade ao periodonto. Bactérias
que aparecem mais tardiamente, predominantemente anaeróbias e Gram-
24
negativas devido ao consumo do oxigênio disponível pelos colonizadores iniciais,
correspondem aos chamados complexos laranja e vermelho, considerados mais
patogênicas ao periodonto, principalmente as do complexo vermelho que são o
Porphyromonas gingivalis, a Tannerella forsythia, conhecida até recentemente
como Bacteroides forsythus, e a Treponema denticola.
A importância dos fatores secundários foi demonstrada por Albandar (2002)
que encontrou riscos aumentados de doença periodontal em pacientes fumantes e
portadores de diabetes mellitus. Bezerra et al. (2003) através da avaliação dos
prontuários odontológicos de 46 pacientes fumantes e 49 não-fumantes, observou
que as médias dos índices profundidade de sondagem e recessão gengival
vestibular de todos os dentes presentes foi estatisticamente maior nos pacientes
fumantes. Já Maldonado et al. (2004) relataram que a maior prevalência e
severidade de doença periodontal em pacientes diabéticos dos tipos 1 e 2 é bem
documentada por estudos de caráter epidemiológico e atribuída a vários
mecanismos distintos.
O papel do hospedeiro em restringir a infecção aos tecidos periodontais é
de extrema importância para a saúde geral do indivíduo. Mas nesse processo, a
resposta do organismo, que inicialmente tem a intenção de defendê-lo contra o
agressor, acaba também resultando na destruição tecidual local que se conhece
como doença periodontal (GENCO, 1992; SEABRA; SEABRA; BRITO, 2005).
O papel das bactérias parece ser o de estimular células inflamatórias
crônicas presentes na gengiva, assim como fibroblastos a produzirem citocinas
como IL-1, TNF e IL-6, que agem estimulando osteoclastos a reabsorverem o
osso. A formação e a ativação dos osteoclastos se dá pela ação destas citocinas,
que agem na diferenciação dos osteoclastos a partir de seus precursores da
linhagem dos monócitos. O papel da IL-1 na doença está relacionado ao aumento
dos níveis de produção de prostaglandina E2 pelos fibroblastos gengivais,
aumento da produção de RNAm para procolagenases em fibroblastos e estímulo
direto à reabsorção óssea mediada por osteoclastos (GENCO, 1992).
25
Seabra, Seabra e Brito (2005) relatam que uma vez no local da agressão os
leucócitos, no processo inflamatório agudo, irão executar a sua função de
fagocitose. Além de degradar o conteúdo fagocitado, as enzimas proteolíticas do
fagossomo acabam sendo liberadas também na matriz extracelular durante a
fagocitose ou a morte do fagócito causando destruição tecidual. Se o agente
agressor é suficientemente limitado para ser combatido pela inflamação aguda, ou
é removido mecanicamente, os agentes quimiotáticos que atraem os neutrófilos e
que também têm a capacidade de inativar os inibidores de metaloproteinases são
removidos e o dano tecidual cessa. Quando a inflamação aguda não pode ser
resolvida devido à persistência do agente agressor ou distúrbios nos processos
normais de cura o processo evolui para uma inflamação crônica, que se
caracteriza por uma duração mais longa e pela presença de células como
linfócitos, plasmócitos e macrófagos. Ocorre fibrose e destruição tecidual com
tentativas de reparação acontecendo simultaneamente à inflamação.
Os polimorfonucleares são as células mais freqüentemente coletadas no
sulco gengival tanto em situação de saúde gengival quanto na doença periodontal.
Apesar de clara função protetora contra a doença periodontal destrutiva,
evidenciada pelo aparecimento de formas altamente agressivas de periodontite
em pacientes com distúrbios de função e número de neutrófilos, estas células
estão envolvidas no dano tecidual encontrado na periodontite, especificamente
devido às proteinases neutras existentes nos chamados grânulos azurófilos que
são encontrados no fluido gengival de indivíduos com doença periodontal ativa
(KINANE; LINDHE, 1999; MEYER et al. 1997).
PASSANEZI et al. (2005) relatam que a reabsorção óssea resultante da
doença periodontal ocorre de forma intermitente, com episódios de atividade,
intercalados por momentos de inatividade. De acordo com estes autores, os
episódios de atividade de reabsorção são causados pela extensão da inflamação
agudizada para o periodonto de sustentação, de forma que a perda óssea ocorre
de forma rápida e o epitélio juncional migra para apical afastando-se do contato
com o biofilme dentário, cessando então a reabsorção. Outro ciclo semelhante se
26
inicia após a propagação apical do “front” do biofilme, aproximando-se novamente
do epitélio junicional dando origem a nova inflamação gengival agudizada
iniciando novo episódio de atividade de reabsorção.
Além de destruição tecidual demonstrada extensivamente na literatura,
KARIMBUX et al. (1998), estudando a expressão de colágenos I e XII em
gengivas com periodontite observou redução da produção da cadeia α2 do
colágeno tipo I e da cadeia α1 do colágeno tipo XII. O que resulta na baixa
produção de colágenos dos tipos I e XII em pacientes com periodontite.
Williams (1992) e Gonçalves et al. (2005) descrevem os estágios da
patogênese da doença periodontal como descritos por Page e Schroeder, em
1976 da forma como se segue. A doença periodontal divide-se em quatro
estágios, denominados de lesão inicial, lesão precoce, lesão estabelecida e lesão
avançada, que são estágios que descrevem desde o início da inflamação gengival
até a reabsorção óssea.
A doença periodontal se inicia realmente no estágio de lesão inicial, onde a
gengiva ainda é considerada “clinicamente sadia”. Este estágio aparece após 4
dias de acúmulo de biofilme dentário e constitui basicamente uma reação
inflamatória aguda. Os tecidos afetados incluem parte do epitélio juncional e a
porção mais coronal do tecido conjuntivo adjacente. São observados dilatação e
aumento da permeabilidade dos vasos, infiltrado inflamatório que ocupa de 5 a
10% do tecido conjuntivo, com perda de colágeno nesta área e a principal
característica histológica é o aumento na migração de neutrófilos do plexo
vascular gengival para o sulco gengival através do epitélio juncional
(GONÇALVES et al., 2005; WILLIAMS, 1992).
O estágio seguinte é a lesão precoce que é observada após cerca de 7 dias
de acúmulo de biofilme dentário. Neste estágio, ocorre aumento no número de
vasos do plexo gengival, o infiltrado já ocupa 15% da área e a principal
característica é um predomínio de linfócitos e macrófagos com poucos
plasmócitos presentes. Neste estágio a gengivite já começa a se evidenciar
27
clinicamente como uma gengivite leve (GONÇALVES et al., 2005; WILLIAMS,
1992).
Quando o biofilme dentário se acumula por 2 a 3 semanas, tem início o
terceiro estágio, caracterizado clinicamente por uma gengivite de moderada a
severa e denominado de lesão estabelecida. Ocorre aumento na extensão da área
afetada e começa um aumento na proporção de plasmócitos que passam a ocupar
até 30% da área afetada. Linfócitos e macrófagos são ainda detectados no tecido
conjuntivo e neutrófilos no epitélio sulcular. O epitélio juncional aumenta suas
projeções digitiformes em direção ao tecido conjuntivo já iniciada de forma discreta
no estágio anterior, além de iniciar a sua projeção para apical, aprofundando o
sulco gengival clínico (GONÇALVES et al., 2005; WILLIAMS, 1992).
A lesão estabelecida pode permanecer sem evoluir para o estágio seguinte
ou pode evoluir dando lugar ao estágio de lesão avançada que caracteriza
clinicamente a periodontite. Este último estágio é caracterizado principalmente
pelo início da reabsorção óssea acompanhada por uma predominância de até
50% de plasmócitos e mudança nos linfócitos que passam a predominar os do tipo
B ao invés dos do tipo T (GONÇALVES et al., 2005; WILLIAMS, 1992).
Smith et al. (2004) consideraram que a migração para apical do epitélio
juncional é um evento chave na formação da bolsa periodontal e que isso ocorre
às custas de degradação das fibras de Sharpey localizadas mais coronalmente.
Quanto às células que participam deste processo, Lins (2003) estudou o
papel do perfil da resposta imunológica em 42 espécimes teciduais emblocados
em parafina diagnosticados como gengivite crônica (17 casos) e periodontite
crônica (25 casos). A análise imuno-histoquímica mostrou que nos estágios que
correspondem à gengivite, os macrófagos predominam, mas com a evolução da
doença para uma periodontie, tendem a desaparecer sendo substituídos por
linfócitos e plasmócitos. Linfócitos T helper, encontravam-se predominantemente
em situação justa-epitelial provavelmente para interagirem com as células
dendríticas no processo de apresentação antigênica. Já os linfócitos B
28
encontravam-se distribuídos focalmente em posição justa-epitelial ou distantes do
epitélio.
2.2 Matriz Extracelular
Alberts et al. (1997) afirmaram que as células de um tecido normalmente
estão em contato com uma rede complexa de macromoléculas extracelulares
denominada de matriz extracelular (MEC), que atua ajudando a manter células e
tecidos unidos, fornecendo uma estrutura organizada onde as células podem
migrar e interagirem entre si, além de suportar a maior parte do estresse mecânico
infligido àquele tecido.
Pereira et al. (2005), conceituam matriz extracelular (MEC) como um
espaço extracelular, preenchido por um complexo de componentes fibrosos e
protéicos, com proporções variadas de proteínas e polissacarídeos que fornecem
um substrato adequado para o crescimento e diferenciação dos mais variados
tipos celulares do organismo.
A quantidade de matriz extracelular varia grandemente de acordo com o
tecido em questão, sendo mais abundante que as próprias células nos tecidos
conjuntivos e escassa nos tecidos epiteliais. Nos tecidos conjuntivos os
componentes da MEC são secretados por fibroblastos ou por células da família
dos fibroblastos, como condroblastos nas cartilagens e osteoblastos nos ossos
(ALBERTS et al., 1997; MOTT; WERB, 2004).
São duas as classes principais de macromoléculas que compõem a matriz
extracelular, as glicosaminoglicanas e as proteínas (ALBERTS et al., 1997; MOTT;
WERB, 2004).
As glicosaminoglicanas são cadeias polissacarídicas não ramificadas
compostas de unidades repetidas de dissacarídeos. São altamente hidrofílicos e
29
têm a capacidade de atrair água formando géis que ocupam grandes volumes e
resistem bem às forças compressoras exercidas sobre a matriz, assim como
permitem fácil difusão de moléculas hidrossolúveis e migração celular. Quatro
grupos compõem as glicosaminoglicanas, são eles: a hialurona, o mais simples e
os sulfatos de condroitina e de dermatana, o sulfato de heparana e o sulfato de
queratana, que são encontrados ligados covalentemente às proteínas na forma de
proteoglicanas, que então recebem nomes como agrecana, betaglicana, decorina,
perlecana, serglicana e sindecana. Além de fornecer um espaço hidratado, as
proteoglicanas podem servir como filtros bioquímicos para moléculas de tamanhos
diferentes e fornecerem ligação para moléculas sinalizadoras exercerem sua
função e para regulação da ação de algumas proteases. Algumas proteoglicanas
como as sindecanas apresentam seus núcleos protéicos atravessando a
membrana celular atuando como receptores para proteínas estruturais da MEC ou
como co-receptores para moléculas sinalizadoras como FGF e TGF-β (ALBERTS
et al., 1997, BORNSTEIN ; SAGE, 2002).
Os componentes protéicos da matriz extracelular, para Alberts et al. (1997)
são classificados ainda em estruturais, como o colágeno e a elastina, e adesivos
como a fibronectina e a laminina.
Os colágenos são uma família de proteínas características encontradas em
todos os animais multicelulares. São as proteínas mais abundantes nos mamíferos
correspondendo a 25% da massa protéica. Tem como principais características de
sua molécula a estrutura longa e rígida de sua fita-tripla helicoidal, que possui três
cadeias polipeptídicas chamadas cadeias α enroladas umas às outras. Cerca de
25 tipos de cadeias α já foram identificadas com 15 tipos de moléculas de
colágeno encontradas. O colágeno mais comum nos tecidos conjuntivos é o do
tipo I, que junto com os tipos II, III, V e XI compõem os colágenos fibrilares. Estes
possuem estrutura tipo corda já que depois de sintetizadas e secretadas para o
espaço extracelular as moléculas se agrupam em fibrilas colágenas que se
agrupam em fibras colágenas, maiores e mais espessas. Os colágenos IX e XII
são chamados de colágenos associados às fibrilas porque localizam-se na
30
superfícies das fibrilas, ligando-as entre si e a outros componentes da MEC. Há
ainda os colágenos formadores de rede, dos tipos IV e VII. O do tipo IV agrupa-se
em uma camada como um feltro formando a parte principal da lâmina basal e o do
tipo VII forma um dímero que se agrupa em estruturas chamadas fibras
ancoradouras que fazem a ligação da lâmina basal ao conjuntivo subjacente. A
elastina é uma proteína hidrofóbica que corresponde ao principal componente das
fibras elásticas. Estas fornecem elasticidade à matriz extracelular de modo que os
tecidos possam voltar à forma original após uma distensão temporária (ALBERTS
et al., 1997; MOTT; WERB, 2004; van den STEEN et al. 2002).
KARIMBUX et al. (1998), relatam que o tecido conjuntivo periodontal é
composto basicamente de colágenos fibrilares dos tipos I e III e do colágeno
associado a fibrilas do tipo XII sendo que os primeiros são observados já durante
o desenvolvimento do ligamento periodontal e o do tipo XII apenas no ligamento
periodontal e tecido conjuntivo gengival maduros.
Ainda de acordo com Alberts et al. (1997), as proteínas adesivas exercem
papel tanto na organização da matriz como na ligação das células a ela. A
fibronectina é uma glicoproteína encontrada em todos os vertebrados e
corresponde a um dímero composto de duas subunidades cada uma, com vários
domínios funcionalmente diferentes separados por regiões flexíveis. Cada um dos
domínios liga-se a componentes diferentes da própria matriz ou das células como
colágeno e heparana, sendo esta proteína importante para a adesão célula-matriz
e para a migração celular.
Bornstein e Sage (2002) afirmam que formas especializadas de matriz
extracelular, chamadas de membrana basal ou lâmina basal, possuem
propriedades estruturais, mas sem perder a ação de influenciar a função das
células.
A lâmina basal, segundo Aberts et al. (1997) e Smith et al. (2004), é uma
camada delgada (de 40 a 120 nm de espessura) e flexível de matriz extracelular
organizada logo abaixo do epitélio ou envolvendo células musculares, células
31
adiposas e células de Schwann separando-os do tecido conjuntivo adjacente.
Além de determinar a polaridade das células, a lamina basal influencia o
metabolismo celular, organiza as proteínas da membrana celular adjacente, induz
a diferenciação e favorece a migração celular. A lamina basal é sintetizada pelas
células que nela repousam e em alguns tecidos ela é ancorada ao tecido
conjuntivo subjacente através das fibras ancoradouras. A maioria das lâminas
basais contém colágeno tipo IV, a proteoglicana perlecana e as glicoproteínas
laminina e entacina.
Para Bornstein e Sage (2002) um grupo de proteínas extracelulares que
não contribuem diretamente para formação de elementos estruturais da matriz
extracelular, mas agem como moduladores das funções celulares e das interações
célula-matriz extracelular são chamadas de “matricelular”. O termo matriz
pericelular se refere a um compartimento da matriz extracelular, adjacente à
célula, que contém fatores de crescimento, citocinas, proteases e outras
moléculas bioativas que interagem com a superfície celular e, junto com outros
elementos como proteoglicanos, influenciam propriedades das células como
motilidade, proliferação, diferenciação e predisposição a apoptose. As proteínas
matricelulares são a trombospondina-1 e -2 (TSP-1 e TSP-2), a proteína secretada
ácida e rica em cisteína (SPARC) que também é conhecida como osteonectina, a
tenascina-C, a tenascina-X e o fator de crescimento de tecido conjuntivo (CCN).
2.3 Metaloproteinases da Matriz (MMPs)
Segundo Birkedal-Hansen (1993) a degradação da matriz extracelular
envolve mecanismos distintos sendo iniciada pela dissolução mediada por
metaloproteinases da matriz (MMPs) ou pela plasmina.
A regulação do turnover das macromoléculas da matriz extracelular é crítica
para uma série de processos biológicos importantes, sendo realizada por enzimas
32
proteolíticas extracelulares excretadas localmente pelas células que pertencem a
uma de duas classes: as metaloproteases ou as serinoproteases (ALBERTS et al.,
1997; GRENIER; MAYRAND, 2001; PEREIRA et al., 2005; SORSA;
TJÄDERHANE; SALO, 2004).
Sternlicht e Werb (2001) explicam que as enzimas proteolíticas são
classificadas em exopeptidases e endopeptidases quando clivam,
respectivamente, ligações terminais ou internas dos peptídios.
As metaloproteinases são um grupo de endopeptidases, dependentes de
Ca++ ou Zn++ ligados no sítio ativo para possuírem atividade (ALBERTS et al.
1997) classificadas em 5 superfamílias, sendo uma delas a superfamília metzincin
que contém um domínio com 3 histidinas que se ligam ao zinco no sítio catalítico.
A superfamília metzincin é subdividida em 4 famílias: as serralisinas, as astacinas,
as ADAMs (adamalisinas) e as metaloproteinases da matriz (MMPs) (MOTT;
WERB, 2004; STERNLICHT; WERB, 2001).
As MMPs são uma família de enzimas proteolíticas que degradam os
componentes da matriz extracelular como o colágeno, a gelatina e a elastina
(HAAKE et al., 2004). As MMPs dos vertebrados atuam em diversos substratos,
sendo capazes de degradar virtualmente todos os componentes da matriz
extracelular (De SOUZA et al., 2005; STERNLICHT; WERB, 2001).
Como a cada momento são descobertos novos membros da família das
MMPs, é difícil dizer com segurança quantas enzimas existem. Birkedal-Hansen
(1993) afirma que a família dos genes MMP codificam pelo menos nove
endopeptidases metal-dependentes.
Sternlicht e Werb (2001) afirmam que, até aquele ano, foram identificadas
25 MMPs nos vertebrados e 22 homólogos em humanos, além de outras nos
invertebrados. Em 2002, De Souza e Line afirmaram que até aquele momento
existiam pelo menos 16 MMPs humanas caracterizadas.
33
Rundhaug (2003) afirma que as MMPs são uma família de mais de 20
endopeptidases que contém zinco capazes de degradar vários componentes da
matriz extracelular. Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) afirmam que as MMPs
correspondem a uma família 23 de enzimas que degradam componentes da
matriz extracelular, incluindo as membrana basais.
Todas as MMPs são derivadas de um protótipo estrutural com cinco
domínios onde pela adição ou deleção de um ou mais domínios tem-se as
variadas formas de MMP com suas particularidades. Todas as formas contêm um
sítio de ligação para um Zn++ que se acredita que constitua o sítio ativo da enzima
(BIRKEDAL-HANSEN, 1993; De SOUZA et al., 2005; PEREIRA et al., 2005;
REYNOLDS; MEIKLE, 1997; RUNDHAUG, 2003; STERNLICHT; WERB, 2001).
As metaloproteinases são referidas de acordo com nomes específicos ou
por uma numeração e agrupadas de acordo com a sua estrutura (NABESHIMA et
al., 2002).
Cotrim et al., em 2002, as classificam em 4 grupos principais, o das
colagenases intersticiais, o das colagenases tipo IV, o das estromelisinas e o das
MMPs ligadas à membrana.
Segundo Rundhaug (2003) as MMPs existem na forma solúvel (MMP-1, -3,
-8, -10, -12, -13, -19 e -20, por exemplo) e na forma ligada à membrana, com um
domínio trans-membrana e uma curta cauda citoplasmática, sendo então
chamadas de MT-MMPs (MT1-, MT2-, MT3-, MT4- e MT5-MMP).
De Souza e Line (2002) e Pereira et al. (2005) listam algumas das MMPs
humanas catalogadas, de acordo com o substrato em que atuam, como
colagenases (MMP-1, -8 e -13), gelatinases (MMP-2 e -9), estromelisinas (MMP-3
e -10), metaloelastase (MMP-12), enamelisina (MMP-20) e metaloproteinases
ligadas à membrana plasmática (MMP-14, -15, -16, -24, -17, -25 e -23).
Para que a degradação seja controlada rigorosamente, vários mecanismos
de regulação atuam como a secreção das proteases como precursores inativos,
34
pró-enzimas ou zimogênios, a ação de inibidores teciduais de metaloproteases
(TIMPs) e os inibidores de serinoproteases (serpinas) (ALBERTS et al. 1997).
Na maioria dos casos as MMPs não são sintetizadas até serem necessárias
e a sua transcrição pode ser induzida por sinais como citocinas, fatores de
crescimento e estresse mecânico. A ativação das MMPs ocorre por ação de
proteases séricas como plasmina e funina e, como acontece com algumas MMPs,
por ação de outras MMPs que podem ativar outros membros da família como a já
conhecida ativação da MMP-2 pela MT1-MMP que se dá pela remoção de um
pró-domínio resultando em uma forma ativa, geralmente de peso molecular menor
(RUNDHAUG, 2003; SORSA; TJÄDERHANE; SALO, 2004).
Regulação adicional da atividade das MMPs é exercida por inibidores
endógenos como a α2-macroglobulina e os inibidores teciduais de
metaloproteinases (TIMPs). As TIMPs são em número de 4 (TIMP-1, -2, -3 e -4) e
sabe-se que além de exercer atividade de inibição das MMPs, também participam,
em alguns casos, no processo de sua ativação como no caso da TIMP-2 que é
necessária para a ativação da pró-MMP-2 pela MT1-MMP (RUNDHAUG, 2003,
SORSA; TJÄDERHANE; SALO, em 2004).
A inibição das MMPs é também possível através de produtos sintéticos
como os quelantes do íon Zn2+, como batimastat e marimastat, e através do uso
de tetraciclinas que possuem o potencial de inibir as MMPs por mecanismos como
inibição da expressão do RNAm para MMPs, interferir com o processo de ativação
da pró-enzima e tornar a MMP ativada mais susceptível à degradação (SORSA;
TJÄDERHANE; SALO, 2004).
Segundo Birkedal-Hansen (1993) a atividade das MMPs é regulada pelo
próprio processo de transcrição dos genes que as codificam, pela ativação de
precursores, pela diferença na especificidade dos substratos e por inibidores. A
regulação transcricional é mediada por citocinas, como as interleucinas e fatores
de crescimento, e por hormônios como o paratormônio os quais têm a capacidade
de estimular a transcrição de algumas e inibir as de outras. Componentes
35
microbianos como os LPS e lectinas possuem também a capacidade estimular a
transcrição de certos tipos de colagenases. A regulação através da ativação de
precursores se dá pela ruptura da ligação de um resíduo Cys do propeptídio do
sítio ativo contendo o Zn++. Alguns inibidores têm também a capacidade de regular
a ação das MMPs, são eles as α-macroglobulinas e os Inibidores teciduais de
metaloproteinases (TIMPs). As α-macroglobulinas têm a capacidade de capturar
as moléculas de MMP através de ligações específicas. Os TIMPs, formam
complexos bimoleculares não covalentes com formas ativas ou latentes de MMPs.
Diferentes células produzem e liberam MMPs de diferentes maneiras. O padrão de
resposta da MMP dos PMNs é singular devido ao armazenamento em grânulos e
liberação rápida levando a um substancial aumento nos níveis destas enzimas em
questão de minutos, mantendo a resposta pelo recrutamento de novas células se
o estímulo permanece.
Reynolds e Meikle (1997) relatam que a ativação das MMPs é mediada por
fatores como a plasmina, capaz de ativar a colagenase e a estromelisina-1. A
estromelisina também pode participar da ativação de outras MMPs como a MMP-9
(gelatinase-B) e a colagenase. Alguns produtos exógenos como os
lipopolissacarídeos (LPS) liberados pelas bactérias do biofilme dentário podem
ativar colagenases. A MMP ligada a membrana (MT1-MMP ou MMP-14) também
participa no processo de ativação de colagenases.
Sternlicht e Werb (2001) relatam que para exercerem sua função, nos
processos fisiológicos ou patológicos, as MMPs precisam estar presentes no tipo
celular e região pericelular no momento certo, na quantidade certa e precisam ser
ativadas ou inibidas apropriadamente. São, portanto, fortemente reguladas nos
níveis transcricional e pós-transcricional, assim como no nível protéico por
ativadores, inibidores e por sua localização na superfície celular. A maioria das
MMPs são reguladas no nível transcricional e estabilização pós-transcricional do
RNAm. Quanto à secreção, a maioria das MMPs são secretadas tão logo seja
traduzido o seu RNAm, sendo então constitutivas do tecido, no entanto, a MMP-8
e a MMP-9 podem ser sintetizadas por granulócitos na medula óssea sendo
36
armazenadas em grânulos dos neutrófilos circulantes e liberadas quando estes
são ativados por mediadores inflamatórios.
Segundo Birkedal-Hansen (1993) a colagenase dos PMN são liberadas de
grânulos específicos existentes nestas células quando estas são ativadas
enquanto que as dos fibroblastos são transcritas de acordo com a demanda. O
grupo das estromelisinas atuam em diversos substratos como a proteína núcleo
das proteoglicanas, colágeno tipos IV e V, fibronectina e laminina e é expressada
por células estromais mediante estímulos por citocinas como o IL-1, o EGF e o
TNF-α. As gelatinases são talvez as mais distribuídas das MMPs e podem ser
produzidas por fibroblastos, queratinócitos, células endoteliais, monócitos/
macrófagos, osteoblastos e condrócitos. Algumas formas de gelatinases podem
ser expressas por PMNs. Além da proteína gelatina, estas enzimas podem clivar
elastina e colágeno dos tipos IV, V, VII e X.
Segundo Wahl e Corcoran (1993) as lesões inflamatórias crônicas são
povoadas por células mononucleares como monócitos e macrófagos, portanto
estas células podem ser importantes fontes de mediadores da destruição tecidual.
Já foi demonstrado que estas células são capazes de produzir várias
metaloproteinases da matriz como colagenases que degradam colágenos I, II e III,
colagenase de 92 kDa capazes de degradar gelatina e colágenos tipo IV e V e
estromelisina que degrada a fibronectina, as proteoglicanas, e a laminina e os
colágenos IV e V. A produção de metaloproteinases por estas células é
dependente de ativação primária por substâncias como lipopolissacarídeos
bacterianos (LPS), concanavalina A (Con A) e linfocinas que levam à produção de
prostaglandina E2 (PGE2) e AMP cíclico (cAMP) intracelular.
De acordo com De Souza e Line (2002) fibroblastos gengivais,
ceratinócitos, macrófagos e leucócitos polimorfonucleares são capazes de
expressarem MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8 e MMP-9.
37
Tanto a MMP-1 quanto a MMP-8 são colagenases, sendo que a MMP-8 é
liberada por neutrófilos infiltrados enquanto a MMP-1 é expressada por
fibroblastos, monócitos, macrófagos e células epiteliais (HAAKE et al. 2004a).
A MMP-1, ou colagenase 1, é uma enzima com 52 kDa na forma inativa e
41 kDa na forma ativa que é expressa in vivo em áreas de rápida remodelação
tecidual fisiológica ou patológica. É expressa por fibroblastos, ceratinócitos,
condrócitos, monócitos, macrófagos, hepatócitos e uma variedade de células
tumorais. Os substratos já identificados desta enzima são os colágenos dos tipos
I, II, III, VII, VIII e X, além de agrecana, serpins e α2-macroglobulina (NABESHIMA
et al., 2002; WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999). Lynch e Matrisian (2002) relatam
que além destes substratos a MMP-1 ainda degrada o colágeno tipo XI, gelatina,
entacina, fibronectina, laminina, tenacina e vitronectina.
A MMP-1 cliva o colágeno tipo I, que é posteriormente degradado por
outras enzimas (De SOUZA; LINE, 2002), pois após clivado, o colágeno I
desnatura-se formando a gelatina que é degradada pela MMP-2 e MMP-9
(COTRIM et al. 2002; STAMENKOVIC, 2000).
A MMP-8 é uma colagenase que já teve a sua produção atribuída
exclusivamente aos neutrófilos, no entanto sabe-se hoje que outras células têm a
capacidade de produzi-la.
De acordo com Kubota, T. et al. (1996), a MMP-1 e a MMP-8 têm
capacidade de degradar o colágeno tecidual pela clivagem da molécula no
domínio da tripla hélice resistente à proteinase. A MMP-3, ou estromelisina-1 é um
membro da família das metaloproteinases com a capacidade de degradar vários
tipos de substratos como proteoglicanas, fibronectina, laminina e colágenos tipo IV
e XI.
A MMP-2, ou gelatinase A, tem 75 kDa na sua forma inativa e 65 kDa na
forma ativa e a MMP-9, ou gelatinase B, tem 92 kDa na forma inativa e 84 kDa
quanto ativada (STAMENKOVIC, 2000; WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999).
38
A MMP-2 é expressa por uma variedade de células normais ou tumorais
(WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999) e tem a capacidade de degradar gelatina,
colágenos dos tipos IV, V e X na sua forma nativa, além de laminina, TGF-β, e
colágenos dos tipos I, II e III desnaturados (KUBOTA, Y. et al., 2002;
STAMENKOVIC, 2000).
A produção de MMP-2 ocorre na sua forma inativa, ou Pró-MMP-2 e é
necessário para que ocorra a sua ativação a ação da MT1-MMP, com a
participação de uma molécula de TIMP-2 como ponte, formando um complexo
trimolecular (KUBOTA, Y. et al., 2002; NABESHIMA et al., 2002; PATTAMAPUN et
al. 2003).
Kubota, Y. et al. (2002) estudando o efeito da IL-1α na ativação de MMP-2
em fibroblastos isolados de ceratocistos, mostraram que esta citocina tem a
capacidade de aumentar a produção de MT1-MMP nos fibroblastos, fazendo com
que a ativação de MMP-2 seja aumentada. Foi sugerido então neste estudo que a
IL-1α, através do aumento da produção de MT1-MMP com maior ativação de
MMP-2 desempenha um papel crucial no crescimento intra-ósseo do ceratocisto.
De Souza et al. (2005) descrevem a MMP-9, ou gelatinase B como uma
enzima expressa por leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, ceratinócitos e
células endoteliais que atua nos colágenos do tipo IV, V e IX, em proteoglicanas e
na elastina e tem sua expressão controlada por fatores como o TNF-α, a IL-1, o
PDGF e o EGF.
Stamenkovic (2000), relata que a MMP-9 tem a capacidade de degradar
gelatina, colágenos do tipo I, IV, V e X, além de TGF-β na forma latente.
Assim como a MMP-2, a MMP-9 também é produzida na sua forma inativa
no entanto o seu mecanismo de ativação in vivo ainda não está completamente
elucidado (KUBOTA, Y. et al., 2000; KUBOTA, Y. et al., 2002). Van Den Steen et
al. (2002) afirmam que ela é ativada principalmente por outras MMPs.
39
A MMP-9 atua na biologia óssea de maneira a participar na regulação do
turnover ósseo mas quando desregulada na sua síntese, secreção ou ativação
resulta em reabsorção óssea patológica (Van Den STEEN et al., 2002).
Kubota, Y. et al. (2000) estudaram o mecanismo de expansão dos cistos
odontogênicos enfocando os efeitos da IL-1α na secreção e ativação de MMP-9. A
análise zimográfica mostrou a presença da gelatinase de 92 kDa, a forma inativa
da MMP-9 em fluidos coletados de cistos dentígeros e cistos radiculares e de 83
kDa, a MMP-9, ativa principalmente em ceratocistos. Fragmentos cultivados dos
cistos coletados mostraram produção de MMP-9, além de MMP-2, quando
incubados com IL-1α além de ativação de Pró-MMP-9 em MMP-9.
Chang et al. (2002) publicaram trabalho que teve o objetivo de determinar
os efeitos das bactérias Porphyromonas endodontalis e Porphyromonas gingivalis
na produção e secreção de metaloproteinases da matriz em culturas de células do
ligamento periodontal. Células de polpas dentárias e de ligamento periodontal
humanos foram obtidas de terceiros molares retidos e então cultivadas. A análise
zimográfica mostrou que a enzima MMP-2 começou a aumentar a partir do quarto
dia de cultura de células pulpares com P. endodontalis e P. gingivalis e continuou
aumentando até o oitavo dia de forma dose-dependente. A MMP-9 também foi
detectada na análise zimográfica mas em pequena quantidade. Na cultura de
células do ligamento periodontal ocorreu efeito semelhante. Este estudo mostra
que o P. endodontalis e o P. gingivalis, desempenham um importante papel na
destruição tecidual e desintegração da matriz extracelular em lesões pulpares e
periapicais através da indução das células residentes locais a produzirem MMPs.
Shin et al. (2002) realizaram um trabalho com o objetivo de verificar se as
MMP-1, -2 e -3 estariam aumentadas nos tecidos pulpares inflamados e lesões
periapicais e a sua distribuição nestes tecidos. Foram obtidas 12 polpas com
diagnóstico clínico de inflamação aguda, 12 com inflamação crônica, 10 lesões
periapicais e 10 polpas normais como controle. Foram feitas ELISA e análises
imuno-histoquímica com anticorpos anti-MMP-1, anti-MMP-2 e anti-MMP3. Os
40
resultados mostraram que nas polpas com pulpite aguda, a MMP-1 e a MMP-3 se
localizaram predominantemente nos neutrófilos e macrófagos, assim como na
matriz extracelular. As células inflamatórias típicas da inflamação crônica
marcaram fracamente. A MMP-2 expressou fracamente nas células inflamatórias e
fibroblastos de todos os grupos experimentais. A MMP-1, -2 e -3 marcaram em
plasmócitos, linfócitos e macrófagos. Estes resultados sugeriram que a MMP-1 e a
MMP-3 podem ser produzidas por neutrófilos, macrófagos, plasmócitos e
linfócitos. A produção de MMPs foi maior nas pulpites agudas que nos grupos
controle o que pode significar que elas participam na progressão da inflamação
pulpar.
Franchi et al. (2002) avaliaram, em carcinomas de cabeça e pescoço, a
expressão imuno-histoquímica da MMP-1, MMP-2 e MMP-9 correlacionando estes
dados com o estado do gene p53, a atividade da enzima óxido nítrico sintetase e
com a angiogênese. Fragmentos do front de invasão de tumores foram obtidos de
43 pacientes e usados para análise imuno-histoquímica e molecular. Os
resultados mostraram que a expressão das MMPs foi variável e envolveu além
das células neoplásicas as células endoteliais e inflamatórias. A expressão da
MMP-1 foi evidente em 97,6% dos espécimes, com 74,5% demonstrando
distribuição moderada ou difusa nas células neoplásicas. A expressão da MMP-2
foi evidente em 79% com marcação considerada moderada ou difusa em 39,5% e
da MMP-9 foi evidente em 65% com 39,5% mostrando marcação moderada ou
difusa. Tumores com superexpressão de MMP-9 foram associados a maior
freqüência de metástases em linfonodos embora não tenha sido estatisticamente
significante. A densidade vascular correlacionou-se positivamente com a presença
de metástases em linfonodos, com tumores primários de maior tamanho e com
superexpressão de MMP-9. Tumores com mutação de p53 apresentaram maiores
densidades vasculares e maior quantidade de superexpressão para MMP-9. Os
autores chamam a atenção para o fato da expressão de MMPs ter sido encontrada
não só nas células tumorais, como também nas células estromais e nas células
inflamatórias próximas ao tumor e consideram estas células fontes importantes
destas enzimas para os tecidos tumorais concluindo então que existe uma forte
41
correlação entre a expressão de MMP-9, a mutação do gene p53 e a
angiogênese.
O papel das MMPs na angiogênese foi discutido por Haas e Madri (1999). A
angiogênese é dependente da ativação de células endoteliais dando início a
proliferação celular e proteólise das membranas basais permitindo a invasão e
migração das células endoteliais através da matriz extracelular para formar novos
vasos. A degradação da matriz extracelular ocorre pela ação de uma série de
enzimas, incluindo as MMPs. Células endoteliais já demonstraram ser produtoras
de MMP-1, MMP-13, MMP-3, MMP-2, MMP-9 e MT1-MMP provavelmente tendo
grande importância na angiogênese.
Segundo Rundhaug (2003) as MMPs são importantes no processo de
angiogênese já que o primeiro passo da angiogênese é a degradação da
membrana basal de um vaso pré-existente. Mas as MMPs não contribuem com a
angiogênese somente pela degradação da membrana basal e de outros
componentes da matriz extracelular. Atuam também na liberação de fatores pró-
angiogênicos ligados à matriz extracelular como bFGF, VEGF e TGFβ.
Componentes da matriz extracelular degradados pelas MMPs tormam acessíveis
sítios de ligação para determinadas integrinas como a αvβ3, que podem iniciar
uma sinalização que contribui para a sobrevivência e proliferação endotelial.
Kumamoto et al. (2003) avaliaram a expressão imunohistoquímica das
metaloproteinases MMP-1, -2 e -9 e dos inibidores TIMP-1 e -2 em
ameloblastomas comparando-os com germes dentários no intuito de verificar o
seu papel no processo de invasividade do tumor já que as ação das MMPs e
TIMPs poderiam estar envolvidos no processo de degradação da membrana basal
dos ameloblastomas. Espécimes removidos de 22 pacientes com ameloblastomas
foram analisados imuno-histoquimicamente. Neste estudo, a reatividade das
MMP-2 e -9, associadas à degradação de membrana basal, foi encontrada
preferencialmente nos componentes mesenquimais que nos epiteliais e a sua
expressão pode estar associada à regulação epitélio-mesenquimal em tecidos
42
odontogênicos tanto normais quanto neoplásicos atuando no processo de
invasividade dos ameloblastomas e em processos desenvolvimentais nos germes
dentários.
Ao exercerem sua atividade na degradação da matriz extracelular, as
MMPs liberam fragmentos escondidos e neo-epítopos das macromoléculas. As
MMP-2 e -9, por exemplo, ao degradarem a membrana basal expõem um epítopo
escondido na molécula do colágeno IV capaz de promover angiogênese. A
degradação da laminina-5, outro componente da membrana basal, pela MT1-MMP
libera um fragmento escondido da sua cadeia γ2 que é capaz de induzir migração
epitelial. Também já foi demonstrado que a MMP-9 e, em menor grau a MMP-2,
ao degradarem a matriz extracelular aumentam a biodisponibilidade da VEGF, um
importante fator de crescimento no processo de angiogênese, e do fator de
crescimento TGF-β (MOTT; WERB, 2004).
2.4 MMPs na Doença Periodontal
Segundo Reynolds e Meikle (1997) e Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) a
destruição tecidual característica da periodontite, outrora considerada efeito direto
das bactérias e seus produtos é hoje considerada efeito principalmente dos
produtos do hospedeiro, liberados no local devido à invasão de produtos
bacterianos. Os produtos liberados pelas bactérias são capazes de estimular
respostas inflamatórias e imunológicas altamente ricas em mediadores como
prostaglandinas, IL-1, TNF e outros que por sua vez estão ligados à ativação das
formas latentes em formas ativas de MMPs.
Segundo Kinane e Lindhe (1999) as proteases, tanto as produzidas pelos
microorganismos quanto as do próprio hospedeiro, têm importância fundamental
para o processo destrutivo.
43
De Souza e Line (2002) afirmam que os altos níveis de MMPs nos tecidos
periodontais são os responsáveis pelo desequilíbrio entre produção e degradação
de colágeno causando destruição periodontal.
Fibroblastos, queratinócitos, macrófagos e células endoteliais respondem
de maneira parecida, produzindo e liberando MMPs mediante estímulos de
mediadores catabólicos como IL-1, TNF-α, TGF-α, EGF, bFGF e PDGF e
inflamatórios como a PGE2 (BIRKEDAL-HANSEN 1993; Van DYKE; LESTER;
SHAPIRA, 1993; WAHL; CORCORAN, 1993).
Nishikawa et al. (2002) estudaram o efeito da TNFα e da PGE2 na produção
de MMPs por fibrobastos do ligamento periodontal mantidos em cultura. As
culturas foram tratadas com TNFα e PGE2 e tiveram posteriormente o RNAm
extraído e examinado pelas técnicas do RT-PCR, zimografia e Western blot. Foi
detectada produção de MMP-1, MMP-3 e MMP-13 de forma dose-dependente da
adição de TNFα e aumento da produção das 3 MMPs com o passar do tempo.
Alvares et al. (1995) estudaram a produção de MMP-1 e TIMP-1 por
fibroblastos do ligamento periodontal mediante estímulos de IL-1β, PDGF e TGF-
β. Culturas de fibroblastos do ligamento periodontal foram obtidas e tratadas com
as citocinas e fatores de crescimento citados e então o RNAm produzido na
cultura foi extraído e estudado pela técnica RT-PCR para detecção de RNAm para
MMP-1 e TIMP-1. A IL-1β causou grande aumento na produção de RNAm para
MMP-1, um aumento menos expressivo foi detectado com o PDGF enquanto que
o TGF-β, ao contrário, provocou inibição. Não houve nenhum efeito significativo
em relação à TIMP-1.
Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) afirmaram que fragmentos de gengiva
inflamada apresentam mais colagenase que fragmentos de gengiva sadia,
colagenases detectadas no fluido do sulco gengival estão em quantidade maior
em gengivas com doença periodontal, inclusive sendo correlacionados com
44
severidade aumentada da doença. As MMPs mais comumente detectadas são a
colagenase-2 ou MMP-8, acompanhada da MMP-9.
De acordo com Genco (1992) a degradação do tecido mole na doença
periodontal ocorre devido à ação de enzimas bacterianas e enzimas do
hospedeiro como a plasmina e as metaloproteinases da matriz (MMPs). Haake et
al. (2004) afirmam que as MMPs são consideradas as proteinases primárias
envolvidas na degradação dos tecidos periodontais.
Smith et al. (2004) estudaram a expressão da MMP-9 no epitélio gengival
de indivíduos com doença periodontal para determinar a participação desta na
degradação da membrana basal e inferir sua participação na migração do epitélio
juncional para apical na formação da bolsa periodontal. Uma análise zimográfica
em biópsias gengivais demonstrou que tanto o epitélio quanto o tecido conjuntivo
de amostras de periodontite expressaram capacidade colagenolítica
correspondente à expressão de MMP-2 e MMP-9. Altos níveis de pró-MMP-9
foram encontrados no epitélio da bolsa quando comparados ao epitélio sulcular
normal. A mesma diferença não pôde ser detectada para a pró-MMP-2. A MMP-9
mostrou-se distribuída por todas as camadas epiteliais tanto do epitélio juncional
quanto do epitélio da bolsa e fraca expressão e distribuição no tecido conjuntivo
gengival. Forte marcação para MMP-9 foi detectada em leucócitos
polimorfonucleares. Os ceratinócitos do epitélio gengival foram identificados como
fonte importante de MMP-9 no epitélio gengival inflamado.
Segundo Birkedal-Hansen (1993) a presença das MMPs é muito importante
para o início da reabsorção óssea uma vez que os osteoblastos são capazes de
produzir MMPs quando estimulados por fatores estimuladores de reabsorção
iniciando o processo reabsortivo, já que o osteoclasto não produz estas enzimas
sendo responsável apenas pela dissolução da matriz mineral, o que corrobora o
fato da reabsorção óssea periodontal ser tão sensível à presença de
estimuladores da produção de MMPs como a IL-1 e o TNF-�.
45
Conforme Grenier e Mayrand (2001) na inflamação periodontal causada por
periodontopatógenos, as MMPs são produzidas de maneira descontrolada e
ocorre um desequilíbrio entre a atividade de MMPs e de TIMPs resultando em
degradação tecidual.
Segundo Genco (1992) está claro que as bactérias do biofilme são capazes
de ativar diretamente MMPs ou inibir a ação dos TIMPs, bem como indiretamente
através da estimulação de células do hospedeiro a produzirem citocinas que por
sua vez induzem outras células como fibroblastos e ceratinócitos a produzirem
colagenases.
Enzimas bacterianas, como a protease semelhante à quimiotripsina
produzida pela bactéria Treponema denticola, e outras substâncias liberadas pelas
bactérias Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans e
Fusobacterium nucleatum são capazes de ativar as MMPs assim como as células
do próprio hospedeiro estimuladas por citocinas (BIRKEDAL-HANSEN, 1993;
HAAKE et al., 2004a; HAAKE et al., 2004b; GENCO, 1992; MALDONADO et al.,
2004; WAHL; CORCORAN, 1993).
Nakaya et al. (1997) estudaram em culturas de células de ligamento
periodontal a indução de MMP-3, ou estromelisina-1, pela IL-1β. Foi encontrado
que as células cultivadas apresentaram aumento da produção de MMP-3 na
presença de IL-1β de forma dependente da concentração desta última.
Grenier e Mayrand (2001) realizaram um estudo com o objetivo de
determinar se o Porphyromonas gingivalis possui a capacidade de degradar e/ou
inativar a TIMP-1. A análise em eletroforese mostrou que a Porphyromonas
gingivalis foi capaz de degradar a TIMP-1 em vários fragmentos. Foi demonstrada
inibição de MMP-9 quando adicionada no ensaio TIMP-1 tratada com bactérias
previamente aquecidas para inativação das proteases. A mesma inibição da MMP-
9 não foi observada quando a TIMP-1 adicionada havia sido tratada com bactérias
proteoliticamente ativas, significando que inibição da TIMP-1 pelo P. gingivalis tem
efeito claro sobre a MMP-9 e, portanto, também sobre a degradação da matriz
46
extracelular. Os autores concluem que a degradação periodontal pode ser
favorecida pelo aumento significante de MMPs ativas, causada pela redução dos
seus inibidores (TIMPs), nos sítios onde existe a presença de P. gingivalis.
O Porphyromonas gingivalis, também foi investigado por Pattamapun et al.
(2002) com relação à sua capacidade de induzir ativação de MMP-2 em células do
ligamento periodontal. Culturas de fibroblastos do ligamento periodontal foram
obtidas e então sofreram a adição de sobrenadantes de culturas de P. gingivalis.
Foi demonstrado que o P. gingivalis possui a capacidade de induzir ativação de
MMP-2 em células do ligamento periodontal além de aumentar a expressão de
MT1-MMP detectados pelas técnicas de RT-PCR e Western.
Wahl e Corcoran (1993) demonstraram que, devido à capacidade do
interferon γ (IFNγ) e da interleucina-4 (IL-4) de suprimirem a produção de PGE2
que é um mediador inflamatório envolvido na estimulação de produção de MMPs,
estas citocinas apresentaram-se capazes de reduzir a produção de PGE2 no meio
de cultura, levando à redução da produção de colagenase intersticial e
colagenase/gelatinase 92kDa.
De acordo com Kubota, T. et al. (1996), as principais colagenases
presentes no tecido gengival podem ser a MMP-1 e a MMP-8, tendo a primeira
sido mais relacionada à Periodontite Juvenil e a segunda à Periodontite do Adulto.
Estes autores detectaram níveis de RNAm para MMP-1, MMP-3, MMP-8 e TIMP-1
maiores em gengivas afetadas pela periodontite que em indivíduos saudáveis mas
não os de RNAm para TIMP-2. Fatores como o TGF-� e o FGF básico mostraram-
se capazes de aumentar a produção de TIMP-1. Concluíram que o aumento
sinérgico da produção de MMP-1, MMP-3 e MMP-8 é importante para a destruição
tecidual encontrada na doença periodontal e que o aumento da TIMP-1 pode ser
uma tentativa do organismo de compensar o aumento das metaloproteinases.
Chang et al. (2002) estudaram a influência de IL-1α, TGF-β, e produtos das
bactérias P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans na expressão das MMPs em
culturas de fibroblastos do ligamento periodontal. A análise zimográfica mostrou a
47
presença de MMP-2 e MMP-9 nos meios de cultura adicionados com extratos de
P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans. A IL-1α elevou a produção de MMP-2
ao longo do tempo enquanto a TGF-β causou redução.
A MMP-8 foi demonstrada ser produzida por neutrófilos e por fibroblastos
periodontais em pacientes com síndrome de Down com diagnóstico de gengivite e
periodontite em quantidades maiores que em pacientes com a mesma síndrome
sem doença periodontal (HALINEN et al., 1996).
A MMP-8, foi estudada por Figueredo et al. (2004) em relação à sua
atividade detectada no fluido gengival após tratamento periodontal não cirúrgico.
Em pacientes com periodontite que receberam tratamento periodontal composto
de procedimentos básicos, foi coletado fluido gengival antes do início do
tratamento e no trigésimo dia após o término. Além de melhorias significativas nos
parâmetros clínicos observados, foi observada redução significativa nos níveis de
MMP-8 nos sítios com gengivite e com periodontite de pacientes com diagnóstico
de periodontite.
Meyer et al. (1997) realizaram um estudo que teve como objetivo comparar
os níveis de elastase ativa (AE), um componente dos grânulos primários dos
neutrófilos que causam destruição tecidual (KINANE; LINDHE, 1999), e do
complexo elastase-inibidor de proteinase α-1 (E-α-1 PI) no fluido gengival entre
pacientes com periodontite de progressão rápida e periodontite do adulto. Os
resultados de coleta de fluido gengival demonstraram que os níveis de AE e E-α-1
PI foram considerados insignificantes nos pacientes controle (sulco gengival de
pacientes sem periodontite). Nos pacientes com periodontite, níveis
significativamente aumentados de AE, mas não do complexo E-α-1 PI, foi
encontrado, independentemente do tipo de periodontite, razão pela qual os
autores consideraram esta enzima como um marcador de doença.
Garlet et al. (2004) estudaram a expressão de MMPs e TIMPs, do fator
osteoclastogênico RANKL e da ospeoprotegerina em periodontite agressiva e
periodontite crônica. O RNAm foi extraído de biópsias gengivais e analisado pela
48
técnica RT-PCR em relação à expressão para MMP-1, MMP-2, MMP-9, TIMP-1,
TIMP-2, TIMP-3, RANKL, OPG, TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10. Foi constatado que a
expressão para as MMPs e as TIMPs analisadas no estudo foi significativamente
maior nos casos de periodontite, tanto crônica quanto agressiva, que nos
pacientes controle, sem periodontite, sem diferença significante entre o tipo de
periodontite exceto para a TIMP-1 e TIMP-3 que foram mais expressas em
periodontite agressiva que em periodontite crônica.
Soell, Elkaim e Tenenbaum (2002) estudaram em biópsias gengivais e
fluido do sulco gengival de 11 pacientes com periodontite e 5 pacientes saudáveis
os níveis de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, TIMP-1 e TIMP-2, além da enzima
Catepsina C. As enzimas e os inibidores em questão foram quantificados e
tiveram suas atividades mensuradas através das técnicas ELISA, Western blot e
análise zimográfica. Todas as MMPs estudadas mostraram níveis maiores em
pacientes com periodontite que nos pacientes controle tanto nas biópsias quanto
no fluido do sulco gengival. As TIMP-1 e TIMP-2 mostraram-se reduzidas nos
pacientes com periodontite. As atividades das MMPs também estavam aumetadas
nos casos de periodontite.
Maldonado et al. (2004) considerando a já conhecida maior prevalência de
periodontite em diabéticos, realizaram um trabalho com o objetivo de estudar a
produção de MMP-1 estimulada por lipopolissacarídeos, em histiócitos
previamente expostos a altas concentrações de glicose. Histiócitos e fibroblastos
gengivais foram cultivados e expostos a concentrações de 5 e 25 mM de glicose,
tidas como normal e excessiva respectivamente e então tratados com
lipopolissacarídeos isolados de Escherichia coli. Os resultados mostraram que a
produção de MMP-1 foi estimulada pela adição de LPS tanto na cultura com
glicose normal quanto na com glicose aumentada, e esse estímulo ocorreu de
uma maneira dependente da concentração. Quando a adição da glicose em alta
concentração foi realizada no mesmo momento da adição do LPS, a expressão de
MMP-1 foi comparável à da cultura com glicose em concentração normal,
diferentemente de quando a adição de altas concentrações de glicose foi realizada
49
previamente. Isso significa que a pré-exposição prolongada à glicose em altas
concentrações é necessária para que a secreção de MMP-1 seja superestimulada
pelo LPS. Foi observado então que a glicose em excesso aumenta a produção de
MMP-1 estimulada por lipopolissacarídeos mais que a expressão de TIMP-1 nos
histiócitos. A expressão de RNAm para MMP-1, MMP-7, MMP-8 e MMP-9 foi
considerada maior nas células expostas a glicose em altas concentrações que em
células com glicose normal, fato encontrado também nas células expostas a
lipopolissacarídeos. O aumento na produção de MMPs nesses casos é devido ao
aumento da expressão do RNAm.
O estudo acima citado conclui então que a pré-exposição de fagócitos
mononucleares a altos níveis de glicose aumentam a expressão de MMP-1
estimulada por lipopolissacarídeos, levando a crer que pacientes diabéticos com
hiperglicemia têm maior susceptibilidade dos seus fagócitos à liberação de
substancias responsáveis pela degradação de tecido periodontal frente à presença
dos principais patógenos periodontais.
Existe um grande potencial clínico nos campos do diagnóstico e tratamento
da doença periodontal com a evolução do entendimento do papel das MMPs
nesse processo (GENCO, 1992; Van DYKE; LESTER; SHAPIRA, 1993).
No diagnóstico, representa a busca por testes que detectem os fatores que
resultarão na perda óssea antes que ela venha a ocorrer ou que forneçam meios
de se acompanhar a atividade de doença ao longo da etapa de controle e
manutenção do tratamento periodontal. Neste sentido, testes que, no futuro,
poderão ser feitos em consultórios ou até em casa, capazes de detectar MMP-8
no fluido do sulco gengival, vem sendo testados com resultados mostrando
diferenças nos seus níveis entre pacientes com ou sem doença periodontal. No
campo do tratamento, inibidores de MMPs com as tetraciclinas e seus derivados
têm sido testados e tem mostrado capacidade de inibir MMP-8, -9 e -14 (SORSA;
TJÄDERHANE; SALO, 2004).
50
De Souza et al. (2005) realizaram um estudo com o objetivo de
correlacionar o polimorfismo na região promotora dos genes MMP-9 e TIMP-2 com
a doença periodontal, o que representaria um importante achado na busca pelo
diagnóstico precoce de indivíduos de risco. Os resultados demonstraram que
pacientes diagnosticados com periodontite crônica não apresentaram associação
com o polimorfismo no gene MMP-9. O genótipo T/T, considerado o de maior
transcrição de MMP-9, não foi encontrado em nenhum paciente com periodontite.
A análise de polimorfismo para o gene TIMP-2 mostrou que 99% dos indivíduos
tinham o mesmo genótipo, não sendo possível fazer qualquer tipo de inferência.
Para Björnsson et al. (2004) uma vez que a associação entre MMPs e
progressão da doença periodontal está estabelecida, esforços devem ser feitos
para inibir estas enzimas. Neste trabalho, os autores fazem uso de um inibidor
sintético das MMPs, o Batimastat (BB-94), que age de forma competitiva, inibindo
reversivelmente a ação da MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9 e MMP-14
em ratos com periodontite induzida por ligaduras. Ratos que receberam o
Batimastat, com ou sem ligaduras, apresentaram perdas ósseas significativamente
maiores que os grupos placebo e controle. Os autores concluíram que o
Batimastat não foi capaz de reduzir a progressão da perda óssea periodontal, e
sim aumentá-la significantemente. Isto pode se dever ao fato do Batimastat ser um
inibidor de MMPs de amplo espectro, portanto inibindo ações essenciais
comandadas por MMPs no reparo de feridas. Outro fato importante é o de que
ratos mutantes deficientes em MMP-14 apresentam doenças degenerativas e
inflamatórias do metabolismo ósseo como osteopenia e artrite generalizada.
Sendo então a MMP-14 essencial para o metabolismo ósseo, e estando os ratos
desta pesquisa em fase de crescimento, a deficiência de MMP-14 devido à
inibição causada pelo Batimastat teria feito destes ratos semelhantes àqueles com
mutação e, portanto, com deficiência no metabolismo ósseo. Portanto, esta
pesquisa demonstra que embora as MMPs participem de forma importante na
perda de inserção periodontal, alguns membros dessa família possuem algum
efeito protetor ainda não identificado.
51
Proposição
52
3 PROPOSIÇÃO
O presente estudo tem como objetivo estudar através de análise imuno-
histoquímica a expressão das enzimas MMP-1, MMP-2 e MMP-9 no tecido
gengival acometido por Gengivite Induzida por Placa e por Periodontite Crônica
bem como identificar os locais de expressão destas metaloproteinases nos tecidos
epitelial e conjuntivo, visando a obtenção de dados que sugiram se a presença
e/ou o grau de expressão destas enzimas estão relacionados com os vários
processos inerentes ao hospedeiro responsáveis pela diversidade na
apresentação da doença periodontal entre os indivíduos.
53
Material e Métodos
54
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1. CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
Este estudo caracteriza-se como uma pesquisa descritiva observacional
baseada na análise e registro do padrão de distribuição e localização das células
imunomarcadas pelos anticorpos anti-MMP-1, anti-MMP-2 e anti-MMP-9 em uma
série de espécimes de gengivite induzida por placa e periodontite crônica.
4.2. POPULAÇÃO
A população deste trabalho consiste de espécimes de tecido gengival com
diagnóstico clínico de doença periodontal registrados e emblocados em parafina,
constantes nos arquivos do Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de
Patologia Oral do Departamento de Odontologia da UFRN.
4.3. AMOSTRA
Foram utilizados 26 espécimes de tecido gengival diagnosticados
clinicamente como gengivite induzida por placa (13 casos) e periodontite crônica
(13 casos).
Os espécimes utilizados foram oriundos de procedimentos cirúrgicos
periodontais ressectivos para fins estéticos ou curativos como gengivectomias,
55
aumentos de coroa clínica por indicação protética ou restauradora, ou cirurgias
conservadoras como o retalho de Widman modificado com incisão paramarginal
para exérese do tecido gengival acometido pela doença e ainda de exodontias
quando da necessidade de remoção da papila gengival para melhor coaptação
das bordas na sutura e para possibilitar a regularidade do rebordo a fim de
favorecer o melhor assentamento de prótese muco-suportada. Todos os
espécimes foram fixados em formol a 10%. As cirurgias foram realizadas em
consultórios particulares, nas clínicas de Periodontia e Cirurgia Odontológica do
Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte e
da Faculdade de Odontologia da Universidade Potiguar no período de 1974 a
2004.
4.4. ANÁLISE MORFOLÓGICA
A análise morfológica foi realizada em cortes histológicos de 5 µm de
espessura corados pela técnica da Hematoxilina/Eosina examinados em
microscopia de luz. Foram investigados nesta análise os seguintes aspectos:
qualidade do infiltrado (predominantemente linfocitário ou linfoplasmocitário),
localização do infiltrado (predominantemente perivascular e justa-epitelial,
indicando um processo inflamatório mais leve e focal, ou difuso, que denota um
processo inflamatório mais grave ou avançado). As anotações foram feitas em
tabela semelhante à reproduzida no anexo 2. As lâminas foram avaliadas duas
vezes pelo mesmo observador em tempos diferentes, como sugerido por Franchi
et al. em 2002 e Godoy em 2005.
4.5 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
56
A análise imuno-histoquímica foi realizada em cortes histológicos medindo 3
µm de espessura, estendidos em lâminas de vidro previamente limpas,
preparadas com adesivo à base de 3-aminopropyltrietoxi-silano (Sigma Chemical
CO. , St. Louis, MO, EUA). Posteriormente, os referidos cortes foram submetidos
à técnica da imuno-histoquímica, pelo método da estreptavidina-biotina (SABC),
utilizando anticorpos primários anti-MMP-1, anti-MMP-2 e anti-MMP-9 (Quadro 1)
seguindo os seguintes passos laboratoriais:
Quadro 1 – Especificidade, recuperação antigênica, diluição e tempo de
incubação dos anticorpos utilizados.
EspecificidadeRecuperação
AntigênicaDiluição
Tempo de
IncubaçãoFabricante
MMP-1Citrato pH 6,0
Steam 30 minutos1/40 Overnight
Calbiochem(Darmstadt,Alemanha)
MMP-2
Pepsina 0,5%
(Estufa 37oC/ 30
minutos)
1/50 60 minutosNovo Castra
(Londres,Inglaterra)
MMP-9Citrato pH 6,0
Steam 30 minutos1/40 Overnight
Novo Castra(Londres,Inglaterra)
o Desparafinização em dois banhos de xilol:
o Xilol 1 (30 minutos) – 57oC
o Xilol 2 (20 minutos) – temperatura ambiente
o Rehidratação em cadeia descendente de etanóis:
o Etanol absoluto I (5 minutos) – TA
o Etanol absoluto II (5 minutos) – TA
o Etanol absoluto III (5 minutos) – TA
o Etanol 95o (5 minutos) – TA
o Etanol 80o (5 minutos) – TA
57
o Remoção do pigmento formólico com Hidróxido de amônia a 10% em
etanol a 95% (10 minutos) – TA
o Lavagem em água corrente (10 minutos)
o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)
o Recuperação antigênica
o Lavagem em água corrente (10 minutos)
o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)
o Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio (H2O2)
10 volumes – 2 trocas (5 minutos cada)
o Lavagem em água corrente (10 minutos)
o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)
o Incubação em solução tampão TRIS-HCL (Tris-hidroxi-metil-
aminometano, Sigma Chemical CO. , St. Louis, MO, EUA) –
pH 7,4 – 2 trocas (5 minutos cada)
o Incubação dos anticorpos primários diluídos em solução tampão de
TRIS-HCL (pH 7,4) acrescida de albumina sérica bovina a 1%,
conservada em azida sódica a 0,1% (BSA – Bioset S/A, São
Paulo, Brasil)
o Dupla lavagem de 5 minutos cada, em solução de Tween 20 a 1%
em TRIS-HCL.
o Incubação em TRIS-HCL – 2 trocas (5 minutos cada)
o Incubação do anticorpo secundário polivalente (anti-camundongo
anti-coelho)/ diluição de 1:100 (30 minutos) – TA
o Lavagem com TRIS-HCL
o Incubação em TRIS-HCL – 2 trocas (5 minutos cada)
o Incubação do complexo Estreptavidina-Biotina (DAKO A/S, Glostrup,
Denmark)/ diluição de 1:100 (20 minutos) – TA
o Lavagem com TRIS-HCL
o Incubação em TRIS-HCL – 2 trocas (5 minutos cada)
o Revelação da reação com solução cromógena de diaminobenzidina a
0,03% (3,3-diaminobenzidina, Sigma Chemical CO. , St. Louis,
58
MO, EUA – DAB) diluída em 100 ml de TRIS-HCL e acrescida
de 0,6 ml de peróxido de hidrogênio 20 volumes, aplicada por
um período de 3 minutos em câmara escura
o Lavagem em água corrente (10 minutos)
o Passagem em água destilada
o Contracoloração com Hematoxilina de Mayer (10 minutos) – TA
o Lavagem em água corrente (10 minutos)
o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)
o Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
o Etanol 80% (2 minutos)
o Etanol 95% (2 minutos)
o Etanol absoluto I (2 minutos)
o Etanol absoluto II (2 minutos)
o Etanol absoluto III (2 minutos)
o Diafanização em dois banhos de xilol:
o Xilol 1 (2 minutos)
o Xilol 2 (2 minutos)
o Montagem em resina Permount® ( Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ,
USA) para observação em microscopia de luz
Toda reação foi efetuada utilizando como controle positivo um
adenocarcinoma de mama. Como controle negativo de todas as reações
realizadas substituiu-se o antocorpo primário por solução de BSA a 1%, diluída em
tampão TRIS-HCL pH 7,4.
4.6. MÉTODO DE ANÁLISE DAS CÉLULAS IMUNOMARCADAS
59
As lâminas foram avaliadas duas vezes pelo mesmo observador em tempos
diferentes (FRANCHI et al., 2002; GODOY, 2005), em microscópio de luz com
aumento de 400x (LEICA ATC 2000).
Foram consideradas positivas as células que exibiram coloração
acastanhada independente da intensidade de marcação.
A intensidade da marcação foi avaliada considerando-se marcação forte
(++), marcação fraca (+) ou ausência de marcação (-), considerando-se para efeito
de análise estatística escores 2, 1 e 0 respectivamente, tanto no tecido epitelial
quanto no tecido conjuntivo gengival.
A marcação no tecido conjuntivo inclui a matriz extracelular (SHIN et al.
2002) e as células presentes, sendo que quando se considera a intensidade de
marcação, nos escores 0, 1 e 2, está sendo avaliada a matriz extracelular
juntamente com as células de forma a se determinar quantodade relativa de
células marcadas e distribuição do anticorpo pelo tecido.
Posteriormente, a marcação foi avaliada em cada um dos tipos celulares
presentes.
A localização da imunomarcação foi avaliada considerando-se os seguintes
aspectos de acordo com a tabela contida nos anexos 3, 4 e 5:
o No epitélio
o Na lâmina própria
o Em células endoteliais
o Em neutrófilos
o Em linfócitos
o Em plasmócitos
o Em macrófagos
o Em fibroblastos
o Na matriz extracelular
60
4.7. TRATAMENTO ESTATÍSTICO
Os resultados obtidos da análise em microscopia de luz foram submetidos a
testes estatísticos adequados com o intuito de testar as hipóteses de diferença
e/ou correlação do padrão de marcação imuno-histoquímica de acordo com o
grupo gengivite ou periodontite. Para tanto foi utilizado o Software GraphPad
InStat versão 3.05.
A existência ou não de distribuição normal foi considerada dispensável em
virtude dos valores serem representados por escores.
Para as variáveis dependentes do tipo ordinal, representadas em escores
foram utilizadas análises não paramétricas. O teste de Mann-Whitney foi utilizado
quando comparação se deu entre dois grupos apenas (Gengivite e Periodontite) e
o de Kruskal-Wallis, seguido de pós-teste de comparação múltipla de Dunn foi
utilizado quando a comparação se deu entre três grupos (MMP-1, MMP-2 e MMP-
9).
Para as variáveis qualitativas foi utilizado o teste exato de Fisher para
determinação de associação entre duas variáveis.
Para todos os testes estatísticos utilizados, o nível de significância
estabelecido foi de 95% (α=0,05).
4.8 IMPLICAÇÕES ÉTICAS
No corpo deste trabalho só foram publicados imagens microscópicas dos
espécimes e dados referentes à idade dos pacientes não sendo possível a
61
identificação dos mesmos visto que seus nomes e números de registros são
preservados. A pesquisa obedeceu a todos os princípios éticos e legais, mantendo
as integridades física e moral dos pacientes (VALLADARES NETO, 2001).
Este projeto foi encaminhado ao Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte e registrado com o número 013-
2005, tendo sido aprovado por este comitê em 03 de Junho de 2005 (Anexo I).
62
Resultados
63
5 RESULTADOS
5.1 Resultados clínicos e morfológicos
A análise das lâminas coradas pela técnica da Hematoxilina-Eosina foi feita
em 26 casos no total sendo 13 com diagnóstico clínico de gengivite e 13 de
periodontite (Tabela 1).
Tabela 1. Total de casos analisados. Natal/ RN, 2006.
N Idade (M ± DP)
Gengivite 13 32,5 ± 8,1
Periodontite 13 46,4 ± 13,25
Total 26 40,4 ± 12,84
Ficou demonstrado que 46,2% dos casos de gengivite apresentaram
infiltrado inflamatório considerado difuso enquanto que 53,8% apresentaram
infiltrado inflamatório perivascular e justa-epitelial. Entre os casos de periodontite,
69,2% dos casos apresentaram infiltrado considerado difuso enquanto que em
30,8% o infiltrado foi considerado perivascular e justa-epitelial (Figura 1). Não
houve associação estatisticamente significante entre a localização do infiltrado
inflamatório e o tipo de doença periodontal diagnosticada clinicamente (Tabela 2).
Tabela 2. Associação entre o tipo de doença periodontaldiagnosticada e a localização da inflamação. Natal/ RN, 2006.
Difuso PVJE Total
Gengivite 6 7 13
Periodontite 9 4 13
Total 15 11 26
Não houve associação estatisticamente significante. Testeexato de Fisher (p=0,66)PVJE = perivascular e justa-epitelial
64
Figura 1. Localização do processo inflamatório em espécimes com diagnósticoclínico de periodontite. Inflamação considerada perivascular e justa-epitelial (A eB) correspondendo a um quadro histológico de menor gravidade que a inflamaçãodifusa (C e D). (H/E, 40x em A e C e H/E, 200x em B e D)
65
Com relação ao tipo celular predominante no infiltrado inflamatório
detectado nas lâminas, foi constatado que em 46,2% dos casos de gengivite o
infiltrado foi considerado predominantemente linfocitário contra 53,8% de infiltrado
considerado linfo-plasmocitário. Nos casos de periodontite, 30,8% foram
considerados predominantemente linfocitários enquanto 69,2% foram
considerados linfo-plasmocitários (Figura 2). Não houve associação significativa
entre o tipo de infiltrado predominante e o tipo de doença periodontal
diagnosticada clinicamente (Tabela 3).
Tabela 3. Associação entre o tipo de doença periodontaldiagnosticada e o tipo de infiltrado inflamatório predominante.Natal/ RN, 2006.
L LP Total
Gengivite 6 7 13
Periodontite 4 9 13
Total 10 16 26
Não houve associação estatisticamente significante. Testeexato de Fisher (p=0,68)L = LinfocitárioLP = Linfo-plasmocitário
66
Figura 2. Caracterização do tipo celular predominante no infiltrado inflamatório emlâminas com diagnóstico clínico de periodontite, evidenciando em A um infiltradopredominantemente Linfocitário e em B um considerado Linfo-plasmocitário. (H/E,200x)
67
5.2. Resultados imuno-histoquímicos
A análise da MMP-1 no epitélio de revestimento (Figura 3) demonstrou que
todos os casos de gengivite e de periodontite exibiram positividade. Dos casos de
gengivite, 30,8% tiveram marcação considerada fraca e 69,2% tiveram marcação
forte. Dos casos de periodontite, 7,7% demonstraram marcação fraca e 92,3%
exibiram forte marcação. Não houve diferença estatisticamente significante entre
a marcação imuno-histoquímica para a MMP-1 entre os epitélios nos dois tipos de
doença periodontal avaliadas (Tabela 4).
Tabela 4. Gradação da marcação imuno-histoquímica paraMMP-1 no epitélio. Natal/ RN, 2006.
- + ++ Total
Gengivite 0 4 9 13
Periodontite 0 1 12 13
Total 0 5 21 26
Não houve diferença estatisticamente significante. Teste Mann-Whitney (p=0,30)- = Marcação negativa+ = Marcação fraca++ = Marcação forte
No tecido conjuntivo gengival (Figura 4), a marcação imuno-histoquímica
para a MMP-1 foi considerada positiva em todos os casos tanto de gengivite como
de periodontite. Dos casos de gengivite, 53,8% tiveram marcação considerada
fraca e 46,2% forte, enquanto que a expressão nos casos de periodontite foi fraca
em 7,7% dos casos e forte em 92,3%. Esta diferença foi considerada
estatisticamente significante (p=0,03) (Tabela 5).
68
Figura 3. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 no tecidoepitelial de revestimento, onde em A é demonstrada uma marcação consideradaforte (++) em B uma marcação considerada fraca (+) e em C ausência demarcação (-). (SABC, 200x)
69
Figura 4. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 no tecidoconjuntivo, onde em A é demonstrada uma marcação considerada forte (++) em Buma marcação considerada fraca (+) e em C ausência de marcação (-). (SABC,200x)
70
Tabela 5. Gradação da marcação imuno-histoquímica paraMMP-1 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, 2006.
- + ++ Total
Gengivite * 0 7 6 13
Periodontite * 0 1 12 13
Total 0 8 18 26
* Diferença estatisticamente significante. Teste Mann-Whitney(p=0,03)- = Marcação negativa+ = Marcação fraca++ = Marcação forte
Ainda com relação à MMP-1, a análise feita em cada um dos componentes
celulares do tecido conjuntivo (Figuras 5, 6 e 7) mostrou que nenhum dos tipos
celulares apresentou associação estatisticamente significante entre ele e o tipo de
doença periodontal diagnosticado clinicamente (Tabela 6).
Tabela 6. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celular encontrado no tecidoconjuntivo gengival para a MMP-1. Natal/ RN, 2006.
Fib End Linf Plasm Neutr Macrof
Pr M Pr M Pr M Pr M Pr M Pr M
Gengivite 13 12 13 13 13 7 11 11 3 3 5 5
Periodontite 13 13 12 12 13 9 11 10 1 1 11 11
Total 26 25 25 25 26 16 22 21 4 4 16 16
Em nenhum caso houve associação estatisticamente significante. Teste Exato deFisher (p>0,05)Fib = Fibroblasto; End = Células Endoteliais; Linf = Linfócitos; Plasm =Plasmócitos; Neutr = Neutrófilos; Macrof = MacrófagosPr = Número de casos em que a célula foi detectadaM = Número de casos em que houve marcação da referida célula
71
Figura 5. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 evidenciandoum neutrófilo marcado (Setas). (SABC, 200x)
Figura 6. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 evidenciandocélulas endoteliais marcadas (Setas). (SABC, 400x)
Figura 7. Análise da marcação imuno-histoquímica para as MMP-1 evidenciandoplasmócitos (seta verde), linfócitos (seta vermelha), fibroblastos (seta preta) emacrófagos (seta azul) marcados. (SABC, 400x)
72
No epitélio, nenhum caso de gengivite apresentou marcação forte para a
MMP-2, onde 84,6% dos casos exibiram marcação fraca e em 15,4% não houve
marcação para a MMP-2. Na periodontite, 76,9% dos casos apresentaram
marcação fraca e em 23,1% da amostra houve ausência de marcação. A diferença
de marcação para a MMP-2 no epitélio não foi considerada estatisticamente
significante entre os casos diagnosticados clinicamente como gengivite e como
periodontite (Tabela 7).
Tabela 7. Gradação da marcação imuno-histoquímica paraMMP-2 no epitélio. Natal/ RN, 2006.
- + ++ Total
Gengivite 2 11 0 13
Periodontite 3 10 0 13
Total 5 21 0 26
Não houve diferença estatisticamente significante. Teste Mann-Whitney (p=0,74)- = Marcação negativa+ = Marcação fraca++ = Marcação forte
A análise da MMP-2 no tecido conjuntivo gengival nos casos diagnosticados
como gengivite demonstrou marcação forte em 7,7% dos casos, fraca em 53,8% e
em 38,5% dos casos ausência de marcação. Nos casos de periodontite não houve
marcação forte em nenhum dos casos, 61,5% apresentaram marcação fraca e
38,5% não apresentaram marcação. Não houve diferença estatisticamente
significante, na marcação para a MMP-2, entre os casos diagnosticados
clinicamente como gengivite e como periodontite no tecido conjuntivo gengival
(Tabela 8).
73
Tabela 8. Gradação da marcação imuno-histoquímica paraMMP-2 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, 2006.
- + ++ Total
Gengivite 5 7 1 13
Periodontite 5 8 0 13
Total 10 15 1 26
Não houve diferença estatisticamente significante. Teste Mann-Whitney (p=0,85)- = Marcação negativa+ = Marcação fraca++ = Marcação forte
Na análise da marcação da MMP-2 nos tipos celulares do tecido conjuntivo
gengival, tanto na gengivite quanto na periodontite pode ser .verificada na tabela
9.
Tabela 9. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celular encontrado no tecidoconjuntivo gengival para a MMP-2. Natal/ RN, 2006.
Fib End Linf Plasm Neutr Macrof
Pr M Pr M Pr M Pr M Pr M Pr M
Gengivite 13 9 13 8 13 4 12 11 2 0 11 8
Periodontite 13 6 12 5 13 4 12 9 3 0 11 7
Total 26 15 25 13 26 8 24 20 5 0 22 15
Em nenhum caso houve associação estatisticamente significante. Teste Exato deFisher (p>0,05)Fib = Fibroblasto; End = Células Endoteliais; Linf = Linfócitos; Plasm =Plasmócitos; Neutr = Neutrófilos; Macrof = MacrófagosPr = Número de casos em que a célula foi detectadaM = Número de casos em que houve marcação da referida célula
A análise imuno-histoquímica para a MMP-9 no epitélio, nos casos de
gengivite mostrou que 30,8% dos casos não exibiram marcação para a MMP-9,
46,2% marcaram fracamente e 23,1% apresentaram marcação forte. Nos
74
espécimes de periodontite 23,1% tiveram marcação fraca e 76,9% apresentaram
marcação forte. Foi encontrada diferença estatisticamente significante na
marcação imuno-histoquímica para MMP-9, no epitélio, entre os espécimes de
gengivite e os de periodontite (p=0,008).(Tabela 10).
Tabela 10. Gradação da marcação imuno-histoquímica paraMMP-9 no epitélio. Natal/ RN, 2006.
- + ++ Total
Gengivite * 4 6 3 13
Periodontite * 0 3 10 13
Total 4 9 13 26
* Diferença estatisticamente significante. Teste Mann-Whitney(p=0,008)- = Marcação negativa+ = Marcação fraca++ = Marcação forte
No tecido conjuntivo gengival, a MMP-9 esteve ausente em 38,5% dos
casos de gengivite, estando fraca em 46,2% e forte em 15,4%. Nos casos de
periodontite, 15,4% dos casos foram negativos, 30,8% exibiram expressão fraca e
em 53,8% a marcação foi forte. Estes dados não resultaram numa diferença
considerada estatisticamente significante entre os dois tipos de doença periodontal
(Tabela 11).
Tabela 11. Gradação da marcação imuno-histoquímica paraMMP-9 no tecido conjuntivo gengival. Natal/ RN, 2006.
- + ++ Total
Gengivite 5 6 2 13
Periodontite 2 4 7 13
Total 7 10 9 26
Não houve diferença estatisticamente significante. Teste Mann-Whitney (p=0,06)
75
- = Marcação negativa+ = Marcação fraca++ = Marcação forte
Os tipos celulares específicos do tecido conjuntivo gengival, analisados
mostraram associação estatisticamente significante entre fibroblastos marcados
para a MMP-9 e o tipo de doença periodontal diagnosticada clinicamente (p=0,04),
o mesmo ocorrendo com os linfócitos (p=0,01). Nas demais células não houve
associação estatisticamente significante (Tabela 12)
Tabela 12. Marcação imuno-histoquímica de cada tipo celular encontrado notecido conjuntivo gengival para a MMP-9. Natal/ RN, 2006.
Fib End Linf Plasm Neutr Macrof
Pr M Pr M Pr M Pr M Pr M Pr M
Gengivite 13 3* 13 13 13 3** 13 11 1 1 12 11
Periodontite 13 8* 13 13 13 9** 13 12 0 0 12 12
Total 26 11 26 26 26 12 26 23 1 1 24 23
* Associação estatisticamente significante. Teste exato de Fisher (p=0,04)** Associação estatisticamente significante. Teste exato de Fisher (p=0,01)Nos demais casos não houve associação estatisticamente significante. TesteExato de Fisher (p>0,05)Fib = Fibroblasto; End = Células Endoteliais; Linf = Linfócitos; Plasm =Plasmócitos; Neutr = Neutrófilos; Macrof = MacrófagosPr = Número de casos em que a célula foi detectadaM = Número de casos em que houve marcação da referida célula
A análise estatística foi utilizada também para determinar se houve
diferença, dentro de cada tipo de doença periodontal diagnosticada clinicamente,
entre os tipos de MMPs objetos deste estudo.
Os resultados mostraram que na gengivite, tanto o tecido epitelial quanto o
tecido conjuntivo apresentaram uma produção de MMP-1 significativamente maior
que de MMP-2 e MMP-9 (Tabela 13).
76
Tabela 13. Média dos postos e significância estatística damarcação imuno-histoquímica para a MMP-1, MMP-2 e MMP-9em gengivite. Natal/ RN, 2006.
MMP-1 MMP-2 MMP-9 p
Epitélio 28.42a 14,92b 16,65b 0,0013
Tecido Conjuntivo 27,19a 15,84b 16,96b 0,0093
Letras diferentes representam diferença estatisticamentesignificante para α=0,05 segundo pós-teste de comparaçãomúltipla de Dunn
Na periodontite, tanto o epitélio quanto o tecido conjuntivo mostraram
produções de MMP-1 e MMP-9 significantemente maiores que a de MMP-2
(Tabela 14).
Tabela 14. Média dos postos e significância estatística damarcação imuno-histoquímica para a MMP-1, MMP-2 e MMP-9em periodontite. Natal/ RN, 2006.
MMP-1 MMP-2 MMP-9 p
Epitélio 28,00a 8,15b 23,84a <0,0001
Tecido Conjuntivo 24,38a 12,00b 23,61a 0,0033
Letras diferentes representam diferença estatisticamentesignificante para α=0,05 segundo pós-teste de comparaçãomúltipla de Dunn
77
Discussão
78
6 DISCUSSÃO
A doença periodontal inflamatória crônica, é uma das doenças mais
prevalentes do nosso tempo, com tendência a se tornar cada vez mais prevalente,
já que está provado que a sua ocorrência aumenta com a idade e a expectativa de
vida da população mundial tem aumentado continuamente nos últimos anos
(ALBANDAR, 2002; GJERMO et al., 2002; SHEIHAM; NETUVELI, 2002)
É referida desde 1977 pela American Academy of Periodontology, como
duas doenças distintas, de acordo com a região do periodonto que atinge,
denominadas gengivite ou periodontite (TODESCAN, 2001).
A gengivite, denominada atualmente como gengivite induzida por placa é
definida como a inflamação crônica dos tecidos que fazem parte do periodonto de
proteção, ou seja, a inflamação restrita à gengiva (ARMITAGE, 1999).
A periodontite é definida como o processo no qual a inflamação atinge os
tecidos do periodonto de sustentação, levando à destruição progressiva do osso
alveolar e ligamento periodontal. É classificada desde 1999 em três tipos distintos:
a periodontite crônica, forma mais prevalente e caracterizada pela progressão
lenta da destruição óssea; a periodontite agressiva, forma de periodontite
caracterizada por uma progressão mais rápida da destruição periodontal devido à
existência de uma microbiota mais virulenta, combinado a alguns fatores do
hospedeiro ainda não totalmente estabelecidos e a periodontite como
manifestação de doenças sistêmicas, que abrange uma forma de doença
periodontal extremamente destrutiva, associada a quadros de doenças sistêmicas
graves (ARMITAGE, 1999).
A patogenia da doença periodontal é classicamente descrita (GONÇALVES
et al., 2005; KINANE; LINDHE, 1999) como a periodontite sendo uma
conseqüência da gengivite, sendo as duas fases distintas da mesma doença que é
a Doença Periodontal Inflamatória Crônica, ou, como chamaram Passanezi et al.
(2005) para diferenciá-la das doenças que atingem o periodonto apical, de doença
periodontal marginal infecciosa. Neste trabalho a doença será considerada desta
79
maneira, sendo sempre referida simplesmente como doença periodontal, tendo
uma fase inicial chamada Gengivite e uma mais avançada chamada de
Periodontite.
Uma breve descrição dos principais eventos da patogenia da doença
periodontal foi feita para que se possa posteriormente colocar os objetos deste
estudo, as MMPs, como personagens chave em alguns dos processos.
A doença periodontal se inicia a partir da existência do chamado fator
etiológico principal, que é o biofilme dentário (SOCRANSKY; HAFFAJEE, 2002;
TODESCAN, 2001; WILLIAMS et al., 1992).
Em resposta aos agentes agressores liberados pelas bactérias existentes
no biofilme, tem-se início, na gengiva marginal uma reação inflamatória aguda de
baixa intensidade, mediada basicamente por neutrófilos com o intuito de combater
os agentes patogênicos que entram em contato com a gengiva. Como as bactérias
estão constantemente na cavidade oral, e mesmo após uma limpeza profissional,
iniciando a formação de novo biofilme, este processo é comumente encontrado na
gengiva, mesmo na gengiva considerada clinicamente sadia (SEABRA; SEABRA;
BRITO, 2005).
Dessa forma, sempre há a presença do agente agressor mas sempre há o
combate por parte do hospedeiro a estes agressores e o equilíbrio é mantido
fazendo com que, diante de agentes periodontopatogênicos de baixa intensidade
o combate seja eficiente e, apesar de histologicamente existir características de
inflamação, esta não é detectável clinicamente pois é suficiente apenas para
combater esta agressão de baixíssima intensidade.
Com o aumento da patogenicidade do agressor, pelo aumento da
quantidade de biofilme ou por uma modificação na microbiota tornando-o mais
virulento (SOCRANSKY; HAFFAJEE, 2002), ou modificação da resposta sistêmica
ao agente agressor (ALBANDAR, 2002; BEZERRA et al., 2003), começa a ocorrer
o desequilíbrio uma vez que o hospedeiro passa a não conseguir mais combater
adequadamente a agressão.
80
O aumento na intensidade do processo inflamatório, com maior quantidade
de células inflamatórias do tipo crônica (LINS, 2003), associado à dilatação
vascular aumentando a permeabilidade dos vasos e à estase sanguínea, bem
como à angiogênese para chegada de mais células de defesa fazem com que a
gengivite passe a ser clinicamente detectável pela presença de edema e eritema
gengival.
À medida em que a agressão vai se intensificando, a resposta também se
torna mais intensa. Com isso, as células de defesa passam a abranger áreas
maiores dentro do tecido conjuntivo gengival e a angiogenêse característica dos
processos de reação de granulação se torna mais pronunciada.
Estes dois componentes citados acima, infiltrado inflamatório e
angiogênese, para ocorrerem dependem da criação de espaços dentro do tecido
conjuntivo gengival, que é um tecido com um grande componente fibroso na sua
matriz extracelular (MEC). Este espaço é criado então às custas de degradação
de matriz extracelular. Portanto, no momento em que se inicia o aparecimento de
concentrações maiores de células inflamatórias no tecido conjuntivo (LINS, 2003),
começando de forma peri-vascular e justa-epitelial, a destruição de matriz
extracelular já deve estar presente. Consequentemente, quanto maior a
inflamação, maior o componente tecidual permeado com células inflamatórias e
atingido por formação de novos vasos, portanto maior a destruição da matriz
extracelular (ALBERTS et al., 1997; SEABRA; SEABRA; BRITO, 2005).
Além da destruição tecidual, os tecidos gengivais e periodontais inflamados
apresentam também queda no nível de produção de colágeno, o que acentua o
desequilíbrio entre formação e destruição tecidual resultando em maior perda de
matriz extracelular (KARIMBUX et al., 1998)
Quando o processo inflamatório no tecido conjuntivo gengival chega a
tomar proporções suficientes para atingir o osso alveolar e ligamento periodontal
subjacentes, a matriz extracelular óssea também passa a sofrer destruição,
embora envolvendo mecanismos destrutivos adicionais em relação à matriz
81
extracelular gengival (BIRKENDAL-HANSEN, 1993; KINANE; LINDHE, 1999;
MEYER et al. 1997).
Nesse momento, a doença passa a ser chamada de periodontite, embora,
como foi descrito acima, seja a continuação da mesma doença periodontal
inflamatória crônica.
Neste estudo não foi demonstrada associação com significância estatística
entre a localização do infiltrado inflamatório, e o tipo de doença periodontal
diagnosticada clinicamente (Tabela 2). Era de se esperar o contrário já que a
localização predominantemente peri-vascular e justa-epitelial corresponde a um
processo inflamatório considerado inicial enquanto que uma localização mais
difusa, indica uma processo inflamatório mais abrangente e portanto mais
avançado (LINS, 2003).
Também a associação entre o tipo de célula predominante no infiltrado
inflamatório e o diagnóstico clínico de gengivite ou de periodontite não pôde ser
estabelecido (Tabela 3). Este achado também é contrário ao que se encontra na
literatura (GONÇALVES et al., 2005; KINANE; LINDHE, 1999) que relata que um
dos sinais histológicos observados no tecido que indicam a progressão da doença
periodontal de uma gengivite em estágio mais inicial para uma em estágio mais
avançado ou mesmo uma periodontite já instalada é o aumento da proporção de
plasmócitos no infiltrado inflamatório, chegando a atingir 50% da população celular
encontrada no infiltrado.
Estes achados podem ser decorrentes do fato do diagnóstico de gengivite
ou periodontite ser exclusivamente clínico e/ou radiográfico, ou seja, não importa
para o diagnóstico quais eventos estejam ocorrendo no interior do tecido gengival
nem os achados histológicos destes eventos, o que importa é se a perda óssea
pode ser detectada clínica ou radiograficamente.
Deve-se considerar que uma biópsia para obtenção de uma gengiva em um
paciente com periodontite pode ser executada durante uma exodontia de um
dente condenado periodontalmente, que não passou pela fase do tratamento
periodontal chamada procedimentos básicos, cuja função principal é reduzir ou
82
eliminar a inflamação gengival, ou durante um procedimento de Retalho de
Widman Modificado, onde o dente em questão sofreu todos o tratamento
periodontal básico.
Obviamente, é razoável assumir que os dois fragmentos gengivais com
diagnóstico clínico periodontite são completamente diferentes histologicamente em
relação aos estágios de lesão inicial, precoce, estabelecida ou avançada
(GONÇALVES et al. 2005; KINANE; LINDHE, 1999). Portanto embora as
amostras utilizadas neste estudo tenham sido diagnosticadas clinicamente como
gengivite ou periodontite, isso não significa que os fragmentos contenham lesões
histologicamente compatíveis com seus diagnósticos clínicos.
Os eventos destrutivos que ocorrem nos tecidos periodontais durante a
doença foram durante muito tempo considerados de responsabilidade direta dos
produtos liberados pelas bactérias do biofilme (GENCO, 1992).
No entanto, sabe-se hoje que a degradação da matriz extracelular, tanto em
eventos fisiológicos quanto patológicos é mediada por uma classe de enzimas
endógenas denominadas Metaloproteinases da Matriz ou MMPs (ALBERTS et al.,
1997; MOTT; WERB, 2004; PEREIRA et al., 2005; SORSA; TJÄDERHANE;
SALO, 2004; STERNLICHT; WERB, 2001; Van DYKE; LESTER; SHAPIRA, 1993)
As MMPs são uma classe de enzimas cuja função principal é exercer a
degradação da matriz extracelular nos processos fisiológicos de formação e
desenvolvimento tecidual, renovação da matriz extracelular e degradação para
crescimento tecidual nos processos de reparo. Ou seja, têm a função de degradar
o tecido sempre que necessário por algum processo fisiológico ou patológico
(PEREIRA et al. 2005; Van DYKE; LESTER; SHAPIRA, 1993). De Souza et al.
(2005) afirmam que as MMPs são capazes de degradar todos os componentes da
matriz extracelular.
Portanto, é razoável assumir que estas enzimas também estão envolvidas
na destruição tecidual observada na doença periodontal, degradando a matriz
extracelular gengival e o componente orgânico do osso, o que significa que
componentes do próprio hospedeiro, e não produtos bacterianos, são os principais
83
responsáveis pela degradação dos tecidos periodontais observada na doença
periodontal (De SOUZA; LINE, 2002; REYNOLDS; MEIKLE, 1997; SORSA;
TJÄDERHANE; SALO, 2004).
Para que a degradação da matriz extracelular seja perfeitamente
controlada, não havendo degradação excessiva, vários mecanismos atuam na
regulação, como hormônios, fatores de crescimento e os inibidores teciduais de
metaloproteinases (TIMPs) (BIRKENDAL-HANSEN, 1993). Por isso, algum fator
que desregule o equilíbrio entre degradação fisiológica e formação de matriz,
resultando em renovação tecidual, deve atuar aumentando a produção e/ou
ativação das MMPs ou inativando os seus inibidores (GRENIER; MAYRAND,
2001).
Vários fatores endógenos como TNF-α, IL-1 e PGE2, que são produzidos
dentro da gengiva principalmente por células inflamatórias, além de fatores
exógenos como LPS bacteriano demonstraram exercer este papel (BIRKENDAL-
HANSEN, 1993; De SOUZA et al. 2005; NISHIKAWA et al. 2002; WAHL;
CORCORAN, 1993).
A MMP-1, ou Colagenase-1, foi demonstrada ser expressa por fibroblastos,
monócitos, macrófagos e células epiteliais (HAAKE et al., 2004a) como também
por plasmócitos, linfócitos e neutrófilos (SHIN et al., 2002). No presente estudo foi
observada MMP-1 nas células do epitélio pavimentoso estratificado ceratinizado
gengival, bem como nas células endoteliais, nos fibroblastos, linfócitos,
plasmócitos, neutrófilos e macrófagos.
Assim como as outras colagenases, que são a MMP-8 (Colagenase-2) e a
MMP-13 (Colagenase-3), a MMP-1 tem a capacidade de degradar o colágeno I,
principal componente fibrilar estrutural do tecido conjuntivo gengival. (HALINEN et
al. 1996; LYNCH; MATRISIAN, 2002; STAMENKOVIC, 2000; WESTERMARCK,
KÄHÄRI, 1999).
Foi detectado por Kubota, T. et al. (1996), níveis aumentados da produção
de RNAm para MMP-1, MMP-3 e MMP-8 em gengivas acometidas por doença
84
periodontal. Assim como redução de MMP-8 em gengivas acometidas por
periodontite após tratamento periodontal básico.
A MMP-1 também mostrou ter sua produção estimulada por citocinas
inflamatórias presentes na doença periodontal como a IL-1β (ALVARES et al.,
1995) e TNFα (NISHIKAWA et al., 2002).
No presente estudo, foi demonstrado que, das três MMPs analisadas a
MMP-1 se apresentou como a mais expressa na gengivite, tanto no epitélio quanto
no tecido conjuntivo. Na periodontite a MMP-9 apresentou-se também
significativamente mais expressa que a MMP-2 e com imunomarcação semelhante
à MMP-1 (Tabelas 13 e 14).
A MMP-1, portanto, mostrou forte expressão tanto no epitélio quanto no
conjuntivo desde estágios iniciais da doença periodontal até a periodontite
permanecendo relativamente inalterada durante as várias fases da doença. Isso
significa que a MMP-1 é uma das mais importantes enzimas de degradação
tecidual em todos os processos da doença.
No tecido conjuntivo gengival, os casos de periodontite apresentaram uma
expressão significativamente maior que os de gengivite (Tabela 5). Sendo
identificadas marcações em fibroblastos, células endoteliais, linfócitos,
plasmócitos, neutrófilos e macrófagos, sem haver associação significante entre a
expressão de qualquer um destes tipos celulares e o tipo de doença periodontal
diagnosticada clinicamente. Foi demonstrado no presente estudo que o tecido
epitelial é uma importante fonte de MMP-1 na doença periodontal tanto na
gengivite quanto na periodontite, uma vez que a expressão foi encontrada em
todos os casos analisados, mostrando também que o epitélio gengival exerce o
papel de produção de MMP-1 em todas as fases da doença (Tabela 4).
Estes dados mostram que em estágios mais avançados da doença
periodontal a produção de MMP-1, uma das colagenases mais importantes da
doença periodontal (KUBOTA, T. et al., 1996; MALDONADO et al., 2004),
aumenta no tecido conjuntivo, embora permaneça relativamente inalterada no
85
tecido epitelial, uma vez que desde os estágios iniciais de gengivite esta
expressão já se encontra elevada.
Isso pode significar que o tecido conjuntivo gengival só passa a ser uma
fonte importante de MMP-1 nos estágios mais avançados da doença periodontal,
que esta enzima pode exercer um papel importante na reabsorção óssea
resultante dessa doença e que a produção de MMP-1 por este tecido pode ser
crucial para a progressão da gengivite para periodontite.
Este dado está em acordo com Garlet et al. (2004) que detectou maior
produção de MMP-1 em pacientes com periodontite crônica e agressiva que em
pacientes sem periodontite e com Soell, Elkaim e Tenenbaum (2002) que
demonstraram aumento de produção e de atividade da MMP-1 em pacientes com
periodontie em relação a pacientes saudáveis.
As análises imuno-histoquímicas feitas especificamente nas células do
tecido conjuntivo, tiveram o intuito de identificar quais tipos celulares estariam
implicados na produção das três MMPs estudadas neste trabalho.
Essa análise mostrou, de acordo com a Tabela 6, que a MMP-1 pode ser
produzida de forma considerável por fibroblastos, células endoteliais, plasmócitos,
neutrófilos e macrófagos, em qualquer estágio da doença periodontal. Expressão
positiva para MMP-1 foi observada também em linfócitos, no entanto em 6 casos
de gengivite e 4 de periodontite os linfócitos presentes não se encontravam
marcados.
Estes achados concordam com os de Shin et al. (2002), que encontraram
também em análise imuno-histoquímica, marcação para MMP-1 em matriz
extracelular, neutrófilos, macrófagos, plasmócitos e linfócitos em polpas
diagnosticadas clinicamente com pulpites agudas e crônicas.
Os dados da tabela 4 e 5 em conjunto, mostram que a MMP-1, ou
Colagenase 1 é uma das enzimas de degradação de matriz extracelular mais
importantes na doença periodontal, agindo de forma considerável tanto na
destruição tecidual observada na gengivite quanto na periodontite e tanto as
células da inflamação aguda, quanto as da inflamação crônica são capazes de
86
produzí-la, assim como outros tipos celulares como ceratinócitos, fibroblastos e
células endoteliais.
Os dados expostos na tabela 6 não mostram diferenças estatisticamente
significantes na marcação de MMP-1 para nenhum tipo celular entre gengivite e
periodontite.
Pode-se inferir a partir disso que o aumento na marcação para a MMP-1
observada no tecido conjuntivo gengival na periodontite em relação à gengivite é
resultado de maior quantidade de tipos celulares produtores de MMP-1, e não por
produção desta enzima por alguma célula apenas na periodontite.
A detecção nas células endoteliais pode confirmar o seu papel na
angiogênese encontrada nos processos inflamatórios e neoplásicos como
sugerido por Haas e Madri (1999), Lynch e Matrisian (2002), Rundhaug (2003) e
DeClerk et al. (2004).
A MMP-2 e a MMP-9 são duas gelatinases, Gelatinase A e Gelatinase B
respectivamente. Wahl e Corcoran (1993) relatam que a MMP-9, chamada na
época de colagenase de 92 kDa, é capaz de degradar a gelatina, e colágenos tipo
IV e V (LYNCH; MATRISIAN, 2002; STAMENKOVIC, 2000; WESTERMARCK,
KÄHÄRI, 1999).
Chang et al. (2002) demonstraram que a produção de MMP-2 é estimulada
em culturas de células pulpares e periodontais pelas bactérias P. endodontalis, P.
gingivalis e A. actinomycetemcomitans. A MMP-9, apesar de ter sido encontrada, o
foi em pequenas quantidades. Ambas as MMPs foram também detectadas em
maior quantidade em pacientes com periodontite crônica e agressiva que em
pacientes controle, sem periodontite, por Garlet et al. em 2004 e em maior
quantidade e atividade em pacientes com periodontite que em pacientes controle
por Soell, Elkaim e Tenenbaum (2002).
Franchi et al. (2002) demonstraram que a marcação para a MMP-2 e a
MMP-9, principalmente esta última, tem grande importância nos processos de
invasão e metástase de carcinomas de cabeça e pescoço, provavelmente pelas
funções desempenhadas por elas na degradação da matriz extracelular,
87
principalmente da membrana basal, que é formada principalmente por colágenos
tipo IV e VII (ALBERTS et al., 1997), e na angiogênese.
Kumamoto et al., em 2003, demonstraram que a MMP-2, juntamente com a
MMP-9 é importante na degradação da membrana basal em germes dentários e
em ameloblastomas, tendo sido encontradas de forma mais pronunciada em
componentes mesenquimais que epiteliais.
No presente trabalho, a tabela 13 demonstra que a MMP-2 foi
significantemente menos expressa que a MMP-1 e apresentou expressão
semelhante à MMP-9 tanto no tecido epitelial quanto no conjuntivo em casos de
gengivite. Como visto na tabela 14, nos casos de periodontite a MMP-2 foi
significativamente expressa de forma mais fraca que a MMP-1 e a MMP-9 que
apresentaram expressões semelhantes entre si. Ou seja, a expressão de MMP-2
foi considerada fraca tanto na gengivite quanto na periodontite, quer seja no
epitélio ou no tecido conjuntivo.
Estes dados podem significar que as duas gelatinases se comportam de
maneiras distintas na doença periodontal. A MMP-2 (Gelatinase A) é expressa de
forma semelhante em todas as fases da doença periodontal, iniciando uma fraca
expressão em estágios iniciais, não se elevando com a progressão para estágios
mais avançados. Já a MMP-9, inicia-se com fraca expressão na gengivite e
aumenta a sua expressão, tanto no epitélio quanto no tecido conjuntivo, à medida
que a doença progride de uma gengivite para periodontite.
Como visto nas tabelas 7 e 8, a MMP-2 é expressa na maioria das vezes de
forma fraca, tanto no epitélio quanto no tecido conjuntivo, embora Chang et al.
(2002) tenha observado aumento de sua produção em cultura de células de
ligamento periodontal com P. gingivalis e Pattamapun et al. (2003) tenha
observado aumento tanto na produção quanto na ativação de MMP-2 em células
do ligamento periodontal.
Provavelmente esta MMP seja importante na degradação da membrana
basal do epitélio juncional, favorecendo sua migração para apical, evento que tem
início no estágio de lesão estabelecida e se continua na lesão avançada, conforme
88
foi sugerido no estudo de Smith et al. (2004) e semelhante à degradação da
membrana basal que ocorre em patologias como o câncer (FRANCHI et al. 2002),
cistos odontogênicos (KUBOTA, Y. et al. 2002) e ameloblastomas (KUMAMOTO
et al. 2003).
A Tabela 9, demonstra que das células analisadas apenas os neutrófilos
não apresentaram marcação para a MMP-2.
As células que são capazes de produzir esta MMP, o fazem mediante
algum estímulo, como contato com LPS bacteriano (BIRKEDAL-HANSEN, 1993;
REYNOLDS; MEIKLE, 1997), continuamente, embora em pequenas proporções,
como foi demonstrado também por Shin et al. (2002).
Mesmo que tal proporção não seja estatisticamente comparável às outras
duas MMPs analisadas neste estudo, o fato da produção da MMP-2 ter se
mostrado constante no tecido epitelial, e no conjuntivo nas células capazes de
produzí-las mostra que a MMP-2 possui alguma função na degradação da matriz
na doença periodontal e na angiogênese, em todos os estágios da doença
periodontal. Mais estudos seriam então necessários para determinar se a MMP-2
consegue desempenhar suas funções num nível importante mesmo numa
quantidade menor que a MMP-1 e MMP-9.
Já a MMP-9, ou Gelatinase B, uma enzima muito semelhante à MMP-2 à
qual é atribuída praticamente as mesmas funções, comportou-se no presente
estudo de forma diferente da Gelatinase A, exibindo o aumento da expressão
desta metaloproteinase nos casos diagnosticados como periodontite em relação
aos casos de gengivite.
Van Den Steen et al. (2002) afirmam que a MMP-9 encontra-se em níveis
aumentados em locais onde há uma ferida crônica, com ulcerações que não
cicatrizam. Esta situação descrita é facilmente encontrada em bolsas periodontais.
Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) também afirmaram que a MMP-9,
juntamente com a MMP-8 ou Colagenase 2, são as que mais frequentemente são
detectadas de forma aumentada em fragmentos de gengiva e fluido gengival de
pacientes com periodontite.
89
Grenier e Mayrand (2001), demonstraram que a P. gingivalis, através da
inativação da TIMP-1 pode fazer aumentar na gengiva inflamada os níveis de
MMP-9.
As tabelas 10 e 11 mostram que a produção de MMP-9 aumenta nos casos
de periodontite em relação aos casos de gengivite tanto no epitélio quanto no
tecido conjuntivo embora tenha apresentado diferença estatisticamente
significante apenas no epitélio.
Os dados estão em concordância com o estudo de Smith et al. (2004) que
observou níveis maiores de pró-MMP-9 mas não de pró-MMP-2 no epitélio de
bolsas periodontais, no entanto, discordam do estudo de Chang et al. (2002), que
mostrou que em células do ligamento periodontal a MMP-9, embora detectada na
análise zimográfica apresentou menor quantidade que a MMP-2.
É razoável se assumir que isso signifique que a MMP-9 pode ser uma das
enzimas mais importantes na doença periodontal, provavelmente atuando nos
processos de degradação da matriz extracelular do tecido conjuntivo gengival,
incluindo a membrana basal do epitélio juncional, do endotélio dos vasos
favorecendo a angiogênese e, possivelmente, na reabsorção do osso e ligamento
periodontal.
Seriam entretanto necessários outros estudos que avaliassem o papel das
MMPs na reabsorção óssea existente na doença periodontal, já que o estudo de
Chang et al. (2002) parece demonstrar que no ligamento periodontal a MMP-2 tem
produção maior que a MMP-9 frente a estímulos bacterianos.
Tanto a MMP-2 quanto a MMP-9, podem ter algum papel na reabsorção
óssea periodontal já que demonstraram serem estimuladas por IL-1β, um
mediador inflamatório existente na doença periodontal e exercerem algum papel
no crescimento de cistos odontogênicos (KUBOTA, Y. et al. 2000, KUBOTA, Y. et
al. 2002), além de já terem sido implicados na destruição tecidual de doenças
inflamatórias como a artrite reumatóide (Van Den STEEN et al. 2002)
A MMP-9, como visto na tabela 12, mostrou-se intensamente marcada em
células endoteliais em quase todos os casos analisados o que pode estar
90
relacionada coma sua função na angiogênese, em acordo com os achados de
Franchi et al. (2002) que encontraram densidade vascular maior em carcinomas
com superexpressão de MMP-9 que foi localizada tanto nas células tumorais
quanto nas células do estroma e nas células inflamatórias adjacentes ao tumor.
Além de atuarem na angiogênese pela degradação da membrana basal a
MMP-2 e, principalmente, a MMP-9, atuam também de forma indireta pela
liberação de epítopos pró-angiogênicos presentes nas macromoléculas da
membrana basal além de aumentarem a biodisponibilidade de fatores como VEGF
e TGF-β (BORNSTEIN; SAGE, 2002; MOTT; WERB, 2004; RUNDHAUG, 2003,).
A tabela 12 mostra também que plasmócitos e macrófagos apresentaram
considerável marcação tanto na gengivite quanto na periodontite, mostrando que
são fontes consideráveis de MMP-9 desde os estágios iniciais da doença
periodontal. Já os fibroblastos e linfócitos, mostraram significativamente maior
expressão nos casos de periodontite que nos de gengivite, o que significa que
estas células passam a produzir mais MMP-9 à medida que a doença periodontal
progride para estágios mais avançados, contribuindo com o aumento da produção
de MMP-9 no tecido conjuntivo gengival encontrado na periodontite em relação à
gengivite, fato demonstrado na tabela 11. Os neutrófilos, considerados
importantes fontes de MMP-9 por Smith et al. (2004) e De Souza et al. (2005),
tiveram baixa detecção na amostra analisada, não sendo possível qualquer
inferência embora tenha sido detectada marcação destas células para MMP-9.
Pode-se inferir que, juntamente com a MMP-1, a MMP-9 é uma enzima que
apresenta importância na destruição tecidual observada na periodontite, tanto pela
sua produção por parte do epitélio quanto do conjuntivo. O aumento na sua
produção pode ser, inclusive, considerado importante na progressão de gengivite
para periodontite e pode ser resultante tanto do aumento na quantidade das
células com capacidade de produzí-la quanto por produção por parte de
fibroblastos e linfócitos apenas na periodontite.
Este estudo demonstra de forma clara que as três MMPs analisadas
mostraram expressão imuno-histoquímica nos diferentes estágios da doença
91
periodontal evidenciadas em vários tipos celulares analisados mostrando que as
células do hospedeiro têm realmente um papel importante na produção das
substâncias responsáveis pela degradação tecidual. Este fato foi demonstrado de
forma evidente não somente em células da inflamação, classicamente
responsabilizadas pela destruição, como também em células como ceratinócitos,
fibroblastos e células endoteliais. Portanto o estudo segue a tendência atual
dentro da Periodontologia que considera que os fatores mais importantes na
degradação tecidual característica da doença periodontal são substâncias
produzidas pelo próprio hospedeiro, estimuladas pelas bactérias do biofilme
dentário, e não pelos microoganismos.
92
Conclusões
93
7. CONCLUSÕES
Podemos concluir com este estudo que:
• A combinação entre diagnóstico clínico de Gengivite ou de
Periodontite com os dados histológicos do tecido conjuntivo gengival
relativos aos estágios da patogenia da doença periodontal descritos
na literatura é difícil de ser conseguido;
• A MMP-1 é uma enzima produzida de forma intensa pelo epitélio
gengival em todas as fases da doença, desde os estágios iniciais de
gengivite até a periodontite;
• A MMP-1 tem sua produção aumentada dentro do tecido conjuntivo
gengival na periodontite em relação à gengivite, significando que a
produção desta enzima nesse tecido pode ter um papel crucial na
reabsorção óssea periodontal e na progressão do estágio de lesão
estabelecida para o de lesão avançada da doença periodontal;
• A MMP-2 mostrou-se predominantemente com fraca expressão, com
maior marcação no epitélio que no conjuntivo, portanto não pôde ser
considerada por este estudo uma das MMPs mais importantes na
patogenia da doença periodontal, no entanto, mais estudos são
necessários para determinar o seu real papel.
• A MMP-9 é expressa mais na periodontite que na gengivite, tanto no
epitélio quanto no conjuntivo significando que esta enzima pode ter
importância tanto na progressão da gengivite para a periodontite
quanto na própria patogenia da reabsorção óssea observada na
doença periodontal.
94
Referências bibliográficas
95
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100
ANEXO 1
101
ANEXO 2
HE
Localiz. da InflamaçãoCélulas
predominantesN. da Lâmina Difusa P-vasc e J-epit Linf Linf-plasm
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Localiz = localização; P-vasc=perivascular, J-epit=justaepitelial; Linf=linfócitos,Plasm=plasmócitos.
102
ANEXO 3
MMP-1Epitélio Conjuntivo Células
N. da Lâmina (-) (+) (++) Lbas (-) (+) (++) Fib End Lf Pl Nt Mc1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Lam. Basal= lâmina basal, Fib=fibroblastos, End=células endoteliais, Lf=linfócitos,Pl=plasmócitos, Nt= neutrófilos, Mc=macrófagos
103
ANEXO 4
MMP-2Epitélio Conjuntivo Células
N. da Lâmina (-) (+) (++) Lbas (-) (+) (++) Fib End Lf Pl Nt Mc1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Lam. Basal= lâmina basal, Fib=fibroblastos, End=células endoteliais, Lf=linfócitos,Pl=plasmócitos, Nt= neutrófilos, Mc=macrófagos
104
ANEXO 5
MMP-9Epitélio Conjuntivo Células
N. da Lâmina (-) (+) (++) Lbas (-) (+) (++) Fib End Lf Pl Nt Mc1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Lam. Basal= lâmina basal, Fib=fibroblastos, End=células endoteliais, Lf=linfócitos,Pl=plasmócitos, Nt= neutrófilos, Mc=macrófagos