FRANCIELLI CRISTINE CUNHA MELO
DUPLA MARCAÇÃO p53/AgNOR EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Patologia Oral da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte como parte dos
requisitos para obtenção do título de MESTRE em
Patologia Oral.
Orientador: Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa
NATAL - RN
2004
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede Melo, Francielli Cristine Cunha. Dupla marcação p53/AgNOR em carcinoma epidermóide oral / Francielli Cristine Cunha Melo. – Natal, RN, 2004. 76 f.
Orientador: Antonio de Lisboa Lopes Costa. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-graduação em Patologia Oral.
1. Neoplasias bucais – Dissertação. 2. Carcinoma epidermóide – Dissertação. I. Costa, Antonio de Lisboa Lopes. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 616.314:616-006 (043.3)
Data da defesa: 17/02/2004.
Banca examinadora
Prof. Dr. Adriano Mota Loyola.
Prof. Dra. Roseana de Almeida Freitas.
Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa.
Avaliada com conceito A pela banca examinadora.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Lourival e Beni, responsáveis pela formação do meu caráter, pelo seu amor e
dedicação. Em especial à minha mãe, quem eu tanto amo e admiro, pela força e paixão com
que vive e luta diariamente pelo futuro dos filhos.
Ao meu amado irmão, Fernando, meu companheiro e amigo de toda a vida.
Ao meu esposo Anderson, que esteve ao meu lado em todos os momentos. Sem seu amor e
incentivo cada passo teria sido muito mais difícil. A você dedico meus sonhos, realizações e
todo o meu amor.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por guiar meus passos na realização deste trabalho.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, por sua dedicação e
compromisso na função de mestre e pesquisador. Obrigado por ser mais que um orientador,
pois sua amizade foi um incentivo a mais para que eu superasse as dificuldades no decorrer do
curso. Agradeço ainda pelo seu apoio quando da vinda a Natal e em minha estadia nesta
cidade.
Ao Prof. Dr. Adriano Mota Loyola, a quem eu devo a minha trajetória na patologia oral,
agradeço pelo incentivo constante, pelos ensinamentos durante a graduação e pelo interesse
em meu aprendizado mesmo à distância. Sua dedicação à ciência foi, com certeza, a
inspiração para minha opção pela vida acadêmica.
Aos professores do curso de odontologia da Universidade Federal de Uberlândia, pelos
conhecimentos transmitidos durante o curso de graduação. À Profa. Dra. Benvinda Rosalina
dos Santos, pela amizade sincera que mantemos desde a iniciação científica. Agradeço
também pelos conselhos e por me ensinar a ver a pesquisa como uma profissão. Ao Prof. Dr.
Cássio José Alves de Sousa, pelo carinho, amizade e incentivo durante minha vida estudantil
e profissional.
Agradeço às professoras do programa de pós-graduação: Dra. Roseana de Almeida Freitas e
Lélia Maria Guedes Queiroz pela amizade e disponibilidade em todos os momentos do
curso de pós-graduação, pelos ensinamentos e constante interesse em meu progresso. Ao
Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, Profa. Dra. Lélia Batista de Souza e Profa. Dra. Hébel
Cavalcanti Galvão pela convivência agradável e pelos ensinamentos transmitidos durante o
curso.
Ao Prof. Carlos Augusto por colocar à nossa disposição o equipamento fotográfico,
indispensável para a documentação das lâminas.
Aos amigos Sandra e Canindé pelo apoio técnico, amizade e pela dedicação na elaboração
da parte experimental deste trabalho. Em especial ao amigo Hévio pelos momentos de
descontração no laboratório de imuno-histoquímica.
À secretária Graça pelo carinho, bom humor e pelos serviços prestados durante o curso.
Ao amigo Floriano de Medeiros Neto pela impressão deste trabalho.
A toda minha família, avós, tios e primos, pelo carinho e incentivo para buscar os meus
sonhos. À minha tia Suely, pela grandiosidade do seu caráter, pela bondade e amor que dedica
a todos, obrigada por me ensinar e me apoiar em todos os momentos. Aos meus avós,
Durvalino e Belmira, obrigada por serem o meu “porto seguro”, pelo exemplo de vida,
dedicação e carinho aos filhos e netos. Aos tios Afrânio, Marcos e Silda, por estarem sempre
ao meu lado, nos momentos bons e ruins, e por terem contribuído de alguma maneira para
minha formação profissional. À Ana Carolina, pela amizade e cumplicidade de toda a vida.
Aos meus sogros, Roberto e Selma, por me acolherem como filha, pela ajuda e incentivo ao
ingresso e conclusão do curso de pós-graduação.
A Meg e Leleh, pela alegria que me proporcionaram dia após dia.
Aos amigos Márcia Bergamini e Wellington Junio pela consideração e amizade sincera,
pelos bons momentos que compartilhamos durante estes dois anos.
À Profa. e amiga Júlia Márcia por cuidar de minha saúde durante o último ano de curso.
Aos amigos de Uberlândia, Fernando, Neila, Janete e Letícia, pelo incentivo, apoio e
companheirismo nos momentos decisivos de minha vida.
Finalmente, aos colegas do curso de Pós-Graduação da UFRN, agradeço pela amizade e pela
boa convivência. À Éricka Janine por ser tão sincera e prestativa com todos à sua volta, à
Jamile Marinho pela autenticidade e cumplicidade de nossa amizade, à Leonardo Yure por
ser como um irmão, me ensinando a ser paciente e diplomática, à Tarsila por me inspirar
força e alegria, à Andréa por me ensinar a ser tolerante.
Aos colegas de doutorado, Márcio, Gustavo, Manoel, Rosilene, Márcia e Sormani, por me
acolher e incentivar a buscar o conhecimento. Em especial ao amigo Rivadávio, pela amizade
sincera e por compartilhar de meus momentos difíceis.
A todos os funcionários do Departamento de Odontologia pela atenção e amizade quando da
solicitação de seus serviços. Em especial a Andréa, Francisca e Ana (do Diagnóstico e
Cirurgia), Ossian, Maria Lúcia, Ailton, Maria das Graças e Cecília (da biblioteca setorial
de odontologia).
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte e a CAPES pelo incentivo financeiro para
realização deste trabalho.
“Um sonho começa a ser realidade quando homens e mulheres sonham
juntos, olham para além das limitações e ousam caminhar caminhos
novos, às vezes pedregosos, às vezes escorregadios, sempre
desafiantes. Não obstante, nenhuma dificuldade, nenhum obstáculo é
mais angustiante do que caminhar solitário... sem mãos que se tocam,
sem ombros que se apóiam, sem olhos que se olham.”
(Abraham Lincoln)
RESUMO
MELO, Francielli Cristine Cunha. Dupla marcação p53/AgNOR em carcinoma
epidermóide oral. 2004. 76 f. Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, 2004.
A utilização da técnica de dupla marcação imuno-histoquímica /histoquímica vem permitindo
a análise de dois parâmetros moleculares ao mesmo tempo em um mesmo tecido. Partindo
deste princípio, o objetivo deste estudo foi pesquisar em carcinoma epidermóide oral o
número médio de NORs/núcleo entre células p53 positivas e p53 negativas por intermédio da
dupla marcação imuno-histoquímica/histoquímica, bem como a correlação do número médio
de NORs/núcleo das células p53 positivas e negativas com os escores histológicos de
malignidade. Foram estudados 16 casos de carcinoma epidermóide, que foram classificados
de acordo com o sistema de gradação histológica de malignidade proposto por Bryne (1998).
A técnica de dupla marcação imuno-histoquímica/histoquímica foi utilizada para a realização
da contagem das NORs em células p53 positivas e negativas. Não houve diferença
estatisticamente significante entre o número médio de NORs/núcleo das células p53 positivas
e negativas. Também não houve correlação entre o número médio de NORs/núcleo das
células p53 positivas e negativas e os escores histológicos de malignidade. Concluímos,
então, que o fenótipo relacionado à expressão imuno-histoquímica do p53 não influi na média
de NORs/núcleo e esta média, tantos das células positivas quanto das negativas, não se
correlaciona com o grau de agressividade histológica do carcinoma epidermóide oral.
Palavras-chave: neoplasias bucais, carcinoma epidermóide.
ABSTRACT
MELO, Francielli Cristine Cunha. Double staining p53/AgNOR in oral squamous cell
carcinoma. 2004. 76 f. Master Thesis (Oral Pathology) – Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, Natal, RN, 2004.
The utilization of the immunohistochemical/histochemical double staining technique comes
permitting the analysis of two molecular parameters at the same time in an even tissue.
Starting from this, the objective of this study was to investigate the existence of differences
between the number of NORS/NUCLEUS between p53 positive and p53 negative cells, as
well as the existence of correlation between the medium of the NORs of the p53 positive and
negative cells and the histological scores of maligninancy in 16 cases of oral squamous cell
carcinoma. It was first classified in agreement with the histological grade system of
maligninancy proposed by Bryne (1998) and the double staining technique
immunohistochemistry/histochemistry was utilized for the achievement to quantify of the
NORs in p53 positive and negative cells. It had not significant differences between the
medium number of NORs of the p53 positive cells and of the p53 negative cells, and they
were not correlated with the histological scores of malignancy. We conclude that the related
phenotype to the p53 immunohistochemical expression did not influence the average of
NORS/NUCLEUS and this medium, in both positive and negative cells, is not correlated with
the degree of histological aggressivity of the oral squamous cell carcinoma.
Keywords: Oral neoplasm, squamous cell carcinoma.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FOTOGRAFIAS:
Fotografia 1 - Aspectos histopatológicos do carcinoma epidermóide oral (H&E – 200X). p.52
Fotografia 2 - Aspectos histopatológicos do carcinoma epidermóide oral (H&E – 400X). p.52
Fotografia 3 - Dupla marcação p53/AgNOR (imuno-histoquímica/histoquímica) em
carcinoma epidermóide oral (400X). p.53
Fotografia 4 - Dupla marcação p53/AgNOR (imuno-histoquímica/histoquímica) em
carcinoma epidermóide oral (imersão-1000X). p.53
GRÁFICOS:
Gráfico 1 - Histograma de distribuição do número de NORs/núcleo de células p53 positivas e
negativas. p.54
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Sistema de gradação histológica de malignidade de Bryne (1998). p.45
Tabela 2 - Dados clínicos referentes a gênero, idade e localização anatômica dos casos de
carcinoma epidermóide. p.55
Tabela 3 - Numero médio de NORs/núcleo de células p53 positivas, negativas e escores
histológicos de malignidade dos casos de carcinoma epidermóide. p.56
Tabela 4 - Teste “t” de Student da média de NORs/núcleo entre células p53 positivas e p53
negativas. p.57
Tabela 5 - Teste de correlação de Spearman entre a média de NORs/núcleo das células p53
positivas e os escores histológicos de malignidade. p.57
Tabela 6 - Teste de correlação de Spearman entre a média de NORs/núcleo das células p53
negativas e os escores histológicos de malignidade. p.57
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C: Graus Celsius.
17p: Porção cromossômica de localização do gene p53.
AgNOR: Do inglês “Argyrophilic Nucleolar Organizer Region”, nome dado à técnica de
impregnação das NORs pela prata.
Antígeno H: precursor químico imediato do antígeno sanguíneo A do grupo ABO.
B23: proteína associada às regiões organizadoras nucleolares.
BSA: Do inglês “Bovine Serum Albumine”, traduzido como albumina sérica bovina.
C23: proteína associada às regiões organizadoras nucleolares.
cm: refere-se a centímetros
CMV: abreviação para Citomegalovírus.
C-terminal: abreviação para carcoxi-terminal, corresponde às regiões das extremidades 5’ da
dupla fita de DNA (terminadas em COOH-).
DNA: Do inglês “Deoxyribonucleic Acid”, traduzido como ácido desoxirribonucléico.
G0: Do inglês “Gap”, traduzido como intervalo. G0 é o intervalo de latência no qual as
células se encontram fora do ciclo celular.
G1: Do inglês “Gap”, traduzido como intervalo. G1 é o intervalo pós-mitótico e pré-síntese de
DNA.
G2: Do inglês “Gap”, traduzido como intervalo. G2 é o intervalo pós-síntese do DNA e pré-
mitótico.
GMC: Iniciais do nome do Prof. Dr. Geraldo Maia Campos, refere-se ao software usado para
análises estatísticas.
H&E: Hematoxilina e Eosina.
h: refere-se à abreviatura de horas.
HPV: Do inglês “Human Papilloma Virus”, traduzido como papiloma vírus humano.
IgG: Refere-se à imunoglobulina do tipo G.
Kb: kilobases
KDa: Kilo daltons.
Ki-67: refere-se ao antígeno ou proteína nuclear Ki-67.
M: Período mitótico do ciclo celular.
Mdm2: do inglês “murine double minute-2”, refere-se ao gene ou proteína mdm2.
NORs: Do inglês “Nucleolar Organizer Regions”, traduzido como regiões organizadoras
nucleolares.
N-terminal: abreviação para amino-terminal, corresponde às regiões das extremidades 3’ da
dupla fita de DNA (terminadas em NH3-).
Pb: abreviação para pares de base nitrogenadas do DNA.
P53: Refere-se ao gene p53 ou à proteína p53.
PCNA: do inglês “proliferation cell nuclear antigen”, que significa antígeno nuclear de
proliferação celular; proteína nuclear presente no início da fase S.
P21: Refere-se à proteína p21 ou ao gene p21.
PCR-SSCP: Do inglês “Polimerase Chain Reaction – Single Strand Conformation
Polymorphism”, que significa reação em cadeia de polimerase – polimorfismo de
conformação de fita única; técnica de estudo do DNA.
pH: Potencial hidrogeniônico.
RNAm: Do inglês “Messenger Ribonucleic Acid”, traduzido como ácido ribonucléico
mensageiro.
S: Refere-se à fase do ciclo celular na qual ocorre a síntese do DNA.
SABC: Do inglês “Streptavidin-Biotin Complex”, traduzido como complexo streptoavidina-
biotina.
Tris: Tris-hidroxi-metil-aminometano.
TUNEL: do inglês “Terminal dUTP nick-end-labeling”, método usado para acessar as taxas
de apoptose de um tecido.
UV: abreviação para radiação ultravioleta.
W: Do inglês “watt”, refere-se à unidade elétrica de potência.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 19
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Carcinoma epidermóide oral: aspectos gerais. 23
2.2 Ciclo celular e proliferação. 26
2.3 P53 27
2.4 AgNOR 34
2.5 Dupla marcação imuno-histoquímica/histoquímica. 38
3 PROPOSIÇÃO 41
4 MATERIAL E MÉTODO
4.1 Seleção da amostra. 44
4.2 Análise morfológica. 44
4.3 Técnica de dupla marcação imuno-histoquímica/histoquímica. 45
4.4 Análise quantitativa das NORs. 47
4.5 Análise estatística. 48
5 RESULTADOS
5.1 Características clínicas e histopatológicas do carcinoma epidermóide oral. 50
5.2 Expressão imuno-histoquímica e histoquímica. 50
5.3 Dupla marcação p53/AgNOR. 50
5.4 Resultados estatísticos. 51
6 DISCUSSÃO 58
7 CONCLUSÕES 68
REFERÊNCIAS 70
INTRODUÇÃO
1 INTRODUÇÃO
O carcinoma epidermóide é a neoplasia mais comum em boca, perfazendo cerca de
90% do total de neoplasias malignas nesta região (COSTA et al., 2000). Este acomete, em sua
maioria, homens acima dos 50 anos. É uma lesão de comportamento biológico agressivo
devido à grande capacidade proliferativa e metastática, fato este que leva a uma rápida
progressão dos casos. Mais de 60% das pessoas acometidas apresentam-se com a doença em
estágio localmente ou regionalmente avançados e este fato contribui para o pobre prognóstico
desta lesão (GASCO; CROOK, 2003).
A avaliação de fatores tais como o tamanho do tumor e a presença de metástases
(através dos sistemas de estadiamento clínico) e de caracteres histológicos (através da
gradação histológica de malignidade) constituem as formas mais comumente utilizadas para
predizer a agressividade e o prognóstico desta neoplasia. Porém, sabe-se que muitos eventos
moleculares são importantes para o crescimento e dispersão dos tumores (BRYNE, 1998).
Neste contexto, a progressão tumoral ocorre provavelmente, devido a alterações genômicas
provocadas, principalmente, por mutações em genes relacionados à proliferação e morte
celulares (KUROPKAT et al., 2002).
As mutações do gene p53 constituem a alteração genética mais comum em diversas
neoplasias, incluindo o carcinoma epidermóide. A proteína p53, em seu estado selvagem, age
impedindo que alterações gênicas produto das mutações se propaguem, uma vez que realiza
uma parada do ciclo celular em G1 para que haja reparo do dano do DNA ou morte por
apoptose. Portanto, qualquer tipo de alteração na estrutura do p53 pode permitir o surgimento
de células com maior capacidade proliferativa (LÓPEZ-MARTÍNEZ et al., 2002).
Durante o ciclo celular também é observada uma variação do número de NORs
(Regiões Organizadoras Nucleolares) devido à agregação e dispersão do material genético
durante as diferentes fases do ciclo. Estas regiões são sítios de ligação de proteínas que se
coram facilmente pela prata (técnica do AgNOR) permitindo seu estudo morfológico e
quantitativo. Vem sendo observado que sua quantidade encontra-se aumentada em células
malignas (SAMPAIO et al., 1999).
Diante disso, o presente trabalho se propõe pesquisar, por intermédio da dupla
marcação imuno-histoquímica/histoquímica em carcinoma epidermóide oral, o número médio
de NORs/núcleo entre células p53 positivas e p53 negativas, bem como a existência de
correlação do número médio de NORs/núcleo das células p53 positivas e negativas com os
escores histológicos de malignidade.
REVISÃO DA LITERATURA
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Carcinoma Epidermóide Oral: Aspectos gerais.
O câncer oral possui uma distribuição geográfica variável nas diferentes regiões do
mundo. Em países da Ásia, o mesmo é responsável por 40% de todos os tumores malignos.
Esta alta incidência em regiões orientais associa-se principalmente à grande utilização do
fumo mascado, que contém, além do tabaco (Nicotiana tabacum), as folhas do bétele (Piper
chavica betel) e frutos da areca (Areca catechu), plantas típicas da Índia portadoras de
potentes carcinógenos (KUTTAN et al., 1995).
Na maioria dos países ocidentais este índice varia de 3% a 5% das neoplasias
malignas, estando entre os 10 tipos mais comuns de câncer. O Brasil reporta uma das mais
altas taxas da América do Sul, abrangendo de 3,4 (a cada 100.000 habitantes/ano) em Goiânia
até 5.5 em Belém. Em mulheres, as taxas também são altas em comparação com o restante da
América do Sul, perfazendo nestas 1,4 e 2,0 (a cada 100.000 habitantes/ano) respectivamente
nas mesmas cidades (MOORE et al., 2000).
Nas últimas décadas um aumento significativo da incidência do câncer oral e da
mortalidade por este tem sido observado na Europa, principalmente em homens jovens do
leste e centro europeus. O aumento desta incidência em pessoas jovens tem sido atribuído ao
aumento do consumo de álcool e tabaco, à diminuição no consumo de frutas e vegetais e ao
uso do tabaco mascado (MACKENZIE et al., 2000). Neste contexto, a Organização Mundial
de Saúde prevê um contínuo aumento pelo mundo da incidência desta neoplasia
(BETTENDORF; PIFFKÒ; BÀNKFALVI, 2004).
O prognóstico e a sobrevida não diferem para pacientes jovens e idosos, porém
observa-se diferentes comportamentos biológicos para o câncer oral nestas duas faixas etárias.
O curto tempo de exposição a carcinógenos e a ausência de lesões pré-cancerizáveis em
jovens, sugere que diferenças moleculares provavelmente influam na etiologia e patogênese
(REGEZI et al., 1999). Além disso, existe uma prevalência ligeiramente maior em indivíduos
com familiares que tiveram tumores malignos de cabeça e pescoço, sugerindo uma
contribuição de fatores hereditários para esses tumores (COOPER et al., 1995).
Evidencia-se ainda o envolvimento de múltiplos fatores de risco exógenos no
desenvolvimento dos carcinomas epidermóides orais. O uso de fumo e o abuso do álcool são
os fatores etiológicos de maior expressão. Ultimamente vêm se dando grande atenção aos
fatores dietéticos e nutricionais. Além destes, a exposição intensa à radiação solar UV e certas
infecções virais também constituem fatores de risco importantes (MACKENZIE et al., 2000).
O efeito das radiações solares UV na etiologia do carcinoma epidermóide de lábio
inferior, principalmente a radiação do tipo UVB, é evidenciado pela maior incidência dessa
lesão em pessoas de pele clara, mais sensíveis à luz solar (DE ROSA et al., 1999).
Quanto à etiologia viral, a participação do papiloma vírus humano ainda não está bem
esclarecida, mas acredita-se que desempenhe função importante no processo de carcinogênese
(MILLER; WHITE, 1996).
Dietas que incluem frutas e vegetais frescos, ricos em betacaroteno, vitamina C e
vitamina E, tem sido associadas com um reduzido risco de câncer na cavidade oral e faringe
(CANTO; DEVESA, 2002).
Os diversos sistemas de gradação histológica de malignidade se propõem a realizar
uma análise das características dos tumores que possam estar relacionadas com seu
comportamento biológico, para que possamos prever possíveis metástases e recorrências ou
mesmo para que o tratamento adequado seja realizado (BRYNE, et al., 1989).
Desde a proposição do sistema de gradação microscópica de tumores de Broders
(1941), Anneroth, Batsakis e Luna (1987) e diversos autores vêm buscando um sistema de
gradação ideal, que reflita a agressividade dos tumores de forma individualizada.
Anneroth, Batsakis e Luna (1987) apresentaram um sistema de gradação que propõe a
avaliação de 6 parâmetros morfológicos, 3 referentes à população celular (através do grau de
ceratinização, pleomorfismo nuclear e número de mitoses) e 3 referentes à relação tumor-
hospedeiro (através do padrão de invasão, estágio de invasão e infiltrado linfoplasmocitário).
Bryne et al. (1989) realizaram a gradação de Anneroth, Batsakis e Luna (1987), nas
margens de invasão de 68 tumores para verificar a importância desta área na determinação do
comportamento clínico do carcinoma epidermóide oral. O parâmetro “estágio de invasão” foi
excluído desta análise por causa da quantidade inadequada de tecido em muitas biópsias.
Obteve-se uma relação significativa com o prognóstico (p<0.05), enquanto o sistema de
Broders (também realizado como fator de comparação) não obteve valor prognóstico,
confirmando assim, a relevância das características das margens de invasão na determinação
do prognóstico.
Um problema verificado nos sistemas de gradação era a concordância não muito alta
entre os observadores na avaliação dos parâmetros. Para avaliar esta reprodutibilidade dos
escores histológicos de malignidade, Bryne et al. (1991) realizaram a comparação entre dois
sistemas de gradação histológica, Anneroth, Batsakis e Luna (1987) e Bryne et al. (1989). Os
referidos autores observaram que a concordância entre os avaliadores para os dois sistemas de
gradação histológica não foi melhor do que para a classificação clínica TNM (70 a 80% de
concordância).
Em 1992, Bryne et al. observaram que a exclusão do parâmetro “número de mitoses”
não afetou a correlação entre a gradação de malignidade utilizada (BRYNE et al., 1989) e o
prognóstico, porém foi notado um aumento na concordância dos escores entre os
observadores. Os autores sugeriram, então, que a contagem de mitoses seja excluída do
sistema de gradação, pois a validade do índice mitótico como marcador de prognóstico é
controversa devido à heterogeneidade dos tumores, a variação entre observadores, variação na
potência de diferentes microscópios e porque o tamanho celular não é levado em
consideração. Além disso, este método de avaliação consome muito tempo e outras medidas
da fase S do ciclo celular seriam mais válidas para a estimativa da atividade proliferativa.
Diversos fatores relacionados à progressão tumoral vêm sendo observados na margem,
ou “front” de invasão, apontando esta região como a mais importante área para determinação
do prognóstico (BRYNE et al., 1992). Partindo deste princípio, Bryne (1998) propôs uma
simplificação do sistema de Anneroth, Batsakis e Luna (1987) através da análise
semiquantitativa de apenas 4 características morfológicas: grau de ceratinização,
pleomorfismo nuclear, padrão de invasão e resposta inflamatória na região do “front”
invasivo. Segundo o autor, todos os estudos que utilizaram este sistema na Noruega, provaram
seu alto valor prognóstico. Porém, diferenças no valor prognóstico podem ser dependentes do
sítio, estágio e observador, além do tamanho da biópsia poder influir na análise, devido à
necessidade de avaliação das margens do tumor.
2.2 Ciclo celular e proliferação
O ciclo celular obedece a uma seqüência de quatro fases, sendo elas G1, S, G2 (fases
correspondentes à interfase) e M (divisão mitótica propriamente dita). A interfase caracteriza-
se por mudanças bioquímicas do DNA necessárias à proliferação celular. Quando a célula não
se encontra em nenhuma dessas fases, dizemos que ela está em G0, que corresponde a um
período com ausência de atividade proliferativa, podendo, de acordo com o estímulo recebido,
retornar à fase proliferativa (RABENHORST; BURINI; SCHMITT, 1993).
A observação da fase M por microscopia de luz foi por muito tempo utilizado para
avaliação da proliferação celular. Porém não foi observada uma boa reprodutibilidade para
este método, além de demandar muito tempo e necessitar de fragmentos teciduais maiores
para uma boa avaliação (BRYNE et al., 1992).
Múltiplos fatores interagem para determinar a proliferação celular de um tumor, dentre
eles as anomalias dos genes reguladores da proliferação celular. Estas são freqüentes em
carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço e podem estar significativamente associadas com
o curso clínico e resposta ao tratamento (KUROPKAT et al., 2002).
Diante disso, várias técnicas podem ser utilizadas no estudo da proliferação e ciclo
celular. Uma das mais utilizadas é a técnica do AgNOR, que consiste na detecção de proteínas
associadas à atividade das regiões organizadores do nucléolo através da impregnação destas
pela prata coloidal. A sua realização não demandando muito tempo ou recursos, sendo por
isso uma forma simples de estudo (TEIXEIRA et al., 1996).
Uma outra maneira de se estudar a proliferação celular é através da Citometria de
fluxo, que gera um histograma do DNA, permitindo a obtenção de índices proliferativos
relacionados ao DNA e à fase S. Kahn et al. (1993) estudaram comparativamente a Citometria
de fluxo e a técnica do AgNOR em lesões pré-malígnas orais e concluíram que o índice de
proliferação do DNA na citometria se correlaciona positivamente com a média das NORs.
Uma outra técnica que também pode ser utilizada para avaliação da proliferação
celular, a imuno-histoquímica, facilitou o estudo de diversas lesões proliferativas, como as
neoplasias. Diversas proteínas ou antígenos nucleares expressos em células proliferativas
passaram a ser identificados bem como seus respectivos anticorpos reconhecedores. Alguns
destes compreendem enzimas e cofatores, como o PCNA e a DNA polimerase α e o Ki-67
(KREIPE et al., 1995).
Schliephake (2003) revisou a literatura dos últimos 5 anos em relação a marcadores de
proliferação celulares relacionados a carcinogênese, dentre outros marcadores. Os mais
freqüentemente estudados foram, em ordem decrescente, as ciclinas, Ki-67, c-cerbBl-4 (EGF-
R), PCNA, bcl-2/BAG-1, telomerase, AgNOR, HSP27 e 70 e skp2. Eles verificaram que há
uma dificuldade se interpretar independentemente os marcadores de proliferação celular para
o julgamento do prognóstico e que o AgNOR tem sido confirmado como um relevante
marcador de prognóstico em uma quantidade maior de trabalhos que o PCNA ou o Ki-67.
O controle das fases do ciclo celular, como o controle de G1 pelo p53 e p21, também
vem sendo alvo de pesquisas para elucidação do comportamento biológico de tumores no que
diz respeito ao fenótipo proliferativo das células tumorais (PIETILAINEN et al., 1995).
2.3 P53
O evento crucial na transformação de células pré-malígnas em malignas é a inativação
de reguladores celulares negativos, também chamados genes supressores tumorais, os quais
são importantes para a manutenção da homeostase e prevenção do desenvolvimento do câncer
(BETTENDORF; PIFFKÒ; BÀNKFALVI, 2004; RAMALHO et al., 2002).
Um desses genes, o p53, está localizado na banda 13 do braço curto do cromossomo
17, e consta de 10 introns e 11 exons, sendo o primeiro destes não codificante. Este gene é
traduzido em uma fosfoproteína nuclear de 53 KDa e 393 aminoácidos. Existem cinco regiões
do gene p53 que permanecem inalteradas no decorrer da evolução das espécies, as chamadas
regiões altamente conservadas I (13-19 pb), II (120-143 pb), III (172-182 pb), IV (238-259
pb) e V (271-290 pb), que correspondem aos códons hot-spot localizados nos resíduos de
aminoácidos 175, 245, 248, 249 e 273. Estas são necessárias para preservar alguma estrutura
ou função particular da proteína p53 (LÓPEZ-MARTÍNEZ et al., 2002; ROBBINS, 1996).
Esta proteína possui três domínios funcionais distintos, sendo estes: (1) o domínio N-
terminal, formado por 75 resíduos de aminoácidos que contém a região de ativação
transcricional do gene, (2) a região central com domínios de ligação ao DNA e (3) o domínio
C-terminal que contém, dentre outros, os sítios de reconhecimento de dano ao DNA
(ROBBINS, 1996). A p53 forma um complexo, existindo usualmente na forma tetramérica,
com conformação espacial dimérica e a região central parece ser essencial para esta ligação
específica de dupla ancoragem (BRISTOW; BENCHIMOL; HILL, 1996).
A p53 selvagem ou normal está normalmente expressa em baixos níveis nas células
normais (LEUNG; PEDLAR; HIGH, 1996), sendo difícil sua detecção. Isso ocorre devido à
sua curta meia vida, de cerca de 20 minutos (KUSAMA et al., 1996). Ela é responsável por
regular negativamente os eventos bioquímicos relacionados ao ciclo celular, e positivamente a
resposta ao dano do DNA, agindo como um fator de transcrição (PIETILAINEN et al., 1995).
A proteína p53 participa ainda do desenvolvimento e diferenciação dos tecidos.
Estudos com ratos provaram que a deficiência de p53 selvagem gerava a morte de embriões e
anormalidades no desenvolvimento destes. Sabe-se ainda que a interferência na função
normal da p53 inibe a diferenciação muscular e hematopoiética em ratos, e que a restituição
de sua funcionalidade restaura a habilidade das células de se diferenciarem (MOLL;
SCHRAMM, 1998).
Nas células epiteliais, a expressão da p53 está relacionada intimamente com a
senescência celular, pois durante o processo de maturação dos ceratinócitos, ocorre a
diminuição dos níveis de p53, até a morte destes por acúmulo de ceratina na superfície,
levando a indícios de apoptose na célula epitelial superficial (WHYTE; BROTON;
SHILLITOE, 2002).
Já em situações de estresse celular, ocorre o início da produção e modulação da p53
selvagem causada por acúmulo de citocinas, hipóxia e alterações no estoque de
ribonucleotídeos (LINKE et al., 1996). Outros fatores como certos danos ao DNA, ativação de
oncogenes ou replicação viral, promovem um aumento na expressão do gene p53 e
conseqüentemente o acúmulo da proteína p53 selvagem no núcleo. Acredita-se que três vias
independentes, ainda desconhecidas, através de enzimas fosforilativas possam estar
relacionadas à ativação da tradução da p53 (GASCO; CROOK, 2003)
O aumento de sua expressão, ou mesmo a queda na sua degradação ocorrem porque a
função primordial da p53 é promover a parada do ciclo celular na fase G1, permitindo que a
célula repare possíveis danos sofridos pelo seu DNA, evitando a expressão de fenótipos
indesejáveis (ALMEIDA et al., 1999; KERDPON; RICH; READE, 1997). Se houver falha
neste reparo, a proteína p53 participa da indução do processo de apoptose. Em condições
fisiológicas, a apoptose assegura que a real proporção e constituição dos tecidos não
ultrapassem os limites ditados pelas necessidades do organismo (RAMALHO et al., 2002).
Em processos patológicos, ela impede que as células lesadas repliquem-se e perpetuem
populações com mutações incorporadas ao seu genoma sendo que alguns mecanismos podem
estar envolvidos no desencadeamento deste processo (RAVI et al., 1999).
A repressão da transcrição de fatores essenciais à sobrevivência da célula (MOLL;
SCHRAMM, 1998), a ativação de genes promotores da apoptose ou a diminuição dos níveis
da proteína bcl-2, que leva à geração de radicais livres de oxigênio podem também estar
relacionados ao processo de morte celular programada (BRISTOW; BENCHIMOL; HILL,
1996).
A proteína p53 selvagem pode estar envolvida também na parada ou checkpoint em
G2 como resposta à radiação, pois se verifica geralmente uma diminuição do tempo de parada
em G2 naquelas células com função da proteína selvagem deficiente. Estas células perderiam
então o controle dos eventos do ciclo celular que ocorrem durante a fase G2 (WANG;
PRIVES, 1995).
Os genes supressores tumorais, agem geralmente de forma recessiva, sendo que ambas
as cópias do gene devem ser inativadas para a manifestação de alterações (PARTRIDGE et
al., 1999). Deste modo, a forma mais comum de perda da funcionalidade do p53 é a mutação
de ponto em um alelo e deleção do outro (LÓPEZ-MARTÍNEZ et al., 2002). Estas alterações
aumentam a instabilidade genética, além de facilitar a amplificação gênica e,
conseqüentemente, as mudanças na ploidia (DOWELL; HALL, 1995). Porém, uma
esporádica mutação de ponto pode ocorrer em um dos dois alelos do gene p53, resultando na
expressão de uma proteína mutada que se liga ou seqüestra a proteína selvagem co-expressa,
levando a um efeito do tipo “dominante negativo” (BRISTOW; BENCHIMOL; HILL, 1996).
Um estudo recente mostrou que as mutações ocorrem preferencialmente no domínio
central que contém a seqüência específica da atividade de ligação ao DNA da proteína p53,
resultando em perda da atividade de ligação ao DNA (YAMAZAKI et al., 2003). Devido a
este fato, certas proteínas mutadas podem preservar a habilidade de reconhecer sítios de dano
ao DNA via extremidade C-terminal e o aumento dos níveis destas poderiam levar a um
“ganho de função” da atividade reparadora do DNA (BRISTOW; BENCHIMOL; HILL,
1996).
As mutações do gene p53 constituem a alteração genética mais comum das neoplasias
malignas, ocorrendo em aproximadamente 50% dos tumores diagnosticados. Em carcinoma
epidermóide oral mais de 80% dos tumores em média possuem mutações no p53, sugerindo
que a perda da função normal do p53 é um passo comum e essencial na carcinogênese deste
sítio (CRUZ et al., 1998). Cerca de 90% das mutações estão localizadas nos exons 5, 6, 7 e 8
do gene, e 20 a 30% dessas se localizam nos seus códons hot-spot citados anteriormente
(GASCO; CROOK, 2003; LÓPEZ-MARTÍNEZ et al., 2002; TRIVEDY et al., 1998).
Parecem existir duas grandes classes de conformação para as proteínas p53 mutadas:
aquelas chamadas mutantes “de contato” que são incapazes de se ligar especificamente às
bases do DNA devido a substituições de resíduos de aminoácidos e outras denominadas
mutantes estruturais, as quais perdem a habilidade de ligação ao DNA através da aquisição de
uma conformação protéica anormal (BRISTOW; BENCHIMOL; HILL, 1996). A perda destas
propriedades possivelmente resulta na falta ou diminuição da habilidade de regular
especificamente as proteínas controladoras do ciclo celular (YAMAZAKI et al., 2003).
Tem sido verificado que as alterações causadas por determinados promotores da
carcinogênese são geralmente constantes, gerando as chamadas “mutações assinatura”
(MOLL; SCHRAMM, 1998). As mutações do p53 em tumores relacionados ao hábito do
fumo ocorrem preferencialmente nos nucleotídeos guanina e acredita-se que a substância
benzopireno, derivada da queima do cigarro, induza tal substituição (KUTTAN et al., 1995).
Mineta et al. (1997) estudaram as mutações no p53 através de PCR-SSCP em
carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço e encontraram todas as mutações ocorrendo na
forma de simples substituições de nucleotídeos, que ocorreram nos exons 5, 6 e 8. Este estudo
confirmou o predomínio da mutação por transição G-A para esta região.
Outros mecanismos de inativação ou regulação incluem a ligação do p53 a proteínas
de vírus tumorigênicos, como a proteína E6 do papiloma vírus tipo 16 e 18 que, por exemplo,
em cânceres genito-anais HPV-positivos formam um complexo com a proteína p53,
resultando na rápida degradação desta (MOLL; SCHRAMM, 1998).
A inativação do p53 pode aumentar a fração de células proliferativas e a probabilidade
de sua transformação neoplásica por inibição da morte por apoptose (WHYTE; BROTON;
SHILLITOE, 2002), bem como promover a manifestação das alterações do DNA em ciclos
celulares subseqüentes (MINETA et al., 1997). Mutações no gene p53 resultam em síntese de
proteína p53 anormal, levando à sua estabilização e acumulação no núcleo o que facilita sua
detecção por métodos imuno-histoquímicos (PIETILAINEN et al., 1995).
A superexpressão da p53 sem mutações aparentes e a presença de mutações sem a
detecção imuno-histoquímica da proteína vêm sendo observados (BONGERS et al., 1995). A
positividade imuno-histoquímica para o acúmulo de p53 nem sempre prediz a expressão da
proteína mutada, pois podem existir mecanismos não mutacionais para o acúmulo da p53,
levando à detecção da proteína funcional. Além disso, a proteína selvagem pode assumir uma
conformação do tipo mutante em alguns tipos celulares sob certas condições de crescimento,
diferenciação ou oxidação (BRISTOW; BENCHIMOL; HILL, 1996).
A presença de proteínas p53 aberrantes pode não ser detectada por imuno-
histoquímica quando resulta: (1) de mutações não-senso ou de frameshift (troca de armação)
no DNA, (2) de transcrição incorreta do RNA a partir do p53, (3) de interações entre a
proteína p53 e proteínas virais que degradem a proteína selvagem e, (4) de rearranjo estrutural
do gene p53. Como resultado, o valor da detecção imuno-histoquímica para a proteína p53
mutada pode ser bastante baixo, dependendo do tipo celular, da natureza das proteínas
mutadas e das interações proteína-proteína (BRISTOW; BENCHIMOL; HILL, 1996).
Alguns estudos vêm obtendo uma correlação positiva entre os resultados imuno-
histoquímicos e a real presença de mutações. Ravi et al. (1999) obtiveram uma alta correlação
(p=0.00001) entre o acúmulo da proteína p53 detectada por marcação imuno-histoquímica e a
detecção do mutante p53 pelo método ELISA. Esta concordância também foi notada por
Trivedy et al. (1998) que compararam os métodos imuno-histoquímicos e PCR-SSCP em
casos de fibrose submucosa e carcinoma epidermóide oral.
Apesar dessas controvérsias, a proteína p53 vem sendo amplamente estudada como
um fator que possivelmente prevê a transformação maligna epitelial ou mesmo o prognóstico
de lesões malignas. Em câncer de mama, Pietilainen et al. (1995) observaram que a
superexpressão do p53 correlacionou-se com a proliferação celular e o processo de apoptose
esteve também ativado em grande parte de núcleos p53 positivos.
Nagler et al. (2002) pesquisaram a relação entre a expressão imuno-histoquímica do
p53, o índice de apoptose através do método TÚNEL e o prognóstico de carcinomas
epidermóides de língua. Mais de 60% dos casos foram positivos para o TÚNEL e para o p53.
A prevalência do p53 e do TUNEL tiveram grande correlação com o prognóstico e sobrevida
de pacientes com a doença em estágio II.
Coleta et al. (2001) observaram, em dois casos de carcinoma basalóide oral, a
expressão imuno-histoquímica do PCNA, p53, MMP e a contagem das AgNOR isoladamente,
como possíveis influenciadores no potencial proliferativo e invasivo desta lesão. O PCNA, o
p53 e o AgNOR estiveram aumentados nestes tumores em relação ao controle utilizado
(carcinoma epidermóide), indicando uma grande atividade proliferativa das duas lesões.
Apesar da alta expressão imuno-histoquímica do p53 e sua correlação com a expressão do
PCNA, não foi observada correlação entre ela e o número de AgNORs por núcleo em casa
lesão.
Cruz et al. (1998) estudaram a imunolocalização do p53 nas diversas camadas
epiteliais da mucosa oral e verificaram que esta expressão estava restrita à camada basal em
lesões sem potencial maligno, tais como a mucosa oral de indivíduos saudáveis e lesões
benignas. Em contraste, a expressão suprabasal do p53 foi detectada apenas em lesões pré-
malígnas, o que poderia refletir a presença da proteína mutante. Não houve associação
significativa entre esta expressão e o grau histológico de displasia epitelial. Porém, quando a
presença de marcação suprabasal de p53 foi combinada à presença de displasia moderada ou
severa, foi notada uma alta sensibilidade para a detecção de casos em progressão.
A interferência na função normal da p53 vêm mostrando grande influência no
tratamento de pacientes oncológicos, visto que a perda funcional da apoptose torna as células
malignas mais resistentes à quimioterapia e radioterapia (XIE et al., 1999). Teman et al.
(2000) encontraram uma relação entre a resposta ao tratamento quimioterápico e as mutações
no p53 em carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço. Pacientes que exibiram mutações “de
contato” no gene p53 apresentaram uma baixa resposta à platina e ao fluorouracil, fato que
leva a um pobre prognóstico para estes. Koelbl et al. (2001) não obtiveram correlação entre a
expressão do p53 e as variáveis sobrevida, controle local e regressão do tumor após o
tratamento radioterápico em carcinoma epidermóide oral.
Uma correlação positiva entre a expressão da p53 e o prognóstico, através de escores
histológicos de malignidade, foi obtida por Araújo et al. (1997). A positividade para a
proteína foi encontrada principalmente em carcinomas epidermóides orais de alto grau de
malignidade, mostrando que a superexpressão do p53 é um bom indicador para prognósticos
pobres nesta lesão. Porém, apenas os parâmetros da gradação relativos à população tumoral
(grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear e número de mitoses) se correlacionaram com a
expressão do p53.
Ainda em relação ao prognóstico, Khademi et al. (2002) realizaram uma pesquisa da
correlação entre a expressão imuno-histoquímica da proteína p53 e marcadores de prognóstico
em carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço. A expressão do p53 não se relacionou com a
gradação histológica do tumor, porém foi notada uma associação entre essa expressão e o
envolvimento de linfonodos, indicando uma possível contribuição deste gene na progressão
dos tumores de cabeça e pescoço e metástases.
Leung, Pedlar e High (1996) notaram uma redução gradual desta expressão em
carcinoma epidermóide oral após muitas recorrências seqüenciais quando eram comparados
os tumores da amostra entre si. Porém o padrão e extensão da marcação foram similares para
a maioria dos casos quando eram analisados o tumor primário e recorrências de cada caso
individualmente. Foi sugerido, então, que as recorrências e o tumor primário possuíssem a
mesma origem celular e que uma forte expressão inicial de p53 poderia ser um indicador
desfavorável ao prognóstico.
Kuropkat et al. (2002) não encontraram nenhuma correlação entre a expressão do p53
e o curso clínico, sobrevida total ou tempo de recorrência do carcinoma epidermóide de boca
e orofaringe. A presença de mutações no p53 também não esteve correlacionada com estas
variáveis. O mais interessante é que a expressão da proteína não se correlacionou com a
presença de mutações do respectivo gene, indicando que outro mecanismo, ao lado das
mutações, comumente possa anular a função do p53.
2.4 AgNOR
As regiões organizadoras nucleolares (NORs) são alças de DNA ribossômico
presentes nos braços curtos dos cromossomos acrocêntricos, 13, 14, 15, 21 e 22. Estas contêm
genes que codificam para a produção de duas subunidades do RNA ribossômico, 18S e 28S,
de vital importância para a síntese de proteínas (GRAY et al., 1995; MONTOYA et al., 2002;
NAKAMURA et al., 2004; TEIXEIRA et al., 1996).
Foram identificadas pelo menos 200 proteínas que utilizam as NORs como sítios de
ligação (PIFFKÒ et al., 1997). Dentre estas, destacam-se um grupo de proteínas acídicas não
histônicas: a RNA polimerase I, a B23 (numatrina) e a C23 ou nucleolina (DERENZINI et al.,
1995).
Estas proteínas acídicas associadas as NORs podem ser facilmente analisadas através
da técnica de impregnação pela prata (LO MUZIO et al., 1997; TEIXEIRA et al., 1996)
devido à reatividade dos seus grupos sulfídricos e carboxílicos que precipitam os íons de prata
(WARNAKULASURIYA; JOHNSON, 1993). Os grânulos marcados por prata são
visualizados como estruturas arredondadas de número variável, coradas em preto ou marrom
no interior dos núcleos (FREITAS; ARAÚJO; ARAÚJO, 1992). A técnica foi denominada
AgNOR por Howell e Black em 1980.
No núcleo em interfase, as NORs estão localizadas nos centros fibrilares do nucléolo.
De acordo com sua morfologia, o nucléolo pode ser dividido em dois tipos: o primeiro tipo é
bem delineado, totalmente denso e com um esboço regular, enquanto os outros são menos
densos e de formato irregular. Este último tipo pode aparecer na telófase e seu número
máximo corresponde ao número de NORs do cariótipo, isto é, apenas 10 NORs, sendo
raramente alcançado em células altamente diferenciadas (ANASTASSOVA-KRISTEVA,
1977; SMITH; MURRAY; CROCKER, 1993). Porém, a existência de AgNORs extra-
nucleolares é bem conhecida, consistindo numa evidência das mudanças na atividade celular e
não artefatos da técnica (SCHWINT, et al. 1994).
O número de NORs/núcleo varia dependendo da ploidia, da atividade transcricional e
do estágio do ciclo celular (WARNAKULASURIYA; JOHNSON, 1993) e a impregnação
pela prata marca esta atividade transcricional das NORs (SCHWINT et al., 1993). Tem sido
sugerido então que os escores para AgNORs podem ser utilizados como marcadores de
proliferação e que o nível de atividade proliferativa, possivelmente refletindo a duração do
ciclo celular, pode ser usado para se distinguir o tecido normal, do reativo e do neoplásico
(GRAY et al., 1995). A associação do AgNOR com marcadores imuno-histoquímicos de
antígenos presentes durante o ciclo celular confirmou a correlação entre ele e a atividade
proliferativa (XIE et al., 1997).
Um total de 10 pequenas NORs pode estar presente após a mitose e, em geral, apenas
uma grande NOR pode ser vista do final de G1 até G2 por causa de sua confluência (YUE;
IWAI; FURUTA, 1999). Portanto, o número de NORs aumenta do início da fase G1 do ciclo
celular até as fases S/G2. Este número, em qualquer estágio determinado do ciclo celular,
parece ser inversamente proporcional ao tempo de duração deste (XIE et al., 1997). Por
exemplo, uma população tumoral em rápida divisão mostra uma grande porcentagem de
células em estágios G1 (antes da união das NORs individuais) possuindo portanto, grande
quantidade de NORs por núcleo (LO MUZIO et al., 1997; SCHWINT et al., 1994).
Alterações nas NORs são observadas precocemente, quando há exposição do tecido a
agentes danosos. Schwint et al. (1993) avaliaram as alterações nas NORs em um modelo
experimental de irradiação do epitélio escamoso, conhecido por levar a mudanças marcantes
da atividade celular. As mudanças observadas no padrão das NORs suportaram a associação
entre este padrão e as atividades celulares ligadas à diferenciação nas camadas epiteliais. Foi
sugerido ainda que as NORs podem ser úteis como marcadores quantitativos de alterações
celulares incipientes antes que as mudanças histológicas possam ser detectadas.
Em mucosa saudável, as NORs constituem um importante parâmetro para avaliar a
resposta epitelial a determinados agentes carcinogênicos, tal como a influência do fumo na
proliferação celular, observada por Sampaio et al. (1999) em um estudo com AgNORs em
amostras de citologia esfoliativa em mucosa jugal de pacientes fumantes e não fumantes. O
número de NORs/núcleo foi maior em células da mucosa oral de fumantes, o que indica um
aumento da atividade proliferativa destas células devido ao hábito do fumo.
As variações encontradas para o AgNOR podem ainda estar refletindo uma resposta
epitelial não necessariamente ligada à transformação maligna. Fatores hormonais e infecções
virais podem também afetar o número de NORs (MONTOYA et al., 2002). Entretanto, a
elevação na taxa de proliferação de um tecido iniciado é a alteração base nos primeiros
estágios da promoção tumoral, que caracteriza as lesões pré-cancerizáveis (SCHWINT et al.,
1994)
Chattopadhyay, Ray e Caplan (2002) conseguiram identificar através da contagem do
número de NORs/núcleo uma diferença numérica de 0.48 entre leucoplasias displásicas e não
displásicas, tendo seu método portanto um poder de distinção destas lesões em torno de 90%.
O número de NORs/núcleo também diferiu significativamente quando foram
comparados casos de displasia epitelial leve e moderada com casos de carcinoma epidermóide
oral no estudo de Montoya et al. (2002). Estes autores verificaram uma maior porcentagem de
marcação para o Ki-67, bem como um aumento no número de NORs em casos de carcinoma,
sinalizando possivelmente um pior prognóstico para estas lesões.
O número médio das NORs encontra-se freqüentemente aumentado em tumores
malignos, exibindo ainda pequeno tamanho, espalhados e de formato irregular. Em neoplasias
benígnas, observa-se pequeno número de AgNORs por núcleo, de tamanho grande,
distribuição agrupada e formato arredondado (FREITAS; ARAÚJO; ARAÚJO, 1992; KAHN
et al., 1993; SAMPAIO et al., 1999; WARNAKULASURIYA; JOHNSON, 1993).
Além disso, o número de NORs serve como indicador histológico da síntese de
proteínas para a detecção de graus histológicos de malignidade em vários órgãos. Migaldi et
al. (1998) pesquisaram a expressão de diversos marcadores de proliferação celular, p120, Ki-
67, PCNA e AgNOR, em carcinoma epidermóide oral e concluíram que apenas a média das
áreas das NORs foi capaz de distinguir lesões de grau I das lesões de grau II.
Em muitos tumores malignos a expressão das AgNORs é um dos melhores parâmetros
indicadores do prognóstico para estas lesões (NAKAMURA et al., 2004).Em carcinoma
epidermóide de língua e assoalho bucal, Teixeira et al. (1996) observaram que a expressão do
AgNOR constitui um bom meio de se predizer o intervalo livre de recorrência e o
prognóstico, sendo um método satisfatório para a seleção de grupos de pacientes com alto
risco, que podem se beneficiar de um tratamento mais agressivo.
A contagem de NORs correlacionou-se significativamente com o prognóstico do
carcinoma de língua, segundo Yue; Iwai e Furuta (1999). Altas médias de NORs se
correlacionaram ainda com recorrência local, metástases cervicais após o tratamento cirúrgico
e com a marcação imuno-histoquímica do PCNA. Não foi observada correlação entre a
contagem de NORs, a idade do paciente e a localização lingual. Porém, o número de NORs
foi significativamente diferente entre os grupos T1 e T4 (p=0.009), maior nos grupos N1 e N2
em relação ao grupo N0 (p=0.0003 e p=0.0019, respectivamente) e maior também no grau
histológico III em comparação com os graus I e II (p<0.05).
Uma correlação positiva entre o número de NORs e o prognóstico também pode ser
verificada para outras lesões orais. Em carcinoma adenóide cístico, foi verificada uma
correlação entre o número médio de NORs/núcleo e os subtipos histológicos desta neoplasia
glandular. Os subtipos cribiforme e sólido, que possuem normalmente um pior prognóstico,
mostraram um maior número de NORs/núcleo quando comparados ao subtipo tubular e ainda
a outro tipo tumoral menos agressivo, o adenocarcinoma polimorfo de baixo grau (FREITAS;
ARAÚJO; ARAÚJO, 1993).
2.5 Dupla marcação Imuno-histoquímica/histoquímica
A técnica imuno-histoquímica veio facilitar o estudo do comportamento biológico do
câncer através da utilização de anticorpos específicos para a detecção de antígenos associados
a diversas funções celulares. Porém, a maioria dos trabalhos utiliza a comparação entre
marcadores em cortes histológicos diferentes de um mesmo tumor, dificultando a sua
comparação e correlação. Neste sentido, a realização da técnica de dupla marcação veio
solucionar este problema, visto que sua principal vantagem é a possibilidade de análise direta
entre os marcadores devido à co-localização dos mesmos. Desta forma o problema da
heterogeneidade das neoplasias é superado, pois a dupla marcação assegura que as NORs
sejam analisadas em um mesmo tipo celular desejado (RIVERO; AGUIAR, 2002).
Esta técnica consiste na marcação imuno-histoquímica de anticorpos combinada à
técnica histoquímica do AgNOR em uma única preparação. Foi primeiramente descrita por
McMeekin, Kennedy e McNicol (1989), que observaram uma redução na intensidade de
marcação do anticorpo quando o AgNOR foi realizado antes da imuno-histoquímica, e
quando esta era realizada primeiro houve um aumento da precipitação da prata. Quando o
AgNOR foi incubado por um longo tempo houve um aumento da reação de fundo, o que
dificultou a observação da marcação imuno-histoquímica.
Em relação ao tipo de material utilizado para a realização da técnica de dupla
marcação, Murray et al. (1989) obtiveram bons resultados tanto com material congelado
quanto com material parafinado, demonstrado em tonsilas humanas. Para os dois tipos de
secções a seqüência de realização do AgNOR, se antes ou depois da técnica imuno-
histoquímica, não influiu nos resultados. Houve uma diferença de apenas 2 a 3% na contagem
de NORs entre a técnica de dupla marcação e a técnica do AgNOR realizada isoladamente.
Para uma perfeita definição das NORs, foi requerido um tempo mínimo de 60 minutos de
incubação.
Janmohamed et al. (1990) estudaram, em material congelado, o número de
NORs/núcleo de células Ki-67 positivas e negativas de 13 casos de linfoma não Hodgkin
nodais através da técnica de dupla marcação. Um maior número médio de NORs/núcleo foi
observado nas células Ki-67 positivas em comparação com as células Ki-67 negativas, tanto
para lesões de alto quanto para lesões de baixo grau de malignidade, evidenciando uma forte
associação entre a proliferação celular e o número de NORs em linfomas.
Através da dupla marcação PCNA/AgNOR em linfomas não-Hodgkin de alto grau e
baixo grau de malignidade, Smith; Murray e Crocker (1993) observaram que, as células
PCNA positivas apresentaram escores mais elevados para AgNOR que as células PCNA
negativas, confirmando a associação das NORs com a proliferação celular. Além disso, tanto
o número de células PCNA positivas quanto o número de NORs foram maiores em linfomas
de alto grau de malignidade.
Para determinar o efeito da dupla marcação na imunorreatividade do Ki-67 e na reação
do AgNOR, Munakata e Hendricks (1994) estudaram esta técnica em 8 tonsilas humanas
emblocadas em parafina. Não foi observada nenhuma alteração na marcação para este
anticorpo quando realizada a imuno-histoquímica isoladamente ou em conjunto com o
AgNOR. Porém, quando analisados parâmetros morfológicos, tanto a média das áreas
nucleares quanto a média das áreas das NORs apresentaram-se significantemente maiores na
dupla marcação do que no AgNOR somente. Foi verificado que tal alteração era provocada
pelo aquecimento do forno de microondas durante a recuperação antigênica.
O estímulo à proliferação celular provocou um aumento da contagem de NORs em
células submetidas à técnica de dupla marcação PCNA/AgNOR num estudo com mucosa
gástrica de ratos (GRAY et al., 1995). Tanto as células PCNA positivas quanto as PCNA
negativas apresentaram este aumento. A contagem de NORs nas células PCNA positivas foi
maior que nas PCNA negativas nos dois grupos estudados, porém ambos os valores foram
maiores para o grupo de ratos que receberam estímulo para a proliferação celular.
Costa et al., (1998) realizaram a otimização da técnica de dupla marcação em
carcinoma epidermóide oral. Foi obtido resultado somente quando a imuno-histoquímica foi
realizada antes da técnica do AgNOR, pois, do contrário, houve dissolução da prata durante o
bloqueio da peroxidase endógena. Em relação ao agente cromógeno, os melhores resultados
foram obtidos com o substrato cromogênico “new fuchsin” por 20 minutos. A utilização da
“diaminobenzidina” não propiciou uma boa visualização e individualização das NORs pela
semelhança desta coloração com a coloração do AgNOR. A incubação do AgNOR durou 35
minutos em estufa a 45°C livre da luz. Acima desta temperatura ocorreu precipitação da prata.
Costa et al (1999) concluíram, em um estudo com dupla marcação PCNA/AgNOR e
Ki-67/AgNOR em carcinoma epidermóide oral, que a média de NORs/núcleo correlaciona-se
intimamente com a proliferação celular. Esta média foi significativamente maior nas células
marcadas pelos anticorpos contra os marcadores de proliferação celulares Ki-67 e PCNA,
quando comparada à média das células não marcadas (p=0.00000 e p=0.0004,
respectivamente).
Rivero e Aguiar (2002) realizaram a dupla marcação em carcinoma adenóide cístico e
também obtiveram melhores resultados quando o AgNOR foi realizado posteriormente a
imuno-histoquímica, permitindo melhor visualização das NORs e melhor definição da
imunopositividade para o PCNA. O tempo de incubação da prata foi de 25 minutos em
temperatura ambiente. Os autores obtiveram menos coloração de fundo com a utilização do
forno de microondas. Não foi observada diferença estatisticamente significante no número
médio de NORs/núcleo de células PCNA positivas e negativas apesar da diferença na média
total (2.14 para as positivas e 1.97 para as negativas).
PROPOSIÇÃO
3 PROPOSIÇÃO
Este trabalho se propôs pesquisar a expressão imuno-histoquímica da p53 e o número
médio de NORs/núcleo entre células p53 positivas e negativas, como também a correlação do
número médio de NORs/núcleo das células p53 positivas e negativas com os escores
histológicos de malignidade.
MATERIAL E MÉTODOS
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Seleção da amostra
Nossa população perfaz todos os casos de carcinoma epidermóide oral diagnosticados
pelo serviço de anatomia patológica do Hospital Dr. Luiz Antônio em Natal-RN, no período
de 1989 a 1994. Destes, foram selecionados 16 casos, cujas informações clínicas tais como:
idade, sexo e localização da lesão foram obtidas a partir de informações contidas nas fichas
clínicas e prontuários dos pacientes.
4.2 Análise morfológica
Os casos de carcinoma epidermóide fixados em formol a 10% e emblocados em
parafina foram submetidos a cortes de 5µm de espessura e as lâminas coradas pela técnica da
H & E para estudo morfológico em microscopia de luz. A avaliação sob o ponto de vista de
malignidade foi realizada por dois examinadores de forma independente, de acordo com o
sistema de gradação histológica de malignidade proposto por Bryne (1998), que consiste na
avaliação de quatro características morfológicas: grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear,
padrão de invasão e infiltração linfoplasmocitária. A cada um desses parâmetros foi atribuído
um valor de 1 a 4, conforme a Tabela 1, e o escore médio total de gradação histológica para
cada caso foi obtido pela somatória desses valores, dividido pelo número de parâmetros.
Tabela 1. Sistema de gradação histológica de malignidade desenvolvido por Bryne
(1998).
Valores (escores individuais)
Parâmetros
morfológicos 1 2 3 4
Grau de
ceratinização
>50% das células.
Altamente
ceratinizado.
20-50% das células.
Moderadamente
ceratinizado.
5-20% das células.
Mínima
ceratinização.
0-5% das células.
Ausência de
ceratinização.
Pleomorfismo
nuclear
>75% das células.
Pequeno
pleomorfismo.
50-75% das células.
Moderadamente
abundante.
25-50% das células.
Abundante
pleomorfismo.
0-25% das células.
Extremo
pleomorfismo.
Padrão de
invasão
Bordas infiltrativas
bem delineadas.
Cordões sólidos ou
faixas infiltrativass.
Pequenos grupos ou
cordões de células
infiltrativas (n<15).
Dissociação celular
marcada ou
difundida em
pequenos grupos ou
células isoladas
(n<15).
Infiltrado
inflamatório Marcado. Moderado. Despresível. Nenhum.
Em seguida, os casos foram submetidos à técnica de dupla marcação imuno-
histoquímica/histoquímica.
4.3 Técnica de dupla marcação imuno-histoquímica/histoquímica
A expressão da proteína p53 foi obtida através da técnica imuno-histoquímica com o
método da Streptoavidina-Biotina (SABC, Streptoavidin-Biotin Complex). Foi empregado o
anticorpo anti-p53, clone DO7 (Dako Corporation; Glostrub, Denmark).
Os casos de carcinoma epidermóide fixados em formol a 10% e emblocados em
parafina foram submetidos a cortes de 3µm de espessura e estendidos em lâminas de vidro
previamente limpas e desengorduradas, preparadas com adesivo à base de 3-
aminopropyltriethoxy-silano (Sigma Chemical CO., St Louis, MO USA) e deixadas em estufa
a 60°C por no mínimo 24 horas. Inicialmente, os cortes histológicos foram desparafinados em
2 banhos de xilol, sendo o primeiro a 60oC, durante 30 minutos, e o segundo à temperatura
ambiente, durante 20 minutos. A seguir, os cortes foram reidratados em cadeia descendente de
etanol: 3 passagens em etanol absoluto, seguidos por etanol 95%, 85% e 80%, durante 5
minutos cada. Finalmente, foram imersos por 10 minutos em solução de hidróxido de amônia
a 10%, para a remoção do pigmento formólico, e lavados em água corrente por 10 minutos,
mais duas passagens em água destilada.
Os cortes foram submetidos ao tratamento em banho-maria (Steamer) para
recuperação antigênica. Este passo foi realizado, colocando-se as amostras em cuba com
ácido cítrico 10 mM, pH 6.0, por 20 minutos. O material foi deixado, então, à temperatura
ambiente para resfriar, até conseguir o equilíbrio térmico com o ambiente. A partir daí, foi
lavado em água corrente por 10 minutos e em duas passagens de 5 minutos por água destilada.
Em seguida, foi feito o bloqueio da peroxidase endógena tecidual, por meio de duas
passagens de 15 minutos em solução de peróxido de hidrogênio 10 volumes. Foi repetido o
procedimento de lavagem e, após esses passos, todos os procedimentos foram precedidos de
lavagem em tampão, TRIS-HCL, pH 7,4 (Tris-hidroxi-metil-aminometano, Sigma Chemical
CO., St. Louis, MO USA), duas trocas de 5 minutos cada.
As secções teciduais foram submetidas à incubação do anticorpo primário anti-p53,
clone DO7 (Dako, Denmark) com diluição de 1:25 em solução tampão TRIS-BSA, uma
mistura de TRIS-HCL pH 7,4 com 1% de albumina sérica bovina (BSA - Biotest S/A, São
Paulo, Brasil), adicionada com azida sódica a 0,1% (BSA – Biotest S/A, São Paulo, Brasil). O
referido anticorpo foi incubado a uma temperatura de 4oC por 18 horas.
Após duas lavagens de 5 minutos cada em tampão TRIS-HCl, os cortes receberam o
anticorpo secundário de coelho anti-camundongo biotinilado em solução pronta para uso
(BioGenex; San Ramon, CA, USA), por um período de 20 minutos em temperatura ambiente,
sendo lavados em seguida em tampão TRIS-HCl por duas vezes, 5 minutos cada. Logo após,
foi aplicado o complexo estreptoavidina biotina mais fosfatase alcalina (BioGenex; San
Ramon, CA, USA), durante o tempo de 20 minutos em temperatura ambiente.
Para a revelação da reação foi utilizado o cromógeno “New fuchsin” (Biogenex; San
Ramon, CA, USA) previamente preparado, de acordo com as recomendações do fabricante.
Os cortes receberam o cromógeno durante 20 minutos e foram mantidos na câmara escura em
temperatura ambiente. Em seguida, foram lavados em água corrente durante 10 minutos. Para
o controle positivo da reação imuno-histoquímica utilizamos um caso de carcinoma
epidermóide com padrão de revelação já para o P53. O controle negativo foi feito,
substituindo-se o anticorpo primário por albumina sérica bovina a 1%, diluída em tampão
TRIS-HCL, pH 7,4.
Em seguida, os cortes foram submetidos à técnica do AgNOR. Os cortes foram
imersos em solução de ácido acético/etanol (1:3) durante 5 minutos e logo após lavados com
etanol absoluto 3 vezes rapidamente. Depois, os cortes foram imersos em celuidina a 1% em
etanol/éter (1:1) durante 1 minuto, realizando-se a retirada do excesso e secagem da lâmina
por um período de 1 hora. Os cortes foram lavados com água destilada e receberam a solução
aquosa de nitrato de prata 50% misturada a uma solução de gelatina em ácido fórmico aquoso
a 2%, na proporção de 1:2. A seguir, as lâminas foram levadas à câmara escura em
temperatura ambiente por 1 hora.
Foram, por fim, lavados com água destilada, desidratados com etanol em soluções
crescentes, clareados com xilol e montados em Permount® (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ,
USA).
4.4 Análise quantitativa das NORs
A análise quantitativa das NORs foi realizada através da contagem manual destas com
o auxílio de um microscópio ótico NIKON, utilizando-se um retículo de contagem WEIBEL
NGW2 com área de 0,25 mm2 e com aumento final de 1000X.
Em cada caso foram contadas as NORs de 200 núcleos, sendo 100 núcleos p53
positivos e 100 núcleos p53 negativos, no front invasivo do tumor. Cada ponto foi contado
como uma unidade, quando individualizado, e o número médio de NORs/núcleo determinado
para cada caso, pela média aritmética.
Os números médios de NORs/núcleo das células p53 positivas e negativas foram,
então, submetidos à análise estatística.
4.5 Análise estatística
Com o objetivo de pesquisar se havia diferença nos números médios de NORs/núcleo
entre células p53 positivas e negativas, foi utilizado o teste “t” de Student, por se tratar de
amostras com distribuição normal. O valor “t” foi comparado ao de uma tabela ao nível de
significância estabelecido e com n-1 graus de liberdade. Toda vez que o valor absoluto de “t”
calculado for igual ou maior que o valor da tabela, conclui-se que o tratamento tem efeito no
nível de significância estabelecido.
Para pesquisar a correlação entre a relação do número médio de NORs/núcleo das
células p53 positivas/negativas e os escores histológicos de malignidade foi aplicado o teste
de correlação de Spearman, que analisa dados pareados. A correlação entre duas variáveis é
expressa por r, cujo valor varia de +1 (correlação direta) a –1 (correlação inversa). Valores
próximos de zero indicam ausência de correlação.
Estes testes foram realizados por meio do software GMC, versão 8.0, de autoria do
Prof. Geraldo Maia Campos, e o nível de significância fixado em 5%.
RESULTADOS
5 RESULTADOS
5.1 Características clínicas e histopatológicas do carcinoma epidermóide oral.
As informações clínicas dos pacientes referentes às lesões como idade, sexo e
localização anatômica podem ser observadas na Tabela 2. Nos 16 casos analisados, a faixa
etária esteve entre 52 e 90 anos e 12 eram do sexo masculino e 4 do feminino. Quanto à
localização anatômica, 14 eram de língua, 1 de região retromolar e 1 de palato duro.
Em nosso estudo, de um modo geral, observamos pela análise em microscopia de luz
que os casos diagnosticados como carcinomas epidermóides caracterizavam-se por uma
proliferação de células epiteliais predominantemente na forma de cordões, pequenos ninhos
ou pequenos grupamentos celulares, caracterizando a invasão da lâmina própria (Fotografia
1). Isoladamente, as células tumorais exibiam hipercromatismo, pleomorfismo nuclear,
figuras de mitose como também queratinização individual com a formação de pérolas córneas
(Fotografia 2).
Os casos foram submetidos à gradação histológica de malignidade de acordo com
Bryne (1998) e os escores atribuídos a cada tumor estão demonstrados na Tabela 3.
5.2 Expressão imuno-histoquímica/histoquímica.
A expressão do p53 foi considerada positiva em células com reação restrita ao núcleo,
de coloração avermelhada, independente da intensidade de coloração, ou seja, o suficiente
para diferenciação entre células positivas e negativas ao P53. As NORs foram observadas
como pontos acastanhados a negros no interior do núcleo, apresentando-se no geral como
estruturas pequenas e irregulares (Fotografia 3)
5.3 Dupla marcação p53/AgNOR
O padrão de expressão da P53 caracterizou-se por uma marcação avermelhada de
média intensidade, com algumas células exibindo diferentes intensidades de marcação. Uma
grande quantidade de células marcadas foi observada em todos os casos analisados. A
expressão das NORs caracteriza-se por pontos acastanhados a negros no interior do núcleo,
apresentando-se como estruturas pequenas e irregulares (Fotografia 4).
O número de NORs/núcleo variou de 1 a 10 nas células p53 positivas, com 80,94%
dos núcleos exibindo 1, 2 ou 3 NORs, e nas células p53 negativas o número de NORs/núcleo
variou de 1 a 8, com 86,44% dos núcleos exibindo de 1 a 3 NORs (Gráfico 1).
O número médio de NORs/núcleo nas células p53 positivas variou de 1.91 a 2.35
(média aritmética ± erro padrão da média, 2.13 ± 0.22), enquanto para as células p53
negativas houve uma variação de 1.61 a 1.89 (média aritmética ± erro padrão da média, 1.75
± 0.14).
As médias do número de NORs/núcleo nas células p53 positivas e negativas e os
escores histológicos de malignidade dos 16 casos estudados estão demonstrados na Tabela 3.
5.4 Resultados estatísticos
O teste “t” de Student não mostrou diferença estatisticamente significante (α>0.05)
entre o número médio de NORs/núcleo das células p53 positivas (2,13) e o número médio de
NORs/núcleo das células p53 negativas (1,75), conforme Tabela 4.
O teste de correlação de Spearman mostrou não haver correlação estatisticamente
significante entre o número médio de NORs/núcleo das células p53 positivas e os escores
histológicos de malignidade como também não houve correlação entre o número médio de
NORs/núcleo das células P53 negativas e os escores histológicos de malignidade. (Tabelas 5 e
6).
Fotografia 1 – Observar a invasão de células epiteliais arranjadas em cordões, pequenos ninhos ou pequenos grupamentos celulares (200X).
Fotografia 2 – Observar o pleomorfismo nuclear, figuras de mitose, como também ceratinização individual com a formação de pérolas córneas (400X).
Fotografia 3 – Observar os núcleos p53 positivos (seta maior) e os núcleos p53 negativos (seta menor), como também as NORs no interior destes (400X).
Fotografia 4 – Observar o padrão de expressão do p53, caracterizado por uma marcação avermelhada de média intensidade (Imersão – 1000X).
Gráfico 1 - Histograma de distribuição do número de NORs/núcleo de células p53 positivas e negativas.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
% T
otal
Células p53+ Células p53-
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10
Número de NORs/núcleo
Tabela 2. Dados clínicos dos casos de carcinoma epidermóide.
Casos Sexo Idade Localização anatômica
1 M 69 Língua
2 M 77 Língua
3 F 55 Língua
4 M 65 Língua
5 M 70 Língua
6 F 81 Língua
7 M 52 Língua
8 F 61 Língua
9 M 75 Língua
10 M 58 Língua
11 M 86 Região retromolar
12 M 59 Língua
13 F 83 Língua
14 M 76 Palato duro
15 M 90 Língua
16 M 58 Língua
Tabela 3. Números médios de NORs/núcleo de células p53 positivas e p53 negativas e escores
histológicos de malignidade das respectivas.lesões.
Casos Células p53 positivas Células p53 negativas Escores
1 2.22 1.79 2
2 2.01 1.65 2.5
3 2.96 2.89 2.75
4 2.06 2.11 3.25
5 2.28 2.01 2.5
6 2.01 2.51 2
7 2.25 1.82 2.75
8 2.79 2.60 3
9 3.19 2.83 2.5
10 2.90 2.92 2.8
11 5.05 3.17 2.5
12 2.17 1.92 2.5
13 1.61 1.44 1.5
14 2.00 2.64 3.25
15 1.95 2.04 2
16 2.09 2.15 2.5
Média 2.13 1.75 2.12
Desvio padrão 0.89 0.58 0.50
Erro padrão da
média 0.22 0.14 0.1250
Tabela 4. Teste “t” de Student dos números médios de NORs/núcleo entre células p53
positivas e p53 negativas.
Variável Valor do t calculado Valor de significância de t
Nº médio de NORs/núcleo
de células p53+ X p53- 2,09 *
*Não significante (α>0,05).
Tabela 5. Teste de correlação de Spearman entre o número médio de NORs/núcleo das células
p53 positivas e os escores histológicos de malignidade.
Variáveis Valor do r calculadoProbabilidade de
H0 Correlação
No médio de
NORs/núcleo de
células p53+ X
escores
0,2324 39,00% Não há correlação*
*Não significante (α>0,05).
Tabela 6. Teste de correlação de Spearman entre o número médio de NORs/núcleo das células
p53 negativas e os escores histológicos de malignidade.
Variáveis Valor do r calculadoProbabilidade de
H0 Correlação
No médio de
NORs/núcleo de
células p53+ X
escores
0,3676 15,86% Não há correlação*
*Não significante (α>0,05).
DISCUSSÃO
6 DISCUSSÃO
O objetivo deste trabalho foi pesquisar a relação entre os números médios de
NORs/núcleo e a expressão imuno-histoquímica da P53 no carcinoma epidermóide de boca
em diferentes graus histológicos de malignidade. Para isso, utilizou a técnica de dupla
marcação, a qual permite a avaliação em um mesmo espécime das NORs e do antígeno
imuno-marcado. Por meio dessa técnica é possível analisar em uma mesma célula a expressão
imuno-histoquímica da P53, como também o número de NORs/núcleo que esta célula
apresenta, correlacionando “in situ” dois métodos diferentes de avaliação. A maioria dos
trabalhos que estuda diferentes marcadores de proliferação celular, tais como: P53 e AgNOR
o faz separadamente por intermédio de cortes seriados. Dessa forma comparam
estatisticamente os índices de P53 com os números médios de NORs/núcleo. A nosso ver, a
técnica de dupla marcação fornece resultados mais convincentes sobre a correlação dos
diferentes marcadores imuno-histoquímicos, pelo fato de demonstrar em uma mesma célula a
expressão de proteínas evidenciadas pela combinação de duas técnicas diferentes (imuno-
histoquímica/histoquímica).
De acordo com os nossos resultados não encontramos diferenças estatisticamente
significantes entre a contagem de NORs/núcleo das células p53 positivas e das células p53
negativas. As células p53 positivas exibiram números de NORs/ núcleo que variaram de 1 a
10, com 80.94% dos núcleos analisados exibindo 1 a 3 NORs, enquanto as células p53
negativas exibiram números de NORs/ núcleo que variaram de 1 a 8, com 86.44% dos núcleos
analisados exibindo 1 a 3 NORs. Estes dados nos permitem sugerir que a presença da proteína
p53, verificada pela sua marcação imuno-histoquímica, não se correlaciona com o estado
proliferativo do carcinoma epidermóide oral, tendo em vista que as NORs são consideradas,
por diversos autores como um bom índice para se medir a proliferação celular (LO MUZIO et
al., 1997; NAKAMURA et al., 2004; SCHWINT et al., 1993).
Não existem, na literatura, trabalhos que correlacionem a expressão do p53 com o
número de NORs através da técnica de dupla marcação, os trabalhos que utilizam estes dois
marcadores, geralmente os analisam de forma isolada. Desta forma, De Rosa et al. (1999)
pesquisaram o papel do p53, PCNA, c-myc (através de imuno-histoquímica) e do AgNOR na
diferenciação e prognóstico de lesões pré-malignas de lábio. Eles obtiveram uma correlação
positiva entre a superexpressão do p53 e a diminuição da diferenciação celular nos diversos
graus de malignidade desta lesão. O número de AgNORs e a porcentagem de células PCNA
positivas foram parâmetros sensíveis para a discriminação entre lesões potencialmente
malignas e o carcinoma epidermóide e para o estabelecimento do prognóstico para o
carcinoma de lábio inferior.
Para Warnakulasuriya e Johnson (1993) em processos que envolvem o aumento da
proliferação celular, o AgNOR pode agir como marcador, pois sua contagem aumenta com a
atividade transcricional e com o estado proliferativo. De acordo com Gray et al. (1995)
células não proliferativas teriam pequeno número de NORs e o número destas aumentaria
com o nível de atividade proliferativa. Costa et al. (1999) pesquisaram por intermédio da
dupla marcação PCNA/AgNOR e Ki-67-AgNOR, a correlação entre estes marcadores de
proliferação nos mesmos espécimes de carcinoma epidermóide oral. Foram observadas
diferenças significantes entre o número médio de NORs/núcleo, tanto nas células Ki-67
positivas em comparação com as Ki-67 negativas, como nas células PCNA positivas em
comparação com as PCNA negativas. Este resultado indicou que o número de NORs
encontrava-se relacionado com a atividade proliferativa do carcinoma epidermóide.
Constatação esta relatada por Xie et al. (1997) quando afirmou que células em grande
atividade proliferativa exibem um maior número de NORs/núcleo, pois este, correlaciona-se
inversamente ao tempo de duração do ciclo celular. De acordo com os referidos autores, uma
célula em divisão passa grande tempo em interfase e que a maior porção desta é ocupada pela
fase G1, é de se esperar que nesses tumores exista um grande número de células nesta fase. A
fase G1 exibe grande número de NORs/núcleo até o seu final, onde ocorre a aglomeração
dessas NORs para posterior divisão celular (ANASTASSOVA-KRISTEVA, 1977), daí um
dos motivos da observação de múltiplas NORs em tumores muito proliferantes.
A ausência de diferença do número médio de NORs/núcleo na presença ou ausência
de p53 em nosso estudo provavelmente associa-se ao fato de que o p53 e as NORs servem
para medir diferentes aspectos da atividade proliferativa. O crescimento de uma população
tumoral depende da porcentagem de células no ciclo celular (parâmetro estático), da duração
do ciclo (parâmetro dinâmico) e da taxa de perda celular. A avaliação apenas de fatores
estáticos, como a porcentagem de células imuno-marcadas para anticorpos relacionados à
proliferação, não possibilita uma boa compreensão do crescimento tumoral (BETTENDORF;
PIFFKÒ; BÀNKFALVI, 2004; PIFFKÒ et al., 1997).
Nesse sentido, o AgNOR parece refletir bastante os aspectos dinâmicos do ciclo
celular, como a rapidez da duplicação celular (PIFFKÒ et al., 1997), enquanto a marcação
imuno-histoquímica do p53 poderia indicar apenas a presença ou não de um descontrole do
ciclo celular. Em nosso estudo, a dupla marcação permitiu, então, a observação desses
parâmetros dinâmicos em relação aos parâmetros estáticos, isto é, a avaliação do número de
NORs em células com acúmulo de p53 no núcleo, o que teoricamente poderia apontar células
com uma maior capacidade proliferativa.
Porém, este resultado não foi encontrado, pois as células p53 positivas não
apresentaram diferenças significativas dos números de NORs/núcleo em relação às células
p53 negativas. É de se esperar que, a detecção imuno-histoquímica da p53 esteja associada a
mutações do respectivo gene, que leva à estabilização da proteína no núcleo da célula
(PIETILAINEN et al., 1995). Mas de acordo com Bristow, Benchimol e Hill (1996), nem
sempre a acumulação de p53 correlaciona-se com a presença de proteína mutada, pois a
proteína p53 normal também pode acumular-se no núcleo da célula. Este fato pode estar
associado a um dano crônico do DNA segundo Partridge et al. (1999). Além disso, a proteína
selvagem também pode estar super expressa em células que foram submetidas a doses de
radiação, o que propiciaria o reparo do DNA alterado e, conseqüentemente a produção de p53
(ALMEIDA et al., 1999). Como a maioria das mutações ocorre no domínio central da
proteína p53 (GASCO; CROOK, 2003; LÓPEZ-MARTÍNEZ et al., 2002; TRIVEDY et al.,
1998) e o anticorpo utilizado é capaz de marcar tanto a acumulação da proteína p53 mutada
quanto a não mutada, pois reconhece um epítopo da região N-terminal destas, uma parcela de
nossos casos marcados para p53 pode estar relacionada à proteína funcional acumulada, e não
à proteína mutada. Por outro lado, determinados tipos de mutações podem levar à não
expressão da proteína mutada. Este fato gera a falsa impressão de que as células p53 negativas
possuam a p53 em sua atividade normal.
A proteína mutada pode, ainda preservar a habilidade de reconhecer os sítios de dano
ao DNA e sua acumulação no núcleo gerar um aumento da função reparadora (BRISTOW;
BENCHIMOL; HILL, 1996). Desta forma, a proteína estaria exercendo sua função, mesmo
em células imuno-marcadas. Todos estes fatores, provavelmente explicam esta discrepância
da presença ou ausência de p53 em relação à capacidade proliferativa medida pela contagem
do AgNOR. Outros fatores que podem associar-se ao aumento da proliferação celular por
perda da função da p53 incluem a presença da proteína viral E6 do HPV 16 e 18, que possui a
capacidade de seqüestrar a proteína p53 (MOLL; SCHRAMM, 1998).
O estudo imuno-histoquímico da proteína p53 vem sendo questionado ainda no que
diz respeito à falta de padronização dos métodos utilizados, o que impossibilita uma
comparação entre os diversos resultados obtidos na literatura científica. Muitos fatores da
metodologia podem afetar os resultados tais como: o tipo de anticorpo utilizado, o método de
fixação do tecido pesquisado, o processamento em parafina, o uso de recuperação de epítopos
(KUTTAN et al., 1995). Além disso, resultados falso-positivos vêm sendo reportados quando
da utilização de recuperação antigênica em forno de microondas (TRIVEDY et al., 1998). Em
nosso estudo realizamos a recuperação antigênica em banho-maria ou Steamer, seguindo as
recomendações do fabricante do anticorpo. Não utilizamos o forno de microondas, pois
concordamos com o fato de que esta recuperação antigênica pode levar a um aumento da
positividade, até mesmo em mucosa normal, devido à diminuição do limiar de detecção para a
proteína p53 selvagem.
Diversos trabalhos utilizaram o anticorpo anti-p53, clone DO7 e obtiveram bons
resultados devido ao fato de que o DO7 é um dos clones anti-p53 mais sensíveis (CRUZ et
al., 1998). No presente estudo por intermédio deste clone obtivemos excelentes achados
quanto ao padrão de marcação da P53 em todos os espécimes analisados. Houve uma
marcação de média intensidade permitindo a perfeita distinção entre as células positivas e
negativas. Da mesma forma, Kerdpon et al. (1997) observaram em carcinoma epidermóide
oral uma distribuição da positividade para p53 de forma focal e difusa. Nossa marcação para o
p53 teve uma distribuição dispersa em todos os espécimes analisados e foi observada uma
coloração avermelhada predominantemente, evidenciando assim um bom contraste para
diferenciação entre células P53 positivas e negativas.
Em relação à técnica do AgNOR, sabe-se que a mesma é bastante sensível a fatores
como luz, temperatura, e ao preparo das soluções, além de outros relativos ao tecido, como
fixação e espessura (COSTA et al., 1998). Além disso, tem sido mostrado que a contagem do
número de NORs poderia levar a alguns erros, devido ao fato de que este procedimento requer
tempo e precisão. A análise semi-automática por imagem ainda apresenta algumas
dificuldades na sua padronização, freqüentemente devido a variações na densidade dos cortes
histológicos.
De acordo com Lo Muzio et al. (1997) os problemas anteriormente referidos poderiam
levar a sub ou superestimação na contagem das NORs. De acordo com o Ofner et al. (1995) e
os membros do Comitê de quantificação do AgNOR da Sociedade Européia de Patologia, a
área total das AgNORs por célula é o indicador básico da quantidade de AgNOR. Porém, a
contagem das AgNORs por meio ótico é o método de segunda escolha e deve ser restrito
àqueles campos ou células que exibam pontos marcados distintos como subestruturas
definidas do nucléolo. O mesmo comitê recomenda o uso de autoclave como forma de pré-
tratamento para o AgNOR, com o objetivo de uma melhor qualidade de marcação para
materiais de arquivo (RIVERO; AGUIAR, 2002).
Diante disso, há a necessidade de um trabalho criterioso tanto no que diz respeito à
execução da técnica quanto no método de contagem das NORs/núcleo. Em nossos casos, a
contagem das NORs foi realizada em 100 células p53 positivas e 100 células p53 negativas
por meio de um microscópio óptico. Cada ponto individualizado foi contado como uma
unidade dentro ou fora do nucléolo e apenas os campos que permitiram uma perfeita
individualização das NORs foram utilizados para obtenção do número de NORs/núcleo de
cada caso. Apesar da difusão dos métodos de análise computadorizados, muitos trabalhos
ainda utilizam a contagem manual das NORs, obtendo bons resultados (KAHN et al., 1993;
NAKAMURA et al., 2004; ROSA et al., 1999; SAMPAIO et al., 1999; SCHWINT et al. ,
1994; WARNAKULASURIYA; JOHNSON, 1993; XIE et al., 1997).
Outros estudos tentaram correlacionar a positividade para o p53 e o número de NORs
individualmente, com fatores relativos ao comportamento biológico do tumor através da
gradação histológica de malignidade. O sistema de Bryne (1998) consiste em um sistema
simplificado, com apenas quatro parâmetros de fácil observação. O mais importante é que os
escores de malignidade são obtidos em relação às células da região de front invasivo. Esta
região, segundo a autora, é a mais importante área para determinação do comportamento
biológico do tumor, pois exibe uma diminuição da diferenciação celular, além de um alto grau
de dissociação. Porém, é necessário que o fragmento tecidual a ser analisado inclua a região
de invasão, pois do contrário, a realização desta gradação histológica torna-se impossível
(BRYNE et al. 1989; BRYNE et al. 1991; BRYNE et al. 1992).
Observamos que, antes da proposta do sistema de Bryne (1998), o sistema mais
utilizado para a gradação do carcinoma epidermóide era o de Anneroth, Batsakis e Luna
(1987), composto por seis parâmetros de avaliação morfológica, incluindo a avaliação do
número de mitoses. Desta forma, o sistema de Bryne (1998) veio facilitar a obtenção do grau
histológico para o carcinoma epidermóide, visto que menos parâmetros são analisados.
Além disso, a avaliação do número de mitoses consome muito tempo e não consiste
em um parâmetro de boa reprodutibilidade entre os observadores. A validade do número de
mitoses como indicador de prognóstico também é questionado, pois há uma grande variação
deste número dentro de um mesmo tumor, além do que, de acordo com a potência do
microscópio utilizado podem ser observadas mais ou menos mitoses no mesmo espécime
(BRYNE et al. , 1989; BRYNE et al. , 1991; BRYNE et al. , 1992).
Há razões biológicas para sugerir que anormalidades do p53 são indicativas de um
pobre prognóstico em tumores malignos. Sendo ele o “guardião do genoma”, suas anomalias
provavelmente coincidem com os parâmetros de pobre prognóstico, como pleomorfismos
morfológicos e atipia, aneuploidia, alto grau ou estágio e resistência à radioterapia (MOLL;
SCHRAMM, 1998). Apesar disso, as discrepâncias entre os estudos baseados em genética
molecular e em anticorpos, atenta para a necessidade de cautelosas conclusões sobre o real
valor da super expressão do p53 em estudos que utilizam apenas uma modalidade de detecção
(BONGERS et al., 1995; KUROPKAT et al., 2002). Porém, algumas correlações podem ser
observadas em relação à progressão de lesões pré cancerizáveis.
Cruz et al. (1998) perceberam que a presença de imuno-marcação para p53 acima da
camada basal em lesões displásicas moderadas ou severas coincidiam com a detecção de
casos em progressão. Os autores sugerem que uma associação entre a marcação do p53 e a
presença de displasia seja feita para que haja um melhor acesso a lesões pré-malignas.
Araújo et al. (1997) relacionaram a acumulação de p53 no núcleo ao grau histológico
de malignidade do carcinoma epidermóide oral. A positividade esteve correlacionada com os
parâmetros da população celular tumoral, podendo assim estar refletindo o grau de
proliferação. Já Khademi et al. (2002) não encontraram correlação entre a imuno-positividade
do p53 e o grau histológico de malignidade de carcinomas de cabeça e pescoço. Uma
associação positiva só foi obtida em relação ao envolvimento de linfonodos em todas as
amostras. De acordo com Nakamura et al. (2004), o número de NORs se correlaciona com o
grau histológico de malignidade de diversas neoplasias. Yue, Iwai e Furuta (1999)
observaram um maior número de NORs em grupos com metástases em linfonodos e em
lesões de alto grau histológico de malignidade (GIII) em comparação com baixos graus de
malignidade (GI e GII).
Leung, Pedlar e High (1996) sugeriram que uma forte expressão da p53 em tumores
iniciais indicaria um pior prognóstico para estas lesões. Mas a correlação positiva entre o p53
e o prognóstico de lesões malignas está mais bem evidenciado quando as variáveis
radioterapia e quimioterapia são consideradas. Tendo em vista que estes tratamentos visam
induzir a apoptose de células danificadas, a perda da capacidade de regular a apoptose e o
reparo ao DNA (que ocorre nas células com disfunção de p53) leva a uma resistência maior a
estes tratamentos e conseqüentemente a um pior prognóstico (KOELBL et al., 2001; TEMAN
et al., 2000). Foi descoberto que tumores com mutações presentes em regiões de ligação ao
DNA na superfície e em regiões conservadas possuem um prognóstico significantemente mais
pobre que tumores com mutações em outras regiões, sugerindo que aquelas mutações sejam
mais agressivas. Esta agressividade provavelmente se dá pela importância funcional das
regiões afetadas pelas alterações no DNA (YAMAZAKI et al., 2003).
Os nossos resultados não demonstraram correlação entre o número médio de
NORs/núcleo das células p53 e os escores histológicos de malignidade, como também não foi
encontrada correlação entre o número médio de NORs/núcleo das células P53 negativas e os
escores histológicos de malignidade. Existem alguns trabalhos publicados na literatura
demonstrando a existência de correlação entre o número médio de NORs/núcleo e os escores
histológicos de malignidade (FREITAS; ARAÚJO; ARAÚJO, 1993; NAKAMURA et al.,
2004; SMITH; MURRAY, CROCKER, 1993).
Com relação ao AgNOR, este consegue realizar uma discriminação entre estas lesões
displásicas potencialmente malignas ou não. Ele pode, ainda, ajudar a prever o prognóstico de
lesões displásicas e de lesões malignas. Geralmente a grande quantidade de NORs, refletindo
o estado proliferativo, acaba por indicar um pior prognóstico quando comparado a tumores
com baixa contagem de NORs/núcleo (TEIXEIRA et al., 1996). Segundo Xie et al. (1997),
pacientes com contagem de NORs abaixo da média total (6.2) tiveram um período livre da
doença significativamente maior e longo tempo de sobrevida que aqueles com altos valores.
De Rosa et al. (1999) observaram que a média das NORs claramente distingue as lesões com
bom seguimento daquelas sem recorrência e/ou metástases e Piffkò et al. (1997) concluíram
que altos valores do coeficiente de variação para o número de NORs estiveram associados
com recorrência precoce do tumor, metástases e morte.
Com relação à técnica de dupla marcação imuno-histoquímica/histoquímica, diversos
autores apontam melhores resultados com a realização do AgNOR após a imuno-histoquímica
(COSTA et al., 1998; RIVERO; AGUIAR, 2002). No início da utilização do AgNOR, os
autores não relatavam grandes diferenças no resultado da técnica se esta ordem fosse invertida
(MURRAY et al., 1989; McMEEKIN; KENNEDY; McNICOL, 1989). Em nosso estudo
preferimos realizar a técnica do AgNOR após a imuno-histoquímica devido à experiência
prévia com bons resultados nesta seqüência de realização. Para o tempo de revelação da
reação imuno-histoquímica do p53, o fabricante do cromógeno “new fuchsin” (Biogenex; San
Ramon, CA, USA) recomendava um tempo de 15 a 40 minutos. Utilizamos o cromógeno
durante 20 minutos, o que proporcionou um ótimo contraste para visualização das NORs nos
núcleos p53 positivos e negativos.
Em relação ao AgNOR, já foi comentado sobre sua grande sensibilidade a diversos
fatores externos, bem como sobre a necessidade de rigorosos critérios em todas as fases para a
obtenção de um bom resultado. Apesar disso, é uma técnica muito acessível, que não
demanda grandes recursos, equipamento sofisticado ou muito tempo para sua realização
(KAHN et al., 1993). O tempo de incubação para o AgNOR é um passo essencial da técnica,
pois uma longa exposição à prata resulta em NORs obscuras e múltiplas, além de aumentar a
coloração de fundo, impedindo a perfeita visualização da marcação imuno-histoquímica.
McMeekin; Kennedy e McNicol (1989) sugeriram um tempo de incubação de 30 a 40
minutos, enquanto Murray et al. (1989) recomendaram o tempo de 1 hora em câmara escura e
temperatura ambiente e Smith; Murray e Crocker (1993) 2 horas nas mesmas condições. Nós
realizamos a incubação do AgNOR por 60 minutos em temperatura ambiente e livre da luz.
Esperamos que os nossos resultados tenham contribuído no sentido de esclarecer
melhor a relação entre o número médio de NORs/núcleo e a marcação imuno-histoquímica da
P53 no carcinoma epidermóide oral. Este resultado nos faz refletir sobre o papel das NORs e
do P53 no ciclo celular. Alem disso, mesmo não havendo correlação entre o número médio de
NORs/núcleo das células P53 positivas e das células P53 negativas com os escores
histológicos de malignidade, a tentativa de identificação de fatores biológicos que indiquem a
agressividade do câncer oral é sempre importante, visto que uma maior objetividade nos
parâmetros indicadores de prognóstico levaria a uma melhor escolha do tratamento, e
conseqüentemente melhor sobrevida para os pacientes com esta doença.
CONCLUSÕES
7 CONCLUSÕES
Através de nossos resultados obtidos com a técnica de dupla marcação, concluímos:
a) Não existe diferença entre o número médio de NORs/núcleo das células p53 positivas
e o número médio de NORs/núcleo das células p53 negativas em carcinomas
epidermóides orais de diversos graus histológicos.
b) Não há correlação entre o número médio de NORs/núcleo das células p53 positivas e
os escores histológicos de malignidade em carcinoma epidermóide oral.
c) Não há correlação entre o número médio de NORs/núcleo das células p53 negativas e
os escores histológicos de malignidade em carcinoma epidermóide oral.
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