Download - Geneti Ki in Enjering
![Page 1: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/1.jpg)
GENETIĈKI
INŽENJERING
REKOMBINANTNA
DNK
TEHNOLOGIJA
![Page 2: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/2.jpg)
Genetiĉki inženjering
Veštaĉko (manipulativno) prenošenje stranih
gena u postojeće genome ćelija.
Stvaraju se novi genotipovi ćelija , sposobni za
samostalnu reprodukciju.
![Page 3: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/3.jpg)
Poĉetak 1973.godine
Kombinovanje raznih i sistematski vrlo
udaljenih organizama
– Geni ĉoveka → genom bakterije
Insulin
Hormoni rasta
Interferon
– Geni biljaka → genom bakterije
– Geni životinja → genom bakterije
– Geni bakterija → genom eukariota
![Page 4: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/4.jpg)
1982. godine kompanija Eli Lilly
Odobrenje za prodaju insulina za ljudsku
upotrebu, dobijenog genetiĉkim inženjeringom
![Page 5: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/5.jpg)
Zašto mikroorganizmi?
Jednostavni
Laki za manipulaciju
Brzo se razmnožavaju
Koriste jednostavne hranljive podloge
![Page 6: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/6.jpg)
Primena
Mikrobiološke fermentacije: antibiotici, vitamin C
Vakcine: virus slinavke i šapa, hepatitis B, AIDS (?)
U poljoprivredi:
– genetski modifikovani organizmi (GMO)
– Rekombinantni mikroorganizmi
Zaštita voća od mraza – Pseudomonas syringae
Insekticid – Bacillus thuringiensis
– Transgene biljke – biljke sa uspešno ugraĊenim stranim
genom
![Page 7: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/7.jpg)
Transgene biljke
Otpornost prema biljnim parazitima: bundeva
Otpornost prema štetnim insektima: krompir,
kukuruz, pamuk
Tolerantnost prema herbicidima: kukuruz, soja
Modifikacija u sastavu proteina, masnih
kiselina, ugljenih hidrata
Poboljšanje kvaliteta biljnih proizvoda
![Page 8: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/8.jpg)
![Page 9: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/9.jpg)
![Page 10: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/10.jpg)
Transgene životinje
![Page 11: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/11.jpg)
I dalja primena
Zaštita životne sredine
– Biodegradacija razliĉitih zagaĊivaĉa
– Toksiĉni otpad
– Otpadne vode
Regulacija gena i genetiĉka terapija
– Leĉenje genetskih oboljenja
![Page 12: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/12.jpg)
Metode rekombinantne DNK tehnologije
Transfer DNK od jednog organizma u drugi
1. Klonirajući vektor i domaćin
2. Konstrukcija rekombinantnog plazmida
![Page 13: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/13.jpg)
Karakteristike klonirajućih vektora
Moraju biti sposobni za nošenje dela DNK donora
Mora ih lako usvojiti klonirani domaćin
PLAZMIDI
– mali, dobro karakterisani,
– laki za manipulaciju i
– mogu biti prenešeni u odgovarajućeg domaćina transformacijom
BAKTERIOFAGI
– imaju prirodnu sposobnost da ubace svoju DNK u bakteriju domaćina transdukcijom
![Page 14: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/14.jpg)
Osnovne procedure genetiĉkog inženjeringa
1. DNK koja sadrži odreĊen, specifiĉan gen
2. Plazmidna DNK
3. Tretiranje enzimom – restriktivna endonukleaza
4. Modifikovan plazmid – rekombinantni plazmid
5. Transformacija
6. Identifikacija kolonije bakterija sa modifikovanim plazmidom
7. Bakterije dobijene GI se umnožavaju u velikom broju, i proizvod kodiran prenešenim genom se izdvaja iz kulture i preĉišćava
![Page 15: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/15.jpg)
![Page 16: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/16.jpg)
![Page 17: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/17.jpg)
1. DNK koja sadrži odreĊen specifiĉan gen
Dobija se iz organizma donora
Može biti sintetisana iz nukleotida
![Page 18: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/18.jpg)
2. Izolacija plazmidne DNK
Služi kao nosaĉ odreĊenog gena
Odvajanje od ćelije i hromozomalne DNK
Centrifugiranje u razliĉitom gradijentu gustine
sa cezijum hloridom i etidijum bromidom
![Page 19: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/19.jpg)
3. Tretiranje enzimom –
restriktivna endonukleaza
Prisutna u gotovo svim mikroorganizmima
Vrše identifikaciju i uništavanje “strane DNK”
Ćelija markira sopstvenu DNK metil (-CH3) grupom
Proces dodavanja metil grupe – DNK modifikacija
DNK donora i plazmidna DNK se tretiraju istim
enzimom
Seĉe DNK stvarajući komplementarne jednostruke
krajeve “lepljivi krajevi” (“sticky ends”)
![Page 20: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/20.jpg)
![Page 21: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/21.jpg)
4. Konstrukcija rekombinantnog plazmida
Lepljivi krajevi fragmenta DNK donora
spajaju se sa lepljivim krajevima plazmidne
DNK obrazujući rekombinantni, modifikovani
plazmid koji nosi fragment DNK donora.
Enzim ligaza ponovo uspostavlja veze fosfat-
šećer koje su prekinute endonukleazama
![Page 22: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/22.jpg)
![Page 23: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/23.jpg)
Prvi rekombinantni plazmid – rezistentnost na
dva antibiotika (1973. god)
Teorijski: bilo koja dva molekula DNK,
razliĉitih vrsta, mogu da se spoje.
Gen iz južnoafriĉke žabe ubaĉen u plazmidnu
DNK bakterije.
Pitanje: iskazivanje (ekspresija) gena kod
bakterija
![Page 24: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/24.jpg)
DNK eukariotskih ćelija: introni i egzoni
Bakterije ne vrše uklanjanje introna prilikom
transkripcije iRNK
Rešenje: Izolacija iRNK umesto DNK iz
eukariotske ćelije
![Page 25: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/25.jpg)
iRNK se koristi kao matrica za sintezu
komplementarne DNK (kDNK) koja može biti
ubaĉena u plazmid
Enzim: reversna transkriptaza (RNK-directed
DNK-polimeraza)
![Page 26: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/26.jpg)
5. Unošenje rekombinantnog plazmida u
bakteriju recipijenata
Transformacija
CaCl2 transformaciona procedura
– Tretiranje ćelija recipijenta sa CaCl2 na niskim
temperaturama (0-4C za E. coli)
– Dodavanje plazmidne DNK
– Zagrevanje ćelije recipijenta (do 42C za E. coli)
Elektroporacija – tretman kratkim
elektropulsevima
![Page 27: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/27.jpg)
6. Identifikacija bakterija koje su primile
plazmid
Upotreba antibiotika
![Page 28: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/28.jpg)
Umnožavanje rekombinantnog plazmida
Kada je rekombinantni plazmid uspešno
ubaĉen u bakterijsku ćeliju, ona može da stvara
veliku populaciju identiĉnih ćelija –
KLONOVA u kojima su novi geni prisutni u
svakoj ćeliji
Novi gen je ušao u nasleĊe – KLONIRANI
GEN
![Page 29: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/29.jpg)
Identifikacija bakterija koje iskazuju novi gen
Koja bakterija sadrži pravilno konstruisan
rekombinantni plazmid sa kloniranim genom?
Bakterija koja stvara proizvod koji kodira gen
![Page 30: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/30.jpg)
![Page 31: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/31.jpg)
Problemi u kloniranju gena
1. Restriktivne endonukleaze mogu iseći i
uništiti gen koji treba klonirati. Više od
jednog gena povezano u ekspresiji odreĊene
karakteristike.
2. Gen donora nepravilno ubaĉen u plazmidni
vektor. Bakterija ne može da iskaže gen, ne
prepoznaje start i stop signale.
![Page 32: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/32.jpg)
I dalje problemi
3. Protein – proizvod unutar ćelije u velikim,
nerastvorljivim agregatima. Izolacija proteina
neće dati odgovarajući proizvod.
4. Može se stvarati previše produkta – letalan
za bakterijsku ćeliju (primer: geni za sintezu
fenilalanina – aminokiselina koja se koristi u
stvaranju aspartama, veštaĉki zaslaĊivaĉ
![Page 33: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/33.jpg)
Problemima nikad kraja
5. Proizvod može biti uništen nakon sinteze.
Bakterije imaju sisteme za otkrivanje i
uništavanje stranih proteina ukoliko se jave u
ćeliji
6. Nestabilnost plazmida. Ne nasleĊuje svaka
ćelija ćerka plazmidni vektor za vreme deobe
ćelija.
![Page 34: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/34.jpg)
I sad KRAJ
7. Ekstrakcija i preĉišćavanje proizvoda
Gram (-) bakterije (E.coli) ne izdvajaju proteine u spoljašnju sredinu; neophodno da se unište bakterijske ćelije.
Gram (+) bakterije (Bacillus subtilis) izdvajaju proteine, ali stvaraju i proteolitiĉke enzime koji uništavaju proizvod
Kvaci nemaju spoljašnju membranu i obiĉno ne stvaraju protelitiĉke enzime (geni za bakterijsku celulazu klonirani u ćelijama kvasca)
![Page 35: Geneti Ki in Enjering](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050820/5695d2da1a28ab9b029bf22f/html5/thumbnails/35.jpg)