Download - Genetic Engineering
1
2
Gene Engineering การสร�าง gene ใหม่ โดยตั�ดตัอระหว่าง DNA จากแหล่งที่��ตัางก�น ได� DNA โม่เล่ก�ล่ใหม่ เป็�นโม่เล่ก�ล่ผสม่ เร�ยก
ว่า Recombinant DNA ว่ ธี�การที่"าหร#อ methodology เร�ยกว่า
Recombinant DNA technology หร#อ
Genetic engineering หร#อGene cloning
3
I. หล่�กการ Recombinant DNA (Gene cloning)
II. สว่นป็ระกอบในการที่"า gene cloning III. การป็ระย�กตั&ใช้� Gene cloning
4
I. หล่�กการที่"า Recombinant DNA
1. แยก DNA ของพาหะ แล่ะ DNA ที่��ตั�องการที่"า cloning2. ตั�ด DNA ของที่�*ง 2 แหล่งด�ว่ย Restriction endonuclease3. ผสม่ DNA ที่�*ง 2 แหล่ง ก�บ DNA ligase
ภายใตั� เง#�อนใขให� DNAs ตัอก�น -- > ได�
Recombinant DNA หร#อ Chimeric DNA
5
การสร�าง Recombinant DNA
6
II. สว่นป็ระกอบของการที่"า Gene Cloning
1.Gene ที่��ตั�องการศึ.กษา เร�ยกว่า foreign DNA
2. DNA พาหะ เร�ยว่า Vector DNA 3. Restriction endonuclease4. DNA ligase ตัอระหว่าง 2 nucleotides5. Host cells ส"าหร�บ recombinant DNA
เพ#�อเพ �ม่จ"านว่นในข�*นตั�นของกระบว่นการ ที่��พ�ฒนาใช้�ได�แล่�ว่ม่� bacteria บางช้น ด แล่ะyeast
7
ข�*นตัอนล่ะเอ�ยดในการที่"า Gene cloning
1. เล่#อก DNA โม่เล่ก�ล่ที่��ตั�องการ clone เร�ยกว่า Foreign DNA แล่ะเล่#อก
DNA โม่เล่ก�ล่ที่��น"าหน�าที่��เป็�นพาหะ เร�ยก ว่า Vector DNA
ตั�ด foreign DNA แล่ะ ตั�ด vector DNA ด�ว่ย enzyme ช้น ดเด�ยว่ก�นEnzyme ที่��ใช้�เร�ยกว่า Restriction enzyme (แยกคนล่ะหล่อด)
8
2. เล่#อกที่อน (fragment) ของ cut foreign DNA ขนาดพอเหม่าะที่��จะ clone
โดย แยก DNA ในแผนว่� �น ใน สนาม่ไฟฟ3า เร�ยกว่ ธี�น�*
ว่า Electrophoresis ซึ่.�ง DNA จะถู6กออก จากก�นตัาม่ขนาดคว่าม่ยาว่ ได�ป็รากฏเป็�นแถูบ
(bands) ตัาง ๆ ก�น ตั�ดแล่ะแยกแถูบที่��ตั�องการออกม่าสก�ดแยกDNA ที่อน (fragment) ที่��ตั�องการ
9
DNA gelelectrophoresi
s ส"าหร�บแยกช้ *น
สว่น DNA
10
3. Insert DNA fragment เข�าไป็ในโม่เล่ก�ล่ของ cut vector DNA ด�ว่ย enzyme Ligase จะได� DNA ผสม่โม่เล่ก�ล่ใหม่ เร�ยกว่าChimeric DNA หร#อ RRRRRRRRRRR RRR 4. น"า Recombinant DNA เข�าไป็ใน host cells ของ cloning vector โดยว่ ธี� Transformation หร#อ ว่ ธี�อ#�น ๆhost cells โดยที่��ว่ไป็ใช้� E. coli แล่ะ yeast 5. Recombinant DNA ภายใน host จะแบง
ตั�ว่เพ �ม่จ"านว่น เร�ยกว่า Amplification แล่ะ ถูายที่อดไป็พร�อม่ก�บการแบงตั�ว่เพ �ม่จ"านว่นของ
host ที่"าให�ได� identical copies หร#อclones ของ recombinant DNA จ"านว่นม่าก
11
หล่�กการพ#*น ฐานของ
Gene cloning
Clone หม่าย ถู.ง ป็ระช้ากร
(copy) ที่��เหม่#อนก�นของ
ส �งม่�ช้�ว่ ตัหร#อโม่เล่ก�ล่
12
6. ที่"าการตัรว่จเล่#อกหา (screening) host cells ม่� recombinant DNA
13
Cloning Vectors
1 . Plasmid 2.Bacteriophage
3. Cosmid 4. PhageRRR 5. Artificial
RRRRR RRRR R
14
1. Plasmid vectors
Plasmids เป็�น extrachromosome ในmicroorganisms โดยเฉพาะ
bacteria เป็�น double-stranded circular โม่เล่ก�ล่ ขนาด ~ 1 kb (1 kb = 1000 bp) ถู.ง 200 kb
ม่� antibiotic-resistant genes ที่��สาม่ารถูใช้� เป็�น markers
ส"าหร�บค�ดเล่#อก clones ที่�� positive pBR322 เป็�น plasmid ตั�ว่แรกที่��ใช้�ใน cloning
15
11. Plasmid322pBR
ขนาด 4.3 Kb ม่� Ampicillin resisteant gene Tetracyclin resistant gene ม่� restriction sites ม่ากแล่ะ งายตัอการใช้�ที่"า cloning เช้น EcoRI, PstI, BamHI ม่� Origin of replication เป็�น cloning vector ใน
prokaryote น"าเข�า bacteria โดย
Transformation
16
Bacteria l cloning
โดยใช้� plasmid pBR322
17
ด�ดแป็ล่งจาก 2 um plasmid (พ เศึษ ) ของ yeast
ขนาด 6 kb ม่� resistant gene ตัอ inhibitors
เช้น copper แล่ะ methotrexate marker ค#อ leu2 gene ใช้�เป็�น cloning vector ในeukaryote
Transform yeast
RRRRR RRRRRRRR RRRRRRRR 12
RRRR/
18
Yeastcl oni
ng โดยใช้�
plasmid ที่��ม่�LEU2 gene
เป็�นmarker
19
Ti p lasmid หร#อ T-DNA ในAgrobacterium tumefaciens ในด น
integrate เข�า plant chromosomal DNA
ที่"าให�เก ดเน#*องอกในพ#ช้ (callus) หร#อcancer growth หร#อ crown gall ในพ#ช้
13. Ti plasmid
20
Gene cloning โดยใช้�Ti plasmid
เพ#�อให� T-DNA (tumor DNA)
ใน bacteria infect (แที่รก )
เข�าchromosome ของพ#ช้ --> crown gall --> ช้�กน"าให�เจร ญเป็�นตั�นพ#ช้
21
2. Bacteriophage vectors
- Double stranded virus ที่��บางระยะของว่งจร ช้�ว่ ตัอย6ในร6ป็ Linear duplex
สว่นม่ากใช้� Bacteriophage Lambda ( ) ขนาด~ 50 kb
ม่� genes ~ 50 % อย6 2 ข�างของ linear duplex ที่��จ"าเป็�นตัอ growth
บร เว่ณกล่างไม่จ"าเป็�นตัอ growth สาม่ารถูตั�ดออกได� package DNA ให�เป็�น circular form ได� 78-105 %
22
การใช้� phage เป็�นcloning vector
สว่นกล่างเป็�นสว่นที่��ไม่จ"าเป็�นในการด"ารงช้�พ
ของ phage จ.งสาม่ารถูเอา
foreign DNA ใสเข�าไป็แที่นได�
cos
cos
23
ใน Linear duplex ที่��บร เว่ณป็ล่ายส�ดที่�*ง 2 ข�างของเส�นเป็�นช้ว่ง Single strand ขนาด
12 nucleotides เร�ยกว่า Cohesive ends หร#อ COS sites
Cos sites ที่"า complementary ตัอก�น ให� ได� circular duplex DNA กอน pack เข�า
capsule กล่ายเป็�น bacteriophage ใหม่ vector ร�บ insert ได� 12-25 % จ.ง
เหม่าะส"าหร�บในการที่"า cloning ของ eukaryotic genes ซึ่.�งสว่นม่�ขนาดใหญ เช้น ใช้�ที่"า Genomic library
24
2.2 M13 vector
S - ingle stranded phage ร�บ insert ที่��เป็�น single-stranded DNA ระหว่าง 300-1000 bases Rolling circle replication ให� double strand
ออกจาก bacteria ในร6ป็ single strand เหม่าะส"าหร�บใช้� cloning เพ#�อ sequence DNA
25
3. Cosmid vector
Vector ที่��สร�าง (construct) จากสว่นของ - 1. Plasmid: dr ug r esi st ant mar ker , or i gi n
of replication แล่ะ restriction sites จ.งม่� replication ได�เหม่#อนplasmid
2. Phage : cos sites ส"าหร�บpackaging cloned DNA ให�เป็�นphage chromosome ใน in vtro
26
cosmid ม่�ขนาด 4-6 kb
construct ให�ม่�polycloning site
cosmid สาม่ารถูร�บinsert foreign DNA ได�ระหว่าง 35 - 50 kb
เหม่าะในการ clone gene ขนาดใหญของeukaryote
27
4. Pagemid vector
Vector ที่�� construct ให�ม่� ค�ณล่�กษณะคล่�ายcosmid ค#อ ม่�ที่�*งล่�กษณะของ phage แล่ะplasmid
ม่� multiple cloning site insert เข�าที่�� lacZ gene
ม่� origin of replication จาก single-stranded f1 คล่�าย M13 ที่"าให� package
ได� single-stranded phagemid DNA
28
Bluescript vector / pBS ใช้�เป็�น Transcri pti onvector
ม่� Multiple cloning site ม่� 2 promoters ค#อ
T3 promoter ข�างหน.�ง แล่ะ T7 promoter อ�กข�างหน.�ง
สาม่ารถู transcribe RNA ใน in vitro ใช้� ศึ.กษา translation in vitro
29
5. Artificial chromosome
เป็�น Construct เพ��อที่"า cloning ในyeast เร�ยกว่า Yeast Artificial chromosome / YAC
เป็�น mini-chromosome ป็ระกอบด�ว่ย 1 centromere, 2 telomeres,
originof repl i cati on, แล่ะ seletable marker gene(s)
ใช้�ศึ.กษา chromosome segregation ระหว่าง meiosis แล่ะ cloning DNA
ขนาดใหญได�ถู.ง 150 kb
30
Yeast Artificial chromosome / YAC
31
Restriction Endonuclease
recognize specific nucleotidesequences
ตั�ดระหว่าง - 4 8 nucleotide ล่"าด�บเฉพาะแตัล่ะช้น ด
32
Resstriction enzymes
ตั�ด DNA ให� ป็ล่าย 2
แบบ Blunt end
Sticky end
33
DNA ligase เช้#�อม่ตัอระหว่าง 2 nucleotide
ของ 2 DNA โม่เล่ก�ล่ Sticky ends : efficiency
คอนข�างด� Blunt ends : efficiency
น�อยกว่า
34
35
DNA library ค#อ ห�องสม่�ด หร#อ s ets ของ cloned DNA
ใน vectors ที่��เก>บไว่�ที่�*งหม่ดใน host cells เพ#�อใช้�ตัรว่จหาแล่ะศึ.กษา genes ภายหล่�ง
แบงเป็�น 3 ป็ระเภที่1. Genomic DNA library : ห�องสม่�ดcloned DNA ของ 1 genome ซึ่.�งค#อgenes ที่�*งหม่ดของ ส �งม่�ช้�ว่ ตัใด ๆ เช้นhuman genome library
2. cDNA library : ห�องสม่�ด cloned cD NA ของ structural gene ใด ๆ
3. - Chromosome specific DNA library : ห�องสม่�ด cloned DNA ของ 1
chromosome
36
37
Application ของ Gene Recombinant Technology
1. Physi cal maps / restri cti onmaps o f DNAmol ecul e
หาแผนผ�งตั"าแหนงของ gene บนchromosomes 2. Nucleotide sequences of gene
หาล่"าด�บ base ของ gene 3. - In vitro site specific mutagenesis
ศึ.กษาการที่"างาน แล่ะการคว่บค�ม่ของ genes โดย การที่"า mutation เฉพาะ base(s)
38
4. I denti fi cati onof genes ช้�*บอก gene แล่ะ รายล่ะเอ�ยดของ gene
เช้น gene ที่��ที่"าให�เป็�นโรค 5. Human gene therapy
ร�กษาโรคที่างพ�นธี�กรรม่ โดยหล่�งว่ เคราะห& ได�ว่า gene ใดเป็�นเหตั�ของโรค น"า
gene หร#อผล่ผล่ ตั (protein) ของgene น�*น ใสหร#อใช้�ที่ดแที่น
ป็3องก�นโดยไม่ให� gene(s) เป็�นสาเหตั� ของโรคร�นแรงถูายถูอด
39
6. Producti onof protei ns ผล่ ตั proteins, hormones แล่ะ enzymes ใช้�bacteria ซึ่.�งเป็�น host ของ recombinant DNA เป็�นผ6�ผล่ ตัให� โดยไม่ตั�องสก�ดจากส �งม่�ช้�ว่ ตัช้�*นส6งโดยเฉพาะส�ตัว่& 7. Transgeni c organisms (plants & animals) หร#อ GMO (Gene modified organism)
crowngal l ,herbi c i de แล่ะ i nsecti ci de resi stant pl ants เช้น
ข�าว่ ข�าว่โพด ถู��ว่เหล่#อง ม่ะเข#อเที่ศึ ม่�นฝร��ง หน6 (ที่ดล่อง ) ฯล่ฯ 9. Paternity tests & forensi c appl i cati on
DNAfi ngerpri nts หาคว่าม่เป็�นพอ- แม่ หาคนร�าย
40
ตั�ว่อยางการป็ระย�กตั&ใช้�Gene Recombinant
Technology
41
Genetic Maps
42
DNA Sequencing
43
Cloning Growth Hormone Gene
44
Gene Therapy : ร�กษาโรคที่างพ�นธี�กรรม่
45
Transgenic Animal
การเตัร�ยม่ฉ�ด DNA ด�ว่ย
microinjection เข�าไป็ในไข
Transgenic mouse (ซึ่�าย)
46
Transgenic Plants
Luciferase plant พื�ชเรื�องแสง
Glyphosate-tolerant petunia
47
DNA Fingerprintings : Identify บ�คคล่ / พอ-แม่
การเตัร�ยม่ DNA Fingerprint
ings
48
หาพอ - แม่ หาคนร�ายจากผ6�ตั�องสงส�ย
49
Cell Cloning
ให�เป็�น cloned animal1. แยก cell จากส�ตัว่&ที่��โตั เตั>ม่ว่�ยแล่�ว่
2. Fuse รว่ม่ก�บ unfertilized egg ที่�� ได� เอา nucleus ออกแล่�ว่
3. กระตั��นให�แบงเซึ่ล่ล่& กล่ายเป็�นตั�ว่ออน(embryo)
4. น"าฝากใสม่ดล่6กของส�ตัว่& ตั�ว่เม่�ยที่��พร�อม่ตั�*งครรภ&l
50