Download - genetica forensica
GENETICA FORENSIC- introducere -
dr. Florin STANCIU Institutul de Criminalistic
I. Preambul
DefiniieGenetica Forensic este ramura geneticii care se ocup cu aplicarea cunotinelor genetice pentru probleme juridice i de procedur legal. Genetica Forensic este, de asemenea, o ramur a medicinei legale care se ocup mai pe larg, cu punerea n aplicare a cunotinelor medicale pentru probleme juridice.Genetica Forensic astzi tinde s evoce ADN-ului. Cu toate acestea, chiar termenul de amprentare ADN este o reminiscen a unor metode mai vechi de identificare a poliiei. Genetica Forensic nu este un domeniu nou. Cu mult nainte de epoca de amprentare a ADN-ului, a existat testarea grupei sanguine (HLA i alte teste ale unor markeri genetici specifici sngelui) pentru a se determina cine este faptaul i cel mai adesea, cine nu este faptaul.
MedicineNet.com
Flux de lucru1
CERCETARE LA FAA LOCULUI ANALIZA PRELIMINAR IZOLAREA ADN-ului CUANTIFICAREA ADN-ului UMAN
Probe biologice n LITIGIU
2
34
5
PCR MULTILOCUS ELECTROFOREZA CAPILAR INTERPRETAREA REZULTATELOR BAZELE DE DATE GENETICE
6
Probe biologice de REFERIN
7
8
Film 1
I. Izolarea ADN-ului (uman)
IntroducereMetodele i tehnicile aferente izolarii ADN-ului, au evoluat odat cu progresele fcute n Genetic i Biochimie. Iniial au fost folosite protocoalele de izolare laborioase, toxice, consumatoare de mult material biologic (ex. izolare organic), apoi au fost descoperite protocoale ultrarapide uor de realizat (ex. izolarea folosind rin Chelex sau FTA paper), precum i protocoale ce permit automatizarea (ex. izolarea magnetic).Tendinele generale ale acestei evoluii au fost: specificitatea crearea de protocoale de izolare specifice categoriilor tisulare (ex. protocoalele pentru esut osos, difer de cele de izolare a ADN-ului din snge) sau specifice tipului de ADN (ex. ADN total, ADN mitocondrial, etc.);
eficientizarea reducerea etapelor protocoalelor de izolare considerate toxice (ex. izolarea ADN-ului folosind Fenol:Cloroform:Izopropanol) sau a reduceri pailor de lucru (scderea anselor de contaminare a probelor cu ADN strin);
calitatea obinerea de extracte ADN cu un nalt grad de puritate i totodat cu un grad redus de degradare (fragmentare);
cantitatea obinerea de ADN din cantiti reduse de material biologic (ex. izolarea dintr-o singur celul epitelial sau dintr-un singur spermatozoid folosind microdisecia laser).
Cerine i masuri de asigurare a calitii n etapa de izolare a ADN-ului
Prelevarea probelor biologice prin metode ct mai puin invazive (n cazul probelor biologice de referin), n condiii sterile, uor de conservat. Evitarea contaminrii i inter-contaminrii probelor biologice analizate prin purtarea de echipament special (halat, cotiere, bonet, masc, ochelari i mnui sterile) i folosirea de instrumente decontaminate n prealabil cu hipoclorit de sodiu (NaOCl), UV, autoclavare, etc..Utilizarea unei probe de control negativ (tub fr prob biologic) i a unei probe de control pozitiv (tub cu prob biologic cunoscut) pe parcursul fluxului de lucru. Numerotarea corespunztoare a tuburilor. Toi reactivii, instrumentele i echipamentul folosit trebuie s satisfac standardele minime pentru controlul calitii (termen de valabilitate, parametrii de calitate, etc.).
Se vor schimba vrfurile de pipet dup fiecare utilizare.Restul de reactiv rmas n vrful pipetei nu va fi niciodat returnat n recipientul de unde a fost luat, acesta va fi aruncat.
Tipuri de probe biologice umane (I)
Tipuri de probe biologice umane (II)
Izolarea ADN-ului - considerente generale (I)1. Fragmentarea probei biologice (pentru probele biologice dure) prin mcinare mecanic (n care se poate folosi azotului lichid), pn se obine o pudr fin. Aceast etap, este necesar pentru a mrii suprafaa de expunere a probei biologice la compuii chimici ce vor fi ulterior folosii n protocol. 2. Liza celular - Rolul de rupere a membranele celulare i de expunere a coninutul celular spre exterior. Prin incubarea esuturilor n tampon fosfat la temperaturi apropiate de cea a fierberii, cu ajutorul unor degradani chimici puternici de tipul fenolului, SDSului sau tiocianatului de guanidin, la care se mai poate aduga proteinaza K, etc. n cazul esutului osos i a esutului dentar, pentru a ndeprta bariera mecanic din jurul osteoclastelor i osteocitelor este necesar o decalcifiere prealabil cu EDTA. 3. Eliminarea celulelor nelizate - Nu toate celule ce intr n componena probei biologice (introduse iniial n tuburile de reacie), vor liza cu aceai vitez. Pentru a trece la urmtoarele etape este necesar eliminarea acestora prin transferul supernatantului obinut n urma unei centrifugri, ntr-un alt tub.
Izolarea ADN-ului - considerente generale (II)4. Splarea lizatului celular - Se realizeaz cu ajutorul compuilor chimici menionai n etapa de liz celular, dar n soluii puin diferite i are rolul de a degrada diferitele structuri organice celulare de tipul complexelor proteice, lipidice sau glucidice, precum i de a minimaliza sau a elimina efectul soluiilor folosite n etapele anterioare. n aceast etap dac esutul/proba biologic este proaspt, pentru a evita o contaminare cu ARN se poate folosi RN-aza.5. Precipitarea ADN-ului - Pentru a izola ADN-ul de celelalte componente organice nc prezente n tuburile de reacie, se poate folosi un alcool care duce la agregarea ADN-ului sub forma unui precipitat vscos sau se pot folosi particule magnetice sau particule de silica care pe baza unor diferene de sarcin, leag de suprafaa acestora ADN-ul aflat n suspensie.
6. Splarea ADN-ului - Se folosete alcool etilic, alcool izopropilic i/sau aceton, pentru a elimina diferiii contaminani care pot rmne intercalai printre moleculele de ADN, sau ataai de acestea (ARN, proteine, polizaharide, lipide, compui chimici folosii n protocol, etc.).7. Izolarea i conservarea ADN-ului - ADN-ul se usuc la t.c., prin evaporarea alcoolului folosit n etapa precedent, se rehidrateaz n tampon TE sau ap distilat steril, dup care se depoziteaz pn la noi etape de analiz la -40 C (pentru cteva sptmni) sau la -200 C (pentru mai mult timp).
Izolarea ADN-ului folosind compui organiciIzolarea ADN-ului folosind fenol:cloroform:alcool izoamilic este o tehnic de izolare n care volume egale de compui organici i lizat celular sunt amestecate formnd o soluie bifazic compus dintr-o faz apoas i o faz organic. ntre aceste faze, dup centrifugare se regsesc precipitate proteice i polizaharidice, vizibile sub forma unei pelicule albe. Avantajele acestei metode constau n obinerea unui ADN pur dar numai atunci cnd sunt folosite cantiti suficiente de prob biologic. Datorit caracterului sau toxic dar i a numeroaselor etape n care ADN-ul n cantitate mic se poate pierde prin transfer, aceasta metod a fost nlocuit de altele mult mai uor de realizat i mai puin toxice. Cu toate acestea n extraciile curente n care probele biologice sunt compuse din esuturi ale organelor interne, esut muscular sau esut osos, aceast metod rmne preferat datorit uurinei cu care compuii organici elimin cantitile mari de proteine, lipide i polizaharide prezente n mod obinuit n aceste esuturi.
Natura probelor biologice: Fire de par cu bulb Fragmente tisulare Snge Saliva esut Osos esut Dentar
Izolarea ADN-ului folosind rina ChelexRin chelatoare de ioni Chelex prezint o afinitate deosebit ctre ionii de cupru, fier i alte metale precum i cationii monovaleni ca cei de sodiul i potasiu. Selectivitatea acesteia pentru ionii divaleni fa de cei monovaleni este de aproximativ 5000 la 1 i prezint o puternic atracie pentru metalele tranziionale chiar i n soluii saline foarte concentrate. Din punct de vedere chimic, rin Chelex este un stiren divenilbenzen ce conine perechi de ioni iminodiacetat care acioneaz ca grupri chelatoare n legarea ionilor metalici polivaleni. Aceast rin chelatoare de ioni se regenereaz eficient ntr-un acid diluat i funcioneaz n soluii bazice, neutre sau uor acide cu un pH = 4 sau mai mare. La pH foarte mic, rin se comport ca un schimbtor de anioni. Datorit proprietilor sale rina permite limitarea procesului de degradare a ADN-ului n momentul n care are loc liza celular, prin inactivarea endonucleazelor aciune direct a lipsei substratului catalitic al acestora (ionii metalici).
Natura probelor biologice:Celule epiteliale Fire de par cu bulb Supernatant obinut n urma splrii de fragmente tisulare. Snge Saliva
Izolarea ADN-ului folosind Silica (SiO2)Principiul izolrii/purificrii ADN-ului folosind matrice de silica se bazeaz pe nalta afinitate a macomoleculelor de ADN ncrcate negativ pentru particulele de silica ncrcate pozitiv. n condiii de nalt salinitate macromolecula de ADN se leag strns de acestea, permind splarea i ndeprtarea contaminanilor intercalai. n condiii de trie ionica mic, macromoleculele de ADN se desprind de silica permind eluia acestuia.
Natura probelor biologice:esut Osos esut Dentar esut Dentar
AGOWA mag DNA Isolation KitPrincipiul acestui kit de izolare al ADN-ului i n general a protocoalelor de izolare magnetic, const n ataarea ADN-ului pe suprafaa unor particule magnetice (denumite i paramagnetice sau superparamagnetice). Aceste particule sunt compuse dintr-un miez de magnetit nvelit ntr-o matrice de legare cu afinitate pentru moleculele de ADN (structura acestei matrice reprezint n cazul de fa un secret comercial, ns prin similitudine cu alte kit-uri de izolare magnetic cel mai probabil este o matrice compus dintr-o rin care prezint aceleai proprieti ca i particulele de silica, adic leag ADN-ul pe suprafaa lor pe baza diferenelor de sarcin dintre suprafaa particulelor i macromolecula ADN. Particulele magnetice sunt manipulate cu ajutorul unui cmp magnetic creat de electromagnei componeni ai separatorului magnetic AGOWA (n funcie de etapele protocolului de izolare magnetic a ADN-ului), ceea ce permite efectuarea de splri eficiente asupra fragmentelor de ADN.
Natura probelor biologice: Celule epiteliale Fire de par cu bulb Fragmente tisulare Snge Saliva
FTA PaperFTA paper este un sistem de colectare, arhivare i purificare oferit de Whatman, foarte uor de folosit, caracterizat prin liza celular la contactul celulelor cu suprafaa hrtiei FTA i expunerea acizilor nucleici. Conform productorilor, acest sistem permite: a) liza membranei nucleare i a organitelor celulare; b) denaturarea proteinelor; c) blocarea fizic a acizilor nucleici n matricea de fibre ce intr n componena acesteia; d) imobilizeaz acizi nucleici ntr-o faz solid; e) previne degradarea cauzat de aciunea enzimelor; f) inhib creterea fungal i microbian; g) inactiveaz virusurile; h) protejeaz ADN-ul de degradarea mecanic; i) permite pstrarea probelor biologice la temperatura camerei.
Imagine de microscopie electronic a unui fragment de hrtie FTA, imediat dup ce s-a adugat snge lichid pe suprafaa acestuia. Se pot observa elementele figurate aflate n stadiul de liza celular.
Imagine de microscopie electronic a unui fragment de hrtie FTA dup ce acesta a fost splat de cteva ori. Se pot observa ADN-ul imobilizat n matricea de fibre.
Cuantificarea ADN-ului de origine umana (I)Determinarea cantitii de ADN obinute n urma izolrii, este esenial pentru majoritatea sistemelor PCR ntruct condiiile optime se nscriu ntr-un domeniu restrns de concentraii. De exemplu protocoalele de amplificare pentru kit-urile ABI Profiler Plus i Cofiler multiplex STR specific necesitatea utilizrii unei cantiti de 1-2,5 ng ADN matri pentru a se obine rezultate optime (Perkin Elmer Corpoartion 1998). De asemenea, kit-urile STR Promega lucreaz cel mai bine n acest domeniu de concentraii. O cantitate prea mare de ADN duce la obinerea unor peak-uri care ies din scala de msurare. Atunci cnd se lucreaz cu cantiti prea mici de ADN, nu se pot evidenia unele alele, deoarece reacia PCR nu amplific n mod corespunztor ADN-ul. Acest fenomen este cunoscut sub numele de fluctuaie stohastic (fluctuaie ntmpltoare)Primeri specifici. Hibridizare specifica
Cuantificarea ADN-ului de origine umana (II)
Transferul Energiei de Rezonan Fluorescent (FRET) de la valori energetice nalte la valori mici Nu se genereaz semnale reporter n cazul probelor intacte.
nlturarea captului cu fluorocrom reporter ca urmare a activitii nucleazice a Polimerazei.
Clivarea secvenei specifice TaqMan Probe ca urmare a activitii nucleazice a enzimei Taq Polimeraza FRET se dezactiveaz genernd un semnal reporter.
Amplificare complet. Un semnal reporter este eliberat pentru fiecare nou copie a secvenei de ADN iniiale
Automatizarea protocoalelor de izolare ADN (I)
Stanciu F., Stoian I. M., Popescu O. R; Evaluation of Freedom Evo 150 with AGOWA sep9600 for Databasing Purposes, P17, Book of Abstracts, Forensica 2008, Praque, Czech Republic.
Automatizarea protocoalelor de izolare ADN (II)
Film 2
II. Markerii Short Tandem Repeat (STR)
Markerii STRAu rspndire randomic n genomul uman, dimensiuni relativ mici i variabilitate ridicat la nivelul indivizilor unei populaii
sunt secvene de ADN necodificatore compuse din 2-6 perechi de baze repetate n tandem
Sunt instrumente genetice importante pentru realizarea hrilor genetice, analiza transmiterii nlnuite a caracterelor ereditare, filogenie, identificarea de persoan, etc..
Nomenclatura markerului Microsatelii SSR (Simple Sequence Repeat) STS/STMS (Sequence-Tagged Microsatellite Site) STR (Short tandem Repeat).
Nomenclatura locilor Secvene ADN intronice TH01 - n intronul 1 al genei pentru tirozin hidroxilaza, FGA - n intronul 3 al genei pentru alfa fibrinogenul uman; Secvene ADN intergenice denumire standard de tipul: Dn1Sn2 (Exemplu D5S818)
Nomenclatura alelelor Conform recomandrilor ISFH, alelele markerilor STR trebuie denumite innd cont de numrul unitilor repetitive ale markerului, iar atunci cnd exist alele care se abat de la motivul complet al unitii repetitive, se ia n considerare numrul unitilor repetitive complete, urmat de punct i numrul de nucleotide din motivul incomplet. (Exemplu: TH01 [AATG]9 = alela 9, [AATG]6 ATG [AATG]3 = alela 9.3)
Clasificare (I)
Clasificare (II)
Dup numrul de nucleotide ce compun unitatea repetitiv.
Repetiii mononucleotidice - dou motive posibile: A i C Repetiii dinucleotidice 4 motive posibile: AC, AG, AT i CG Repetiii trinucleotidice 10 motive posibile: AAC, AAG, AAT, ACG, ACT, AGC, AGC, AGG, ATC i CCG Repetiii tetranucleotidice 33 motive posibile: AAAC, AAAG, AAAT, AACC, AACG, AACT, AAGC, AAGG, AAGT, AATC, AATG, AATT, ACAG, ACAT, ACCC, ACCG, ACCT, ACGC, ACGG, ACGT, ACTC, ACTG, AGAT, AGCC, AGCG, AGCT, AGGC, AGGG, ATCC, ATCG, ATGC, CCCG i CCGG Repetiii pentanucleotidice 102 motive posibile Repetiii hexanucleotidice 350 motive posibile Din punct de vedere matematic exist 4, 16, 64, 256, 1024 i 4096 motive posibile pentru repetiii mono-, di-, tri-, tetra-, penta- i hexanucleotidice. Cu toate acestea, datorit repetiiei n tandem a acestor secvene, unele motive repetitive sunt echivalente ntre ele. Pentru a determina dac un motiv A este echivalent cu un altul B se ine cont dac: - motivul A este complementar cu motivul B, - motivul A este diferit de motivul B i de secvena complementar a acestuia, datorit modificrii cadrului de citire (frameshift). Exemplu: motivele (GAAA)n, (AGAA)n, (AAGA)n, (AAAG)n, (TTTC)n, (TTCT)n, (TCTT)n i (CTTT)n sunt echivalente.
Clasificare (III)
Dup complexitatea motivului unitii repetitive (Urquhart et al.):
- Repetiii simple cu motive complete: FES/FPS, CSF1PO, D5S818, D13S317, etc. (GATA)(GATA)(GATA) - Repetiii simple ce prezint i alele cu motive incomplete: TH01, F13A1, D7S820,etc. (GATA)(GAT)(GATA)
- Repetiii compuse, formate din dou sau mai multe motive : GABRB15(GATA)(GATA)(GACA) - Repetiii compuse ce prezint i alele cu motive incomplete: VWA, FGA, D8S1179, etc.
(GATA)(GACA)(CA)(CATA)- Complexe repetitive: D21S11 - Repetiii hipervariabile: SE33
Metode i tehnici de analiza a markerilor STR (I)Marcare fluorescenta a capatului 5 Secventa Primer 3-end 5-end Linkeri Non-nucleotidici (modificatori de mobilitate) Pentru fiecare linker adaugat se realizeaza o modificare a ratei de migrare de ~2.5 pb
Amplificarea PCR genereaza anmpliconi marcati fluorescent ce contin si modificatori de mobilitate
FAM (blue)
JOE (green)
TAMRA (yellow)
ROX (red)
Metode i tehnici de analiza a markerilor STR (II)Penta E FGA Penta D CSF1PO
D18S51
D16S539TPOX D7S820
D8S1179 D21S11 D13S317
TH01
VWA
D5S818D3S1358
Amelogenin
PowerPlex 16 BIO
Metode i tehnici de analiza a markerilor STR (III)LASER Argon (488 nm) Separare pe baza dimensiuniiSpectrograph ABI Prism
Separarea CulorilorFluorescenta
Separarea Ampliconilor
Capilar
CCD Panel (cu filtre virtuale) Detectarea Ampliconilor
Injectarea Ampliconilor
GeneScan/Genotyper software
Amestec de ampliconi marcati fluorescent
Interpretarea rezultatelor
Avantaje ale markerilor STR (I)Caracteristici / Metoda RFLPmediimari
RAPDmicimici
AFLPmicimedii
STRmarimici
SNPmarimari
Costuri de dezvoltare a tehniciiCosturi de funcionare / ntreinere
Probe / ziNivel de pregtire necesar Automatizare
20mic dificil da/nu
50mic da nu mic / mediu D mediu
50mediu da da/nu
50mic / mediu da da/nu
20mare da da/nu
Radioactivitate / fluorocromie necesarCoeficient de siguran Dominan / Codominan Polimorfism
mare C mediu
mare D(C) mediu
mare C mare
mare C depinde de secvena de ADN analizata
Avantaje ale markerilor STR (II)Mare RFLP Multi-Locus Probes RFLP Single Locus Probes PolyMarker D1S80 single STR DQ ABO blood groups Rapida Markeri Genetici Markeri Genetici Multiplex STRs Puterea de Discriminare (Factori Genetici)
mtDNA
Mica Inceata
Viteza Analizei (Factori Tehnologici)
Simplicitate tehnica
Informativite
Genotip
ADN degradat
Amestec
Multilocus Probe
+
+++
-
-
-
Single locusMinisatelii Microsatelii (repetiii de 2pb) PCR Microsatelii (repetiii de 3 i 4 pb)
++++ ++ ++
+++ + +
(+)+ + ++
+ ++ ++
+++ + +
ADN mitocondrial (SNP)
+
++
+++
++
-
STR Autozomal (I)Markerii autozomali STR stau la baza eforturilor internaionale n a crea un set de loci standard pentru toate rile care folosesc aceti markeri n identificarea de persoan, n ideea uurrii cooperrii transfontaliere, respectiv al alinierii bazelor de date naionale la standardele formrii bazelor de date internaionale pe de-o parte, iar pe de alt a asigurrii unui numr suficient de loci pentru discriminarea eficient ntre indivizii unei populaii. n acest sens se evideniaz formarea de ctre FBI n 1998 a sistemului de 13 loci CODIS (Combined DNA Index System), a sistemulului de 6 loci al Interpolului: ISSOL (Interpol Standard Set Of Loci) i ESS (European Standard Set) a sistemului de 10 loci ce urmeaz a fi ratificat de rile membre UE prin tratatul de la Prum.
STR Autozomal (II)Nume Kit STR Loci Inclusi Probabilitatea de regasire
AmpFlSTR BlueAmpFlSTR Green I AmpFlSTR COfiler AmpFlSTR Profiler Plus AmpFlSTR Profiler Plus ID AmpFlSTR Profiler
D3S1358, VWA, FGAAmelogenin, TH01, TPOX, CSF1PO D3S1358, D16S539, Amelogenin, TH01, TPOX, CSF1PO, D7S820 D3S1358, VWA, FGA, Amelogenin, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820 D3S1358, VWA, FGA, Amelogenin, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820 (extra unlabeled D8-R primer) D3S1358, VWA, FGA, Amelogenin, TH01, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820
1.0 x 10-37.8 x 10-4 2.0 x 10-7 2.4 x 10-11
2.4 x 10-119.0 x 10-11 4.5 x 10-13 5.1 x 10-15 7.2 x 10-19
AmpFlSTR SGM PlusAmpFlSTR SEfiler AmpFlSTR Identifiler
D3S1358, VWA, D16S539, D2S1338, Amelogenin, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, TH01, FGAFGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338, D19S433, SE33, amelogenin
CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338, D19S433, amelogenin
STR Autozomal (III)Marker D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO Localizarea Cromozomala 8 21qll.2-q21 7q11.21 -22 5q33.3-34 Alelele incluse n Ladder 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18,19 24, 24.2, 25, 26, 27, 28, 28.2, 29, 29.2, 30, 30.2, 31, 31.2, 32, 32.2, 33, 33.2, 34, 34.2, 35, 35.2, 36, 37, 38 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 Fluorocrom 9947A 13 30 10,11 10,12
6-FAM
D3S1358TH01 D13S317 D16S539 D2S1338 D19S433 vWA
3p11 pi 5.5 13q22-31 16q24-qter 2q35-37.1 19q12-13.1 12p12-pter
12,13,14,15,16, 17,18,194,5,6,7,8,9,9.3, 10,11,13.3 8,9,10,11,12, 13, 14,15 5,8,9,10,11,12,13, 14,15 15,16,17,18,19, 20,21,22,23,24, 25, 26, 27, 28 9,10,11,12,12.2, 13,13.2, 14,14.2, 15,15.2, 16,16.2, 17, 17.2 11,12,13,14,15,16, 17,18,19,20,21, 22, 23, 24 VIC
14,158,9.3 11 11,12 19,23 14,15 17,18 NED
TPOXD18S51 Amelogenina D5S818 FGA
2p23-2per18q21.3 X:p22.1-22.3 Y:p11.2 5q21 -31 4q28
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 137, 9, 10, 10.2, 11, 12, 13, 13.2, 14, 14.2, 15,16,17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 X,Y 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16
815,19 X 11
PET 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26.2, 27, 28, 29, 30, 30.2, 31.2, 32.2, 33.2, 42.2, 43.2, 44.2, 45.2, 46.2, 47.2, 48.2, 50.2, 51.2 23,24
STR Heterosomal - Cromozomul Y (I)Cromozomul Y nu sufer recombinare, ceea ce face pe de-o parte ca acesta s se transmit exclusiv pe linie patern, iar pe de alt parte rata mutaional s fie considerabil redus comparabil cu markerii STR autozomali. Acesta situaie a permis folosirea markerilor STR de pe cromozomului Y n studii de paternitate i mult mai important n studii de filogenie pe linie patern.
STR Heterosomal - Cromozomul Y (II)MarkerDYS456
Alelele incluse n Ladder1318
Fluorocrom
DNA00715
DYS389IDYS390
10151827
6-FAM
1324
DYS389IIDYS458
24341420
2917
DYS19DYS385 a/b
1019725
VIC
1511,14
DYS393DYS391 DYS439 DYS635 DYS392 Y GATA H4 DYS437 DYS438 DYS448
816713 815 2026 718 813 1317 813 1724 PET NED
1311 12 24 13 13 15 12 19
miniSTR (I)Markerii miniSTR sunt markeri STR a cror secvene primer au fost micorate n vederea creterii eficienei n dou situaii posibile: 1) n cazurile mutaiilor prezente n regiunea de legare a primerilor clasici i 2) n cazul probelor biologice degradate n care ADN-ul se gsete foarte fragmentat.
miniSTR (II)
miniSTR (III) AmpFlstr MiniFilerLocus D13S317 D7S820 Amelogenin D2S1338 Localizare 13q22-31 7q11.21-22 X:p22.1-22.3 Y:p11.2 2q 35-37.1 Alelele incluse n Ladder 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 X, Y 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 Fluorocrom 6-FAM DNA007 11 7.12 X,Y 20,23 VIC 28.31
D21S11
21q11.2-q21
24, 24.2, 25, 26, 27, 28, 28.2, 29, 29.2, 30, 30.2, 31, 31.2, 32, 32.2, 33, 33.2, 34, 34.2,35, 35.2, 36, 37, 385.8,9. 10,11.12.13.14. 15 7, 9, 10, 10.2, 11, 12, 13, 13.2, 14, 14.2, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26.2, 27, 28, 29, 30, 30.2, 31.2, 32.2, 33.2, 42.2, 43.2, 44.2, 45.2, 46.2, 47.2, 48.2, 50.2, 51.2
D16S539 D18S51 CSF1PO
16q24-qter 18q21.3 5q33.3-34
9. 10 NED 12,15 11.12 PET
FGA
4q28
24,26
Artefacte - Produii StutterProdusii Stutter sunt ampliconi cu 4 perechi de baze mai mici sau mai mari dect ampliconul unui alele. Aceste amplificri nespecifice sunt cauzate de alunecarea - mperecherea greit a ADN polimerazei, n timpul amplificrii PCR. Conform modelului de alunecare - mperechere greit, n procesul de extensie, ntr-o regiune a complexului primer - matri primer-ul elongat se decupleaz de matri (se distaneaz de matri), ceea ce duce la alunecarea fie a primer-ului fie a matriei, iar la recuplare matria formeaz o bucl pe lungimea unui bloc repetitiv. Consecina acestei bucle, de mrimea unui bloc de secven repetitiv, este c produsul PCR este mai scurt dect ampliconul primar cu un bloc repetitiv (Hauge i Litt 1993).
Artefacte - Adiii non-matriADN polimerazele, n particular Taq Polimeraza folosit n PCR, adaug adesea un nucleotid suplimentar la captul 3 al produsului PCR, atunci cnd copiaz catena matri (Clark 1988, Magnuson et al. 1996). Aceast adiie non-matri este de cele mai multe ori adenozina, de aceea acest proces se numete adenilare, iar produsul - forma +A a ampliconului. Adiia non-matri duce la formarea unui produs PCR, care are o pereche de baze mai mult dect secvena int. Adiia nucleotidului 3, A, este favorizat de introducerea unei etape finale de incubare la 60 sau 72 C, dup parcurgerea etapelor de termociclare PCR (Clark 1988, Kimpton et al. 1993). Gradul de adenilare depinde de secvena catenei matri care n cazul PCR este captul 5 a primer-ului revers.
Artefacte Pull-upn urma excitrii laser a fluorocromilor cu care sunt marcai primeri, rezult un fascicul de lumin care este descompus n culorile componente cu ajutorul unor filtre speciale. Aceast descompunere nu este total existnd un grad de suprapunere ntre culorile cu lungime de und apropiat. Dintre cele patru culori folosite cel mai frecvent, albastru i verde au cel mai mare grad de suprapunere. Aceste suprapuneri fac ca uneori s apar artefacte de tip pull-up respectiv, ntreptrunderea peak-ului unei alele de pe o culoare pe o alta, ceea ce poate duce la atribuirea de alele false (ntruct un pull-ul poate corespunde ntmpltor unei zone care de obicei i este atribuit unei alele din ladder) n cazul n care nu se compar culorilor ntre ele pentru anumii loci, n momentul interpretrii rezultatelor.5-FAM JOE NED ROX100
Normalized Fluorescent Intensity
80
60
40
20
0
520
540
560
580
600
620
640
Lungimea de Unda (nm)
Laser excitation(488, 514.5 nm)
Alele excluse i alelele nulen momentul amplificrii fragmentelor ADN format din secvene repetitive, este posibil apariia fenomenului de excludere a unor alele. Se cunoate faptul c polimorfismul de secven se poate exprima att n interiorul zonei repetitive a unei alele ct i n afara acestei zone. Modificrile secvenei pot fi la nivelul a trei regiuni (n raport cu zona de legare a primerului): n zona repetitiv, n zona terminal i n zona de legare a primer-ului. Dac are loc o schimbare n matria ADN la zona de legare a primer-ului PCR, hibridizarea primer-ului va fi mpiedicat i de aceea amplificarea nu mai poate avea loc i nu va putea fi detectat alela din matria ADN. Pe scurt, matria ADN pentru o anumit alel exist dar nu poate fi amplificat pe parcursul PCR datorit nehibridizrii primer-ului. Acest fenomen duce la apariia aa numitelor alele nule. Din fericire alelele nule sunt rare deoarece zonele ce flancheaza regiunea repetitiv a locilor sunt destul de stabile i constante n populaia uman.
Bazele de Date
Baze de Date NaionaleCODIS (SUA) UK National Database (Anglia) SNDGJ (Romnia)
Baze de Date Publice PubMed [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/] The Allele Frequency Database (ALFRED) Internet DataBase (STRBase)
[http://alfred.med.yale.edu/alfred/index.asp]
Short Tandem Repeat DNA (http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase)
Y-STR haplotype reference database [http://www.yhrd.org] ENFSI DNA WG STR Population Database [http://www.str-base.org] Earth Human STR Allele Frequencies Database (EHSTRAFD)[http://www.ehstrafd.org]
V mulumesc pentru atenie!