![Page 1: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/1.jpg)
1. Genomikáról általában, főbb metodikák, összehasonlításuk
2. Második generációs szekvenálás alkalmazási területei 1.
3. Második generációs szekvenálás alkalmazási területei 2.
4. Mutagenezis technikák/ Harmadik generációs szekvenálás
![Page 2: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/2.jpg)
Genomics is the study of the genomes of organisms.
Milestones:- Full sequence of f-X174 bacteriophage (5368 bp) 1977, Frederick Sanger -The first free-living organism to be sequenced was that of Haemophilus influenzae (1.8 Mb) in 1995, Hamilton Smith - Shotgun technique 1998, Celera Genomics- Fruit fly (Drosophila melanogaster) in 2000- Human in 2001 (3.3 Gb)- Human in good quality in 2007 (less than one error in 10,000 bases and all chromosomes assembled)-Today: more than 1000 prokaryotic genomes, more than 2500 viruses and around 100 eukaryotic genomes (more than half are fungi) are fully sequenced
![Page 3: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/3.jpg)
Genomics
Functional genomics
Personal genomics
Metagenomics
Nutrigenomics
Psychogenomics
Nitrogenomics Hydrogenomics etc.
Pharmacogenomics
![Page 4: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/4.jpg)
Functional genomics
Related to transcriptomics and proteomics
Only 1.5 % of the human genome encodes proteins (ca. 20 000 genes)
![Page 5: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/5.jpg)
Personal genomics
![Page 6: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/6.jpg)
Pharmacogenomics
![Page 7: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/7.jpg)
Nutrigenomics
![Page 8: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/8.jpg)
Psychogenomics (Behavioural genetics)
The role of genes in behaviour.
![Page 9: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/9.jpg)
Metagenomics
![Page 10: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/10.jpg)
Nitrogenomics
![Page 11: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/11.jpg)
Techniques applied in Genomics
General features:- High-troughput- Generate huge amount of data- Data evaluation is often the main challenge
1. Microarray techniques
2. Sequencing techniques
![Page 12: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/12.jpg)
1. Microarray techniques
Arrayed series of thousands of spots of DNA oligonucleotides, called probes. Probes can beshort sections of genes that are used to hybridize a cDNA sample (called target) under high-stringency conditions. Probe-target hybridization is usually detected and quantified bydetection of fluorophore- or chemiluminescence-labeled targets to determine relativeabundance of nucleic acid sequences in the target.
![Page 13: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/13.jpg)
Microarray experiment
![Page 14: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/14.jpg)
Microarray’s weaknesses
Ioannidis et al; Nat Genet 41 (2009)
- arrays prerequisite known sequences- examination of similar sequences is almost impossible by arrays (cross-hybridization, specificity issues)- array reproducibility shows huge fluctuations
![Page 15: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/15.jpg)
2. Sequencing techniques
1. Traditional sequencing: non-high-throughput(not detailed here, see Gabor Rakhely’s lecture)1.1. Maxam-Gilbert method1.2. Chain termination method (Sanger method): key principle is the use of
dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs) as DNA chain terminators1.3. Shotgun sequencing (Sanger chemistry)
Chain termination method Shotgun seq
![Page 16: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/16.jpg)
2. High-throughput sequencing NGS (next generation sequencing)
2.1. Second generation sequencing (pyrosequencing, sequencing byligation), this is the present454 Life Sciences: pyrosequencingIllumina: sequencing by synthesisABi SOLiD: sequencing by ligation
2.2. Third generation sequencing (nanopore sequencing, one moleculesequencing), this is the futurePacific BiosciencesHelicosComplete GenomicsEtc.
![Page 17: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/17.jpg)
Need for library preparation in a host
• Labour and time - intensive, expensive
• Toxic regions are not represented
• Host genome contaminations
Low throughput
• strand synthesis and base determination are separated
• need for electrophoretic step
• high unit cost (cost/bp)
No need for library preparation in a host
• immobilized template fragments, PCR methods
• labour, time and cost effective
High throughput
• several millions of sequencing /run
• synthesis and sequencing are not separated
Sanger sequencing
NGS (Next Generation Sequencing)
No competition, but complementation
Long read, low coverage
Short read, huge coverage(especially SOLiD and Illumina)
Use in: De novo sequencing, validation
Use in: Resequencing, SNP analysis, RNA-Seq
Main characteristics of sequencing generations
![Page 18: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/18.jpg)
Illumina platform
![Page 19: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/19.jpg)
454 FLX
![Page 20: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/20.jpg)
October 2007
SOLiD V 1.0
June 2008
SOLiD V 2.0
August 2010
SOLiD V 4
ABi SOLiD platform
![Page 21: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/21.jpg)
Comparison of NGS technologies
Illumina
![Page 22: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/22.jpg)
Mix DNA Library
& capture beads
(limited dilution)
454 FLX Technology
“Break micro-reactors”
Isolate DNA containing beads
• Generation of millions of clonally amplified sequencing templates on each bead
• No cloning and colony picking
Create
“Water-in-oil”
emulsion
+ PCR Reagents
+ Emulsion Oil
Perform emulsion PCR
Adapter carrying
library DNA
A
BMicro-reactors
![Page 23: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/23.jpg)
Centrifuge Step
Load Enzyme
Beads
44 μm
Load beads into
PicoTiter™Plate
454 FLX Technology
![Page 24: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/24.jpg)
Photons
Generated are
Captured by
Camera
Reagent Flow
PicoTiterPlate Wells
Sequencing
By Synthesis
(pyrosequencing)
Sequencing Image Created
454 FLX Technology
Enzymes needed:- DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, apyrase
Template: ssDNA
Addition of one of the four dNTPs in each step
![Page 25: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/25.jpg)
Flow Order
• Count the photons generated for each “flow”
• Base call using signal thresholds
• Delivery of one nucleotide per flow ensures accurate base calling
TACG
1-mer
2-mer
3-mer
4-mer
KEY (TCAG)
Measures the presence
or absence of each
nucleotide at any given
position
454 FLX Technology: Basecalling
![Page 26: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/26.jpg)
Summary of 454 FLX
• Read length: 350-450 bases
• Throughput: 400MB/slide/run
(average bacterial genome size: 5 MB)
• Homopolymer problem
(caused by proportionality of light intensity)
![Page 27: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/27.jpg)
Illumina Technology
Step 1-6DNA Fragmentation
Adaptor ligationTemplate amplification
![Page 28: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/28.jpg)
Illumina Technology
Step 7-12
Base determination
(sequencing by synthesis,
differently labeled nucletides,
laser excitation, fluorescence
detection)
Base imaging
Multiple cycles
![Page 29: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/29.jpg)
Illumina Technology
Summary:
• Read length: 35-50 bases
• Throughput: 8 GB/flowcell/run
(1600x coverage on 5 MB bact. genome)
• High accuracy (no homopolymer issue)
Flow cell
![Page 30: Genomikáróláltalában, főbb metodikák, összehasonlításuk 2 ...biotech.szbk.u-szeged.hu/biotechmsc/MG_MSC_2011_ora1.pdf · Functional genomics Related to transcriptomics and](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022071013/5fcb2b684d9db90fe35c5442/html5/thumbnails/30.jpg)
SOLiD™ Chemistry