A Edição de Genomas e os Impactos na Agricultura
Giancarlo Pasquali
Universidade Federal do Rio Grande do SulInstituto de Biociências & Centro de Biotecnologia
Hereditary Tyrosinemia
Massachusetts Institute of Technology - MIT - USA
Novas Metodologias de Melhoramento Genético de Plantas Edição de DNA – DNA Editing
Tópicos
1.Edição de DNA: principais metodologias
2.Vantagens e aplicações das técnicas de edição de DNA a vegetais
3.Exemplos de plantas geradas por edição de DNA
4.Principais organizações envolvidas
5.Biossegurança relativa à edição de DNA em plantas
O Dogma Central da Biologia Molecular
http://www.rsc.org/images/FEATURE-nobel-400_tcm18-165980.jpg
Promotor A Sequência
codificadora
Terminador A
Promotor B Terminador B
G. Pasquali - CBiot/UFRGS
G. Pasquali - CBiot/UFRGS
Gene de interesse + Gene marcador
TRANSGENIA = TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA
Edição de DNA: Principais Metodologias
Meganucleases - 2001 - Engineered Meganuclease Re-engineered Homing
Endonucleases
ZFN - 2003 - Zinc Finger Nucleases (Nucleases do Tipo “Dedos-de-Zinco”)
TALENs - 2009 - Transcription Activator-like Effector Nucleases (Nucleases Efetoras
Semelhantes a Ativadores da Transcrição)
CRISPR/Cas9 - 2012/2013 - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
/Cas9 System (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e
Regularmente Interespaçadas/Sistema Cas9)
CRISPR/Cas9Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
Genome Editing with CRISPR-Cas9Published on Nov 5, 2014
This animation depicts the CRISPR-Cas9 method for genome editing – a powerful new technology with many applications in biomedical research, including the potential to treat human genetic disease. Feng Zhang, a leader in the development of this
technology, is a faculty member at MIT, an investigator at the McGovern Institute for Brain Research, and a core member of thBroad Institute. Further information can be found on Prof. Zhang’s website at http://zlab.mit.edu.
https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8
Wiedenheft et al. (2012) RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.Nature 15: 331 (doi: 10.1038/nature10886)
Mali et al. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339: 823(doi:10.1126/science.1232033)
CRISPR/Cas9Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
Gene Editing Mechanism of CRISPR-Cas9https://vimeo.com/112757040
In this animation, learn how CRISPR-Cas9 gene editing technology can be used to preciselydisrupt and modify specific genes.
Credit: Wyss Institute at Harvard University.
More information: wyss.harvard.edu/viewpressrelease/180/broad-institute-harvard-and-mit-license-crisprcas9-technology-to-editas-medicine-for-therapeutic-applications
Ann Ran et al. (2013) Nature Protocols 8: 2281 (doi:10.1038/nprot.2013.143)
(short-guide RNA)
https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/crispr-cas9-and-targeted-genome-editing-a-new-era-in-molecular-biology
New England Biolabs Inc. - CRISPR/Cas9 and Targeted Genome Editing
http://www.artofthecell.com/animation/crispr-cas9-gene-editing
ZFNsZinc Finger Nucleases
Urnov et al. (2010) Genome editing with engineered zinc fingernucleases. Nature Reviews Genetics 11: 636
Isalan (2012) Zinc-finger nucleases: how to play two good handsNature Methods 9: 32
Os domínios “dedos-de-zinco” de proteínas que ligam DNA sãoconhecidos desde 1994. Pesquisadores produziram 64 versõesde domínios dedos-de-zinco capazes de ligar tri outetranucleotídeos e, assim, ligar especificamente qualquersequência de DNA. Aos domínios dedos-de-zinco foi acopladauma nuclease, FokI, que realiza a clivagem de DNA. Portanto, asZFNs realizam essencialmente a mesma atividade de Cas9,porém a região de ligação ao DNA é determinada por domíniosproteicos do tipo “dedos-de-zinco” (e não por gRNAs).
ZFNsZinc Finger Nucleases
http://cen.acs.org/articles/87/i30/Knockout-Rats-Easy-Way.html
Each zinc finger protein (Zn is silver) iscoupled to a FokI domain (central ribbonstructures). When two of the proteins bindto their target sequence, the FokI domainsjoin and create a double-strand break.
Credit: Sangamo Biosciences
TALENs or TAL Effector NucleasesTranscription Activator-like Effector Nuclease(s)
Bogdanove & Voytas (2011) TAL effectors:customizable proteins for DNA targeting.Science 333: 1843(doi: 10.1126/science.1204094)
No sistema TAL ou TALENs, as nucleases FokIsão acopladas a domínios peptídicos quereconhecem um único nucleotídeo e,portanto, são de 4 tipos, fundamentalmente.Novamente, qualquer região cromossômicapode ser acessada a partir da sequência dedomínios de ligação ao DNA.
TALENs or TAL Effector NucleasesTranscription Activator-like Effector Nuclease(s)
Bogdanove & Voytas (2011) TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science 333: 1843 (doi: 10.1126/science.1204094)
Structure of a TAL effector protein wrapped arounda DNA double helix. Image based on data fromMak et al. (2012) Science
http://mcgovern.mit.edu/news/?attachment_id=1807#sthash.xuVcALVi.dpuf
Engineered Meganuclease Re-engineeredHoming Endonucleases
Meganucleases are endodeoxyribonucleases characterized by a large recognition site:
double-stranded DNA sequences of 12 to 40 base pairs.
Grizot et al. (2009) Nucleic Acids Research 38: 2006 (doi:10.1093/nar/gkp1171)
Crystal structure of I-DmoI meganuclease in complex with its target DNA.
Marcaida et al. (2008) PNAS 105: 16888
Cientistas da Cellectis(França) desenvolveram uma coleção de mais de 20.000 domínios proteicos a partir da meganucleasehomodiméricaI-CreI, assim como para outros arcabouços de meganucleases.
Vantagens e Aplicações das Técnicas de Edição de DNA
➢ Edição direta de sequências cromossômicas sem extensos
programas de melhoramento
vs
➢ Melhoramento genético tipicamente obtido por métodos
aleatórios seguido de seleção, incluindo:
➢ Indução de mutações aleatórias
➢ Cruzamentos genéticos
➢ Transformação genética mediada por agrobactérias, biobalística, etc.
Vantagens e Aplicações das Técnicas de Edição de DNA
➢ Silenciamento por “deleção” (ablação): as nucleases
direcionadas a sítios específicos do genoma promovem quebras
de dupla fita (DSB). Ao reparar a quebra de DNA, a célula
inadvertidamente rompe a sequência gênica, adicionando ou
removendo alguns nucleotídeos (união terminal não-homóloga
ou nonhomologous end-joining - NHEJ).
Vantagens e Aplicações das Técnicas de Edição de DNA
➢ Correção de genes: ao combinar ao sistema da nuclease um
fragmento de DNA exógeno com complementaridade às
extremidades do DNA clivado, a sequência-alvo pode ser
reescrita por reparação dirigida por homologia (homology
directed repair - HDR).
➢ Especificidade: a tecnologia CRISPR/Cas9 potencialmente possui
razão de um erro a cada 100 bilhões de bp (teoria), ou seja,
especificidade suficiente para aplicações em pesquisa.
Edição de DNA – Vetores
Integração de DNA: plantas transgênicas capazes de expressar Cas9 e gRNA/crRNA.Transformação mediada por agrobactérias.
(Micro)injeção de RNAs ou Cas9 e gRNAs/crRNAPor eletroporação, choque osmótico, biobalística.Não há introdução de DNA e não há integração de transgenes no genoma.
Exemplos de Plantas Geradas por Edição de DNA
1....
http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2015.01.010
Araki & Ishii
Disease R
Oil Qlity
Disease R
Herbicide
Nutrition
Application of genome editing technologies in plants
PLANT SPECIES TRAIT STUDIED METHOD USED
Arabidopsis thaliana Gene modification ZFN
Nicotiana tabacum Gene editing ZFN
Zea mays Targeted integration into endogenous loci ZFN
Arabidopsis thaliana Targeted mutagenesis TALEN
Oryza sativa Targeted mutagenesis TALEN
Oryza sativa Gene editing TALEN
Arabidopsis thaliana Targeted transcriptional gene repression TALEN
Arabidopsis thaliana Herbicide resistance ODM
Nicotiana tabacum Herbicide resistance ODM
Oryza sativa Herbicide resistance ODM
Shah T, Andleeb T, Lateef S, AliNoor M (2018) Genome editing in plants: Advancing crop transformation and overview of tools. Plant Physiology & Biochemistry 131: 12-21.
(1/3)
PLANT SPECIES TRAIT STUDIED METHOD USED
Zea mays Herbicide resistance ODM
Brassica napus Herbicide resistance ODM
Arabidopsis thaliana Gene knockout or editing CRISPR/Cas
Nicotiana benthamiana Gene knockout or editing CRISPR/Cas
Nicotiana tabacum Gene knockout or editing CRISPR/Cas
Oryza sativa Gene knockout or editing CRISPR/Cas
Arabidopsis thaliana Multiplex genome editing CRISPR/Cas
Nicotiana tabacum Multiplex genome editing CRISPR/Cas
Arabidopsis thaliana Gene insertion or replacement CRISPR/Cas
Nicotiana benthamiana Gene insertion or replacement CRISPR/Cas
Arabidopsis thaliana Epigenetic gene regulation CRISPR/Cas
Glycine max Targeted mutagenesis CRISPR/Cas
(2/3)
Shah T, Andleeb T, Lateef S, AliNoor M (2018) Genome
editing in plants: Advancingcrop transformation andoverview of tools. Plant
Physiology & Biochemistry131: 12-21.
PLANT SPECIES TRAIT STUDIED METHOD USED
Oryza sativa Targeted mutagenesis CRISPR/Cas
Camelina sativa Improvement of nutritional value CRISPR/Cas
Solanum lycopersicum Yield improvement CRISPR/Cas
Zea mays Yield improvement CRISPR/Cas
Oryza sativa Salt resistance CRISPR/Cas
Oryza sativa Drought resistance CRISPR/Cas
Zea mays Herbicide resistance CRISPR/Cas
Triticum aestivum Biotic resistance CRISPR/Cas
Oryza sativa Biotic resistance CRISPR/Cas
Arabidopsis thaliana Biotic resistance CRISPR/Cas
Oryza sativa Biotic resistance CRISPR/Cas
Oryza sativa Biotic resistance CRISPR/Cas
Cucumis sativus Biotic resistance CRISPR/Cas
(3/3)
Shah T, Andleeb T, Lateef S, AliNoor M (2018) Genome
editing in plants: Advancingcrop transformation andoverview of tools. Plant
Physiology & Biochemistry131: 12-21.
Exemplos de Organizações Atuando em Edição de DNA
http://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/genome-editing/genome-editing-publications/genome-engineering-poster.html#
Exemplos de Organizações Comerciais(ordem alfabética)
Cellectis – Meganucleases
Dow – ExZact™ – ZNF
Horizon Discovery – GENASSIST™ – CRISPR/Cas9
New England Biolabs – CRISPR/Cas9
OriGene – CRISPR/Cas9
Precision Biosciences – Meganucleases
Sigma (Aldrich) Life Science – CompoZr™ – ZNF & CRISPR/Cas9
Thermo Fisher Scientific – CRISPR/Cas9
Addgene – TAL Effectors & CRISPR/Cas9
Life Technologies – GeneArt® Precision TALs – TALENs & CRISPR/Cas9
Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas
➢ A edição de DNA permite o melhoramento vegetal sem a
introdução de transgenes. Permite gerar plantas semelhantes ou
essencialmente idênticas àquelas geradas por técnicas
convencionais de melhoramento, criando fronteiras indistinguíveis
para a regulamentação de OGMs.
➢ Transgênese vs Cisgênese vs Intragênese: a engenharia genética
convencional é trabalhosa e requer longa e intensa seleção para
encontrar os vegetais mutantes desejados.
Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas
➢ Off-target effects: a ocorrência de mutações não-alvo é a mais
forte crítica ao emprego das tecnologias de edição de DNA.
➢ Pesquisadores vem desenvolvendo estratégias que permitirão
reduzir a um mínimo a possibilidade de mutações não-alvo.
➢ Aumento do tamanho de RNAs guias
➢ Emprego de duas CRISPR/Cas9 combinadas com quebras
de fitas-simples
Canela et al. (2015) Collateral DNA damage produced by genome editing drones: exception or rule? (Review)Molecular Cell 58: 565
Translocations Discovered by LAM-PCR HTGTS (human DNA-edited)
(A) Top: CRISPR/Cas9 wild-type (left) and D10A nickase (right) generates DSBs and DNA nicks, respectively, leading to on-target and potentially off-target DSBs; aberrant fusions of the DNA ends can cause chromosomal translocations. Bottom: scheme of LAM-PCR HTGTS technology to detect novel translocation partners. Cartoon illustrates the arrangement of chromosomes into three distinct territories within the nucleus. The highlighted square indicates the enlarged view of the on-target (red) and off-target (green) DSBs that are in proximity to each other, thus promoting translocations. Following DNA extraction and shearing, a biotinylated primer specific to the bait DSB is extended, amplifying the hybrid fragment on-target-off-target (bait-prey). The product is subsequently purified with streptavidin and ligated to an adaptor, allowing PCR amplification followed by the identification of the off-targets by next-generation sequencing.
(B) Circos plot illustrating the different type of translocations discovered by the HTGTS method, including off-targets DSB ‘‘hotspots,’’ widespread DSBs reflecting non-specific and endogenous DSBs, and inter-homologous fusions involving DSBs generated on both homologous chromosomes. CRISPR/Cas9 (D10A nickase) suppresses translocation hotspots and reduces widespread DSBs in contrast to wild-type CAS9, although inter-homologous fusions at the bait chromosome still persist.
(C) Combination of a known DNA break instigator (CRISPR/Cas9; leading to translocation pattern depicted by red lines, bottom) together with an uncharacterized genomic mutator (e.g., TALEN or AID, top) reveal novel translocation partner induced by the latter (blue lines, bottom).
Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas
➢ Off-target effects: plantas mutantes geradas por agentes
mutagênicos clássicos (raios X ou químicos) apresentam
(inúmeras) mutações não-alvo (e raríssimamente investigadas).
Qual é a diferença entre produtos?
➢ Protocolo de Cartagena sobre Biossegurança: “Organismo vivo
modificado é qualquer organismo vivo que possua uma nova
combinação de material genético obtida por meio do uso da
biotecnologia moderna.”
Biossegurança Relativa à Edição de DNA em Plantas
➢ Plantas geradas por edição de DNA podem gerar segregantes
nulos, isto é, linhagens sem quaisquer transgenes ou insertos de
DNA exógeno integrados nos cromossomos e, assim, escapariam
da definição do Protocolo e das regulamentações sobre OGMs.
➢ Lei Brasileira de Biossegurança (No 11.105): “Organismo
Geneticamente Modificado - OGM: organismo cujo material
genético – ADN/ARN tenha sido modificado por qualquer técnica
de engenharia genética.”
Process-based GMO Regulations:
➢ União Europeia, Austrália e Nova
Zelândia: mais exigentes
➢ A adição de sequências/genes mediada
por HDR (reparação dirigida por
homologia) será regulamentada.
➢ A introdução de indels por NHEJ (união
terminal não-homóloga) será
regulamentada na EU, mas não na Nova
Zelândia (Suprema Corte vs EPA).
Product-based GMO Regulations:
➢ EUA, Argentina e Canadá: menos
restritivas
➢ A adição de sequências/genes mediada
por HDR (reparação dirigida por
homologia) será regulamentada.
➢ A introdução de indels por NHEJ (união
terminal não-homóloga) não será
regulamentada.
Araki & Ishii (2015) Trends in Plant Science 20: 145