GROUND ROUND “GRUPPO PROSTATA”
“Gli anticorpi come strumento per lo studio e la terapia del carcinoma prostatico ”
Milano15 febbraio 2005
Mariangela Figini
Molecular Therapies Unit, INT, Milan
MeccanismiMeccanismi di di distruzionedistruzione del del tumoretumoredada parteparte del del sistemasistema immuneimmune
cTCD8
TCD4
IL-2, IFN, TNF...
IL-2
B ly
Anticorpitumore-specifici
Monociti, DC
NKAttività
antitumoralediretta
Attivitàantitumorale
(rilascio di citochine,lisi, etc.)
Le grandi scoperte della medicina
1975 Anticorpimonoclonali
ANTICORPI
gruppo di proteine seriche che specificamente legano ed inattivanoagenti estranei quali :
Proteine eterologhe Virus Batteri Parassiti Funghi Cellule Tumorali
e che hanno importanti attività biologiche.
Molecular Therapies Unit, INT, Milan
E’ stato calcolato che il repertorio anticorpale umano può raggiungere una dimensione di 109 molecole anticorpali diverse.
STRUTTURA DELLE IMMUNOGLOBULINE
Da Abbas, Lichtman & Pober: Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders, 1999
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VISIONE TRIDIMENSIONALE
Effetto citotossico
TERAPIA CON ANTICORPI
Innesco di meccanismi effettori della risposta immune
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Fc ReceptorAg
ComplementC1q
TargetEffector
Targetting
MAb
Fc ReceptorAg
ComplementC1q
TargetEffector
Targetting
MAb
TERAPIA CON ANTICORPI
Signals blocked by MAb
MAbLigands blocked by MAb
Target
Signals blocked by MAb
MAbLigands blocked by MAb
Target
TargetAg
Signals activated by MAb
TargetAg
Signals activated by MAb
Attivazione del segnale: anti-recettore
Blocco della trasduzionedel segnale : anti-recettore
anti-ligando
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(Bevacizumab/Avastin)
(Trastuzumab/HerceptinCetuximab/Erbitux(Rituximab/Rituxan)
STRATEGIE PER AUMENTARE LA POTENZA DEGLI ANTICORPI
CITOCHINE:Innesco di meccanismi effettori della risposta immune
Effetto citostatico/citotossicoGemtuzumab (anti CD33 AML)
RADIONUCLIDIEffetto citostatico/citotossicoZevalin (anti-CD20)Bexxar (anti-CD20)
FARMACI, ENZIMI, TOSSINE:
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Da Carter P. Nat CANCER REV. 2001
siRNA:
PARAMETRI CHE INFLUENZANO L’EFFICACIA IN VIVO DEGLI ANTICORPI
MODALITÀ di SOMMINISTRAZIONE
CARATTERISTICHE del BERSAGLIO
CARATTERISTICHE dell’ANTICORPO
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CARATTERISTICHE del BERSAGLIO
NATURA DELLA NEOPLASIA:Tumore solido\ematopoietico
Dimensioni LocalizzazioneVascolarizzazione
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ANTIGENE BERSAGLIO:Localizzazione (membrana\microambiente)Livello di espressioneSpecificitàRilascioInternalizzazione
Cleareance In Vivo
Immunogenicità
Penetrazione e uptake nel tumore
CARATTERISTICHE dell’ANTICORPO
SPECIE di ORIGINE, DIMENSIONE ed AFFINITA’
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CRONOLOGIA DEI PRINCIPALI AVANZAMENTI BIOTECNOLOGICI CHE HANNO CONSENTITO LO SVILUPPO DELLA IMMUNOTERAPIA CON
ANTICORPI
1975 George Kohler and Cesar Milstein (Nobel 1984) sviluppano la tecnologia di ibridazione somatica per la produzione di anticorpi monoclonali
1983 Kary Mullis (Nobel 1993) inventa la Reazione a Catena dellaPolimerasi (PCR)
1990 John Mc Cafferty et al. esprimono librerie anticorpali sullasuperficie fagica
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PRINCIPALI LIMITAZIONI :
INEFFICIENZA DELLE FUNZIONI EFFETTRICI
BREVE VITA MEDIA IN CIRCOLO (T1/2= 20-60 H)
IMMUNOGENICITA’ (SVILUPPO DI RISPOSTAHAMA)
PRINCIPALI VANTAGGI:
OMOGENEITA’ DELLE PREPARAZIONI
SEMPLICITA’ DI PREPARAZIONE
Anticorpi Monoclonali MURINI in vivo
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Conseguenze della rispostaHAMA
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CLEARANCE ACCELLERATA
RIDUZIONE DELL’EFFICACIA
PRECLUSIONE DI SOMMINISTRAZIONI RIPETUTE
Biodistribuzione di anticorpimonoclonali
PRINCIPALE LIMITAZIONE OSSERVATA:Ridotto accumulo nel tumore
Limitata vascolarizzazioneAlta pressione interstizialeLimitata diffusione: dimensione, affinita’
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POSSIBILI SOLUZIONI:Somministrazione Locoregionale (i.p., i.t.)Uso di frammenti anticorpaliStrategie di pretargeting
ANTICORPO UMANO COME REAGENTE IDEALE PER TERAPIA
metodologie utilizzate per ottenere cloni stabili producenti anticorpi umani:
Fusione somaticaImmortalizzazione con EBV
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Approcci di ingegneria proteica
CRONOLOGIA DEI PRINCIPALI AVANZAMENTI BIOTECNOLOGICI CHE HANNO CONSENTITO LO
SVILUPPO DELLA IMMUNOTERAPIA CON ANTICORPI
1975 George Kohler and Cesar Milstein (Nobel 1984) sviluppano la tecnologia di ibridazione somatica per la produzione di anticorpi monoclonali
1983 Kary Mullis (Nobel 1993) inventa la Reazione a Catena dellaPolimerasi (PCR)
1990 John Mc Cafferty et al. esprimono librerie anticorpali sullasuperficie fagica
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30-40 cicli totaliRisultato amplificazione
DNA doppio filamento 1° STEP denaturazione
2° STEP appaiamento 3° STEP allungamento
Ogn
icic
lodi
am
plifi
cazi
one
prev
ede
3 ST
EP
PRINCIPIO DELL’AMPLIFICAZIONE DEL DNA MEDIANTE PCR
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LE IMMUNOGLOBULINE SONO NATURALMENTESUDDIVISE IN DOMINI FUNZIONALI
Da Abbas, Lichtman & Pober: Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders, 1999
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Murino
Umanizzato
Chimerico
Umano
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Dati Clinici di Immunogenicità e Farmacocinetica
di Anticorpi Monoclonali
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2-3 settimane0%0-1%Umanizzato
100-200 h0-6%6-30%Chimerico
20-62 h30%60%Murino
T 1\2 βANTI IDIOTIPO
HAMA
IgG(2 binding sites)
F(Ab’)2 fragment(2 binding sites)
FAb fragment(1 binding site)
Single Chain (scFv)(1 binding site)
Diabody(2 binding sites)
Triabody(3 binding sites)
MOLECOLE OTTENIBILI PER INGEGNERIA PROTEICA
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ANTICORPO UMANO COME REAGENTE IDEALE PER TERAPIA
Nuove metodologie per ottenere cloni stabili producenti anticorpi umani:
Topi transgeniciEspressione e selezione di librerie anticorpali umane sulla superficie di fagi
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CRONOLOGIA DEI PRINCIPALI AVANZAMENTI BIOTECNOLOGICI CHE HANNO CONSENTITO LO SVILUPPO DELLA IMMUNOTERAPIA CON
ANTICORPI
1975 George Kohler and Cesar Milstein (Nobel 1984) sviluppano la tecnologia di ibridazione somatica per la produzione di anticorpi monoclonali
1983 Kary Mullis (Nobel 1993) inventa la Reazione a Catena dellaPolimerasi (PCR)
1990 John Mc Cafferty et al. esprimono librerie anticorpali sullasuperficie fagica
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LIBRERIE ANTICORPALI ESPRESSE SULLA SUPERFICIE DI FAGI* FILAMENTOSI
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*I fagi sono virus che infettano i batteri e sonoin grado di ospitare nel loro genoma DNA
esogeno
Linfocita
Le variabili anticorpali vengono isolate più facilmente da linfocitidi sangue periferico di donatore o di paziente ma potrebbero essere isolate
anche dalla milza dal midollo osseo o da un linfonodo
mRNA
mRNA
VLCL
VH
Trascriptasi inversa
PCR
Clonaggio
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Libreria anticorpale
PROCESSO DI SELEZIONE FAGICA
VHVL
VL
VH
VHVL
VL
VH
VHVL
VL
VH
VHVL
VL
VH
VHVL
VL
VH
VHVL
VL
VH
INCUBAZIONE DELLA LIBRERIA ANTICORPALE FAGICA
CON L’ANTIGENE IMMOBILIZZATO
LEGAME DEL FAGO SPECIFICO PER L’ANTIGENE IMMOBILIZZATO
VHVL
VL
VH
VHVLV
LV
HVHVL
VL
VH
VHVL
VL
VH VHVL
VL
VH
VHVL
VL
VH
Allontanamento Dei fagi aspecifici
Tramite lavaggi
VHVL
VHVL VHVL
VHVL
ISOLAMENTO DEL FAGO SPECIFICO E SUA
CARATTERIZZAZIONE
VHVL
VL
VH
Produzionesolubile
Caratterizzazione Biochimico funzionale
E genetica
Fago
VHVL
VL
VH
CLCH
VHVL
VH VL
Fab
scFv
Antigene
Linfocita B
MATURAZIONE DI AFFINITA’In vitro
Mutagenesi Sito specificaMutagenesi Random
-ceppi mutatori-error prone polimerasi
Permutazione di catena (Chain-Shuffling)
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MAbs Anti-tumore approvati per terapia dei Tumori ematopoietici
2002/2003CD20Murino(90Y/ 131I)Ibritumomab tiuxetanTositumomab
2001CD52UmanizzatoAlemtuzumab
2000CD33Umanizzatoconiugato
Gemtuzumabozogamicin
1997CD20ChimericoRituximab
APPROVAZIONE FDABERSAGLIOTIPO DI
ANTICORPONOME GENERICO
2004EGFRChimericoCetuximab
2004VEGFUmanizzatoBevacizumab
1998Her2RUmanizzatoTrastuzumab
1994 (D)EpCamMurinoPanorex
APPROVAZIONE FDABERSAGLIOTIPO DI
ANTICORPONOME GENERICO
MAbs Anti-tumore approvati per terapia dei Tumori solidi
Il CaP ha molte caratteristiche che lo rendono un eccellente target per una terapia con anticorpi monoclonali
•La prostata non è un organo essenziale (quindi l’anticorpo non è essenziale che sia tumore specifico in senso stretto ma e suff. che sia organo specifico).
•Le metastasi da CaP coinvolgono principalmente le ossa ed i linfonodi (localizzazioni che ricevono alti livelli di anticorpi circolanti e che da studi su altre patologie sono responsive a questo tipo di trattamento vedi linfomi e carcinoma della mammella).
•CaP è relativamente sensibile alla radioterapia (è quindi auspicabile che il trattamento con radionuclidi possa essere efficace).
•Le metastasi di CaP sono relativamente piccole (quindi l’antigene è facilmente accessibile in quanto la massa facilmente penetrabile).
•La possibilità di monitorare la ripresa di malattia con un marcatore biochimico (PSA) ci permette di utilizzare la terapia anticorpale ai primi segni di ripresa quando il tumore ha dimensioni piccole (quindi più facilmente aggedibile).
•Il PSA ci permette inoltre di monitorare passo a passo l’efficacia della terapia
ANTICORPI IN SVILUPPO NEL CaP
PSMA Prostate SSpecific MMembrane AAntigen
Proteina transmembrana di tipo II (750 aa., 100 kD)
Viene costitutivamente internalizzata
Possiede attività peptidasica ( folato idrolasica , glutammato carbossipeptidasica )
Espresso nella prostata normale, overespresso nei carcinomiprostatici (metastatici, androgeno indipendenti)
Espresso nella neovascolatura di tumori di vario istotipo
Anticorpi anti-PSMA:
7E11 (ProstaScint) Capromab pendetide, J591 e D2B
Nat Clin Pract Urol. 2005 Dec;2(12)Therapy Insight: osteoporosis during hormone therapy for prostate cancer.Smith MR.AMG162 (toremifene) per il controllo dell’osteoporosi dovuta alla somministrazione di ormoni
N. Engl. J. Med. 2005; 353 (12): 1224-35Auto antibody Signatures in Prostate CancerWang X. Et al
RANKL is an essential factor for osteoclastogenesis. Amgen research group has developed AMG 162, a fully human monoclonal antibody to RANKL.
PRODUZIONE MONOCLONALI MURINI
Anti-PSCA Immunizzazione con lisati batterici ricombinanti esprimenti PSCA Gli anticorpi sono in fase di caratterizzazione
Anti-PSMA Immunizzazione con membrane cellulari di LNCaPOttenuto un anticorpo con buona affinità e specificità (D2B). Le variabili dell’anticorpo sono state clonate, sequenziate ed inserite in un vettore fagemidico (pMIMO) da noi costruito per l’espressione di scFv sulla superficie fagica o come solubile
Legame dell’Anticorpo Murino intero e del scFv espresso su fagi
LNCaPAbD2B
LNCaPscFvD2B
Produzione anticorpo monoclonale murino e coniugazione con catena A della ricina
Le Immunotossine (IT) sono reagenti biotecnologici ottenuti mediante il legame di una molecola citotossica (tossina) ad una molecola vettrice ( mAb, citochina, fattore di crescita ), che conferisce al coniugato la specificità di targeting
+ +linker
toxinImmunotoxin
mAb
Clonaggio delle regioni variabili e costruzione di un
scFv
scFv immunotoxin
SCOPO DEL LAVORO:
1. Creazione di una libreria anticorpale da pazienti con CaP, utilizzando la tecnologia del “phage display”
2. Selezione del repertorio anticorpale contro antigeni tumore associati (TAA) già conosciuti ma non ancora validati come markers tumorali
3. Identificazione di nuove molecole tumore associate utilizzando un approccio proteomico
• per contribuire alla determinazione del profilo antigenico del CaP
• per identificare nuovi markers tumorali
SCOPO DEL LAVORO:
1. Creazione di una libreria anticorpale da pazienti con CaP, utilizzando la tecnologia del “phage display”
2. Selezione del repertorio anticorpale contro antigeni tumore associati (TAA) già conosciuti ma non ancora validati come markers tumorali
3. Identificazione di nuove molecole tumore associate utilizzando un approccio proteomico
• per contribuire alla determinazione del profilo antigenico del CaP
• per identificare nuovi markers tumorali
SCOPO DEL LAVORO:
1. Creazione di una libreria anticorpale da pazienti con CaP, utilizzando la tecnologia del “phage display”
2. Selezione del repertorio anticorpale contro antigeni tumore associati (TAA) già conosciuti ma non ancora validati come markers tumorali
3. Identificazione di nuove molecole tumore associate utilizzando un approccio proteomico
• per contribuire alla determinazione del profilo antigenico del CaP
• per identificare nuovi markers tumorali
Tappe nello sviluppo di unaimmunoterapia
Identificazione del bersaglio
Sviluppo del miglior anticorpo contro il bersaglio
Sviluppo del miglior approccio terapeutico
Studi preclinici in vitro ed in vivo
Produzione per uso clinico (GMP)
Analisi di tollerabilita’ (studi di fase I)
Analisi di efficacia (studi di fase II)
Analisi di efficacia rispetto ai farmaci convenzionali (studi di fase III)
NUOVA IMMUNOTERAPIA
Gli anticorpi monoclonali rappresentano uno trai reagenti con la più alta versatilità ed applicabilitànelle più svariate aree della biomedicina.
Stato dell’arte
Cancer Immune/inflammatory disorders
da Nature Review Drug Discovery
1/4 3/4
Cancer Immune/inflammatory disorders
da Nature Review Drug Discovery
1/4 3/4
CONCLUSIONE
Tramite tecnologie del DNA ricombinante e di ingegneria proteica, è possibile produrre reagenti "su misura", e cioèopportunamente modificabili secondo le specifiche esigenze di utilizzo.
Buone idee e buoni anticorpi necessitano buone infrastrutturee competenze interdisciplinari per convertire un buon risultato di laboratorio in un farmaco utile
La fattibilità del progetto è supportata dalla collaborazone con il Laboratorio del Prof. Colombatti M. (Università di Verona)
UO11
Mimosa MortarinoRenata FerriElena Luison
Silvana Canevari
clinici INT
“gruppo prostata”Riccardo ValdagniTiziana Magnani