Glucósidos Cianogénicos en Productos de Yuca
Darwin Ortiz Osorio*
Teresa Sanchez*
Harold Acosta Zuleta***CIAT, Centro internacional de agricultura Tropical, [email protected]
**Ph.D. Profesor titular, escuela de ingeniería de alimentos. Universidad del Valle
Glucósidos Cianogénicos•Son carbohidratos que producen algunas planta y son productos intermediarios de la biosíntesis de algunos aminoácidos.
Alimentos con cianoglucósidos
Yuca
Sorgo
Almendras amargas
Limón
Cereza
ManzanaRemolacha azucarera
Ciruelas
Melocotón Pera
Enfermedades asociadas al consumo de yuca
Niño enfermo de konzoFotografías cortesía de Konzo.info. Facultad de Medicina de la Universidadde Bergen© Thorkild Tylleskar, 2002.
Konzo o “buka-buka”
Causa parálisis y deformación irreversible de las piernas
Neuropatía atáxica tropical, "TAN"
Causa dificultad progresiva para caminar, se presenta urgencia o retención urinaria,estreñimiento, dolor lumbar e impotencia
Técnica Analítica
• Etapa de Extracción Hidrólisis EnzimáticaDestilación del Cianuro
• Etapa de Cuantificación
O
OH
O
OH
OH
CH2OH
C CH3
CH3
CN
Linamarina,Glucósido Cianogénico
β - glucosidasaC CN
CH3
HO
CH3O
OH
OH
OH
OH
CH2OH
++ H2O
D-Glucosa Cianohidrina
C CN
CH3
HO
CH3
HCN + C CH3
CH3
O
Cianohidrina Acetona
N
O O
CN
Cl
+ H2O CH
O CH
C
COO
CH
OCH2
CH
O CH
C
COO
CH
OCH2N
NCH2
CH3
O
N
NH2C
CH3
O
CH
CH
C
COO
CH
CH2N
NC
CH3
O
NN
C
CH3
O
Como aseguramos que la metodología funciona?
LINEALIDADLINEALIDAD
EXACTITUDEXACTITUD
ROBUSTEZROBUSTEZ
Validación de Métodos Analíticos
SENSIBILIDADSENSIBILIDAD
PRECISIÓNPRECISIÓN
Análisis de Muestras
2,042,04t tablas
9,613,39t calculado
18162228Numero de muestras
0,540,650,841,39LC 95%
1,021,211,903,13Desviación estándar
14,67 ± 0,54*18,48 ± 0,65*22,90 ± 0,84*25,54 ± 1,39*Promedio
Método CIATMétodo JapónMétodo CIATMétodo Japón
Bolsa 2Bolsa 1
* Los limites de confianza son calculados al 95 %
•Prueba t por parejas, y comparación de dos medias experimentales
Ho = “Las medias de los resultados dados por ambos métodos son iguales”
Ha = “Las medias de los resultados por ambos métodos son significativamente distintas”
t calculado > t tabla
La diferencia entre los dos resultados es significativa al nivel del 5 %
CONCLUSIONES• La etapa de extracción del cianuro en la muestra es crítica porque
proporciona un nivel de error elevado
• La curva de calibración del método presenta dos intervalos de respuesta lineal, uno entre 0.1 -0.8 ppm y el otro desde 1.2 y 2.4 ppm. La ecuación de la recta para el primer caso es Y = 1.2955 (±0.038) X - 0.0109 (± 0.018)
• El límite de detección para la determinación de cianuro, hallado según la definición de la IUPAC y basado en la curva de calibración a bajas concentraciones de analito fue de 0.003 ppm, el límite de cuantificación establecido con base en el intervalo de respuesta lineal fue de 0.1 ppm
• Los coeficientes de variación para la repetibilidad y precisión intermedia, tanto para el sistema como para el método, se encontraron por debajo de los valores aceptados para los niveles de concentración ensayados; esto permite concluir que tanto el sistema como el método tienen buena precisión intralaboratorio
• El método de adición de estándar en la determinación de cianuro mostró resultados cercanos al 100 %. Estos permite decir que el método es exacto
Linealidad
y = 1,3006x + 0,0214R2 = 0,9698
0,000,501,001,502,002,503,00
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Concentración de HCN, (ppm)
Abs
orba
ncia
• 3 curvas de calibración, preparadas en días diferentes, en el intervalo de 0.1 – 3.0 ppm de HCN.
• Cada punto de la Curva se le midió la absorbancia por triplicado
Curvas promedio para los 3 dias evaluados en el intervalo 0,1 -0,8 ppm
0,0000,2000,4000,6000,8001,0001,200
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1Concentración ppm
Abs
orba
ncia
Dia 1Dia 2Dia 3
•Intervalo de Respuesta Lineal 0.1 – 0.8 ppm de HCN
•Análisis de Varianza para el intervalo 0.1 – 0.8 ppm, se realiza el análisis para las tres curvas en conjunto
•Test de Cochran, homogeneidad de varianzas
Gexp =0,4670; Gtablas (α = 0,05, K=5, n=3)= 0,6161
Gexp < Gtablas, las variancias de las concentraciones son homogéneas, el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados
-0.12
-0.06
0.00
0.06
0.12
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Concentración de HCN, (ppm)
Res
iduo
s
•Normalidad de los residuales. se observa que la distribución de los residuales, es completamente aleatoria, no se observa ninguna tendencia
y = 1,2955x - 0,0109R2 = 0,9864
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Concentración de HCN,(ppm)
Abso
rban
cia
Ecuación de la Recta obtenida
Y = 1.2955 (± 0.038) X - 0.0109 (± 0.018) (r = 0.9932)
•Coeficiente de correlación. Indica que un 99.32 % de la variación de la respuesta es explicada por la recta de regresión.
•ANOVA.
•Prueba F
Ho = “El cuadrado medio de la regresión (CM reg) es igual a el cuadrado medio residual (CM res) (Ho: CM reg = CM res, Ha = CM reg≠ CM res),
F calculado = 1157.73. F crítico (P = 0.05) = 2.36 x 10-16,
Existe correlación muy significativa entre x e y.
• TEST DE LINEALIDAD
• Test de verificación de la pendiente o linealidad
Ho = “La pendiente no es significativamente diferente de cero”.
Ha = La pendiente es significativamente diferente de cero”.
t calculado = 34.00, t teórico (P = 0.05, gl = 16) 2.12,
t calculado> t teórico
Existe diferencia significativa entre la pendiente y cero.
Intervalo de confianza de la pendiente= 1,2955 ± 0,081 (1.376, 1.215) y se observa que este
intervalo no incluye el cero.
bsb
t =exp
• Test de verificación de la variable independiente o de proporcionalidad
• Ho = “No existe diferencia significativa entre el intercepto y cero”.
• Ha = “Existe diferencia significativa entre el intercepto y cero”.
t calculado = 0.6 t teórico (P = 0.05, gl = 16) 2.12,
texp < ttablas
La ordenada en el origen es estadísticamente igual a cero
Intervalo de confianza del intercepto 0,018 ± 0,081 (-0.049, 0,0273).
asa
t =exp
Sensibilidad
nbsyLD blbl 3+
=nb
syLC blbl 10+=
Método de Bajas Concentraciones
Limite de detección = 0,004 ppm
Limite de cuantificación = 0,012 ppm
Método Miller
Limite de detección = 0.0045ppm
Limite de Cuantificación = 0.015
Precisión
))log(5.01(2(%) CCV −=
16,88%0,7
17,28%0,6
17,76%0,5
18,37%0,4
19,18%0,3
20,38%0,2
22,63%0,1
CV(%)Concentración
Se calculan los coeficientes de variación para cada uno de los parámetros evaluados, es decir; Repetibilidad (sistema y método), Precisión Intermedia (sistema y método)
3,736,06,65,23,012,03,00.735 ± 0.006
2,345,98,57,85,54,92,70.630 ± 0.005
2,286,25,94,610,06,04,20.525 ± 0.004
0,964,54,03,95,65,63,70.420 ± 0.003
2,215,65,35,34,49,43,70.315 ± 0.002
1,944,63,84,63,28,03,60.210 ± 0.002
3,016,12,54,35,59,78,70.105 ± 0.001
%%%%%Estándar(P= 0.05)CV,CV,CV,CV,CV,
DesviaciónPromedioDía 5Día 4Día 3Día 2Día 1Concentración*
Repetibilidad del Sistema
Se observan que los coeficientes de variación obtenidos son inferiores al 10%
5,900,050,88310,180,080,7929,570,060,6755,050,030,5554,280,020,4166,620,020,27912,780,020,139
%EstándarPromedio, AbsCV DesviaciónRespuesta
Precisión Intermedia del Sistema
Se observan coeficientes de variación inferiores al 13 %
Repetibilidad y Precisión intermedia del método
11,40223,3226,59112,040CV (%)
0,3070,3010,3820,423
0,3390,3740,3680,451
0,3990,4210,4180,3550,309
0,3290,3310,3620,473
6,19921,39112,2035,988CV (%)
0,2370,2360,3220,281
0,2480,2680,2570,309
0,2140,2530,2490,2690,206
0,2350,2270,2630,293
21,88610,3698,11012,994CV (%)
0,1250,1480,1290,106
0,1450,1430,1080,145
0,0910,1270,1260,1330,103
0,0970,1180,1270,123
Teórica
Día 4Día 3Día 2Día 1Concentración
Exactitud
0,0
0,2
0,5
0,7
0,08 0,16 0,24 0,32Concentración de HCN, (ppm)
Abs
orba
ncia
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Curva Promedio
1.539 ± 0,091.032 ± 0.011.265 ± 0.111.699 ± 0.021.2955 ± 0.04(P= 0.05)
Pendiente
Muestra 4Muestra 3Muestra 2Muestra 1Curva Patrón
• Prueba t student Ho = “No hay diferencias
significativas entre las pendientes de las curvas de las muestras con adición de patrón y la pendiente de la curva patrón promedio”.
t calculado = 0.597; t crítico fue 3.18,
t calculado < t critico
Estadísticamente las pendientes obtenidas de las curvas de adición estándar son iguales a la de la curva de adición patrón.
No hay efectos de matriz en las muestras analizadas.
• Test de Cochran.
Prueba de igualdad de variancias de varios grupos muéstrales del mismo tamaño
Ho = “El factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados”
G calculado = 0.624; G crítico 0.7977,
G calculado < G crítico
El factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados.
89,55107,90103,8381,21Porcentaje de recuperación
35,0438,8539,1638,21Concentración por lectura directa
31,3841,9240,6631,03Concentración con adición de estándar
Muestra 4Muestra 3Muestra 2Muestra 1
Se observa que los porcentaje de recuperación son cercanos al 100%, indicando que:
La variación entre las dos formas de determinar las concentraciones es mínima y no es necesaria la adición de patrón para determinar cianuro en muestras de croqueta de yuca.
•Comparación de los dos métodos de cuantificación
12,0CV%
11,93DS
99,60R(n = 12)
108,6585,0094,60121,500,3087
109,8988,77100,37114,710,2058
86,6096,6787,96100,480,1029
Muestra 4Muestra 3Muestra 2Muestra 1% Recuperación Concentración
• Test de t, (α = 0.05)
Ho = “no existe diferencia significativa entre la recuperación media y el 100.
t calculado = 0.116, t critico 2.20,
t calculado < t crítico
No existe diferencia significativa entre la recuperación media y el 100%
La exactitud del método analítico es correcta.
Robustez
7 min.3 min.Factor C: Tiempo de reacción cloramina T
50 min.30 min.Factor B: Tiempo de Reacción Colorimétrica
45ºC35ºCFactor A: Temperatura del Baño
+-Factores
Nivel
Se construyó una matriz de diseño, la cual se define como el valor que deben tomar cada uno de los factores a evaluar en cada uno de los experimentos a realizar.
+++++++8
-+--++-7
--+-+-+6
+--++--5
---+-++4
+-+--+-3
++----+2
-+++---1
ABCBCACABCBANº Ensayo
InteraccionesFactores
0.045-0.105-0.03ABC
Interacción de tres factores
0.055-0.095-0.02BC
0.025-0.125-0.05AC
0.04-0.11-0.04AB
Interacción de dos factores
0.07-0.08-0.05C
0.01-0.14-0.07B
0.220.070.145A
Intervalo de confianzaEfectoEfecto único (efecto principal)
“El factor que no incluya el cero dentro del intervalo de confianza significa que el análisis se encuentra influenciado por la variación del factor en cuestión, el factor que incluya el cero se considera que su efecto es negligible”
Recomendaciones• La hidrólisis enzimática emplea gran parte del tiempo de la técnica
analítica, es indispensable realizar un estudio con el objetivo de reducir en lo mínimo el tiempo empleado
• Adaptar la técnica analítica a un equipo de destilación por arrastre de vapor que sea mas eficiente y el tiempo de destilación se reduzca, ya que por el momento la técnica analítica no permite realizar análisis de rutina
• Realizar estudios de eficiencia de la enzima con el objetivo de reducir la cantidad de enzima utilizada
• Realizar ensayos a micro escala con el fin de reducir en lo mas mínimo la cantidad de reactivos utilizado
• Realizar un estudio de robustez de la técnica completa, es decir; incluyendo la etapa de la hidrólisis enzimática