1

EsetmegoldásokHematológia

Dr Nagy Éva

2009. november 4. „Hogyan értékeljük a laboratóriumi eredményeket?”

16 éves lánynak 5 hónappal ezelőtt észlelték V. hepatica részleges thrombosisát.Jelenleg az ok tisztázása folyik.

1. eset

Hogyan?

MIT és HOGYAN vizsgáljunk thrombophylia gyanúja esetén?

Kivizsgálás szempontjai:• szerzett okok kizárása• ismételt vizsgálat• akut thrombosis befolyásolhatja az

eredményeket• antikoaguláns terápia

befolyásolhatja az eredményeket

Veleszületett thrombophiliák I

• Antithrombin III hiány 6,7%• Protein C hiány 7,8%• Protein S hiány 7,7%• Aktivált protein C rezisztencia /

Thrombophiliás populáció

FV Leiden, Cambridge, Hong Kong 20%• Prothrombin mutáns(ok) /

FII G20210 3,9%• Fibrinogén szint emelkedés• Dysfibrinogenaemia• Hyperhomocysteinaemia

Veleszületett thrombophiliák II

• FVIII:C emelkedés• FIX emelkedés • Sticky Platelet Syndrome (SPS)• Plazminogén, t-PA hiány

PAI I lk dé• PAI-I emelkedés• Heparin kofaktor II csökkenés• HRGP(histidine rich glycoprotein) emelkedés• FXII hiány• FXIII mutáció • Thrombomodulin eltérések

•••

Szerzett thrombophiliák• Anti-foszfolipid szindróma• posztoperatív állapot• idős kor• immobilitás• fertőzés, sepsis

• billentyű protézis• pitvar fibrilláció• varicositas • obesitas• dohányzásfertőzés, sepsis

• malignus betegségek• nephrosis szindróma• myeloproliferatív kórképek• paroxismalis nocturnalis

haemoglobinuria• terhesség, oralis

antikoncipiens, ösztrogén terápia

• dohányzás• syncumar terápia• heparin terápia• egyéb gyógyszerek• B12 vitamin, fólsav hiány

•••

2

További részletes anamnézis során kiderül:16 éves lánynak korábban észlelték anaemiáját, amely miatt 1 alkalommal transzfúziót is kapott. Vas, majd B12 vitamin és Folsav kezelés nem javított anaemiáján. Időnként sötétebb vizelet ürítéséről számol be. Jelenleg sápadt, de jó általános

1. eset

állapotban van.

Vérkép: Fvs: 3,45 4-13 G/L Neu: 44,4 % Ly: 48,4% Mo: 4,9% Eo: 1,7% Baso: 0,6%Hgb: 77 110-155 g/L Htk: 0,26 0,34-0,47 L/L Vvt: 2,72 4,2-5,1 T/LMCV: 90 73-91 fL MCH: 28,3 27,3-32,6 pg MCHC: 324 316-349 g/L RDW-CV: 16 11,6-13,9% Ret: 4,5% 0,2 - 2,8 % RKI: 1,46 >3Thr: 188 169-358 G/L

Hemolízist igazoló vizsgálatok szérumból és vizeletből (időnként sötét vizelet)LDH: 4712 (02.05)- 7200 (03.05)- 4610 (04.06)- <580 U/L Bi: 22,7 <19 μmol/L ASAT/GOT: 131 <27 U/L vizelet urobilinogén (POCT) : norm/emelkedettALAT/GPT 14 39 U/L

1. eset

Vas státusz felmérése (folyamatos hemolízis miatti vas vesztés megítélésére)Vas: 5,3 – 17,9 6,6-26 μmol/L Transzferrin: 2,5 - 2,4 2-3,6 g/LFerritin: 63,1 – 65,7 20-200 ng/mL TVK: 56 - 54 55-101 μmol/LSTrfR: 18,3 1,9-4,4 mg/L TrfSzat.: 9 - 33 15-50%CRP: 5,3 <5 mg/L Fibrinogén: 3,6 - 5,06 2-4 g/L

ALAT/GPT: 14 <39 U/LGGT: 9 <30 U/L Haptoglobin: 0,1 0,3-2 g/L

Csontvelő aspiratio (csontvelői érintettség megítélésére). Negatív

Hemolízis okának felderítésére.

Hemolízis és trombózis• Anti-foszfolipid szindróma• posztoperatív állapot• idős kor• immobilitás• fertőzés, sepsisfertőzés, sepsis• malignus betegségek• nephrosis szindróma• myeloproliferatív kórképek• paroxismalis nocturnalis

haemoglobinuria• terhesség, oralis

antikoncipiens, ösztrogén terápia

Az érintett klónban a PIG-A gén mutációja miatt nem szintetizálódnak GPI anchor proteinek és nem jelennek meg a sejtek felszínén– komplement regulátor (DAF=CD55 C3 convertase inhibitor, C8 binding protein, CD59= MIRL membrane inhibitor of reactive lysis), adhéziós molekulák, att receptorok, vércsoport antigének ….

PNH

Előfordulás: 2-6/ 1 millió emberSzerzett hemolitikus anemia

Intravascularis hemolízisCsontvelő elégtelenségCsontvelő elégtelenségThrombosis hajlam

Jelentőség:Budd-Chiari syndromában nagy PNH incidencia!Hepatikus, agyi vénák thrombosisában kellene PNH vizsgálat!!

Típusai:1. Hemolitikus PNH

50% thrombosis előfordulás – 1/3 mortalitás2. Hypoplasias PNH

cytopenia - 10% mortalitás3. egyéb kategória

1.Ham teszt

2.Módosított Ham teszt Hemolitikus PNH-ban nem jó

3.Sucrose lysis teszt

4 CLS komplement lysis sensitiv Bonyolult

PNH Diagnosztika

4.CLS – komplement lysis sensitiv Bonyolult

5.DiaMed monoklonalis att. gel technika Rutinszerűen elérhető, de rosszabb szenzitivitású, specificitású, mint a FC

Ham tesztSav Sav

+ HőSav Sav

+ HőSav Sav

+ Hő

Beteg sejtjei +Beteg szérum

Beteg sejtjei +Donor szérum

Donor sejtjei +Donor szérum

3

6.Flow cytometry: CD55, CD59, (CD14 monocytán)

• Min. 2 ag. együttes deficienciája vvt és granulocytán

• Megfelelő klinikai állapotban!Interferencia: TranszfúzióAplasztikus anemia – kis PNH klón

PNH

Aplasztikus anemia kis PNH klónSúlyos hipoplasztikus anaemia – kevés granulocytaEosinophylia – CD 16-

• Csak perifériás vér vizsgálható - csv nem jó- különböző granulocyta érési vonalban a GPI ag-ek másként jelennek meg

Granulocyta

Monocyta

VörösvérsejtVörösvérsejt

Furcsa Immunstátusz

2. esetReumatoid arthritisos fiatal nő

4

T-sejt: 93%

Th:57%

Tsz:37%

B-sejt: 1%

NK-sejt: 6%

Absz. Sejtszám

T-sejt: 0,74 G/L

Th: 0,45 G/L

Tsz:0,29 G/L

B-sejt: 0,008G/L

NKsejt: 0,05G/L

Mi kóros? Mi az oka? Mi a teendő?

B-sejt defektus?

• XLA• ARA• Variabilis immundeficiencia• IgA deficiencia• IgG alsoztály deficiencia

Gyermekkor (esetleg későbbi megjelenés)

Bakteriális fertőzés (otitis, pneumonia, bronchiectasia)

Kezelő orvossal konzultáció

Rituximab terápia

Rituximab, Mabthera, antiCD20

http://cme.medscape.com/viewarticle/523554 B-Cell Targeted Therapies: Clinical Trials Update Faculty: Larry W. Moreland, MD; Alan J. Bridges, MD Published: 06/26/2006

5

Laborosnak a terápiás fejlődést is nyomon kell j ykövetni!

3. eset A flow cytometriás jelölési rendszerek célja hematológiai betegségekben:

1.

Kóros sejtpopuláció beazonosítása

2.

Kóros sejtpopuláció jellemzése

SSC Gran.

Mo.Ly.

CD45FSC

SSCGran.

Mo.

Ly.CD2 FITC/CD13 PE/CD45 PerCP CD19 FITC/CD10 PE/CD45 PerCP CD3 FITC/CD22 PE/CD45 PerCP

36%

45%

3%

14%

2%

CD

CD

CD

14% blaszt:

CD45 dim+

CD33 FITC/CD34 PE/CD45 PerCP CD33 FITC/CD14 PE/CD45 PerCP

CD2 FITC

D10 PE

CD19 FITC

CD33 FITC

CD3 FITC

CD

34

PE

22

PE

13

PE

CD

14 PE

CD33 FITC

SSC alacsony

CD34+

CD33+

CD13+45% monocyta:

CD33+

CD13+

CD14+

6

Akut leukémia panel

Alap panel:1. Izotípus Kontroll2. CD2/CD13/CD453. CD19/CD10/CD454. CD3/CD22/CD455. CD33/CD34/CD45

Multidrog RezisztenciaA. Intracelluláris gyógyszer koncentráció csökkenése~ gyógyszer aktív intracelluláris transzportjának csökkenése~ gyógyszer fokozott aktív kipumpálása a sejtből

-MDR1 (MultiDrug Rezisztencia1 / P-glikoprotein) ABC B1-MRP1 (Multidrug Rezisztenciához társult Protein1) ABC C1-LRP (Lung-Rezisztencia Protein)cMOAT (canalicularis Multispec Org Anion Transzporter) ABC C2-cMOAT (canalicularis Multispec. Org. Anion Transzporter) ABC C2

~ fokozott metabolikus inaktivációB. Toxikus intermedierek semlegesítéseC. Gyógyszerhatás célmolekulájának kvalitatív és

kvantitatív változásaiD. DNS repair mechanizmus megváltozásaE. Programozott sejthalál megváltozása

1. ábra Rezisztencia kialakulásának mechanizmusai(Vizi E. Szilveszter: Humán Farmakológia Medicina 1997. alapján módosítva)

A MDR fehérje transzport aktivitása

MDR expresszáló sejt, MDR gátlása nagy mennyiségűalacsony calcein koncentráció szubsztrát hozzáadásával

Fmax=Inhibitor1-gyel kapott átlag MFI érték (1-3 cső)Fmrp=Inhibitor2-vel kapott átlag MFI érték (4-6 cső)F0=Inhibitor nélkül kapott átlag MFI érték (7-9 cső)

A MAFtotál érték 0 és 100 közötti szám lesz. A kit gyártója által megadott AML-re vonatkozó MAFt cut-off értékek:

0-20 normál perifériás vér mononukleáris sejtjei20-25 határeset> 25 pozitív: kemoterápiára tapasztalt rezisztencia

7

4. esetFiatal férfi hátfájdalommal keresi fel a reumatológust.

A reumatológus gyulladási markereket kér a laboratóriumtól és HLA-B27 vizsgálatot.

Milyen akut fázis reakciót jelző rutin laboratóriumi módszereket kérhet?

Mi az a HLA-B27 vizsgálat?

Milyen betegségre gondol a reumatológus?

1. ábra: HLA1. ábra: HLA--B komplexek szerepe az antigén prezentációbanB komplexek szerepe az antigén prezentációban1. ábra: HLA1. ábra: HLA--B komplexek szerepe az antigén prezentációbanB komplexek szerepe az antigén prezentációban

DP DQ DR C2 BF C4A C4B TNF B C A

6. kromoszóma 15. kromoszóma

II. osztály molekulákIII.osztály molekulák

I.osztály molekulák

α-láncai

β2-mikroglobulin

MHC I.osztályú molekula + antigén

ANTIGÉN PREZENTÁCIÓ

CD 8+ citotoxikus T-sejtek

MÓDSZERTANI TAPASZTALATOKMÓDSZERTANI TAPASZTALATOKMÓDSZERTANI TAPASZTALATOKMÓDSZERTANI TAPASZTALATOKPreanalitikai hiba lehetőségek:

• Szobahőmérsékleten 24 órán túl tárolt,• hemolizált,• 1 ml- nél kisebb térfogatú, és• a jelölés előtt hűtőben tárolt minták analízisre alkalmatlanok.

Analitikai hiba lehetőségek:• CD3+ populáció nem megfelelő elkülönítése;• Álpozitív eredmény: Kereszt-reaktivitás más HLA-B antigénekkel

(B7 B13 B22 B40 B41 B42 B47 B48 B37 B39)(B7,B13,B22,B40,B41,B42,B47,B48,B37,B39);• Álnegatív eredmény: Akut szakban HLA-B 27 down-regulációja,

konformáció változás;• 133-151 MFI érték mellett a hisztogram megtekintése olyan

„határesetekre” deríthet fényt, melyekben más módszerrel (pl. PCR)megerősítő vizsgálat javasolt.

Posztanalitika / Klinikai hasznosság:• A HLA-B 27 meghatározás önmagában nem diagnosztikus értékű. A

vizsgálat eredménye csak a klinikai képpel, immunológiai statussal ésegyéb diagnosztikai eredményekkel (radiológia) együtt differenciál-diagnosztikai és prognosztikai jelentőségű.

HLA-B 27 pozitív (%)Spondylitis ankylopoetica 80-96Psoriasisos arthritis 4,5-27

sacroiliitis-szel 9-77

HLAHLA--B 27 allél gyakorisága különböző betegségekbenB 27 allél gyakorisága különböző betegségekbenHLAHLA--B 27 allél gyakorisága különböző betegségekbenB 27 allél gyakorisága különböző betegségekben

A HLA-B27 allél frekvenciája európai populációban 8-10%-ra tehető. Asejtfelszíni HLA-B27 antigén előfordulása számos betegséggel hozhatókapcsolatba, és kimutatása az ún. szeronegatív spondyloarthropathiák (SNSA)megítélésében diagnosztikus és prognosztikus jelentőségű.

Reaktív arthritis 80-90Reiter syndroma 65-96Enteropathias synovitis KKrónikus gyulladásos bélbetegség spondylitis ankylopoetica-val 28-72

Uveitis 56Whipple betegség 60Bechet syndroma K

C.J. Eastmond, Oxford Textbook of Medicine, 1996. 3rd edition, Chapter 18.5K = gyakoriság a kontroll és beteg populációban azonos

Köszönöm, hogy együtt gondolkozhattunk!!gondolkozhattunk!!