Het optimaliseren en visualiseren van western blot
voor collageen Type I
BMTE0740
Karim Abdullah
December 2007
Supervisor: Ing. W.L. van de Loo
Dr. A. mol
Dr. M. de Liefde
Stagedocente: Mw. C.A.M Huijbregts
Opleiding: ROC Eindhoven MLO
Differentiatie: Microbiologie niveau 4
Stagebedrijf: TU/Eindhoven
Faculteit: Biomedische technologie
Afdeling: Soft tissue engineering
Periode: September t/m December 2007
School: ROC Eindhoven LMP
Samenvatting:
Het hart is een holle spier die door geregeld samen te trekken bloed door het
lichaam pompt. De hartkleppen zorgen ervoor dat het bloed in één richting
gaat. Als een klep niet goed werkt, kan men deze vervangen. In de TU is men
bezig met de mogelijkheden van het maken van kunstmatige hartkleppen m.b.v.
tissue engineering. Er wordt gezocht in welke verhouding welke type collageen
bevindt, zodat er zoveel mogelijk een gelijke kunstmatige hartkleppen gemaakt
kan worden.
Het eiwit collageen zorgt ervoor dat de weefsels flexibel en sterk zijn. Dit eiwit
heeft verschillende typen met elk een eigen functie en plaats in het lichaam.
Omdat in de hartkleppen collageen type I en III bevinden, wordt collageen type
I als positief controle gebruikt bij het optimaliseren van western blotting voor
collageen type I. De stage gaat over het optimaliseren van western blotting voor
collageen type I. Collageen Type III wordt als negatief controle gebruikt.
Western blot bestaat uit twee delen, het eerste deel is het runnen van eiwitten in
een SDS-page gel. De tweede deel is het blotten en het aantonen van de
eiwitbandjes in de gel m.b.v. antilichamen en chemolumonicentie.
Het doel van dit onderzoek is het visualiseren en optimaliseren van het protocol
van western blot dat in het lab aanwezig is. Bij het optimaliseren van dit
protocol wordt naar de verdunningen van de antilichamen gekeken. De juiste
verdunning wordt gebruikt bij het onderzoek naar de verschillende typen
collageen. Ook van het apparaat waarmee de foto’s gemaakt kunnen worden,
Versa Doc (Bio-Rad) moet een handleiding gemaakt worden.
Na het testen van verschillende verdunningen van de 1e en 2
e antilichaam is
gebleken dat de optimale verdunning van de 1e antilichaam 1:1500 is. Bij de 2
e
antilichaam is gebleken dat de optimale verdunning 1:12500 is.
Voorwoord:
Dit verslag is geschreven in het kader van de stage die als onderdeel is van mijn
vierde studiejaar van mijn opleiding aan ROC Eindhoven.
Ik wil hierbij de volgende mensen bedanken voor de ondersteuning, uitleg en
de samenwerking:
• Ing. Anita van de Loo, door haar steun en hulp is deze stage voor mij
een leerzame en leuke stage geworden.
• Dr. Anita Mol voor de mogelijkheid om in het lab stage te mogen lopen.
• Dr. Moniek de Liefde voor haar hulp tijdens mijn stageperiode.
• Mijn medestagiaire Roel Lalieu voor zijn medewerking en zijn
gezelschap tijdens mijn stageperiode.
• Ook wil ik graag alle collega’s bedanken waarmee ik heb
samengewerkt.
Afkortingen:
µl = microliter
ml = milliliter
mg = milligram
V = volt
mA = milliampère
RPM = rotations per minute
SDS-page
SDS = sodium dodecyl sulfate
Page = poly acrylamide gel electroforese
APS = Ammonium persulfaat
HRP = Horse radish peroxidase
PVDF = Polyvinylidene fluoride
ECM = Extracellulaire matrix
Inhoudsopgave:
1. Inleiding ....................................................................................................... 1
2. Achtergrond informatie................................................................................ 2
2.1 Het menselijke hart ........................................................................ 2
2.2 Hartkleppen .................................................................................... 3
2.3 Tissue engineering ......................................................................... 5
2.4 Collageen........................................................................................ 6
3. Onderzoek en methoden............................................................................... 7
3.1 Onderzoek ...................................................................................... 7
3.2 Methoden........................................................................................ 8
3.2.1 Gel-electroforese (SDS-Page)............................................... 8
3.2.2 Western blotting .................................................................... 9
3.2.3 Ponceau kleuring................................................................... 10
4. Resultaten..................................................................................................... 11
5. Discussie ...................................................................................................... 13
6. Conclusie...................................................................................................... 14
7. Bronnen ........................................................................................................ 15
8. Bijlagen ........................................................................................................ 16
• I: Gel-electroforese............................................................................... 16
• II: Schema Gel Percentage ................................................................... 18
• III: Western Blot .................................................................................. 19
• IV: Antilichamen, controles en markers .............................................. 22
• V: Ponceau kleuring............................................................................. 23
• VI: Indeling collageen volgens Bornstein en Traub ............................ 24
• VII: Handleiding Versadoc Apparaat................................................... 25
1
1. Inleiding:
Op TU/e faculteit Biomedische technologie houdt men zich met tissue
engineering bezig. Deze faculteit onderzoekt de mogelijkheid om getissue-
engineerde hartkleppen en bloedvaten te maken.
Er zijn twee soorten hartkleppen: de mechanische en de biologische.
Mechanische kunstkleppen zijn geheel gemaakt van duurzaam metaal of
kunststof. Voordeel is dat ze een leven lang meegaan. Helaas hebben ze als
groot nadeel dat de patiënt dan altijd bloedverdunners moet blijven slikken. Dit
moet om de kans op het coaguleren van bloedplaatjes, veroorzaakt door de
kunstklep, tegen te gaan.
Biologische kleppen zijn gemaakt van speciaal bewerkt weefsel van dieren,
meestal van een varken of rund. Het kan ook een menselijke donorklep zijn van
een overledene. De biologische klep heeft als groot voordeel dat je geen
bloedverdunners nodig hebt. Nadeel is dat deze klep een beperkte
duurzaamheid heeft, vergeleken met een mechanische klep. De patiënt moet
ook medicijnen innemen om de afstoting van de nieuwe hartklep tegen te gaan.
Biologische kleppen gaan tegenwoordig ongeveer vijftien jaar mee.
Biologische kleppen worden verdeeld in drie soorten. Dit zijn menselijke klep
(donor), dierlijk klep en getissue-engineerde klep. De TU/e houdt zich met de
derde soort (getissue-engineerde klep) bezig.[1]
De belangrijkste eigenschap van de hartkleppen is dat ze sterk en duurzaam
zijn. Het eiwit collageen is een van de eiwitten die daarvoor verantwoordelijk
is. Van dit eiwit zijn er verschillende typen bekend. Het is ook bekend dat in de
hartklep en bloedvaten de typen collageen I en III aanwezig zijn.
De techniek western blotting wordt gebruikt om te bepalen welke typen
collageen aanwezig zijn in de getissue-engineerde hartkleppen. De verhouding
tussen de verschillende typen die aanwezig zijn wordt ook met western blotting
bepaald.
Het protocol dat aanwezig is in het lab is niet helemaal geoptimaliseerd.
Daarom moet het nu verder geoptimaliseerd worden. De verdunningen van de
antilichamen die gebruikt worden bij het blotten moeten geoptimaliseerd
worden. Wanneer het optimaliseren afgrond is, moet ook een protocol gemaakt
worden om de blot te visualiseren.
2
2. Achtergrond informatie
2.1 Het menselijke hart
Het hart is een holle spier die zich midden achter het borstbeen bevindt. Het
zorgt ervoor dat het hele lichaam bloed krijgt door geregeld samen te trekken.
Het hart is verdeeld in vier ruimten die gescheiden zijn door kleppen
(afbeelding 1). De vier ruimten vormen twee pompen die verantwoordelijk zijn
voor de long- en lichaamscirculatie van bloed. De hartspier is sterker dan een
normale spier. Dit komt doordat het hart als een pomp werkt. Het heeft ook een
ingewikkelde bouw.
Afbeelding 1: het menselijke hart. [2]
De vier holtes van het hart zijn twee boezems en twee kamers. Deze vier holtes
trekken zich samen onder de leiding van de sinusknoop. De sinusknoop is een
gespecialiseerd stukje weefsel die elektrische signalen afgeeft aan de vier
kamers. Onder invloed van deze signalen trekken de kamers en de boezems
afwisselend samen. Door het samentrekken wordt het bloed door het hele
lichaam gepompt. De linkerkamer trekt veel krachtiger samen dan de
rechterkamer. Zijn spierwand is dan ook dikker. Dat komt doordat deze kamer
het bloed pompt door het hele lichaam[3].
3
2.2 Hartkleppen
Tussen de kamers van het hart en ook tussen de kamers en de slagaders zitten
verschillende kleppen. Deze kleppen hebben als functie het voorkomen dat het
bloed terugstroomt in de kamers. De kleppen bestaan uit de eerste laag van de
hartwand, endocard. De geluiden die men hoort vanuit het hart, zijn de
veroorzaakt door de kleppen.
Er zijn verschillende soorten kleppen in het hart. De eerste soort is de inlatende
kleppen, hieronder behoren de triscuspidalisklep en de mitralisklep. De
triscuspidalisklep bevindt zich tussen de rechterboezem en rechterkamer. De
mitralisklep bevindt zich tussen de linkerboezem en linkerkamer. De tweede
soort zijn de uitlatende kleppen, die zijn ook verdeeld tot pulmonalisklep
(longslagaderklep) en aortaklep (lichaamsslagaderklep). [1, 4]
Zonder deze kleppen verliest het hart zijn pompfunctie. Er zijn verschillende
typen aandoeningen bij de hartkleppen; dit zijn:
• Hartinsufficiëntie, waarbij de kleppen lekken.
• Stenose, waarbij de hartklep vernauwd is en niet goed opent.
• Atresie, de hartklep ontbreekt (een aangeboren afwijking). [4]
Om deze aandoeningen aan te pakken, heeft men verschillende oplossingen. Er
zijn meer soorten kleppen te implanteren, biologische (afbeelding 2) en
mechanische (afbeelding 3). De biologische wordt verdeeld in drie soorten,
menselijk klep (donor), dierlijk klep en getissue-engineerde klep. Het komt niet
vaak voor dat een klep wordt gedoneerd. Als er wel een donor is, dan zal het
beter zijn dat men het hele hart transplanteert.
Afbeelding 2: getissue-engineerde hartkleppen. [6]
De mechanische hartkleppen zijn de oplossing daarvoor. De patiënt hier is niet
afhankelijk van donors. Een mechanische klep is een duurzame klep, maar het
heeft ook zijn eigen nadelen, namelijk:
• De mechanische klep kan het hele leven mee gaan, maar het zal niet met
het lichaam meegroeien. Dit heeft geen nadeel bij oudere mensen, maar
bij kinderen en baby’s moet het na enige tijd vervangen worden door
een grotere klep. Gezien het inbrengen van een hartklep erg veel risico’s
met zich mee brengt is dat erg gevaarlijk.
4
• De mechanische kleppen maken geluid dat buiten het lichaam te horen
is. Dit kan een psychisch probleem veroorzaken bij de patiënt.
• Aan het oppervlak van de kunststof zal er coagulatie gevormd worden,
daardoor moet de patiënt zijn hele leven bloedverdunners innemen om
dit tegen te gaan.
Afbeelding 3: mechanische hartkleppen. [6]
De dierlijke hartkleppen kunnen lang blijven functioneren maar uiteindelijk
worden ze door het immuunsysteem geweigerd. Ook hebben ze als nadeel dat
ze niet met het lichaam meegroeien.[5]
5
2.3 Tissue engineering
Tissue Engineering, ook wel cel- en weefseltechnologie genoemd, is een
wetenschap dat verschillende wetenschapsgebieden met elkaar verbindt.
Voorbeelden van deze wetenschappen zijn moleculaire, chemische en medische
wetenschappen als ook biomechanica en engineering.
Het doel van deze wetenschap is het maken van (bio)implantaten om de
beschadigde of slechte organen te vervangen of te ondersteunen.
Tissue Engineering kan ook gebruikt worden om specifieke cellen, die
genetisch aangepast zijn, te implanteren. Deze cellen kunnen bepaalde stoffen
afgeven die het lichaam niet meer maakt, bijvoorbeeld insuline bij diabetes. [8]
Bij de TU/e onderzoekt men de mogelijkheden om geheel getissue-engineerde
hartkleppen, spiertjes en bloedvaten te maken. Hieronder een afbeelding dat het
principe van het hele proces aanduidt (afbeelding 4). Er worden cellen van de
patiënt genomen, deze cellen worden in grote hoeveelheden opgekweekt. De
opgekweekte cellen worden op de drager materiaal gezaaid. Daarna gaan ze
groeien tot een weefsel. Als laatste worden deze cellen geïmplanteerd.
Afbeelding 4: tissue engineering van een hartklep.[9]
6
2.4 Collageen
Het bindweefsel in het menselijke lichaam zorgt ervoor dat ons
lichaam stevig blijft. Daarnaast is het verantwoordelijk voor de
vormgeving en bescherming van ons lichaam. Tussen de cellen
die het weefsel vormen, bevinden zich niet-levende draadachtig
vezels die voornamelijk uit collageen bestaan. Collageen vormt
70% van het bindweefsel in het menselijke lichaam. In de
hartkleppen bevindt zich collageen type I en III. Collageen zorgt
voor de stevigheid van de hartkleppen.
De functie van collageen hangt sterk af van de plaats dat het in
het lichaam zich bevindt. In bijvoorbeeld de huid, komt een
andere soort collageen dan in kraakbeen. Het meeste
voorkomende type van collageen in het menselijke lichaam is
type I. [11]
De aanwezige typen van collageen in het menselijke lichaam
zijn: • Collageen type I: bot, pezen, ligamenten, huid, fascia,
bloedvaten, fibrotisch kraakbeen
• Collageen type II: hyalien kraakbeen,
tussenwervelschijven.
• Collageen type III: huid, synovia, bloedvaten.
• Collageen type IV: basale membraan. [11]
Afbeelding 5: Collagentriplehelix [10]
Collageen is opgebouwd uit drie om elkaar gedraaide polypeptideketens die elk
bestaan uit herhalingen van een motief Glycine-X-Y(Afbeelding 5)[10,11].
Hierbij is het aminozuur op de X-positie meestal proline en op de Y-positie
meestal hydroxyproline. In bijlage VI is er meer informatie over de indeling en
de typen van collageen.
7
3. Onderzoek en methoden
3.1 Onderzoek
De western blotting methode dient geoptimaliseerd worden voor verschillende
typen collageen. Tijdens de stage periode wordt de western blotting verder
geoptimaliseerd voor collageen type I. Door dit onderzoek wil men te weten
komen welke type collageen in de ge-tissue engineerde weefsel en in welke
verhouding het voorkomt. In het aanwezige protocol is de western blot
gedeeltelijk geoptimaliseerd, het protocol moet verder geoptimaliseerd worden.
In deze periode zullen de gebruikte verdunningen van de antilichamen in het
onderzoek bepaald worden. Deze antilichamen worden bij het visualiseren van
de eiwitbandjes in het membraan gebruikt.
In de hartkleppen komen er collageen type I en III voor. Voor het opzetten van
western blotting voor collageen type I wordt collageen type III als negatieve
controle gebruikt worden. Dit om te controleren of de antilichamen specifiek
zijn voor collageen type I. Ook collageen type I Rat wordt als negatieve
controle gebruikt. De gebruikte controles zijn terug te vinden in bijlage IV.
8
3.2 Methoden
3.2.1 Gel - electroforese (SDS - Page)
SDS-Page is een methode om de eiwitten uit elkaar te scheiden. De eiwitten
worden hier op basis van hun grootte gescheiden in een gel onder invloed van
elektrische spanning (afbeelding 6).
De eiwitten moeten voor het onderzoek uitgevouwen worden, dit gebeurt door
de monsters te incuberen met Laemmli buffer bij 96 ºC. Deze buffer bevat SDS
(sodium dodecyl sulfaat) dat verantwoordelijk is voor het uitvouwen van de
eiwitten zodat ze in de gel gescheiden kunnen worden. De bandjes die
gescheiden zijn in de gel zijn onzichtbaar op dit moment. Laemmli buffer bevat
ook broomfenolblauw (BFB). Dit wordt als indicator gebruikt en geeft aan hoe
ver het electroforese proces is. Laemmli buffer bevat ook DDT ( β-
mercaptoethanol) om de zwavelbruggen in de eiwitten te verbreken.
De monsters, die eiwitten bevatten, worden in de gel gebracht na het uitvouwen
daarvan. De kleine eiwitten migreren sneller in de gel dan de grote eiwitten.
Door het scheiden van de verschillende eiwitten in de gel, kunnen er na afloop
bandjes gezien worden. Deze bandjes zijn kenmerkend voor de verschillende
eiwitten.
Er worden ook markers bij een elektroforese proces gebruikt. De markers zijn
eigenlijk eiwitten met verschillende grootte die ook verschillende bandjes in gel
geven. Deze markers worden gebruikt voor het afleiden waar de bandjes met
welke formaat zich op de gel bevinden. Er kan gekozen worden tussen
gekleurde en ongekleurde marker. De gekleurde marker is te zien met het blote
oog op de gel. [5, 16].
De werkwijze en de verschillende gel
percentages zijn in bijlage I en II terug
te vinden, en bijlage IV voor de
gebruikte markers en controle.
Afbeelding 6: SDS Page [12]
9
3.2.2 Western blotting
Western blotting is een methode die m.b.v. antilichamen een bepaald eiwit kan
aantonen. Om dit proces uit te voeren moet eerst de eiwitten vanuit de gel op
een membraan gebracht worden (PVDF-membraan). Dit gebeurt door een
zogenaamde sandwich van de gel en het membraan te maken. Het gebruikte
apparaat voor dit proces lijkt op een normaal electroforese apparaat. De stroom
wordt nu recht op de ‘sandwich’ gezet. Daardoor worden de eiwitten bandjes
vanuit de gel naar het membraan getrokken (afbeelding 7). Hierna dient het
membraan gekleurd worden d.m.v. ponceau kleuring. Ponceau kleuring wordt
in de volgende paragraaf uitgelegd (zie paragraaf 3.2.3).
Voor het aantonen van het gezochte eiwit, moet eerst na het afronden van het
blotten het verkregen membraan geblokt worden. Deze stap voorkomt dat de
toegevoegde antilichamen aan het membraan zelf gebonden zullen worden. Het
blokken wordt bereikt door het membraan met een eiwitrijke oplossing te
verzadigen, bijvoorbeeld melk.
De tweede stap is het toevoegen van 1e antilichaam. Dit is een antilichaam dat
gericht is tegen het gezochte eiwit. Het antilichaam wordt in een dier gekweekt
(bijvoorbeeld konijn). Voordat het 2e antilichaam toegevoegd kan worden,
wordt het verkregen membraan gewassen om de overtollige 1e antilichaam weg
te wassen. Het 2e antilichaam is in een ander dier gekweekt en gericht tegen 1
e
antilichaam. Het is gelabeld met HRP (horse radish peroxidase). HRP is een
enzym dat door H2O2 wordt geactiveerd en dan het substraat luminol zal
omzetten in o.a. licht. Luminol wordt toegevoegd bij het gebruiken van ECL
oplossing. Deze oplossing bestaat uit twee componenten, luminol en
waterstofperoxide. Door het activeren van het label door deze oplossing
ontstaat chimoluminicentie. Dit betekent dat alleen het bandje van het gewenste
eiwit licht zal uitstralen. Dit licht is waar te nemen in het donker, waarvan een
foto kan gemaakt worden.
Afbeelding 7; principe western blot en immuno-blot [14]
10
De factoren die invloed kunnen hebben op het hele proces zijn;
� Monsterbehandeling; de juiste verdunning en het verhitten daarvan
� De stroom; dit moet 200 mA zijn
� De duur van het hele proces; tussen 120 en 130 minuten
� De temperatuur (koeling); dit gebeurt m.b.v. een ijspak. De ijspak wordt
halverwege vervangen [16, 17]
� Samenstelling van de blotbuffer.
Andere vormen van blotten zijn Southern blotting voor DNA, en northern
blotting voor RNA [5, 13, 16, 17]. Het western blotting protocol is in bijlage III
terug te vinden.
3.2.3 Ponceau kleuring
Ponceau kleuring is een kleuringsmethode om te controleren of de eiwitten op
het membraan terecht gekomen na het blotten. Het is een aspecifieke kleuring
dat alle eiwitten kleurt. Het wordt ook gebruikt om te controleren dat er geen
luchtbellen op het membraan ontstaan. Ponceau is een rode synthetische
kleurstof (afbeelding 8). Het kan worden afgespoeld met (demi)water. De
werkwijze en de benodigdheden zijn in bijlage V terug te vinden.
Afbeelding 8: Ponceau kleuring.[15]
11
4. Resultaten
4.1 Eerste antilichaam
Bij western blot wordt de verdunning 1:250 als standaard verdunning gebruikt.
Dit zou nog verder doorverdund kunnen worden. Volgens de bijsluiter dat bij
het antilichaam komt ligt de grens waar het 1e antilichaam verdund kan worden
tussen 1:100 en 1:500 (zie bijlage VIII). Daarom is besloten om de volgende
verdunningen te testen; 1:500, 1:1000, 1:1500 en 1:2000. De laatset drie
verdunningen zijn getest omdat bij de verdunning 1:500 de belichtingstijd kort
was (20 sec) en de bandjes waren duidelijk te zien. Als de bandjes nog
zichtbaar zijn bij een belichtingstijd dat gelijk aan of minder dan (60 sec) is,
dan kan het antilichaam doorverdund worden. Als er belichtingstijd langer dan
(60 sec) nodig is om de bandjes zichtbaar te maken, dan hoeft er niet
doorverdund worden.
Bij de verdunning 1:250 was bij een belichtingstijd van 15 sec waren de
bandjes goed te zien. Daarna is de verdunning 1:500 getest. De belichtingstijd
was gelijk aan de belichtingstijd bij de eerste verdunning (15 sec) maar de
bandjes waren zichtbaar op het blot. Doordat de bandjes nog goed te zien
waren, is besloten om de volgende verdunning te testen, de verdunning 1:1000.
Hierbij waren de bandjes nog te zien. De belichtingstijd was iets langer dan bij
de vorige verdunningen (20 sec), maar nog minder dan de grens (60 sec).
Daarom is besloten om naar de volgende verdunning te gaan. De volgende stap
was het testen van de verdunning 1:1500. Bij het gebruiken van deze
verdunning waren de bandjes nog te zien bij een belichtingstijd van (30 sec).
Omdat deze belichtingstijd binnen de grens ligt, is besloten om door te
verdunnen. Als laatste was de verdunning 1:2000 gebruikt. Deze verdunning
was te groot. Bij een belichtingstijd van (40 sec) waren de bandjes niet goed te
zien. Ook bij een belichting van (60 sec) waren de bandjes niet goed te zien.
Daarom is besloten om niet door te gaan verdunnen, en dat was eigenlijk de
laatste verdunning van de 1e antilichaam die getest wordt. Na het uitvoeren van
western blotting met verschillende verdunningen was gebleken dat verdunning
1:1500 de optimale verdunning is.
Sluitertijd 30 sec bij verdunning 1:1500
12
4.2 Tweede antilichaam
De verdunning 1:5000 werd als standaard gebruikt bij western blotting. Dit zou
verder doorverdund kunnen worden. In de bijsluiter van dit antilichaam staat
dat het doorverdund kan worden tussen 1:1000 en 1:100.000 (zie bijlage VIII).
Bij het testen van het antilichaam is gebleken dat alleen tot 1:20.000 verdund
kan worden. Bij deze antilichaam is besloten om de volgende verdunningen te
testen als begin; 1:10.000, 1:12.500, 1:15.000 en 1:20.000. Als bij verdunning
1:20.000 de bandjes nog goed te zien dan kan er doorverdund worden. Als de
bandjes nog zichtbaar zijn bij een belichtingstijd dat gelijk aan of minder dan
(60 sec) is, dan kan het antilichaam doorverdund worden. Als er belichtingstijd
langer dan (60 sec) nodig is om de bandjes zichtbaar te maken, dan hoeft er niet
doorverdund worden. Bij deze verdunningen zijn de volgende belichtingstijden
gebruikt (15, 30, 45 en 60 sec).
Bij het testen van de verdunning 1:5000 zijn de bandjes nog te zien bij een
belichtingstijd van (30 sec). Daarna is verdunning 1:10.000 getest. De bandjes
waren nog duidelijk te zien bij een belichtingstijd van (45 sec). Daarom is
besloten om de volgende verdunning te gaan testen, verdunning 1:12.500. Bij
deze verdunning waren de bandjes ook te zien bij een belichtingstijd van (45
sec). Hierdoor was besloten om de volgende verdunning te gaan testen,
verdunning 1:15.000. Bij deze verdunning waren de bandjes moeilijk te zien bij
een belichtingstijd van (45sec). Bij een belichtingstijd van (60 sec) waren de
bandjes beter te zien dan bij (45 sec). Hierna was de verdunning 1:20.000 als
laatste getest. Hierbij zijn dezelfde belichtingstijden gebruikt als bij de andere
verdunningen. De bandjes waren helemaal niet te zien ook bij een
belichtingstijd van (60 sec). De enige bandjes die te zien waren, waren de
bandjes van de magic marker. Na dit resultaat is besloten om te stoppen met het
doorverdunnen, omdat het geen nut heeft om door te gaan verdunnen.
Bij de verdunning 1:12.500 waren de bandjes duidelijk te zien dan bij
verdunning 1:15.000 bij dezelfde belichtingstijden. Uit de resultaten van de
western blotting met de verschillende verdunningen is gebleken dat optimale
verdunning van de 2e antilichaam is 1:12.500.
Sluitertijd 45 sec bij verdunning 1:10.000.
13
5. Discussie en aanbevelingen
Tijdens dit onderzoek is geprobeerd om de western blot methode te
optimaliseren voor collageen I. Gedurende het onderzoek zijn veel problemen
opgetreden waardoor het experiment opnieuw uitgevoerd moest worden.
Een voorbeeld van deze problemen; tijdens dit onderzoek is een ponceau
kleuring gebruikt om te controleren of de blotting proces goed vergelopen is. In
het begin waren er geen bandjes te zien op het membraan, ook na langere tijd
kleuren. Uiteindelijk was gebleken dat de ponceau kleuring die gebruikt is,
uitgewerkt was omdat het waarschijnlijk over de datum was. Het heeft als
resultaat dat er geen bandjes op het membraan te zien waren. Daarna was er
nieuwe fles gekocht als vervanging voor de oude. Na het gebruik van de
nieuwe fles waren er wel bandjes zichtbaar op het membraan.
Veel factoren van de western blot methode waren al opgezet in het protocol die
in het lab aanwezig was. Het protocol was ver uitgewerkt, alleen de
verdunningen van de 1e en de 2
e antilichamen zouden nog bepaald moeten
worden. Ook het visualiseren van de western blot voor collageen type I zou nog
geoptimaliseerd moeten worden.
In het begin van het onderzoek was collageen type I rat als negatieve controle
gebruikt. Bij de laatste zes experimenten is collageen type III ernaast als
negatieve controle gebruikt. Dit gebeurt om te controleren of de 1e antilichaam
specifiek is voor collageen type I humaan. Het gebruik van collageen type III is
besloten na het gesprek met de supervisor. Collageen III moet altijd als
negatieve controle gebruikt worden bij het optimaliseren van western blotting
voor collageen type I. Dit om te controleren of het 1e antilichaam specifiek is
voor collageen type I.
Doordat er niet genoeg tijd was, is alleen western blot voor collageen type I
humaan onderzocht. Voor het optimaliseren van western blot methode voor
collageen type III humaan, moet hetzelfde proces opnieuw gedaan worden.
Uiteindelijk zullen de twee typen collageen op hetzelfde manier bepaald
kunnen worden.
Voor de komende tijd is aan te raden dat men direct met twee gels tegelijk aan
de slag te gaan. Op deze manier is het sneller om western blot te optimaliseren.
Ook is het wenselijk dat alles van tevoren gecontroleerd wordt. Een voorbeeld;
als de buffers op zijn moeten deze gemaakt worden. Dit moet voor het
beginnen met het experiment zodat het proces snel begint en de
gels/membranen niet droog gaan worden.
14
6. Conclusie
• Na het gebruik van verschillende verdunningen van het 1e antilichaam is
gebleken dat de optimale verdunning die gebruikt kan worden bij de
western blot methode voor collageen type I humaan verdunning 1:1500
is.
• Na het gebruik van verschillende verdunningen van het 2e antilichaam is
gebleken dat de optimale verdunning die gebruikt kan worden bij de
western blot methode voor collageen type I humaan verdunning
1:12500 is.
15
7. Bronnen
1) http://www.mstwente.nl/thoraxcentrum/hart/problemen_met_de_hartkleppe
n.doc/
2) http://www.yayabla.nl/users/Innercircle/Uploads/img_113.jpg
3) http://www.natuurinformatie.nl/nnm.dossiers/natuurdatabase.nl/i002083.ht
ml
4) http://nl.wikipedia.org/wiki/Hartklep
5) R. van Wezel; ROC stage verslag; Juni 2007.
6) http://roy.schrijft.nl/hartkleppen.jpg
7) http://www.lumc.nl/2070/patientenzorg/operaties/foto/replac1.jpg
8) http://www.dpte.nl/site/index.php?id=17
9) http://biomed.brown.edu/Courses/BI108/BI108_2007_Groups/group12/ho
mepage.html
10) http://nl.wikipedia.org/wiki/Afbeelding:Collagentriplehelix.png
11) http://nl.wikipedia.org/wiki/Collageen
12) http://www.imb-jena.de/~rake/Bioinformatics_WEB/gifs/sds_page2.gif
13) http://www.chemieforum.nl/forum/index.php?showtopic=1349&st=0&
14) http://www.chemicon.com/images/ant101/A2WB.gif
15) http://www.western-blot.org/photos/rouge_ponceau_1.jpg
16) Braam, W.G.M.; Electroforese; EPN te Houten; 2000, 4edruk.
17) W.L. van de Loo; Fontys stageverslag; augustus 2004.
16
Gel elektroforese Bijlage I
(SDS-Page)
Materialen:
• Glasplaat met opstaande randjes (0,75mm)
• Afdek glas
• Mal
• Kam
• Houder
• Bak
• Power supply
• Runningbuffer
• Separating Gel
• Stacking gel
• Pipetten 1000 µl / 100 µl / 10 µl
• Bijbehorende puntjes
• Leammli buffer
• Marker
Gels:
Bijvoorbeeld 8% gel (andere percentages en stacking gels zijn terug te vinden
in bijlage II) (onderstaande waarden zijn gebaseerd op 1 gel)
• Water: 2,3 ml
• Bisacrylamide: 1,3 ml Let op: Kankerverwekkend! R45
• Tris buffer: 1,3 ml
• APS (ammonium per sulfaat): 0,05 ml
• SDS: 0,05 ml
• TEMED: 0,003 ml
Let op: Na toevoegen van TEMED zal de gel polymeriseren. Dus direct
verwerken!
Gebruik bij het maken van een polyacrylamide gel altijd blauwe handschoenen!
Leammli buffer:
2x Laemmli Buffer omdat deze met het monster verdund zal worden bij
verwerking
• 125 mM Tris-HCl pH 6,8
• 20 % (v/v) Glycerol
• 5% SDS
• 0.02% Broom phenol Blue
• 10% 2-mercaptoethanol
De Laemmli buffer kan bij -20oC lang bewaard blijven.
17
Procedure: Bijlage I
• Neem de 2 glasplaatjes en plaats ze in de mal. Haal deze over de
labtafel om zeker te zijn dat beide onderzijden gelijk staan.
• Plaats de mal in de houder op het rubber sponsje om lekken te
voorkomen.
• Maak zowel de stacking gel als de separating gel (Voeg pas TEMED
toe bij gebruik).
• Pipeteer de separating gel tussen de twee glasplaatjes en laat ongeveer
1,5 cm vrij. Vul deze ruimte af met ethanol. Binnen 30 minuten is de gel
gepolymeriseerd en kan de ethanol er afgegoten worden. Pipeteer nu de
stacking gel hier boven op en plaats de kam in de gel. Laat deze gel ook
polymeriseren.
• In de tijden dat de gels moeten polymeriseren moeten de monsters
verdund en verwerkt worden. De verdunde monsters worden 1:1
vermengd met Leammli buffer en 10 minuten verhit bij 96oC.
• Haal de gel die tussen de glasplaatjes zit uit de mal en plaats deze in de
houder. Zet de houder in de bak en vul de bak met running buffer.
(Indien 1 gel runt, moet de tegenoverliggende houder afgedekt worden
met de plastic plaat die hiervoor bestemd is).
• Was de slotjes uit door de buffer in en uit het slotje te pipetteren.
• Voeg 5µl van de gewenste marker toe aan het eerste en laatste slotje in
de rij. Pipeteer van de verhitte monsters 15µl in elk slotje.
• Sluit de bak af met het hiervoor bestemde deksel en sluit deze aan op de
power supply. (Let hierbij op dat zwart staat voor – en rood voor +) Stel
in op 90 Volt en start running. Na ongeveer 10 minuten de voltage
verhogen naar 120 Volt.
• Als de blauwe kleur van de Leammli buffer de onderkant van de gel
bereikt heeft is het runnen voltooid.
• Neem glasplaatjes met de gel uit de houder en haal voorzichtig de
glasplaatjes van elkaar. Steek de stacking gel weg en steek een klein
hoekje af van het begin zodat je weet waar het eerste en laatste eiwit in
gepipetteerd is.
• De gel kan gekleurd worden in bijvoorbeeld zymo staining of coomassi
staining. Indien nodig kan de gel gebruikt worden voor western blot.
(Let op: Een gel is niet houdbaar!)
18
Tabel 1: Schema Gel percentage Bijlage II
Separating gels
6% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml
H2O 2,6 5,3 7,9 10,6 13,2 15,9 21,2 26,5
30% acrylamide 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 8,0 10,0
1,5M Tris pH8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 0,024 0,032 0,04
8% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml
H2O 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2
30% acrylamide 1,3 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,7 13,3
1,5M Tris pH8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018 0,024 0,03
10% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml
H2O 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8
30% acrylamide 1,7 3,3 5,0 6,7 8,3 10,0 13,3 16,7
1,5M Tris pH8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
12% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml
H2O 1,6 3,3 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5
30% acrylamide 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 16,0 20,0
1,5M Tris pH8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
15% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml
H2O 1,1 2,3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5
30% acrylamide 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20,0 25,0
1,5M Tris pH8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
Stacking gels
5% 1ml 2ml 3ml 4ml 5ml 6ml 8ml 10ml
H2O 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4,1 5,5 6,8
30% acrylamide 0,17 0,33 0,5 0,67 0,83 1,0 1,3 1,7
1,0M Tris pH6,8 0,13 0,25 0,38 0,5 0,63 0,75 1,0 1,25
10% SDS 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1
10% APS 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1
TEMED 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,008 0,01
Bron: Sambrook & Russel; Molecular cloning and laboratory manual; 3e editie 2001
[13]
19
Western Blot Bijlage III
Materialen:
• PVDF membraan
• Whatman papier
• Sponsjes
• Blotmal
• Schaaltje
• Blotbak
• Ijsbak
• Roervlo
• Roerder
• Blotbuffer (Bio-Rad)
• 100ml 10x blotbuffer
• 200 ml MeOH
• 700 ml MilliQ
• PBS-Tween 0,1%
• 5 tabletten PBS per Liter water
• 1000 ml MiLiQ
• 1 ml Tween
• Handschoenen
• 50ml buis
• Melkpoeder
• PBS-tween 0,1%
• Eerste antilichaam (USBiological, C7510-17K)
• Tweede antilichaam (pierce, 31402)
• PBS
• ECL oplossing ;kit met luminol en waterstofperoxide. (Thermo 34075)
Oplossingen:
Runningbuffer:
• 100 ml Running buffer 10x Bio-Rad
• 900 ml Milli Q water
Blotbuffer:
• 100 ml Blotbuffer 10x Bio-Rad
• 300 ml Methanol
• 598 ml Milli Q water
• 2 ml 10%SDS oplossing
PBS-Tween:
• 5 PBS tabletten (Sigma; P4417t00TAB)
• 1 L Water
• 1 ml Tween
20
Procedure: Bijlage III
Knip de membranen op formaat van de gel (90 mm bij 60 mm), draag hierbij
handschoenen om te voorkomen dat er eiwit van je handen op het membraan
komt. Week het membraan ongeveer één min. in 100% methanol. Week het
membraan daarna in de blotbuffer samen met de sponsjes en whatman
papiertjes.
Leg de blotmal in een schaaltje met blotbuffer en leg de materialen er in de
volgende volgorde in:
• Zwarte kant van de blotmal (-)
• Sponsje
• Whatman papier (aantal is afhankelijk van de dikte van het papier)
• Gel (verkregen via gel elektroforese)
• PVDF membraan
• Whatman papier (aantal is afhankelijk van de dikte van het papier)
• Sponsje
• Transparante kant van de blotmal (+)
Plaats de blotmal in de blotbak met de zwarte kant aan de zwarte zijde. Zet de
ijsbak en een roervlo er in. Zet de roerder rustig aan en blot ± 2 uur bij 200 mA.
Na 1 uur blotten op pauze drukken en de ijsbak vervangen voor een nieuwe.
Vries de gesmolten ijsbak opnieuw in voor latere blots.
Na 125/130 minuten blotten:
Spoel het blot met PBS-Tween en bewaar het blot in PBS-Tween. Het
membraan kan zo ongeveer één dag bewaard blijven bij 4oC en onbeperkt bij -
20oC.
Het verkregen membraan bevat nu de eiwitten die in de gel een bandje
vormden. Om de eiwitten zichtbaar te maken is een immuno blot mogelijk maar
ook een ponceau kleuring. Immuno blot wordt gebruikt bij het aantonen van
een specifiek eiwit. Ponceau kleuring is een aspecifieke methode voor alle
eiwitten. Deze methoden sluiten elkaar niet uit, maar ze kunnen ook aanvullend
gebruikt.
Immunoblot:
Als onderdeel van western blot.
• Melkpoeder
• PBS /PBS-tween (0,1%)
• Primair antilichaam
• Secundair antilichaam
• 50 ml buis
• Versa Doc (Bio-Rad)
• Geblot PVDF membraan
• Rollenbank (gekoeld)
21
Werkwijze: Bijlage III
• Dag 1:
o 3.5% melkpoeder in PBS tween maken.
o Leg het membraan wat is verkregen door blotten in een schaaltje en
voeg hier 30 ml 3,5% PBS tween melk aan toe. Het melkpoeder
oplossen in PBS-Tween 0,1%. Laat het 1 uur incuberen bij
kamertemperatuur.
o Stop vervolgens het membraan in een 50 ml buis met de bovenkant
naar binnen. Maak de juiste verdunning van het eerste antilichaam
in 3,5% melkpoeder met PBS-Tween. Leg de buis in de koelkast op
de rollenbank, laat overnacht incuberen.
• Dag 2:
o Was de volgende dag het blot door het buisje leeg te gieten en 5 tot
10 ml PBS-Tween toe te voegen. Leg het buisje 5 minuten op de
rollenbank (bij kamertemperatuur). Herhaal deze wasstap 3x.
o Maak een verdunning van het 2e antilichaam in 3,5% melkpoeder
met PBS-Tween en voeg die aan de buis met het membraan.
o Leg de buis gedurende 1 uur op de rollenbank bij kamertemperatuur
om het 2e antilichaam te laten incuberen.
o Was daarna het blot weer 3 keer met PBS-Tween en één keer met
PBS, elke keer voor 5 minuten en op de rollenbank bij
kamertemperatuur incuberen.
o Leg het membraan op een overhead sheet en maak de ECL
oplossing klaar door 1:1 de 2 componenten (luminol en
waterstofperoxide) bij elkaar te voegen.
o Druppel de substantie over het membraan en laat ongeveer 2
minuten incuberen. Laat het membraan uitdruppen en leg het op een
nieuwe overhead sheet met een andere sheet er boven op zodat het
membraan niet uit kan drogen. (Voorkom hierbij luchtbellen die er
tussen kunnen komen).
o Maak nu een foto met het de Versa Doc (Bio-Rad) van Bio-Rad. Het
uitgezonden licht is van de bandjes afkomstig en wordt zo zichtbaar
gemaakt.
Afbeelding: Voorbeeld van membraan gekleurd met behulp van immunoblot
Sluitertijd 60 sec. rechts en links magic mark™ midden collageen.
Eerste 6 bandjes collageen type I humaan in verdunningen, 7e bandje collageen type I rat,
lege plaats is collageen type III humaan. (Geen binding van 1e antilichaam aan type III)
22
Tabel 2: Gebruikte antilichamen, controles en markers Bijlage IV
Mag
icma
rk xp
All b
lue m
arker
Co
ntro
les
Ra
bb
it an
ti go
at
imm
un
op
ure
IgG
HR
P
lab
eled
Secu
nd
aire
an
tilicha
men
Go
at a
ntih
um
an
imm
un
op
ure
col. T
ype I
Prim
aire
an
tilicha
men
Co
llag
en typ
e
III hu
ma
n
Co
llag
een typ
e I
rat
Co
llag
een typ
e I
hu
man
Co
ntro
les
---------
---------
1:5
.000
– 1
:10
0.0
00
1:1
00
– 1
:50
0
---------
---------
---------
Verd
un
nin
g
Inv
itrog
en
Bio
-Rad
Pierce
Bio
techno
log
y
US
Bio
log
ical
Sig
ma
Sig
ma
Sig
ma
Fa
brik
an
t
---------
---------
Ca. 1
30
kD
Ca. 1
30
kD
Ca. 1
30
kD
Fo
rmaa
t
(kD
)
LC
560
2
16
1-0
373
31
40
2
C7
510
-17
K
C4
407
C8
897
C7
774
Pro
d. N
r.
Reco
mb
inan
te
eiwitten
Reco
mb
inan
te
eiwitten
Rab
bit
Go
at
Hu
man
placen
ta
Rat tail
Hu
man
placen
ta
Oo
rspro
ng
---------
---------
Mo
no
clon
al
Po
lyclo
nal
---------
---------
---------
Po
ly/m
on
o-
clon
al
23
Ponceau kleuring Bijlage V
Materialen:
• Ponceau oplossing. (Sigma Aldrich; P7170-1L)
• PVDF membraan (al wel geblot)
• Schaaltje
• Water
• Overhead sheet
• Pincet
• Tissues
Procedure:
• Giet een bodem ponceau in het schaaltje.
• Neem het membraan voorzichtig met een schoon pincet van het
blotpapiertje af en leg deze in een schaaltje met ponceau oplossing.
Zorg dat het membraan goed onder gedompeld is. Laat ongeveer 15 min
staan. (evt. op een schudplaat)
• Giet nu voorzichtig de ponceau oplossing terug in de fles en vul het
schaaltje met water uit de kraan. Let op: niet rechtstreeks op het
membraan laten spoelen!
• Spoel enkele seconden met het water en giet het water door de
gootsteen. Vul het schaaltje opnieuw met een bodem water (weer niet
direct op het membraan gieten). Haal het membraan uit het water en leg
het op de overhead sheet.
• Een gedroogd membraan is onbeperkt te bewaren*. Een gedroogd
membraan is echter niet meer te bewerken. Om het membraan te
gebruiken voor immunoblot mag het zeker niet drogen.
Afbeelding: Voorbeeld membraan kleuring met ponceau kleuring [5]
*Mogelijk ontkleuren de membranen door blootstelling aan licht en lucht. Dit is nog niet bekend.
24
Tabel 3: Indeling collageen volgens Bornstein en Traub Bijlage VI
Type Notes
I
This is the most abundant collagen of the human body. It is present in
scar tissue, the end product when tissue heals by repair. It is found in
tendons, the endomysium of myofibrils and the organic part of bone.
II Articular cartilage and Hyaline cartilage, makes up 50% of all cartilage
protein
III
This is the collagen of granulation tissue, and is produced quickly by
young fibroblasts before the tougher type I collagen is synthesized.
Reticular fiber. Also found in artery walls, intestines and the uterus
IV Basal lamina; eye lens. Also serves as part of the filtration system in
capillaries and the glomeruli of nephron in the kidney.
V most interstitial tissue, assoc. with type I, associated with placenta
VI most interstitial tissue, assoc. with type I
VII forms anchoring fibrils in dermal epidermal junctions
VIII some endothelial cells
IX FACIT collagen, cartilage, assoc. with type II and XI fibrils
X hypertrophic and mineralizing cartilage
XI cartilage
25
Handleiding Versadoc Apparaat Bijlage VII
• Start het apparaat aan 2X:
o Start de camera
o Start de Versadoc apparaat
• Zet de pc aan.
• Altijd controleren of in het apparaat de korte of de lange lens staat.
Voor western blot moet altijd de korte lens gebruikt worden.
• Start Quantity One op.
• Selecteer scanner; Versa Doc.
• Selecteer onder de button Select: Versadoc.
• Selecteer channel 1 (het staat meestal al op channel 1)
• Druk op de button “Select” en kies hieronder ‘blotting’ en dan ‘Chem
Hi Sensitivity’.
• Druk op de button “position” om de positie van het membraan vast te
stellen, (Light off).
• Draai aan de lens en kijk naar het scherm om een scherp beeld te
krijgen.
• Scherpstellen op het membraan door op de button “Focus” te drukken.
• Light off.
• Stel de sluitertijd om te beginnen in op 10 sec.
• Druk op de button “Acquire” om de foto te maken.
• Zoom op het sterkste bandje door middel van het zoom icoon.
• Activeer de “density tool”, dit is te vinden onder View → Plot density,
daarna kan gekozen worden tussen verschillende opties; bijvoorbeeld
density at cursor. De maximale haalbare intensiteit is 4000.
• De behaalde intensiteit is aangegeven als “Average Quantity” onder in
beeld. Stel dat deze 35.9 is, zal de berekening van de gewenste
sluitertijd als volgt zijn:
4000/36= 111 X meer dan wat nu gebruikt is, dus 111*10= 1110 sec.
Ander voorbeeld: stel dat de “Average Quantity” 550 is, dus
4000/550= 7.3X meer dan wat nu gebruikt is, dus 7.3*10= 73 sec
sluitertijd.
• Kies de gewenste sluitertijd en druk op “Acquire” om de foto vast te
stellen.
• Na het vaststellen van de foto verschijnt de foto in het wit, om het in
zwart te krijgen moet het volgende gedaan worden; rechter muisknop →
transform kiezen → onder display kies invert display. Door de pijlen
van (high en low) te veranderen kan het contrast veranderd worden.
• Foto opslaan.
• Om de foto te kunnen openen op alle PC’s, moet het volgende gedaan
worden; File → Export to TIFF Image → Export view excluding
overlays.
• Nu is de foto formaat geschikt voor alle pc’s.
• Einde.
26
Bijsluiter 1e antilichaam Bijlage VIII
27
Bijsluiter 1e antilichaam Bijlage IX