Download - Horizontální elektroforéza na agarovém gelu
![Page 1: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/1.jpg)
Horizontální elektroforéza na agarovém gelu
MUDr. Michal Jurajda
ÚPF LF MU
![Page 2: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/2.jpg)
Agarózový gel
![Page 3: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/3.jpg)
Agarózový gel
![Page 4: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/4.jpg)
![Page 5: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/5.jpg)
Příprava agarózového gelu
• Připravit navážku agarózy
• Za míchání smísit s potřebným množstvím pufru
• Zvážit
• Rozvařit
• Doplnit na původní hmotnost dest. Vodou
• Zchladit a přidat EtBr.
![Page 6: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/6.jpg)
Nalévání agarózy
• Připravit nalévací misku (olepit páskou nebo umístit do „formičky“, nasadit hřebínek a zkontrolovat jeho vzdálenost ode dna.
• Umístit na vodorovnou podložku.
• Nalít agarózu o teplotě cca 40 ºC.
• Nechat zchládnout a odstranit hřebínek a pásku
![Page 7: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/7.jpg)
Příprava TBE pufru
• 61,8g kys. borité
• 121,0g TRIS báze
• 7,5g EDTA
• Doplnit do 1000ml destilovanou vodou
• pH 8,0
![Page 8: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/8.jpg)
Nanášecí pufr
• Ficoll– zvyšuje hustotu roztoku, drží roztok na dně
jamky
• bromfenolová modř– vizualizuje roztok při nanášení a migruje v
elektrickém poli
• 300 μl bromfenolové modři 0,125% + 30ml vodného roztoku ficollu 15-20%
![Page 9: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/9.jpg)
![Page 10: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/10.jpg)
Barvení DNA v gelu
• Ethidium bromid
• Zásobní roztok 5mg/ml
• Pracovní koncentrace 0,5-1 μg/ml
• (1-2 μl zásobního roztoku / 10 ml agarózy)
![Page 11: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/11.jpg)
Intenzita elektrického pole
• Obecně 2-10V/cm
• Nejčastěji používáme intenzitu 2-4V/cm
• !pozor! intenzita elektrického pole se počítá ze vzdálenosti elektrod, nikoliv z rozměrů gelu
![Page 12: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/12.jpg)
Pohyb DNA při elektroforéze
• Elektrické pole
• Difúzní pohyb
![Page 13: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/13.jpg)
+
-
![Page 14: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/14.jpg)
![Page 15: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/15.jpg)
Vizualizace a archivace obrazu
![Page 16: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/16.jpg)
Elektroforéza v agarovém gelu
![Page 17: Horizontální elektroforéza na agarovém gelu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062321/56812a52550346895d8da176/html5/thumbnails/17.jpg)
Jak zajistit co nejlepší výsledek?
• Nenanášet velké množství DNA
• Nepoužívat zbytečně vysoké napětí
• Volit správný druh a koncentraci agarózy
• Recyrkulace pufru
• Chladit elektroforézu