1
Cytogenetisk diagnostik 2005 (PCR, FISH, CGH)
Thue BryndorfKromosomlaboratoriet
Klinisk Genetisk Afdeling
Hvorfor er vi der ?
Dr. Lejeune
Trisomi 21 (Downs Syndrom)Oplæg
• Klassisk cytogenetik (kromosomer)• Nye metoder
– Kromosom-PCR til hurtigt at diagnosticere de hyppigste fosterkromosomfejl
– FISH og CGH til mere sensitiv kromosomdiagnostik
2
Prænatale prøvetyper
• Chorion villus biopsiFra 11u+0d
• AmniocenteseFra 15u+0d
Kromosomundersøgelse I
• Cirka 7.500/år i DK. ↓• Dyrkning af fostervands- eller chorion
villus celler i 10-12 dage• Standsning i delingsfase og herefter
– fremstilling af karyotype (d.v.s. samlet billede af alle fostrets kromosomer) og
– Kromosomoptælling• Svartid: 2-3 uger
Metafasekromosomer Karyotype
3
Kromosomundersøgelse II
• Hyppigste fund er NY-opståede sygdomme med ekstra eller manglende kromosomer (numeriske aneuploidier)
Prænatalt detekterede kromosomfejl i DK, 1993-2000
Kromosom 13, 18, 21, X og Y aneuploidier udgør 60-75% af alle prænatalt detekterede kromosomfejl, men 90-95% af alle de klinisk betydende kromosomfejl hos nyfødte
40 %Andre
16 %Kønskromosomfejl
44 %Trisomi 13, 18, 21 i alt
4 %Trisomi 13
10 %Trisomi 18
31 %Trisomi 21
Kromo-fejl i fostervandsprøver
Fra “Practical genetic counselling” af P. S. Harper, Oxford 1993.
0,739,647
0,737,746
0,716,245
0,705,044
0,614,543
0,583,742
0,582,941
0,582,340
0,571,839
0,551,538
0,521,238
0,501,036
0,450,935
Relativ andel af trisomi 21Alle kromosomfejl %Maternel alder
Kromosomundersøgelse III
• Sensivitet
Cirka 10 millioner DNA-basepar
4
CACTGTAGCTGTACTACCTTCCATCTCCTCACCTATTCCAACTATCTGAATCATGTGCC CTTCTCTGTGAACCTCTATCATAATACTTGTCACACTGTATTGTAATTGTCTCTTTTACTTTCCCTTGTATCTTTTGTGCATAGCAGAGTACCTGAAACAGGAAGTATTTTAAATATTTT GAATCAAATGAGTTAATAGAATCTTTACAAATAAGAATATACACTTCTGCTTAGGATGAT AATTGGAGGCAAGTGAATCCTGAGCGTGATTTGATAATGACCTAATAATGATGGGTTTTA TTTCCAGACTTCACTTCTAATGATGATTATGGGAGAACTGGAGCCTTCAGAGGGTAAAATTAAGCACAGTGGAAGAATTTCATTCTGTTCTCAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCAT TAAAGAAAATATCATCTTTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGTCATCAA AGCATGCCAACTAGAAGAGGTAAGAAACTATGTGAAAACTTTTTGATTATGCATATGAACCCTTCACACTACCCAAATTATATATTTGGCTCCATATTCAATCGGTTAGTCTACATATAT TTATGTTTCCTCTATGGGTAAGCTACTGTGAATGGATCAATTAATAAAACACATGACCTA TGCTTTAAGAAGCTTGCAAACACATGAAATAAATGCAATTTATTTTTTAAATAATGGGTT CATTTGATCACAATAAATGCATTTTATGAAATGGTGAGAATTTTGTTCACTCATTAGTGA GACAAACGTCTCAATGGTTATTTATATGGCATGCATATAGTGATATGTGGT
e Lys Glu Asn Ile Ile Phe Gly Val Ser Tyr Asp Glu Tyr ArgT AAA GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT TCC TAT GAT GAA TAT AGA
F508del
Kromosom-PCR
• Nakkefoldsscanning: Færre prøver. Flere abnorme. Mere nervøse gravide.
• Sundhedsstyrelsen 2004: Konsekvenserne ved de ofte betydelige ventetider ved kromosomdiagnostikken søges afbødet gennem anvendelse af analysemetoder med kort svartid.
Hvad er kromosom-PCR ?
• Kvantitativ PCR anvendes til at måle antallet af kromosomerne 13, 18, 21, X & Y
• Analysetid: 1½ døgn.• Svartid: 4-5 dage.
PCR – Nobelpris 1993
5
PCRPolymerase Chain Reaction
Redskab til kopiering af udvalgte DNA-segmenter 1.000.000 gange≥
1. cyklus
3. cyklus
2. cyklus
n cykler = 2n kopier
Kromosom-PCR
Kapillær-elektroforesemaskine Kromosom-PCR resultater
6
Kromosom-PCR resultater Svarbrev på Kromosom-PCR
• Resultatet af kromosom-PCR på din fostervandsprøve – den hurtige prænatale undersøgelse for kromosom 13, 18, 21 og kønskromosomerne – viser normale forhold.
• Det endelige resultat, som omfatter analyse af alle kromosomer, forventes inden for 3 uger og du modtager endnu et brev.
• Såfremt vi finder forhold, der fraviger det første resultat, bliver du kontaktet telefonisk.
Perspektiv
• Kromosom-PCR teknikken bliver allerede nu anvendt til andre analyser– udredning af mentalt retarderede børn– skal til at anvendes inden for udredning af
cancer og fostre med hjertefejl
Hvad er FISH ?
• DNA-baseret teknik• Specifik farvning af kromosomer eller dele
af kromosomer
7
FISH FISH
FISH
• Interfase-FISH– FISH på cellekerner
• Metafase-FISH– FISH på kromosompræparater
Interfase-FISH disomi
8
Interfase-FISH trisomi Interfase-FISH multicolor
Normal (18/21-hybridisering) Trisomi 21
Aneuploidi screening for 13, 16, 18, 21, og 22
Prober: gul, rød, mørkeblå, lyseblå og grøn fluorescens
Mor med balanceret 1;5 translokation
9
Balancerede translokationsbærere
• Risiko for ubalancerede fejl i kønsceller– Nedsat fertilitet– Spontane aborter– Misdannede/retarderede børn
Præimplantatorisk diagnostik (PGD)
PGD ubalanceret 1;5 translokation Metafase FISH
• Afklaring af indviklede karyotyper
10
Translokation (ekstra materiale på kr. 18) Metafase FISH (kr. 18 maleprobe)
Metafase FISH (kr. 11 maleprobe) Henvisning fra UL
• Hjertemisdannelse hos fostret (truncus arteriosus), obs. del 22q11
11
Mikrodeletioner
• 22q11 deletions-syndrom– Medfødte hjertefejl– Aplasi/hypoplasi af thyroidea/parathyroidea– Craniofaciale misdannelser
Undersøgelse for 22q11 deletion
- Deletion + Deletion (A1600-01)
Metafase FISHFordel
• Sikker identifikation af translokeret og ekstra eller manglende materiale
Metafase FISHUlemper
• Man skal have en mistanke om, hvilket materiale som er translokeret og/eller duplikeret
• Prober er dyre• Varierende probe signal kvalitet• Visse områder dækkes ikke af maleprober• Proberne er vanskelige at kombinere i stort
tal i samme reaktion
12
Perspektiv
• FISH teknikken finder ikke nye anvendelsesområder.
• Multi-PCR overtager – bortset fra ved præimplantatorisk diagnostik
CGH
CGH hybridisering på normale kromosomer CGH-analyse
13
CGH analyse af Tali, 3 år gammel pige
• Fysisk og mentalt retarderet • Mikrocefali• Bred og flad næse• Lavtsiddende ører• Tynd øverste læbe• Lang philtrum• Høj gane
Mor gravid (10 uger)Dim(21q22->ter) Enh(22q13->qterB4996-02, No. 36
Mor
CGH på foster
CGH på Tali
Dim(21q22->ter) Enh(22q13->qter)
Enh(21q22->qter) Dim(22q13->qter) CVS - foster
14
1Mb chip
3000 kloner med cirka 1 millionbasepars afstand470 særligt udvalgte kloner fra områder,som er involveret i mental retardering
Array-CGH
• Måske den endelige afløser for almindelig kromosomanalyse – evt. i kombination med kromosom-PCR
• En masse ”nye” syndromer vil blive defineret –ligesom det skete i 50-60’erne, da det blev muligt at lave almindelig kromosomanalyse.
• Vi skal være med til at definere, hvad der er normalt
89
1211 11
12 1213
12 1213 13 13
1211 11 11 11 1111
01000020000300004000050000600007000080000
80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 00
Prænatal diagnostik 1980-2000
0
2000
4000
6000
8000
10000
80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 00
Udviklingen af prænatal diagnostik 1980-2000
0 0 0 03 4
1015 17
2025
31 3338 39 40
4339 41
4544
CVS
AC
15
6468 68
76 73 70 72 69 68 67 66 67 68 65 6157 56 54 53 5251
0
2000
4000
6000
8000
10000
80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 00
Prænatal diagnostik af gravide > 35 år 1980-2000
-PD
+PD
24
37404136
303639
4339
31
484642
65
4954 514850
60
0
50
100
150
200
80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 00
prænatal
postnatal
Præ- og postnatal diagnostik af trisomi 21, 1980-2000
Provokerede aborter 1989-95Antal abn. Ab. Prov %
• +21 350 349 99,7 • +18 107 107 100 • +13 30 30 100
• XXY 56 39 70 • XYY 39 24 62 • XXX 31 23 74 • X 94 72 77 • De novo transl. 35 20 57
Genetik på nettet
• Pubmed– OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man)– Books
• Genetics Home Reference
16
Pubmed.com /.org / .gov Genetics Home Reference
Centers for Disease Control
• CDC