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Módulo 3
IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS
Identificação de isolados de Enterobacteriaceae
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3.1. Caracterização das Enterobacteriaceae
As Enterobacteriaceae são uma família de bacilos Gram-negativos de muito
ampla distribuição na natureza. Podem encontrar-se na água, solo, plantas e, como o
nome indica, no tracto gastro-intestinal dos animais de sangue quente (incluindo o
Homem). A família Enterobacteriaceae contém mais de 100 espécies de bactérias. As
Enterobacteriaceae que fazem parte da microflora normal do tracto gastro-intestinal
designam-se por coliformes. Os membros da família Enterobacteriaceae são bacilos
Gram-negativos, não esporulados, relativamente pequenos. Quando móveis, possuem
falgelos peritriquiais. Algumas têm cápsulas. A resistência aos antibióticos é comum
entre os membros desta família. Fermentam um grande número de glúcidos. Os
padrões de açúcares fermentados são utilizados para diferenciá-las e classificá-las.
Algumas enterobacteriáceas são patogénicas. O factor de virulência comum a todas as
enterobacteriáceas patogénicas são as endotoxinas (lipopolissacárido, LPS). Algumas
estirpes patogénicas também produzem exotoxinas: Algumas destas exotoxinas
designam-se por enterotoxinas porque afectam especificamente o tracto gastro-
intestinal, causando diarreia e perda de fluidos. Várias espécies de enterobacteriáceas
podem causar pneumonias e infecções do tracto urinário. Também são conhecidas por
serem uma das principais causas de infecção de feridas e de infecções nosocomiais
(infecções adquiridas em ambientes hospitalares). Podem também causar bacteremia e
meningite, se as condições lhes forem propícias. Contudo, sucumbem sob a acção de
concentrações relativamente baixas dos desinfectantes comuns (cloro, p. ex.). A sua
susceptibilidade aos antibióticos é variável, existindo presentemente numerosas
estirpes resistentes. A congelação não as destrói, nem na natureza, quando presentes
na água ou em alimentos congelados que tenham sido previamente contaminados com
estes microrganismos. Por se encontrarem no tracto gastro-intestinal em número
muito elevado, a transmissão destes microrganismos faz-se normalmente pela via
fecal-oral. A causa mais frequente para que as enterobacteriáceas atinjam os alimentos
resulta de uma lavagem inadequada das mãos após contacto com material fecal ou
pela ingestão ou utilização na confecção de alimentos de água contaminada.
Entre os géneros mais significativos da família Enterobacteriaceae, contam-se
os seguintes:
Cedecea (Cedecia) – tem 3 espécies associadas a infecções humanas e que geralmente
causam bacteremia.
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Citrobacter – é um género próximo da Salmonella, que é o agente etiológico de
infecções do tracto urinário.
Edwardsiella – associado a meningites, septicemia e infecções de feridas.
Enterobacter – género próximo da Klebsiella, que também causa infecções
semelhantes. A espécie mais frequente é a E. cloacae, que apresenta muitas vezes
resistências aos antibióticos.
Escherichia – este género contém uma só espécie, a E. coli. Durante muitos anos,
pensou-se que não existiam estirpes patogénicas de E. coli. Este microrganismo é um
dos elementos predominantes da microflora intestinal e é utilizado como indicador de
contaminação fecal das águas e alimentos. Como a maior parte da investigação em
biologia molecular e tecnologia do DNA recombinante foi feita utilizando E. coli,
sabe-se muito mais sobre este organismo do que sobre qualquer outro. A E. coli
possui a capacidade de reproduzir-se a uma taxa astronómica. Se as condições fossem
as ideais, uma só célula de E. coli poderia originar em três dias uma população com
uma massa superior à do planeta Terra. Esta bactéria pode duplicar de número a cada
15 minutos, embora em geral o faça apenas a cada duas horas. A maior parte das
estirpes de E. coli são inofensivas, mas existem várias estirpes que produzem toxinas
que causam diarreias com diversos graus de gravidade. Uma destas estirpes, a E. coli
O157:H7 (E. coli da Colite Hemorrágica) causa anemia hemolítica aguda e disfunção
renal. Pior ainda – é resistente a muitos antibióticos: tetraciclina, sulfonamida,
estreptomicina e cloranfenicol.
A E. coli O157:H7 é uma mutante que foi descoberta em 1982 e da qual se
conhecem pelo menos 62 subtipos até ao presente. A toxina que esta bactéria produz e
liberta ainda não foi suficientemente estudada, mas como a bactéria faz parte da
microflora natural do gado, pensa-se que o seu comportamento patogénico poderá ter
resultado do abuso dos antibióticos na produção animal. É particularmente perigosa
para as crianças, mas nos casos extremos até mesmo os adultos podem desenvolver
uma disfunção chamada púrpura trombótica trombocitopénica, em que o sangue perde
a capacidade de coagular e começa a escorrer pela boca. Estes casos são fatais.
Certas outras estirpes de E. coli designam-se por E. coli enterotoxigénica
(ETEC) e produzem enterotoxinas que funcionam de forma semelhante à do bacilo da
cólera. Estas estirpes são a causa mais comum de diarreias infecciosas a nível
mundial. As infecções por estas estirpes de E. coli são muito comuns entre os
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viajantes, que podem adquiri-las a pelo consumo de carne mal passada, leite não
pasteurizado ou mesmo nadando em águas contaminadas.
Ewingella – género associado a septicemia, infecções de feridas e infecções do tracto
urinário.
Hafnia – associada a bacteremia e casos de diarreia.
Klebsiella – causa pneumonia primária em idosos que já sofrem de outras doenças
como bronquite crónica, diabetes ou alcoolismo. É também uma causa frequente de
septicemia, infecções do tracto urinário e de feridas.
Kluyvera – associada à infecção das feridas de ocorrência frequente em pessoas que
sofrem de diabetes.
Proteus, Providencia e Morganella – são grupos bacterianos muito próximos uns dos
outros. As bactérias destes géneros encontram-se geralmente em águas, solos, esgotos
e no tracto gastro-intestinal do Homem e dos animais. São uma causa frequente de
infecções do tracto urinário e infecções de feridas. Dez por cento das infecções
nosocomiais são atribuíveis a estas bactérias.
Salmonella – é uma espécie muito importante dentro do género Salmonella. Encontra-
se associada a gastroenterites, febres entéricas (febre tifóide, p. ex.) e osteomielites.
Shigella – tem quatro serovariedades responsáveis por infecções humanas associadas
a doenças intestinais com elevada taxa de mortalidade.
Serratia – a espécie mais frequente é a S. marcescens, que produz colónias de
pigmentação vermelha quando cresce à temperatura ambiente. Durante muito tempo,
pensou-se que não era patogénica, mas sabe-se hoje em dia que pode causar
pneumonia, cistite e outras infecções. É uma bactéria em que as resistências a
antibióticos são frequentes, pelo que o tratamento das infecções poderá ser difícil.
Tatumella – associada a bacteremia e a infecções do tracto urinário.
Yersinia – é conhecida por ser o género de microrganismos a que pertence a bactéria
que causa a peste bubónica.
3.2. Características morfológicas empregues na identificação de
Enterobacteriaceae
3.2.1. Gram
As Enterobacteriaceae são, por definição, bacilos Gram-negativos.
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3.2.2. Mobilidade
A mobilidade bacteriana pode se detectada por observação microscópica
directa, colocando uma gota de meio de cultura numa lâmina para microscopia ,
cobrindo-a com uma lamela e observando-a ao microscópio. A microscopia de
contraste de fase dá bons resultados para este fim. Esta técnica é mais usada para
espécies que não crescem bem em meios sólidos. No caso da Pseudomonas
aeruginosa, o emprego de meios semi-sólidos não vai produzir bons resultados
porque, embora esta bactéria seja móvel, não consegue crescer longe da zona da
picada, onde há contacto com a atmosfera e a concentração de oxigénio é elevada.
Neste caso, é aconselhável recorrer a técnicas microscópicas. Não é o caso das
Enterobacteriaceae, pelo que para detectar a mobilidade deste grupo bacteriano se
recorre normalmente ao crescimento em meios semi-sólidos.
Os meios empregues para detectar a mobilidade contêm concentrações de agar
que não excedem os 0,4%, porque concentrações mais elevadas produzem géis
demasiado firmes para que os microrganismos se possam deslocar livremente
neles. Muitas vezes, empregam-se meios como o SIM (Sulfuretos-Indol-
Mobilidade) para detectar a mobilidade. Como estes meios já de si apresentam um
carácter ligeiramente turvo, pode tornar-se difícil a visualização do crescimento.
Para facilitar a visualização, podem incorporar-se sais de tetrazólio no meio. Os
sais de tetrazólio são incolores, mas transformam-se em formazan, que é
vermelho, em resultado das condições redutoras que advêm do crescimento
microbiano. Assim, a zona onde ocorre o crescimento microbiano encontra-se
marcada a vemelho. Contudo, a presença destes sais pode inibir algumas bactérias
fastidiosas.
Dentre as Enterobacteriaceae, as espécies dos géneros Shigella e Klebsiella
são caracteristicamente móveis. A detecção da mobilidade nas enterobacteriáceas
faz-se a 35ºC, com excepção da Yersinia enterocolitica, em que a produção de
proteína flagelar é mais rápida para temperaturas mais baixas. Neste caso, faz-se a
detecção da mobilidade a 22ºC.
3.3. Meios selectivos e diferenciais para Enterobacteriaceae
Os meios geralmente empregues para o isolamento das Enterobacteriaceae são
meios diferenciais e/ou selectivos em que o carácter diferencial advém da presença de
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lactose e de um sistema indicador de pH, tal como o vermelho neutro ou o azul de
bromotimol. A natureza selectiva deriva da incorporação de inibidores do crescimento
doutros microrganismos, como os sais biliares, o cristal violeta ou o verde brilhante.
A presença de crescimento e o tipo de colónia podem já fornecer ao analista uma ideia
sobre o tipo de microrganismo presente.
3.3.1. Agar de McConkey
O agar de mMcConkey é um meio diferencial para o isolamento de
Enterobacteriaceae e bacilos Gram-negativos com elas relacionados. Os sais biliares e
o cristal violeta que o meio contém inibem o crescimento de bactérias Gram-positivas
e de alguns Gram-negativos fastidiosos. A lactose é o único glúcido adicionado ao
meio. As bactérias que fermentam a lactose produzem, neste meio, colónias que têm
diversas tonalidades de vermelho, devido à viragem do indicador vermelho neutro
(que apresenta cor vermelha quando pH<6,8) que é causada pela produção de uma
mistura de ácidos orgânicos. As colónias das bactérias que não fermentam a lactose
apresentam-se transparentes ou incolores.
As bactérias que fermentam fortemente a lactose, como as espécies dos
géneros Escherichia, Klebsiella e Enterobacter, produzem colónias vermelhas
rodeadas por um halo de bílis precipitada. As bactérias que apresentam uma
fermentação retardada ou fraca da lactose (Citrobacter, Providencia, Serratia, e
Hafnia) podem apresentar-se incolores após 24h de incubação e ligeiramente rosadas
se a incubação for prolongada até às 48h. As espécies de Proteus, Edwardsiella,
Salmonella e Shigella originam, salvo raras excepções, colónias incolores ou
transparentes.
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Fig. W. Enterobacteriaceae em meio de Mc Conkey Agar: fermentadoras da lactose à esquerda, não
fermentadoras da lactose à direita.
3.3.2. Violet Red Bile Agar
Este agar é utilizado para a pesquisa de coliformes em alimentos, leite, água e
outros materiais semelhantes. É um meio selectivo que detecta o crescimento dos
coliformes através da propriedade que estes possuem de fermentar a lactose. As
colónias de coliformes acidificam o meio, como resultado da fermentação da lactose,
pelo que as suas colónias apresentam cor vermelha, que é a cor ácida o indicador de
pH que o meio contém (vermelho neutro. Para além disso, estas colónias têm à volta
um halo de bílis precipitada. O cristal violeta e os sais biliares do meio inibem o
crescimento de microrganismos Gram-positivos.
Fig. Z. Enterobacteriaceae em Violet Red Bile
Glucose Agar
3.3.3. Hektoen Enteric Agar
O Hektoen Agar foi formulado para permitir uma boa taxa de recuperação de
Salmonella e Shigella a partir de amostras com contaminações pesadas por outros
tipos de microrganismos (p. ex., material fecal). A elevada concentração de sais
biliares inibe o crescimento de todas as bactérias Gram-positivas e retarda o
crescimento de muitas das estirpes de coliformes. O meio contém sucrose e lactose, a
partir das quais pode verificar-se produção de ácidos. Quando isto sucede, o azul de
timol vira para a sua cor ácida – amarelo. O meio possui ainda tiossulfato de sódio,
que funciona como fonte de enxofre para a produção de H2S. A formação de H2S é
detectada pelo indicador citrato férrico de amónio, que é bastante sensível. O citrato
férrico de amónio reage com o H2S produzindo um precipitado de cor negra.
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Neste meio, as bactérias que fermentam rapidamente a lactose (como a E. coli)
são ligeiramente inibidas, produzindo colónias de cores que variam entre o laranja
vivo e o rosa salmão. As colónias de Salmonella são azuis-esverdeadas, tipicamente
com o centro de cor negra devido à produção de H2S. A Shigella apresenta colónias
de um verde mais intenso do que o da Salmonella, com uma cor que se vai esbatendo
em direcção à periferia da colónia. As estirpes de Proteus também sofrem alguma
inibição. Se conseguirem produzir colónias, estas são pequenas, transparentes, e mais
luzidias ou aquosas do que as da Salmonella e da Shigella.
Fig. Y. E. coli e Shigella em Hektoen Agar.
3.3.4. Brilliant Green Agar
O Agar de Verde Brilhante (Brilliant Green Agar) é um meio selectivo que se
utiliza para o isolamento de espécies do género Salmonella. O corante verde brihante
inibe as bactérias Gram-positivas e a maioria das outras Gram-negativas. O outro
corante presente no meio, o vermelho de fenol, serve de indicador de pH para detectar
a produção de ácidos resultante da fermentação da glucose ou da sucrose.
Fig. X. E. coli e Salmonella em Brilliant Green Agar.
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3.3.5. Kligler Iron Agar
O Kligler Iron Agar (ou o Triple Sugar Iron Agar) é especialmente importante
para a identificação dos bacilos Gram-negativos recuperados a partir de meios de
cultura de isolamento primário. Os padrões de reacção nestes meios fazem parte de
muitos dos esquemas de identificação das Enterobacteriaceae e também constituem
um valioso instrumento de confirmação para o controlo de qualidade dos
procedimentos e meios de cultura empregues para o isolamento primário.
O agar de açúcares duplos foi descrito pela primeira vez em 1911, por Russell,
que o empregou para detectar a produção de ácido e de gás a partir da glucose e da
lactose num único meio de cultura. Kligler modificou a fórmula em 1917,
adicionando-lhe o sulfato ferroso e o tiossulfato de sódio, para permitir detectar a
produção de H2S. As fórmulas do Kliger Iron Agar (KIA) e do Triple Sugar Iron Agar
(TSI) são idênticas, só que o TSI contém 10g de sucrose por litro de meio, para além
da glucose e da lactose. A fórmula do KIA é a seguinte:
Extracto de carne 3g
Extracto de levedura 3g
Peptona 15g
Proteose peptona 5g
Lactose 10g
Glucose 1g
Sulfato ferroso 0,2g
Cloreto de sódio 5g
Tiossulfato de sódio 0,3g
Agar 12g
Vermelho de fenol 0,024g
Água destilada 1 l
pH final = 7,4
Há algumas considerações importantes a ter em conta no estudo da fórmula do
KIA. A incorporação de quatro derivados proteicos (extracto de carne, extracto de
levedura, peptona e proteose peptona) torna o meio muito rico do ponto de vista
nutritivo e a ausência de inibidores faz com que este meio permita o crescimento de
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praticamente todas as bactérias – são excepções as muito fastidiosas e os anaeróbios
obrigatórios. Por este motivo, só se pode utilizar o KIA (ou o TSI) para testar as
características de culturas puras, que já foram submetidas a isolamento primário e a
purificação. A lactose encontra-se presente numa concentração que é 10 vezes
superior à da glucose. O sulfato ferroso é um indicador um pouco menos sensível do
que outros que também são empregues em bacteriologia para a detecção da produção
de H2S pelas bactérias. Por isso, podem verificar-se discrepância entre os resultados
obtidos no KIA e os obtidos, por exemplo, no meio de SIM. O vermelho de fenol é
um indicador de pH que apresenta cor vermelha para valores de pH inferiores a 6,8.
Como o pH do meio não inoculado se encontra tamponizado para 7,4, são necessárias
quantidades relativamente pequenas de ácido para virar a cor do indicador.
Os princípios bioquímicos subjacentes às reacções observadas no KIA ou no
TSI estão ilustrados na fig. 1. É de notar que este agar se coloca em rampas. Esta
configuração resulta na existência de duas câmaras de reacção dentro do mesmo tubo.
A porção da rampa, exposta em toda a sua superfície ao oxigénio, é aeróbia. A porção
inferior, que se designa por fundo, encontra-se protegida do ar, sendo por isso
relativamente anaeróbia. Ao preparar o meio, é importante manter comprimentos
equivalentes da rampa e do fundo, para que este efeito de câmara dupla se verifique
efectivamente. Cada uma das zonas deverá apresentar um comprimento de
aproximadamente 3 cm.
Os tubos de KIA ou de TSI inoculam-se com o fio de inoculação. Toca-se o
crescimento duma cultura pura ou uma colónia bem isolada obtida num meio de
isolamento primário com o fio e faz-se uma picada na zona do fundo do tubo, que
chegar quase ao fundo (3 – 5 mm acima do fundo). Ao remover o fio, procede-se à
inoculação da rampa por estrias superficiais. A incubação é feita a 35ºC, por 18 – 24h.
As reacções que podem verificar-se no KIA são:
Rampa alcalina/fundo alcalino
Não ocorreu fermentação dos glúcidos. Característica de bactérias não fermentativas,
tais como a Pseudomonas aeruginosa.
Rampa alcalina/fundo ácido
A glucose foi fermentada. A lactose não foi fermentada. Característica de espécies
que não fermentam a lactose, como a Shigella.
Rampa alcalina/fundo ácido com enegrecimento
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A glucose foi fermentada. A lactose não foi fermentada. Ocorreu produção de H2S.
Característica de bactérias que não fermentam a lactose e produzem H2S, como as
espécies dos géneros Salmonella, Arizona, Citrobacter e alguns Proteus.
Rampa ácida/fundo ácido
A glucose e a lactose foram fermentadas. Característica de coliformes fermentadores
da lactose, como a E. coli e o grupo Klebsiella – Enterobacter.
A porção do tubo correspondente à rampa, que se encontra exposta ao
oxigénio atmosférico, têm propensão para se tornar alcalina, devido à descarboxilação
aeróbia dos péptidos e aminoácidos que provêm da peptona que o meio contém.
Formam-se assim aminas a partir dos aminoácidos na rampa, reacções estas que são
aceleradas pelo crescimento microbiano. Por este motivo, a rampa tem tendência para
permanecer alcalina (de cor vermelha). Na zona profunda do tubo, onde há pouco
oxigénio, a degradação oxidativa dos aminoácidos é mínima. Na verdade, pode
mesmo verificar-se a produção de pequenas quantidades de ácido, detectáveis pelo
aparecimento duma cor amarelada.
Assim, como mostra a fig. 1, se não houver fermentação dos glúcidos, a
produção de aminas na rampa, juntamente com a tamponização para um pH
ligeiramente alcalino, vão produzir uma cor vermelha, que se espalha por todo o meio.
As bactérias que dão este tipo de reacção designam-se por não fermentativas. A
produção duma reacção negativa no KIA ou no TSI é uma das mais importantes
indicações iniciais de que o microrganismo em causa não é uma Enterobacteriaceae.
Se o KIA for inoculado com um microrganismo que fermenta a glucose, mas
não a lactose, só irá produzir-se uma quantidade muito pequena de ácido, dada a baixa
concentração de glucose (0,1%) que o meio contém. Inicialmente, durante as
primeiras horas de incubação, até mesmo quantidades tão pequenas de ácido podem
bastar para virar a cor do meio, tanto na rampa como no fundo, para amarelo.
Contudo, após mais algumas horas de incubação a rampa reverterá à cor alcalina,
devido à degradação dos aminoácidos por acção das bactérias, em presença do
oxigénio. Ao fim das 18 – 24 h de incubação, já toda a rampa apresentará cor alcalina
(vermelha). No fundo do tubo, contudo, a formação de aminas não é suficiente para
contrabalançar a produção de ácido e o fundo permanece ácido (amarelo). Assim, uma
reacção rampa alcalina/fundo ácido no KIA (ou no TSI) é um indicador inicial
importante de que o microrganismo em questão não fermenta a lactose.
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As bactérias que utilizam a lactose produzem quantidades relativamente
abundantes de ácido no KIA; porque a lactose está presente numa concentração muito
mais elevada do que a glucose (10:1). Esta quantidade de ácido já é suficiente para
contrabalançar a produção de aminas que se verifica na rampa. Por isso, todo o tubo
vai virar para amarelo. Uma reacção rampa ácida/fundo ácido indica que o
microrganismo fermenta a lactose.
Como o H2S é um gás incolor, tem que se adicionar ao meio um indicador que
permita a sua detecção. O tiossulfato de sódio é o composto mais frequentemente
empregue para fornecer às bactérias os átomos de enxofre de que necessitam para
produzirem H2S. Os sais de ferro (sulfato ferroso e citrato férrico de amónio) são os
indicadores mais comuns para a detecção do H2S. O sulfureto de hidrogénio produz
com estes sais um precipitado negro de sulfureto ferroso. Como a produção de H2S só
se verifica em ambiente ácido, o enegrecimento correspondente no KIA ou TSI
aparece frequentemente apenas no fundo do tubo, especialmente quando se trata de
bactérias que não fermentam a lactose. Assim, se o fundo se apresentar enegrecido,
deverá ser lido como ácido, mesmo que a cor amarela não seja visível por se encontrar
obscurecida pelo precipitado de sulfureto ferroso. O KIA e o TSI são menos sensíveis
do que o SIM (Meio para Sulfuretos-Indol-Mobilidade) para a detecção da produção
de H2S. Alguns microrganismos produzem o H2S em quantidades muito pequenas,
que poderão não ser evidenciadas no KIA, mas que poderão resultar num
enegrecimento distinto do SIM.
3.4. Testes para a identificação de Enterobacteriaceae
3.4.1. Teste da citocromo oxidase
Os citocromos são ferro-proteínas hémicas que constituem o último elo da cadeia
respiratória na respiração anaeróbia. Transferem electrões (hidrogénio) para o
oxigénio, com produção de água. Encontram-se em microrganismos aeróbios,
microaerófilos e anaeróbios facultativos. É um teste muito útil para a diferenciação
inicial de Enterobacteriaceae (sempre negativas) e de outros Gram-negativos como
Pseudomonas, Neisseria ou Campylobacter (positivas).
Para fazer o teste da citocromo oxidase utilizam-se certos corantes, como o di-
hidrocloreto de p-tetrafenileno diamina, que vão receber os electrões da cadeia
respiratória, substituindo assim o oxigénio. No estado reduzido, o corante é incolor.
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Contudo, em presença da citocromo oxidase e de oxigénio atmosférico, oxida-se,
originando um composto de cor azul, o azul de indofenol.
Controlo positivo: Pseudomonas aeruginosa
Controlo negativo: Escherichia coli
Fig. 4.1. Teste da oxidase com as Baticdent Oxidase Test Strips. A primeira fita da esquerda mostra um
resultado negativo, a terceira um resultado positivo.
3.4.2. Teste da redução de nitratos
A capacidade de um microrganismo reduzir nitratos a nitritos é uma característica
importante para a identificação e diferenciação de espécies em muitos grupos de
microrganismos. Todas as Enterobacteriaceae, excepto certos biótipos de
Enterobacter e Erwinia, apresentam redução dos nitratos. O teste também é útil na
identificação de membros dos géneros Haemophilus, Neisseria e Branhamella.
Os organismos que reagem positivamente a este teste têm a capacidade de retirar
oxigénio aos nitratos, produzindo nitritos, de acordo com a equação:
NO3- (nitrato) + 2e
- + 2H NO2 (nitrito) + H2O
Detecta-se a presença de nitritos no meio por adição de -naftil amina e ácido
sulfanílico que, em presença de nitrito vão dar origem a um corante diazónioco
vermelho, a p-sulfobenzeno-azo--naftil amina.
Controlo positivo: Escherichia coli
Controlo negativo: Acinetobacter calcoaceticus, var anitratus
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Fig. 4.2. Resultados do teste da redução de nitratos. No tubo 1, resultado negativo, no
tubo 2 resultado positivo. O resultado negativo deve ser confirmado pela adição de
zinco em pó (tubos 3 e 4).
3.4.3. Teste do o-nitrofenil galactósido (ONPG)
O orto- nitrofenil galactósido (ONPG) é um composto estruturalmente semelhante
à lactose. A única diferença entre as duas moléculas reside na substituição da glucose
por ortonitrofenil (fig. 1).
Quando hidrolisado por acção do enzima -galactosidase, o ONPG origina dois
resíduos, galactose e orto-nitrofenol. O ONPG é incolor, mas o o-nitrofenol é
amarelo, o que permite visualizar a hidrólise.
As bactérias que fermentam a lactose possuem dois enzimas, lactose permease e
-galactosidase, para o fazer. A permease é necessária para que a molécula de lactose
possa entrar na célula, enquanto que a -galactosidase serve para cindir a ligação
galactosídica, com produção de glucose e galactose. As bactérias que não fermentam
a lactose são desprovidas de ambos os enzimas e, nos testes de fermentação, não são
capazes de produzir ácido a partir da lactose. Algumas espécies bacterianas podem
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aparentar não fermentarem a lactose porque não têm a permease, têm apenas a -
galactosidase. Estas bactérias conseguem clivar o OMPG e, portanto, dão reacções
positivas a este teste. Nos testes de fermentação, é necessário aguardar mais tempo
para que estas bactérias dêem resultados positivos (reacção retardada) pelo que o teste
do ONPG permite obter uma identificação rápida nestes casos.
Controlo positivo: Escherichia coli
Controlo negativo: Proteus spp.
Fig. 4.3. Teste do ONPG. O tubo da esquerda mostra um resultado positivo, o da
direita um resultado negativo.
3.4.4. Testes IMViC
Um dos mais antigos grupos de testes empregues para a identificação de bacilos
entéricos foram as reacções IMViC. Esta sigla significa Indol, Methyl Red, Voges-
Proskauer e Citrato, que são um conjunto de características diferenciais inicialmente
empregues por sanitaristas e epidemiologistas para detectar contaminações cruzadas
de águas e alimentos com esgotos ou material fecal.
a. Teste do indol
O indol é um dos produtos da degradação metabólica do aminoácido triptofano.
As bactérias que possuem o enzima triptofanase podem hidrolisar e desaminar o
triptofano, produzindo indol, ácido pirúvico e amónio. A produção de indol é uma
característica importante para a identificação de muitas espécies de microrganismos,
sendo particularmente útil para a distinção da Escherichia coli (positiva) dos membros
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do grupo Klebsiella – Enterobacter – Hafnia – Serratia (que são, na sua maioria,
negativos).
O teste do indol baseia-se na formação de um complexo de cor vermelha pela
reacção do indol com o grupo aldeídico do p-dimetil aminobenzaldeído. Este
composto é o princípio activo dos reagentes de Kovacs e de Ehrlich que se utilizam
para pesquisar a presença de indol nos meios de cultura. O meio a empregar para este
teste deverá ser rico em triptofano. Na prática, usam-se muitas vezes meios que
permitem fazer um conjunto de testes duma vez só, como o meio de SIM (Meio para
Sulfuretos, Indol e Mobilidade). A presença de indol é visualizada pelo
desenvolvimento duma cor fúcsia viva na interface entre o reagente e o caldo alguns
segundos após a adição do reagente.
Controlo positivo: Escherichia coli
Controlo negativo: Klebsiella pneumoniae
Fig. 4.4. Teste do Indol. A – resultado positivo; B – resultado negativo
b. Teste do Vermelho de Metilo (Methyl Red)
O vermelho de metilo é um indicador de pH com um intervalo de viragem situado
entre os 6,0 (amarelo) e os 4,4 (vermelho). O pH a que o vermelho de metilo detecta
os ácidos é consideravelmente mais baixo do que o pH para o qual os outros
indicadores utilizados em bacteriologia o fazem. Por isso, para produzir alteração da
cor do meio, o microrganismo em estudo tem que produzir quantidades elevadas de
ácidos a partir do glícido que lhes serve de substrato.
Este teste é então um teste qualitativo para a produção de ácidos, requerendo que
o microrganismo produza quantidades apreciáveis de ácidos (láctico, acético, fórmico)
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a partir da glucose, por fermentação ácido-mista, para dar um resultado positivo.
Como, numa fase inicial da incubação, muitas espécies de Enterobacteriaceae poderão
produzir quantidades suficientes de ácidos para virar a cor do indicador, só se
consideram positivos os resultados em que esta viragem se mantenha mesmo após
incubação prolongada (48 – 72 h).
O meio mais empregue para este teste é o caldo de MR-VP, na formulação de
Clark e Lubs.
Controlo positivo: Escherichia coli
Controlo negativo: Enterobacter aerogenes
Fig. 4.5. Teste do vermelho de metilo. Da esquerda para a direita: negativo, não
inoculado, e positivo.
c. Teste de Voges-Proskauer
O nome deste teste deriva do nome de dois microbiologistas do início do século
XX, que foram os primeiros a observar a reacção em que se baseia o Voges-
Proskauer. O teste detecta a presença no meio de um composto intermediário do
metabolismo bacteriano, o acetilmetil carbinol (fig. 2).
O ácido pirúvico, que é um composto fulcral produzido durante a degradação
fermentativa da glucose, pode ser posteriormente metabolizado segundo diversas vias.
Uma destas vias resulta na produção de acetilmetil carbinol, que é um composto
neutro. Em presença de oxigénio atmosférico e de hidróxido de potássio a 40%, o
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acetilmetil carbinol é convertido em diacetilo. Adiciona-se -naftol para servir de
catalisador e produzir um complexo de cor vermelha. Esta via metabólica é
característica dos membros dos grupos Klebsiella – Enterobacter – Hafnia – Serratia.
Controlo positivo: Enterobacter aerogenes
Controlo negativo: Escherichia coli
Fig. 4.6. Resultados do teste de Voges-Proskauer.
d. Citrato
O citrato de sódio é um sal do ácido cítrico, composto orgânico que é um dos
metabolitos do ciclo dos ácidos tricarboxílicos. Algumas bactérias podem obter
energia de outra forma que não a fermentação de glúcidos. Podem, por exemplo,
utilizar o citrato como fonte exclusiva de carbono e energia. Esta característica é
muito importante para a identificação de Enterobacteriaceae.
Detecta-se a utilização do citrato pela bactéria testada através da produção de
produtos metabólicos secundários alcalinos. No meio, há citrato de sódio como fonte
exclusiva de carbono e fosfato de amónio como fonte exclusiva de azoto. As bactérias
que utilizam o citrato como fonte de azoto também podem utilizar o sal de amónio
com libertação de NH4+, o que conduz a uma alcalinização do meio. Existe no meio
um indicador de pH, o azul de bromotimol, que assume cor amarela para pH<6,0 e
azul para pH>7,6. O resultado positivo é visualizado pela formação de uma cor azul
intensa após 24 – 48 h de incubação.
Controlo positivo: Enterobacter aerogenes
Controlo negativo: Escherichia coli
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Fig. 4. 7. Resultados do teste do citrato.
3.4.5. Urease
A ureia é uma diamida com a fórmula:
Todas as amidas são facilmente hidrolisadas, libertando amónio e dióxido de
carbono.
Muitas espécies de microrganismos são capazes de hidrolisar a ureia, por
possuírem a enzima urease:
O amónio formado origina posteriormente carbonato de amónio, o que vai resultar
numa alcalinização do meio, que é detectada pela mudança de cor do indicador
vermelho de fenol.
Os microrganismos que hidrolisam rapidamente a ureia, dão reacções positivas
(cor vermelha) após 1 – 2h de incubação. Os microrganismos menos activos podem
necessitar de 3 ou mais dias de incubação antes de produzirem alcalinização suficiente
para virar a cor do indicador. No primeiro grupo contam-se as espécies dos géneros
Proteus – Morganella, no segundo, as Klebsiella.
Controlo positivo: Proteus
Controlo positivo (fraco): Klebsiella
2 NH3 + CO2 CH4N2O + H2O
urease
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Controlo negativo: Escherichia coli
Fig. 4.8. Resultados do teste da urease. Da esquerda para a direita, negativo, positivo
(24 h), positivo (4 h) e não inoculado.
3.4.6. Pesquisa de descarboxilases
As descarboxilases são um grupo de enzimas que atacam o grupo COOH dos
aminoácidos, formando aminas, de reacção alcalina. Esta reacção, que se designa por
descarboxilação, liberta CO2 como produto secundário. Cada descarboxilase é
específica para um dado aminoácido. Os aminoácidos que normalmente se testam
para identificar Enterobacteriaceae são a lisina, ornitina e arginina. A descarboxilação
da lisina dá origem à cadaverina. As reacções correspondentes da ornitina e da
arginina originam, respectivamente, putrescina e citrulina. No último caso
(degradação da arginina) o enzima interveniente é uma di-hidrolase e não uma
descarboxilase e o mecanismo da reacção é diferente: inicialmente, ocorre a remoção
de um grupo NH2, seguidamente verifica-se a conversão da citrulina e orinitina e é
esta última que sofre descarboxilação, convertendo-se em putrescina.
O meio mais utlizado para a pesquisa de actividade das descarboxilases é o meio
basal de Moeller. O aminoácido que se pretende testar só é adicionado ao meio basal
após a esterilização, sob a forma duma solução aquosa que foi esterilizada por
filtração, imediatamente antes da inoculação com o microrganismo em estudo.
Simultaneamente, prepara-se um tubo de controlo, só com meio basal (sem
aminoácido), que também é inoculado. Como a descarboxilação é favorecida em
condições de anaerobiose, cobre-se a superfície do meio contido em ambos os tubos
com óleo mineral. Durante as fases iniciais da incubação, ambos os tubos vão mudar
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de cor (passam de roxo a amarelo) devido à fermentação das quantidades vestigiais de
glucose presentes no meio. Se ocorrer descarboxilação do aminoácido, formam-se
aminas alcalinas e o meio retoma a sua cor inicial (roxo).
Controlos:
Aminoácido Controlo positivo Controlo negativo
Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae
Ornitina Enterobacter cloacae Klebsiella spp.
Arginina Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes
Fig. 4.9. Resultados do teste da ornitina descarboxilase.
3.4.7. Pesquisa de fenilalanina desaminase
A fenilalanina é um aminoácido que origina, ao perder o grupo amina, um ceto-
ácido, o ácido fenilpirúvico. Dentre as Enterobacteriaceae, apenas os membros do
género Proteus, Morganella e Providencia possuem o enzima (desaminase)
necessária para esta conversão.
O teste da fenilalanina baseia-se na detecção do ácido fenilpirúvico no meio de
cultura, após crescimento do microrganismo em estudo. O teste é positivo se aparecer
uma cor verde após a adição de uma solução a 10% de cloreto férrico.
Controlo positivo: Proteus spp.
Controlo negativo: Escherichia coli
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Fig. 4.10. Resultados do teste da fenilanina desaminase. O tubo da esquerda é
negativo, o da direita positivo.
3.4.8. Identificação de espécies
Para a identificação de espécies de Enterobacteriaceae é necessário analisar um
número bastante elevado de características fisiológicas (consultar Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology). Como isto pode tornar-se um trabalho moroso e
dispendioso, devido à grande quantidade de meios de cultura que são necessários,
existem alguns kits comerciais que facilitam o trabalho de identificação. O mais
utilizado para Enterobactereaceae e outros bacilos Gram-negativos é o sistema API
20E (BioMérieux). Este sistema consiste numa tira de plástico com 20 cúpulas
miniaturizadas que contêm substratos desidratados e que, depois de inoculada, se
coloca numa câmara de incubação própria, em plástico. Por acção do crescimento
bacteriano, verificam-se alterações de cor dos substratos que podem ser lidas
visualmente ou com sistemas automatizados. O padrão destas alterações de cor é
comparado com os padrões das espécies conhecidas de Gram-negativos para chegar a
uma identificação da espécie. Os substratos contidos no API 20E destinam-se aos
seguintes testes: ONPG, arginina di-hidrolase, lisina descarboxilase, ornitina
descarboxilase, citrato, H2S, urease, triptofano deaminase, indol, Voges-Proskauer,
liquefação da gelatina, e utilização dos açúcares glucose, manitol, inositol, sorbitol,
ramnose, sucrose, melibiose, amigdalina e arabinose.
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3.5. Trabalho prático – Identificação de isolados de Enterobacteriaceae
São fornecidas aos alunos culturas dos seguintes géneros bacterianos:
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Salmonella, Proteus e
Pseudomonas. Para cada cultura, é necessário proceder à inoculação dos seguintes
meios de cultura:
McConkey Agar: inoculação à superfície, por estrias.
Violet Red Bile Agar: inoculação por incorporação de 1 ml de cultura diluída.
Após a inoculação, deixar que o agar solidifique e adicionar mais 4 ml de agar para
que se forme uma camada que iniba a difusão de oxigénio. Deixar solidificar esta
camada antes de inverter as placas para incubar.
Hektoen Enteric Agar: inoculação à superfície, por estrias.
Brilliant Green Agar: inoculação à superfície, por estrias.
Kligler Iron Agar: inoculação por picada + inoculação à superfície.
Ainda durante esta sessão, realizar-se-ão os seguintes testes:
Preparação de esfregaços para posteriormente corar pelo método de Gram
Oxidase (em Oxidase Strips)
Inoculação dos meios IMViC
Teste das descarboxilases
Notas sobre a inoculação dos meios IMViC:
1. VP: inocular o meio de MR-VP com uma cultura pura do organismo em estudo.
Incubar a 35ºC por 24 h um dos tubos. Retirá-lo da estufa, adicionar o reagente
para a pesquisa de acetilmetil carbinol. Agitar muito bem e deixar o tubo aberto,
para haver melhor contacto com o oxigénio atmosférico. A cor característica do
teste VP+ aparecerá 15 – 60 min após a adição do reagente. Não se deve esperar
mais de 1 h para fazer a leitura porque poderão surgir falsos positivos.
2. MR: inocular o meio de MR-VP com uma cultura pura do microrganismo em
estudo. Incubar a 35ºC por 48 – 72h. Ao fim deste tempo, adicionar 5 gotas de
solução de vermelho de metilo. Se o meio virar para amarelo, considerar positivo.
Cores alaranjadas ou vermelhas constituem resultados negativos.
3. Indol: inocular o meio de SIM por picada central. Incubar a 35ºC por 18 – 24h.
Ao fim deste tempo, examinar a linha de picada para detectar a mobilidade,
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verificar se houve enegrecimento para detectar a produção de H2S e adicionar o
reagente de Kovac para fazer a pesquisa de indol.
4. Citrato: inocular a rampa do meio com uma única estria longitudinal. Incubar a
35ºC por 24 – 48h. Considera-se que o resultado foi positivo quando ocorreu
desenvolvimento duma cor azul profunda e/ou crescimento visível ao longo da
linha de picada durante o tempo de incubação. O teste deu resultado negativo se
não tiver havido crescimento e a cor do meio se apresentar verde.