Identification de la base moléculaire de l’antigène érythrocytaire de haute fréquence PEL
Mémoire
Corinne Nadeau Larochelle
Maîtrise en biochimie
Maître ès sciences (M.Sc)
Québec, Canada
© Corinne Nadeau Larochelle, 2013
iii
Résumé
En 2013, la Société internationale de médecine transfusionnelle (ISBT) reconnaît
33 groupes sanguins et 339 antigènes érythrocytaires différents, dont plus de 297
sont déjà associés à un groupe sanguin. Les autres antigènes sont classés dans des
séries et des collections en attendant la découverte de leur base moléculaire. En
1996, Geoff Daniels et collaborateurs identifiaient l’antigène PEL. À la suite de cette
découverte, des travaux ont démontré qu’il est présent chez plus de 99,9% de la
population en général et que le phénotype PEL négatif semble être spécifique à la
population québécoise. À la lumière des caractéristiques connues à propos de
l’antigène PEL, des analyses génomiques et protéomiques ont été effectuées dans
le but de découvrir sa base moléculaire. Cependant, l’analyse des ARN messagers
séquencés, ainsi que les résultats obtenus lors des expériences en protéomique,
n’ont pas permis d’identifier la base moléculaire de l’antigène PEL.
v
Avant-propos
Premièrement, je tiens à remercier ma directrice de recherche, Maryse St-Louis,
d’abord pour m’avoir accueillie au sein de son équipe, mais aussi pour m’avoir fait
bénéficier de son expérience et de sa grande disponibilité tout au long de mon
projet.
Merci également à Josée Perreault, Élaine Deschênes, Danny Brouard et
Josée Lavoie pour leur soutien et leur disponibilité. Merci aussi à
Maureen Thompson pour son aide lors du stage qu’elle a effectué au sein de
l’équipe.
Je veux aussi remercier les membres de mon comité d’encadrement :
Manon Couture, Louis Thibault et Michel Vincent, pour le temps qu’ils m’ont accordé
et pour tous leurs judicieux conseils.
Un merci particulier à Patrick Trépanier, Tony Tremblay et Annie Roy pour l’aide
fournie pendant certaines parties de mes travaux et au Laboratoire de référence et
des cellules souches (LRCS) d’Héma-Québec pour avoir fait toutes les expériences
de cartes-gel.
Merci à tous les employés du département de Recherche et Développement
d’Héma-Québec. Vous faites de la R&D un environnement enrichissant et stimulant,
où il est agréable de travailler.
Un merci spécial à mes deux collègues et amies Dominique Chabot et Lee-Ann
Mckinnon pour tous les fous rires et pour avoir contribué à rendre ces deux années
de travail une vraie partie de plaisir!
Merci à mon amoureux, aux membres de ma famille et à mes ami(e)s pour leur
appui inconditionnel et leurs encouragements.
Finalement, je veux remercier Héma-Québec, le CRSNG, ainsi que le FQRNT pour
le soutien financier reçu tout au long de ce projet.
vii
Tables des matières
Résumé.................................................................................................................... iii
Avant-propos ............................................................................................................. v
Tables des matières ................................................................................................ vii
Liste des tableaux ..................................................................................................... x
Liste des figures ...................................................................................................... xii
Liste des abréviations............................................................................................. xiv
1. Introduction ........................................................................................................... 1
1.1. Héma-Québec ................................................................................................ 1
1.2. Le sang ........................................................................................................... 1
1.3. Les globules rouges ........................................................................................ 3
1.4. Les groupes sanguins ..................................................................................... 4
1.5. Les antigènes érythrocytaires ......................................................................... 9
1.6. La sérologie érythrocytaire ............................................................................ 10
1.6.1. Les immunoglobulines ............................................................................ 11
1.6.2. Les immunoglobulines de type G ........................................................... 12
1.6.3. La liaison antigène-anticorps .................................................................. 14
1.7. Le génotypage sanguin ................................................................................. 16
1.8. L’antigène PEL ............................................................................................. 19
1.9. Contexte de recherche et hypothèse ............................................................ 20
1.10. Objectifs ...................................................................................................... 21
2. Matériel et méthodes ........................................................................................... 23
2.1. Analyses génomiques ................................................................................... 23
2.1.1. Échantillons ............................................................................................ 23
2.1.2. Extraction d’ARN .................................................................................... 23
2.1.3. Design d’amorces pour les RT-PCR ....................................................... 23
2.1.4. Amplification par RT-PCR ...................................................................... 24
2.1.5. Amplification des exons 1 à 5 du gène codant pour la glycoprotéine CD44
......................................................................................................................... 26
2.1.6. Amplification de la séquence codante de SMIM1 par PCR classique ..... 27
2.1.7. PCR nichée de l’amplicon de l’aquaporine-1 et PCR à demi nichée du
deuxième fragment de l’ARN messager du CD238 .......................................... 28
2.1.8. Purification et dosage des amplicons ..................................................... 28
viii
2.1.9. Clonage de l’amplicon correspondant à l’ARNm de CD47 ...................... 29
2.1.10. Séquençage et analyse des résultats ................................................... 30
2.2. Analyses protéomiques ................................................................................. 31
2.2.1. Préparation de globules rouges fantômes .............................................. 31
2.2.2. Traitement des globules rouges fantômes à la ficine .............................. 31
2.2.3. Électrophorèse SDS-PAGE et coloration des gels .................................. 32
2.2.4. Spectrométrie de masse ......................................................................... 32
2.2.5. Adsorption-élution des anticorps anti-PEL .............................................. 32
2.2.6. Purification des IgG totales du plasma PEL- par Fast Protein Liquid
Chromatography (FPLC) .................................................................................. 33
2.2.7. Fractionnement des IgG totales purifiées par focalisation isoélectrique .. 33
2.2.8. Tests d’agglutination en carte-gel ........................................................... 34
2.2.9. Immunobuvardages de type Western ..................................................... 36
2.2.10. Observation de l’expression des protéines CD55 et CD59 par
immunobuvardage de type Western ................................................................. 37
2.2.11. Immunoprécipitation en conditions non-dénaturantes ........................... 37
2.2.12. Immunoprécipitation avec crosslinking ................................................. 38
3. Résultats ............................................................................................................. 39
3.1. Analyses génomiques ................................................................................... 39
3.1.1. Amplification par RT-PCR des différents ARNm codant pour les protéines
d’intérêt ............................................................................................................ 39
3.1.2 Amplification des exons 2 à 5 du gène codant pour la glycoprotéine CD44
......................................................................................................................... 39
3.2. Analyses protéomiques ................................................................................. 40
3.2.1. Traitement des globules rouges fantômes à la ficine .............................. 40
3.2.2. Coloration de gels SDS-PAGE et envoi de bandes en spectrométrie de
masse .............................................................................................................. 41
3.2.3. Envoi des globules rouges fantômes PEL+ et PEL- en solution pour être
analysés en spectrométrie de masse ............................................................... 44
3.2.4. Purification des IgG totales du plasma PEL- par FPLC ........................... 45
3.2.5. Séparation des IgG totales selon leur point isoélectrique par
chromatofocalisation ........................................................................................ 47
3.2.6. Tests d’agglutination sur les fractions d’IgG purifiées séparées par
chromatofocalisation ........................................................................................ 48
ix
3.2.7. Adsorption-élution des anticorps anti-PEL .............................................. 49
3.2.8. Immunobuvardages de type Western ..................................................... 49
3.2.9. Observation de l’expression des protéines CD55 et CD59 par
immunobuvardage de type Western ................................................................. 50
4. Discussion ........................................................................................................... 51
4.1. Analyses génomiques ................................................................................... 51
4.2. Analyses protéomiques ................................................................................. 53
4.2.1. La purification des anticorps anti-PEL du plasma ................................... 53
4.2.2. Adsorption-élution des anticorps anti-PEL .............................................. 53
4.2.3. Les immunobuvardages de type Western............................................... 55
4.2.4. Observation de l’expression des protéines CD55 et CD59 par
immunobuvardage de type Western ................................................................. 56
4.2.5. Les immunoprécipitations avec et sans crosslinking ............................... 57
4.2.6. Les analyses en spectrométrie de masse ............................................... 58
4.2.7. Électrophorèses IEF ............................................................................... 59
4.2.8. Électrophorèses en deux dimensions (2D) ............................................. 60
5. Conclusion .......................................................................................................... 61
Bibliographie ........................................................................................................... 63
Annexe I .................................................................................................................. 66
x
Liste des tableaux
Tableau 1.1. : Classement des différents groupes sanguins, du nombre d’antigènes et du (des) gène(s) associé(s). ........................................................... 5
Tableau 2.2. : Description des protéines dont l’ARNm a été ciblé pour les analyses génomiques. ..................................................................................... 24
Tableau 2.3. : Conditions expérimentales pour l'amplification des exons 1 à 5 de l'ARNm de la glycoprotéine CD44 ..................................................... 27
Tableau A.1. : Paramètres utilisés pour l'amplification RT-PCR des ARNm des protéines ciblées. .............................................................................. 66
Tableau A.2. : SNP identifiés à la suite du séquençage des ARNm de différentes protéines membranaires érythrocytaires. .......................................... 67
xii
Liste des figures
Figure 1.1. : Visualisation des composantes du sang après centrifugation. .............. 2 Figure 1.2. : Processus qui mène à la maladie hémolytique du nouveau-né causée
par des anticorps anti-D. ....................................................................... 8 Figure 1.3. : Illustration de la disposition de certaines molécules porteuses
d'antigènes érythrocytaires. .................................................................. 9 Figure 1.4. : Structure d’une immunoglobuline. ....................................................... 12 Figure 1.5. : Fonctions et propriétés physiques des immunoglobulines humaines. . 13 Figure 1.6. : Concept d’affinité dans la liaison antigène-anticorps. .......................... 15 Figure 2.1. : Principe d'agglutination en carte-gel.. ................................................. 35 Figure 2.2. : Interprétation des résultats d'agglutination obtenus en carte-gel. ........ 36 Figure 3.1. : Résultat du traitement des globules rouges fantômes à la ficine en
immunobuvardage de type Western ................................................... 40 Figure 3.2. : Premier gel de polyacrylamide (12%) qui a permis l'envoi de bandes en
spectrométrie de masse.. .................................................................... 42 Figure 3.3. : Deuxième gel de polyacrylamide (12%) qui a permis l'envoi de bandes
en spectrométrie de masse.. ............................................................... 43 Figure 3.4. : Test d'efficacité de la purification des IgG totales effectuée par FPLC.
........................................................................................................... 46 Figure 3.5. : Séparation des IgG totales préalablement purifiées par FPLC en huit
fractions selon leur point isoélectrique. ............................................... 47 Figure 3.6. : Tests d’agglutination effectués en carte-gel effectués pour les huit
fractions obtenues lors de la chromatofocalisation. ............................. 48 Figure 3.7. : Exemple d'immunobuvardage de type Western effectué avec les
fractions 0 et 1 d'IgG purifiées par chromatofocalisation. .................... 50
xiv
Liste des abréviations
ADN : Acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire ARN : Acide ribonucléique ATP : Adénosine tri-phosphate CHUL : Centre hospitalier de l’Université Laval CH/RG : Système sanguin Chido/Rodgers CO2 : Dioxyde de carbone COST : Collection sanguine Cost CROM : Système sanguin Cromer DTT : Dithiothréitol ER : Collection sanguine Er ERMAP : Erythroid membrane-associated protein FPLC : Fast Protein Liquid Chromatography FY : Système sanguin Duffy GE : Système sanguin Gerbich GLOB : Système sanguin Globoside Glut-1 : Transporteur de glucose 1 GPI : Glycosylphosphatidylinositol H : Système sanguin Hh I : Système sanguin Ii IgG : Immunoglobuline G IN : Système sanguin Indian ISBT : La Société internationale de médecine transfusionnelle kDa : Kilodalton KEL : Système sanguin Kell
KN : Système sanguin Knops LRCS : Laboratoire de référence et des cellules souches LU : Système sanguin Lutheran LW : Système sanguin Landsteiner-Wiener NCBI : National Center for Biotechnology Information ng/ml : Nanogramme par millilitre nm : Nanomètre nmoles : Nanomoles pb : Paires de bases PBS : Phosphate buffered saline PEL- : Individus dont les globules rouges n’expriment pas l’antigène PEL PEL+ : Individus dont les globules rouges expriment l’antigène PEL PCR : Réaction en chaîne par polymérase PCR-AS : PCR allèle-spécifique PCR-RFLP : Restriction fragment length polymorphism PCR RT-PCR : Reverse-Transcriptase PCR SC : Système sanguin Scianna SDS-PAGE : Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate SNP : Single Nucleotide Polymorphism YT : Système sanguin Cartwright
1
1. Introduction
1.1. Héma-Québec
Héma-Québec est responsable de la gestion et de l’entreposage des produits sanguins au
Québec. Chaque année, l’entreprise livre environ 500 000 produits sanguins aux hôpitaux
de la province[1]. Aussi, en plus des produits sanguins, Héma-Québec prépare et gère la
distribution des cellules souches de sang de cordon et des tissus humains. Plus
récemment en 2013, le gouvernement québécois a donné son accord pour la mise sur
pied, par Héma-Québec, de la première banque publique de lait maternel au Canada.
En constante évolution, cette entreprise a su s’adapter, au fil du temps, aux nouvelles
réalités québécoises. Parmi celles-ci, il y a la présence grandissante des diverses
communautés culturelles à travers la province. Le défi pour Héma-Québec a été de
recruter des donneurs de sang au sein de ces communautés culturelles. Pour plusieurs
raisons, certaines communautés culturelles ne voient pas d’un très bon œil le don de
sang. Ainsi, Héma-Québec a dû redoubler d’ardeur pour recruter des donneurs, puisque
les gens de ces communautés ont, comme les Québécois de souche, parfois besoin de
transfusions.
Avant qu’il ne soit transfusé, le sang du donneur doit être compatible avec celui du
receveur. Puisqu’il existe plusieurs variants au sein des diverses communautés culturelles
et afin de fournir avec efficience et efficacité des produits sanguins à tous les Québécois,
Héma-Québec a créé, au fil des années, une banque de sang rare.
1.2. Le sang
Le sang est indispensable au corps humain à plusieurs niveaux. Aussi, il permet de
véhiculer tout ce qui est nécessaire à la survie des cellules : l’oxygène, les nutriments, les
vitamines, les électrolytes, ainsi que plusieurs autres molécules indispensables au bon
fonctionnement du corps humain[1]. Chez un adulte de taille moyenne, la quantité de sang
qui circule est de 5 à 6 litres[1].
2
Figure 1.1. : Visualisation des composantes du sang après centrifugation.
Le sang est un liquide biologique homogène qui, après avoir été centrifugé, est séparé en
trois phases distinctes : le plasma, la couche leuco-plaquettaire et le culot globulaire
(Figure 1.1.). Puisqu’aucune composante synthétique n’existe encore pour le remplacer,
les dons de sang sont d’une importance capitale en médecine. En fait, puisqu’un individu
en santé ne peut donner du sang qu’une fois tous les 56 jours, le traitement distinct de
chacune des trois phases du sang permet de traiter un plus grand nombre de patients.
Ainsi, chaque patient reçoit la composante sanguine dont il a besoin.
En fait, après avoir été centrifugé, le sang total est séparé en trois composantes distinctes.
À partir de la transformation d’un seul don de sang total, il est possible d’obtenir quatre
composés : le plasma, les plaquettes, le culot globulaire et le cryoprécipité[1]. Ce dernier
n’est pas obtenu directement après la centrifugation du sang, mais plutôt en congelant et
en décongelant le plasma[1]. Ensuite, ces quatre composés peuvent être donnés
séparément à quatre receveurs, d’où vient la possibilité de sauver quatre vies avec un
seul don de sang total[1].
3
La phase supérieure correspond au plasma. Il s’agit du liquide jaunâtre dans lequel
baignent les cellules sanguines : les globules rouges (érythrocytes), les globules blancs
(leucocytes) et les plaquettes (thrombocytes). À lui seul, le plasma occupe de 50 à 60% du
volume total du sang. En plus de servir à véhiculer les cellules sanguines, iI contient
plusieurs molécules utiles à toutes les cellules, comme des immunoglobulines, des
facteurs de coagulation, des lipides, des hormones et plusieurs protéines, dont la plus
abondante est l’albumine.
Sous le plasma, se trouve la couche leuco-plaquettaire contenant toutes les cellules
immunitaires appelées cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC). Ces cellules
jouent un rôle fondamental, autant dans l’immunité innée que dans l’immunité acquise.
Elles englobent, entre autres : les lymphocytes, les macrophages, les neutrophiles, les
cellules NK et les monocytes. La plupart du temps, à cause de leur pouvoir immunogène,
ces cellules sont retirées du don de sang total par filtration. En fait, ces cellules expriment
plusieurs antigènes, ce qui les empêche d’être transférables aisément d’une personne à
une autre sans causer de réactions néfastes.
Finalement, le culot globulaire occupe la phase inférieure tout au fond du tube et contient,
comme son nom l’indique, les globules rouges.
1.3. Les globules rouges
Les globules rouges sont des cellules de forme biconcave, qui mesurent de 8 à 9 μm et
qui sont dépourvues de noyau. Ainsi, à maturité, les globules rouges ne contiennent pas
de matériel génétique. Dans le corps humain, ils circulent pendant environ 120 jours avant
d’être éliminés dans la rate. Par contre, in vitro, la durée de conservation des culots
globulaires est de 42 jours lorsqu’ils sont conservés à 4ºC[2]. Après cette période, les
paramètres biochimiques au sein des culots globulaires sont trop altérés pour que ces
derniers soient transfusés. La couleur conférée aux globules rouges est due à
l’hémoglobine, une protéine composée de quatre chaînes polypeptidiques, deux chaînes α
et deux chaînes β, qui contiennent chacune une molécule d’hème. Cette protéine permet
aux globules rouges de remplir leur principale fonction au sein du corps humain, c’est-à-
dire le transport de l’oxygène.
4
Du point de vue structural, les globules rouges sont entourés d’une membrane plasmique
qui contient un nombre impressionnant de protéines et de molécules diverses. À ce jour, le
nombre de protéines que contiendrait le globule rouge est évalué à 2289[3]. Notamment,
les dernières avancées en spectrométrie de masse ont permis d’atteindre ce nombre au fil
des ans. Bien que les techniques d’analyses soient de plus en plus sensibles,
l’hémoglobine, qui forme à elle seule 98% du protéome érythrocytaire, reste un
contaminant majeur lors des études protéomiques[4]. Comme l’ont décrit Singer et
Nicolson en 1972, la membrane plasmique des globules rouges est une mosaïque fluide
où toutes les composantes sont en mouvement constant[5]. Ces diverses protéines et
molécules sont à la base des groupes sanguins et, sont d’une importance capitale en
médecine transfusionnelle.
1.4. Les groupes sanguins
La médecine a été révolutionnée par la découverte du groupe sanguin ABO par
Karl Landsteiner en 1900[6]. Depuis cette découverte, la Société internationale de
médecine transfusionnelle (ISBT) reconnaît 33 groupes sanguins distincts, qui sont tous
codés par un (des) gène(s) différent(s)[6]. Les groupes sanguins sont définis par
l’expression et l’exposition des antigènes érythrocytaires à la surface des globules rouges
de chaque individu. Bien que les antigènes érythrocytaires soient les mêmes pour tous et
que leur expression varie au sein des différentes populations, l’expression de certains
d’entre eux est spécifique à l’ethnicité des individus[7]. Parmi tous les groupes sanguins,
deux sont davantage connus de la population en général : l’ABO et le Rh.
5
Tableau 1.1. : Classement des différents groupes sanguins, du nombre d’antigènes et du (des) gène(s)
associé(s). Information tirée de [6].
En ce qui concerne le groupe sanguin ABO, une personne est dite de groupe sanguin A
lorsque ses globules rouges expriment l’antigène A. Pareillement, les individus de groupe
sanguin B expriment l’antigène B et ceux de groupe AB expriment à la fois les antigènes A
et B. Pour leur part, les globules rouges des individus de groupe O n’expriment aucun des
deux antigènes A et B. Les antigènes A et B ne sont pas produits directement par
l’expression d’un gène, mais sont plutôt définis par des sucres (GalNAc pour l’antigène A
et Gal pour l’antigène B), attachés à un ou jusqu’à quatre différents types de chaînes
d’oligosaccharides, qui elles sont portées par des glycosphingolipides et des
glycoprotéines[7].
Pour chaque antigène érythrocytaire, il existe un anticorps correspondant. Les anticorps
du groupe sanguin ABO ont la particularité d’être des anticorps naturels réguliers; c’est-à-
dire que les cellules immunitaires de chaque individu produisent des anticorps dirigés
contre le ou les antigènes qui ne sont pas exprimés à la surface des globules rouges. Par
exemple, le plasma d’une personne de groupe O contiendra à la fois des anti-A et des
anti-B et à l’opposé, celui d’une personne de groupe AB ne contiendra aucun anticorps
dirigé contre les antigènes du groupe ABO. Bien que les anticorps du groupe ABO soient
présents systématiquement dans l’organisme, ce n’est pas le cas pour la plupart des
anticorps de groupes sanguins.
6
Le Rh est le deuxième groupe sanguin le plus connu, mais a été le quatrième à être
découvert. Contrairement à l’ABO qui n’a que deux antigènes (A et B), le Rh en possède
jusqu’à 54. Lorsqu’une personne est dite « positive » ou « négative » à la suite de
l’énonciation de son groupe sanguin ABO, il s’agit en fait de la présence ou non de
l’antigène D à la surface de ses globules rouges. Environ 85% de la population
caucasienne exprime l’antigène D et ces personnes sont dites D positif[1]. Contrairement à
celle d’autres antigènes érythrocytaires, l’expression de l’antigène D ne résulte pas de la
mutation d’un seul acide aminé au sein de la protéine (SNP) qui porte cet antigène, mais
bien de la présence ou de l’absence du gène RHD[7]. Donc, l’absence du gène RHD chez
l’autre 15% de la population est responsable du phénotype D négatif. Aussi, il est à noter
que l’antigène D est une mosaïque de différents épitopes et que l’absence de certains de
ces épitopes peut mener au phénotype D partiel[7]. Quant à lui, le phénotype D faible est
caractérisé par une expression moins élevée de tous les épitopes de l’antigène D[7].
Tout comme les antigènes A et B, l’antigène D est très immunogène[7]. Les antigènes de
groupes sanguins immunogènes ont la capacité de déclencher une réaction immunitaire
lorsqu’ils sont reconnus par des anticorps spécifiques (ex : l’antigène D qui est reconnu
par des anticorps anti-D). Cette mise en branle du système immunitaire amène des
réactions post-transfusionnelles. Ces dernières sont, la plupart du temps, causées par la
reconnaissance d’un ou de plusieurs antigènes présents sur les globules rouges du
donneur par les anticorps présents chez le receveur. La gravité des réactions post-
transfusionnelles immunes, c’est-à-dire celles qui sont causées par une incompatibilité
antigène-anticorps, est variable et elle dépend de plusieurs facteurs. La réaction
hémolytique immédiate, par exemple, se caractérise par la destruction rapide des globules
rouges transfusés et elle est la forme la plus grave de réaction transfusionnelle[8]. Elle peut
se produire lorsqu’il y a une incompatibilité antigène-anticorps pour certains groupes
sanguins (ABO, Kidd, Kell, Duffy et Lewis), ce qui entraîne, entre autres, l’activation du
complément[8]. Dans le cas d’une incompatibilité ABO par exemple, qui correspond à 90%
des cas, cela peut entraîner la mort du receveur[8, 9].
Heureusement, tous les groupes sanguins n’ont pas la même importance clinique en
médecine transfusionnelle. Les plus immunogènes sont l’ABO, le Rh, le Kell, le Kidd et le
Duffy[8]. La raison qui explique leur importance clinique est que certains de leurs antigènes
7
respectifs peuvent mener à l’immunisation du receveur, c’est-à-dire à la production
d’anticorps chez ce dernier. Exceptionnellement, l’immunisation se fait naturellement chez
un individu qui développe des anticorps contre ses propres antigènes[10]. Ces anticorps
sont appelés autoanticorps. Ce phénomène d’immunisation est plus souvent observé chez
les personnes âgées, mais la cause de celui-ci est toujours inconnue à ce jour. Dans la
plupart des cas, l’immunisation se produit lors de transfusions sanguines ou de
grossesses[11, 12].
L’immunisation d’un individu peut compliquer de manière significative le processus de
transfusion et entraîner certaines complications, notamment dans le cas où la personne
immunisée est une femme enceinte[13]. Tout comme ceux du système sanguin Rh, les
anticorps dirigés contre les antigènes du système sanguin Kell peuvent causer la maladie
hémolytique du nouveau-né (Figure 1.2.)[7]. Cependant, outre ceux-ci, d’autres antigènes
de groupes sanguins peuvent aussi causer cette maladie.
8
Figure 1.2. : Processus qui mène à la maladie hémolytique du nouveau-né causée par des anticorps anti-D.
Adaptée de [14].
La maladie hémolytique du nouveau-né est caractérisée par la reconnaissance des
antigènes présents à la surface des globules rouges du fœtus par les anticorps présents
dans le sang de la mère. Pour causer cette maladie, les anticorps produits par la mère
doivent être de type IgG, puisque seul cet isotype a la capacité de traverser la barrière
placentaire[15]. En fait, le transport sélectif des IgG de la mère vers le fœtus se fait grâce à
une protéine de transport des IgG du placenta, FcRn, qui reconnaît la partie Fc des IgG[15].
Lorsque la mère est D négatif et que le père est D positif, le fœtus a 50% ou 100% de
chances d’être D positif selon le génotype du père (Dd ou DD). Dans ces cas, la mère
peut produire des anticorps dirigés contre l’antigène D. Ce phénomène survient, dans la
plupart des cas, lorsqu’il y a contact entre le sang de la mère et celui du bébé. Lorsque
cela se produit, c’est le plus souvent lors de l’accouchement. Ainsi, les grossesses
subséquentes d’un fœtus D positif sont plus à risques d’être problématiques pour une
femme D négatif, puisque les anti-D sont encore la cause principale de la manifestation de
la maladie hémolytique du nouveau-né[16].
En résumé, lorsqu’il y a eu un premier contact entre le sang de la mère D négatif et celui
du fœtus D positif, les cellules sécrétrices d’anticorps anti-D de la mère peuvent être
activées pour en produire lors des grossesses subséquentes. Donc, ces anticorps en
circulation chez la mère peuvent traverser la barrière placentaire et détruire les globules
rouges D positif du fœtus. Puisque les femmes D négatif qui possèdent des anti-D ont un
9
suivi de grossesse à fréquence élevée, l’apparition de cette maladie est plutôt rare de nos
jours[16]. Cependant, dans certains cas graves, les médecins doivent procéder à une
plasmaphérèse chez la mère ou, dans les cas extrêmes, transfuser le fœtus de manière
intra-utérine.
1.5. Les antigènes érythrocytaires
L’ISBT répertorie tous les antigènes érythrocytaires et ce nombre est de 339 à ce jour[6].
D’une part, environ 297 antigènes sont déjà associés à un groupe sanguin. D’autre part,
les autres sont classés dans des séries et des collections en attendant la découverte de
leur base moléculaire. D’un côté, la série 901 regroupe les antigènes de haute fréquence
exprimés par plus de 90% de la population et dont le phénotype négatif a été déterminé
comme étant hérité génétiquement[6]. À l’inverse, la série 700 regroupe les antigènes de
faible fréquence exprimés par moins de 1% de la population et dont la transmission
héréditaire a été démontrée et ce, pour au moins deux générations[6]. Finalement, les
différentes collections regroupent chacune au moins deux antigènes, qui sont liés de
manière sérologique, biochimique ou génétique et qui ne peuvent pas être classés dans
l’une ou l’autre des séries[6].
Figure 1.3. : Illustration de la disposition de certaines molécules porteuses d'antigènes érythrocytaires[17]
.
Les antigènes érythrocytaires sont portés par différentes molécules présentes au sein de
la membrane plasmique des globules rouges (Figure 1.3.). Ces molécules peuvent être
des chaînes glucidiques, attachées ou non à un lipide ou à une protéine, des protéines
10
transmembranaires ou des protéines liées à un ancrage GPI[18]. En fait, les protéines
codées par les gènes se combinent à des polypeptides, à des lipides ou à des
oligosaccharides pour former les molécules qui seront porteuses de ces différents
antigènes érythrocytaires[8]. Bien que la majorité des antigènes érythrocytaires soient
portés par des molécules membranaires, certains ont, en plus, des composantes
hydrosolubles. Par exemple, les antigènes du groupe sanguin Lewis ne sont pas
intrinsèques à la membrane des globules rouges, mais ils sont plutôt localisés sur des
glycosphingolipides, qui eux sont adsorbés par les globules rouges à partir du plasma[7].
Ces dernières sont en circulation dans l’organisme et elles possèdent des déterminants
antigéniques semblables à ceux retrouvés dans la membrane plasmique.
Les protéines membranaires peuvent avoir plusieurs fonctions. Notamment, celles qui sont
liées à un groupe sanguin et qui sont les plus abondantes (>200 000 copies par cellule)
contribuent aux fonctions essentielles de la cellule, soit en étant des transporteurs
membranaires (Bande 3, RhAG, aquaporine-1, SLC14A1, Kx), soit en fournissant une
structure qui permet l’ancrage au cytosquelette, ou encore en facilitant l’assemblage des
complexes protéiques dans la membrane (RhD, RhCE, glycophorines A et B, CD151)[17].
Ces complexes membranaires ont la fonction de lier la membrane plasmique au
cytosquelette, aidant ainsi à garder la structure des globules rouges intacte[17]. Les
protéines moins abondantes à la surface des globules rouges, mais dont le lien avec un
groupe sanguin a déjà été démontré, ont des fonctions qui ne sont pas très bien connues
à ce jour. Cependant, bien que les protéines qui servent de base moléculaire aux groupes
sanguins remplissent diverses fonctions, seule l’absence de la protéine Kx, du groupe
sanguin du même nom, a été identifiée comme étant la cause d’une pathologie[17].
1.6. La sérologie érythrocytaire
En sérologie érythrocytaire, les antigènes présents à la surface des globules rouges
doivent être reconnus par un anticorps spécifique[6]. Cette liaison antigène-anticorps
permet l’agglutination des globules rouges et ainsi, il est possible de détecter la plupart
des antigènes érythrocytaires. Les anticorps spécifiques aux antigènes érythrocytaires
sont de type immunoglobuline G (IgG), IgM et dans de rares cas, IgA[19]. Particulièrement,
la structure des IgM leur permet de former des pentamères et d’offrir dix sites de liaisons
11
antigéniques. Ainsi, les IgM ont la capacité de faire agglutiner les globules rouges dans les
conditions sérologiques standards, c’est-à-dire dans une solution saline 0,85%[8]. À
l’opposé, les IgG et les IgA sont le plus souvent retrouvées sous forme de monomères
dans le plasma, mais les IgA peuvent aussi s’associer sous forme de dimères[8]. Ainsi,
l’agglutination des globules rouges dans les conditions sérologiques standards par les
isotypes IgG et IgA nécessite un nombre important de sites antigéniques. Dans les autres
cas, l’ajout d’un anti-IgG commercial est nécessaire pour visualiser l’agglutination. Ce
réactif permet le pontage des IgG fixées spécifiquement à la surface des globules rouges
pour créer l’agglutination. La sérologie érythrocytaire permet de détecter, de manière
rapide et spécifique, quel(s) antigène(s) est ou sont présent(s) sur les globules rouges et
quel(s) anticorps est ou sont présent(s) dans le sang des individus.
1.6.1. Les immunoglobulines
Un des outils grandement utilisé en sérologie demeure les anticorps ou immunoglobulines
(Ig). Dans le corps humain, elles sont sécrétées par les plasmocytes et elles sont à la
base de l’immunité humorale. Chaque Ig possède au moins un site de liaison spécifique à
un antigène. Le nombre de sites de liaison antigénique dépend, entre autres, du type d’Ig.
Chez l’humain, il existe cinq classes d’Ig : les IgM, IgG, IgD, IgE et IgA. La structure de
chaque classe d’Ig est très semblable et elle se définit par la structure de sa chaîne
lourde[15]. Il s’agit d’une molécule en forme de « Y », formée de deux chaînes lourdes (H
pour heavy) et de deux chaînes légères (L pour light). Chacune de ces chaînes est formée
de peptides dont les séquences en acides aminés sont plus ou moins variables. Les
régions déterminant la complémentarité (CDR) des domaines variables des chaînes
lourdes et légères contribuent au site de liaison antigénique, c’est-à-dire que c’est
l’association de la chaîne légère et de la chaîne lourde, et non une seule des deux, qui
détermine la spécificité antigénique[15].
12
Figure 1.4. : Structure d’une immunoglobuline[20]
. Structure type en «Y», où les deux chaînes lourdes sont liées
par deux ponts disulfures et où chaque chaîne lourde lie une chaîne légère avec un seul pont disulfure.
Chaque classe d’Ig est conçue pour assurer une fonction principale et leur quantité varie
considérablement en fonction du tissu ou du liquide biologique étudié. Chez l’humain, les
IgG sont distribuées également dans le sang et les tissus et ce sont les plus abondantes
dans le sérum[21]. Ainsi, elles sont souvent impliquées dans les interactions avec les
antigènes érythrocytaires. Les anticorps dirigés contre des antigènes de haute fréquence
peuvent parfois causer des problèmes aux gens qui les développent puisqu’il devient
parfois très difficile de trouver du sang compatible à leur transfuser[22].
1.6.2. Les immunoglobulines de type G
Les IgG représentent 75% des anticorps du sérum humain. Elles sont formées de quatre
chaînes de peptides : deux chaînes lourdes dites gamma (γ) et deux chaînes légères dites
kappa (κ) ou lamba (λ). Les chaînes légères sont κ ou λ, jamais les deux à la fois. La
fonction de chaque type, κ ou λ, est toujours inconnue à ce jour et le ratio κ sur λ est de
deux pour un chez l’humain[21]. La masse moléculaire d’une IgG est d’environ 150 kDa
(50 kDa par chaîne lourde et 25 kDa par chaîne légère). Du point de vue structural, les
deux chaînes lourdes sont liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne
lourde lie une chaîne légère par un seul pont disulfure.
13
Dans le sérum, les IgG sont retrouvées majoritairement sous forme de monomère et
chacune possède deux sites de liaison à l’antigène. Ces sites se trouvent aux extrémités
supérieures du « Y », là où se trouvent les régions hypervariables des chaînes lourdes et
légères. La région constante est composée d’une partie des deux chaînes lourdes et ce
fragment interagit avec les molécules effectrices et les autres cellules[21].
Il existe quatre sous-classes d’IgG et elles sont nommées ainsi en fonction de leur
concentration relative dans le sérum humain : IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4[23]. Les sous-
classes diffèrent aussi selon leur fonction (Figure 1.5.), mais aussi selon d’autres
propriétés biologiques, comme leur temps de demi-vie. La figure 1.5. démontre aussi que
plusieurs sous-classes d’IgG peuvent remplir la même fonction. En général, les IgG
agissent, d’une part, directement sur la réponse immunitaire en neutralisant les virus et les
toxines et d’autre part, indirectement en activant le complément ou d’autres cellules
impliquées dans l’immunité.
Figure 1.5. : Fonctions et propriétés physiques des immunoglobulines humaines[15]
.
14
1.6.3. La liaison antigène-anticorps
La liaison entre l’anticorps et l’antigène peut être comparée à une clé qui permet d’ouvrir
spécifiquement une serrure. Chaque anticorps est conçu pour lier spécifiquement un seul
épitope. En fait, certains anticorps reconnaissent un épitope unique, mais qui est formé
par l’association de plusieurs molécules sous forme de complexe. Étant donné que
chaque anticorps est conçu pour reconnaître et lier de manière spécifique un seul épitope
antigénique, plusieurs anticorps différents peuvent reconnaître le même antigène en liant
des épitopes différents. La spécificité de liaison d’un anticorps à un seul ou à plusieurs
épitope(s) sur un antigène permet de différencier les anticorps monoclonaux des anticorps
polyclonaux. Les anticorps monoclonaux vont reconnaître tous le même épitope d’un
antigène, alors que les anticorps polyclonaux vont reconnaître le même antigène, mais en
ne se liant pas tous au même épitope, donc au même endroit sur l’antigène. Le sérum
humain est un mélange d’anticorps polyclonaux. Ainsi, la purification biochimique d’un seul
type d’anticorps monoclonal est très difficile, en partie parce que la concentration de
n’importe quel anticorps dans l’organisme est très faible[24]. La préparation d’anticorps
monoclonaux nécessite, dans un premier temps, l’isolement de plasmocytes qui sécrètent
spécifiquement cet anticorps[25]. Cette cellule doit ensuite être mise en culture, puis
fusionnée avec une cellule immortelle, dérivée d’un myélome par exemple. Ensuite, les
anticorps sécrétés sont récoltés du milieu de culture, puis purifiés. Plusieurs réactifs
utilisés en sérologie sont des anticorps monoclonaux fabriqués en laboratoire.
Les réactions antigène-anticorps peuvent être caractérisées selon deux facteurs : l’affinité
et l’avidité. D’une part, l’affinité représente la force de liaison entre un site antigénique et
un seul site de liaison sur l’anticorps (Figure 1.6.). Cette force de liaison est dépendante
de la somme des forces attractives et répulsives qui sévissent entre l’anticorps et
l’antigène[8].
15
Figure 1.6. : Concept d’affinité dans la liaison antigène-anticorps.
Puisque la liaison antigène-anticorps est non-covalente, les forces impliquées sont celles
de Van der Waals, les liaisons électrostatiques et hydrophobes, ainsi que les liaisons
hydrogènes.
D’autre part, l’avidité représente la force totale de la liaison entre un anticorps et un
antigène. L’avidité d’un anticorps pour un antigène dépend de l’affinité de chacun des sites
de fixation de l’anticorps aux différents déterminants antigéniques[26]. Par exemple, une
affinité moindre entre une IgM et un site de liaison antigénique pourrait être compensée
par le fait que les IgM, lorsqu’elles sont associées en pentamères, offrent dix sites
identiques de liaison à l’antigène. Ce phénomène permet d’augmenter considérablement
l’avidité. Les concepts d’affinité et d’avidité dans la réaction antigène-anticorps sont à la
base des tests sérologiques effectués dans les banques de sang.
Héma-Québec teste et répertorie le phénotype sanguin de chacun des donneurs de sang.
Ce registre s’avère essentiel dans la recherche de sang compatible à chaque receveur.
Dans la plupart des cas, les tests effectués en sérologie érythrocytaire permettent le
typage sanguin d’un individu. Cependant, comme chaque technique d’analyse, elle a ses
limites. Par exemple, lorsqu’un donneur ne peut pas être phénotypé avec les tests
sérologiques standards ou que des résultats divergents sont observés à la suite de ces
16
tests, d’autres méthodes doivent être envisagées. Le génotypage sanguin en est un
exemple.
1.7. Le génotypage sanguin
Dans le cas des patients récemment transfusés ou greffés de moelle osseuse, le
phénotype sanguin est impossible à établir de manière traditionnelle. En fait, les individus
récemment transfusés ont en circulation, en plus de leurs propres globules rouges, ceux
qui proviennent du (des) donneur(s). À cause de la présence simultanée de ces deux
populations cellulaires dans l’organisme, il est impossible de procéder aux tests
sérologiques standards. En fait, il n’est pas possible d’isoler les globules rouges
intrinsèques du receveur. Dans le même sens, avant d’être greffés de moelle osseuse, les
patients sont tous irradiés. Cette irradiation altère de façon majeure les fonctions des
cellules souches, lesquelles sont les cellules progénitrices des cellules sanguines[27]. Une
fois irradié, le receveur est greffé des cellules souches saines du donneur dans le but de
reconstruire son système immunitaire et sanguin. Lorsque la greffe est un succès, les
cellules sanguines du receveur deviennent de manière intrinsèque celles du donneur, et
ce, pour le restant de sa vie. Ainsi, l’ADN retrouvé dans les cellules sanguines du receveur
sera différent de celui retrouvé dans ses autres types de cellules. Cependant, pendant la
prise de greffe, le receveur exprime une mosaïque hétérogène d’antigènes sanguins,
c’est-à-dire qu’il exprime à la fois les siens et ceux du donneur. Ainsi, à cause de la
présence des deux populations de cellules sanguines, les tests d’agglutination
sérologiques standards sont très difficiles à effectuer.
Ces deux exemples démontrent bien l’utilité du génotypage sanguin. Il existe cependant
un bémol au génotypage sanguin dans les cas de prise de greffe. En fait, pendant celle-ci,
il est difficile de génotyper les patients puisque les cellules du donneur sont encore
présentes dans leur organisme. À mesure que la greffe s’implante, de moins en moins de
cellules sanguines vont exprimer le génotype intrinsèque du receveur, mais elles vont
plutôt exprimer celui du donneur. Donc, lorsque la prise de greffe est terminée, le
génotypage sanguin permet de confirmer le fait que le receveur exprime bel et bien les
antigènes érythrocytaires du donneur.
17
Le génotypage sanguin est apparu au début des années 1990[6]. Cette technique
d’analyse permet de prédire le phénotype par l’analyse du génotype. En fait, la majorité
des antigènes érythrocytaires sont définis par des polymorphismes observables dans
l’ADN génomique, qui affectent la plupart du temps un seul nucléotide (SNP)[28]. Ces SNP
codent spécifiquement certains acides aminés dans la portion extracellulaire des protéines
membranaires érythrocytaires.
Les protéines membranaires, comme toutes les autres protéines, sont synthétisées à la
suite de la traduction des codons des ARNm en acides aminés. Les ARNm sont transcrits
par l’ADN polymérase II et correspondent à une version simple brin de l’ADN qui sert de
matrice. Chaque codon est composé de trois bases azotées et l’enchaînement de ces trois
bases code pour un seul acide aminé. En fait, l’ARNm mature contient seulement les
séquences codantes de l’ADN, c’est-à-dire les exons. Les introns sont transcrits dans le
pré-ARNm, mais sont ensuite retirés par un processus nommé épissage. Chez les
eucaryotes, les ARNm contiennent une coiffe en 5’ et une queue de poly-A en 3’.
Contrairement à la transcription de l’ADN en ARNm qui a lieu dans le noyau, le processus
de traduction des ARNm en protéines a lieu dans le réticulum endoplasmique. En fait, les
ribosomes enchaînent les acides aminés l’un à la suite de l’autre jusqu’à ce qu’ils aient
formé une protéine complète.
Selon la structure des atomes qui composent les acides aminés, ces derniers forment des
chaînes qui se replient pour former d’abord des structures secondaires en hélices α et en
feuillets β, puis des structures tridimensionnelles. Dans la plupart des cas, la protéine sera
fonctionnelle seulement dans sa structure tridimensionnelle. Cependant, il arrive que
certaines protéines se regroupent entre elles pour former des structures quaternaires et
ainsi, elles peuvent former une nouvelle protéine avec une tout autre fonction. En général,
la structure des protéines renseigne beaucoup à propos de leur(s) fonction(s). Par
exemple, celles qui traversent de part et d’autre la membrane plasmique des cellules
peuvent avoir une fonction de canal ou de pompe, ou encore avoir un rôle purement
structural.
Une quantité importante de maladies sont causées par une ou des mutations dans une
protéine en particulier. C’est notamment le cas de la fibrose kystique[29]. Dans l’ADN, une
18
quantité importante de mutations s’accumulent au fil du temps. La substitution des bases,
surtout des transitions de cytosine à thymine, est la mutation somatique la plus fréquente,
mais des insertions/délétions, des duplications, des réarrangements chromosomiques et
des translocations peuvent aussi avoir lieu[30].
De la même manière, les mutations dans les protéines membranaires des globules rouges
définissent les antigènes érythrocytaires qui eux, sont à la base des groupes sanguins. En
fait, plus de 90% des antigènes de groupes sanguins sont codés par un seul
polymorphisme (SNP), qui n’altère pas la fonction de la protéine porteuse de ces
antigènes[31]. Cependant, bien que la plupart des SNP n’affectent pas la fonction première
des protéines, certains peuvent avoir un effet majeur sur la structure de celles-ci, selon
l’acide aminé touché et surtout de sa position au sein des protéines. Donc, comme
structure rime avec fonction, la mutation d’un seul acide aminé dans une protéine peut
avoir comme effet de l’inactiver complètement.
À défaut d’éliminer complètement la fonction d’une protéine, certaines mutations vont
seulement l’altérer. Au fil des ans, plusieurs SNP ont été identifiés et associés à des
maladies. Par exemple, l’anémie falciforme est une maladie qui atteint deux individus sur
mille de souche africaine et elle est causée par une mutation faux-sens dans le codon 6
de la protéine normale par un résidu valine dans la protéine mutée[24]. Ce changement
d’acide aminé altère profondément la structure de l’hémoglobine, ce qui entraîne une
rigidité plus importante des globules rouges et ultimement, des lésions tissulaires[24].
Cependant, l’effet réel de ces SNP sur la transcription génique est difficile à connaître
puisqu’un seul SNP peut modifier la transcription d’autres gènes[32]. Il a été observé
maintes fois dans la littérature que plusieurs des fonctions vitales au sein des cellules
peuvent être gérées par plus d’une protéine. Ceci serait le résultat de l’évolution, qui avait
pour but de garder en vie les cellules, même dans le cas de l’apparition de certaines
mutations[33]. En fait, ensemble, les mutations épigénétiques et génétiques amènent un
nombre élevé de variations au sein des cellules, des variations sur lesquelles une
sélection peut avoir lieu. C’est la raison pour laquelle la majorité des mutations délétères,
celles qui affectent la survie de la cellule, vont être éliminées par le principe de la sélection
naturelle[30]. Donc, chez les eucaryotes, chaque protéine est conçue pour remplir un ou
19
plusieurs rôle(s) et à ce jour, ce(s) rôle(s) est (sont) inconnu(s) pour une grande quantité
d’entre elles. Heureusement, plusieurs méthodes de protéomique et de biologie
moléculaire sont utilisées afin d’élucider la fonction des protéines.
Les méthodes de biologie moléculaire utilisées pour génotyper les groupes sanguins
peuvent être classées en deux catégories : celles à faible-moyen débit (PCR, PCR-RFLP,
PCR-SSP ou PCR-ASP, PCR en temps réel, séquençage de l’ADN et le pyroséquençage)
et celles à haut-débit, qui regroupent tous les systèmes basés sur les puces[28]. En plus de
permettre la résolution des cas complexes en sérologie érythrocytaire traditionnelle,
l’apparition des plates-formes automatisées de génotypage sanguin a permis d’augmenter
considérablement l’efficacité à créer les registres de donneurs de sang.
1.8. L’antigène PEL
L’antigène érythrocytaire PEL a été identifié pour la première fois en 1996 par l’équipe du
chercheur Geoff L. Daniels en Angleterre[22]. Depuis ce jour, il a été classé dans la série
901 par l’ISBT, celle qui regroupe tous les antigènes de haute fréquence[6]. Il a été nommé
PEL en l’honneur de la femme dénommée Pelletier chez qui les anticorps anti-PEL ont été
découverts. Cette femme de 29 ans passait des tests sérologiques lors de sa deuxième
grossesse lorsqu’ils ont identifiés les anticorps. À la suite de différents tests sérologiques,
ils sont parvenus à la conclusion que ces anticorps étaient spécifiques à un nouvel
antigène, inconnu jusque-là. Les mêmes anticorps anti-PEL ont été identifiés chez une
autre femme, elle aussi d’origine québécoise. Aussi, ils ont identifié, chez deux autres
québécoises, des globules rouges qui exprimaient l’antigène PEL, mais en très faible
quantité. Ces deux femmes avaient développé des anticorps, mais contrairement à ceux
qui avaient été identifiés précédemment, ceux-ci ne réagissaient pas avec les cellules
PEL-. Pour cette raison, ils ont été nommés anti-MTP[22].
Même si l’antigène PEL a une importance clinique, il n’a jamais été démontré que ses
anticorps spécifiques peuvent causer la maladie hémolytique du nouveau-né[22]. Le sérum
des deux femmes identifiées comme étant PEL- a réagi avec des antiglobulines
polyspécifiques et avec des anti-IgG. De plus, l’analyse sérologique des enfants de ces
deux femmes a démontré que le phénotype PEL- était hérité de manière récessive.
20
Puisque la base moléculaire de l’antigène PEL n’a pas été découverte, très peu de
caractéristiques sont connues à son sujet. Outre le fait qu’il s’agit d’un antigène de haute
fréquence présent chez plus de 99% de la population, le phénotype PEL- semble être
spécifique à la population québécoise. Aussi, il a été démontré qu’il résiste au traitement
des globules rouges par ces enzymes protéolytiques : ficine, papaïne, trypsine, alpha-
chymotrypsine, pronase, sialidase ainsi que par le DTT[7]. De plus, des tests
d’agglutination en cartes-gel effectués en sérologie ont permis de déterminer que les
anticorps anti-PEL étaient des IgG.
1.9. Contexte de recherche et hypothèse
En 1996, Goeff Daniels et son équipe ont fait la découverte d’anticorps anti-PEL dans le
sérum de deux femmes d’origine québécoise[22]. Bien qu’ils soient parvenus à déterminer
que ces anticorps reconnaissent un antigène qui diffère de tous ceux qui ont été identifiés
jusqu’à maintenant, la base moléculaire de l’antigène PEL demeure inconnue à ce jour. La
découverte de la base moléculaire des antigènes érythrocytaires permettrait de les
associer à un groupe sanguin déjà existant ou d’en créer un nouveau. En fait, pour qu’un
nouveau groupe sanguin soit nommé, la base moléculaire de l’antigène érythrocytaire doit
être codée par un gène qui n’est pas déjà associé à un autre groupe sanguin[6]. Lorsque la
base moléculaire est connue, il devient possible de connaître le génotype de ces individus
concernant cet antigène, en complément du phénotype qui a été préalablement identifié
en sérologie. Récemment, au mois de février 2012, le groupe de Lionel Arnaud publiait la
découverte de la base moléculaire des antigènes Lan et Jra, qui sont deux antigènes de
haute fréquence, tout comme l’antigène PEL[34, 35]. Par exemple, dans le cas de l’antigène
Lan, la création d’un anticorps monoclonal spécifique a permis d’identifier un complexe
immun par immunobuvardage. La bande correspondant au complexe immun a été
envoyée en spectrométrie de masse et c’est ainsi qu’ils ont lié l’antigène Lan au
transporteur d’ATP ABCB6. En sachant que la protéine ABCB6 est la base moléculaire de
l’antigène Lan, l’analyse du gène ABCB6 de certains individus de phénotype Lan+ versus
ceux de phénotype Lan-, a permis d’identifier divers SNP responsables de ce
phénotype[34].
21
Les résultats obtenus par l’équipe de L. Arnaud démontrent bien que la découverte de la
base moléculaire d’un antigène de haute fréquence peut se faire selon deux types
d’analyses, soient par des analyses génomiques, soient par des analyses protéomiques.
Puisqu’il n’y a qu’un seul article publié à ce jour à propos de l’antigène PEL et qu’il a été
démontré que les anticorps anti-PEL sont des IgG, l’hypothèse émise est que la base
moléculaire de cet antigène est de nature protéique. Des analyses génomiques et
protéomiques ont été effectuées sur des échantillons PEL+ et PEL- pour tenter de
découvrir la base moléculaire de l’antigène PEL.
1.10. Objectifs
Ce projet de maîtrise avait pour but d’identifier la base moléculaire de l’antigène PEL. Pour
tenter d’y parvenir, plusieurs analyses génomiques et protéomiques ont été envisagées en
fonction des caractéristiques déjà connues à propos de cet antigène. Tout d’abord, les
analyses génomiques consistaient en l’analyse des séquences codantes des ARNm de
certaines protéines déjà connues comme étant la base moléculaire de certains groupes
sanguins. En fait, bien qu’il soit possible que l’antigène PEL soit porté par une protéine qui
n’est pas déjà associée à un groupe sanguin, il se peut aussi qu’il soit la manifestation
d’une ou de certaine(s) modification(s) transcriptionnelle(s) au sein d’une protéine déjà
associée à un groupe sanguin.
Les protéines à analyser ont été sélectionnées selon le fait que leur(s) antigène(s)
réagissait(ent) de la même manière que l’antigène PEL aux enzymes protéolytiques[23].
Aussi, en sachant que les anticorps anti-PEL sont des IgG et que cet isotype reconnaît
souvent des antigènes protéiques, l’hypothèse du projet était que la base moléculaire de
l’antigène PEL est de nature protéique. Ainsi, il a été envisagé d’isoler l’antigène par des
méthodes de capture et de reconnaissance des protéines.
L’objectif principal de la recherche était d’identifier la base moléculaire de l’antigène
érythrocytaire de haute fréquence PEL.
22
Pour arriver à atteindre l’objectif principal de la recherche et dans le but de vérifier
l’hypothèse, voici l’objectif de la recherche en ce qui concerne les analyses génomiques :
Séquencer la partie codante de différents ARNm de plusieurs protéines, associées
ou non à un groupe sanguin, dans des échantillons PEL+ et PEL- afin de les
comparer
Parallèlement, voici les objectifs de la recherche en ce qui concerne les analyses
protéomiques :
Faire des électrophorèses SDS-PAGE avec des échantillons PEL+ et PEL- pour en
comparer le motif de migration
Envoyer des échantillons PEL+ et PEL- en spectrométrie de masse pour en
comparer le protéome érythrocytaire respectif
Isoler les anticorps anti-PEL du plasma par diverses méthodes de purification
Identifier un complexe immun par immunobuvardage de type Western en utilisant
diverses préparations biologiques contenant des anticorps anti-PEL comme
anticorps primaires
23
2. Matériel et méthodes
2.1. Analyses génomiques
2.1.1. Échantillons
Tous les échantillons PEL+ (ceux dont les globules rouges expriment l’antigène PEL) et
tous les échantillons PEL- (ceux dont les globules rouges n’expriment pas l’antigène PEL)
ont été obtenus après la signature d’un formulaire de consentement éclairé et leur
utilisation a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche d’Héma-Québec. Les
deux échantillons sanguins PEL- et les deux échantillons contrôles PEL+ provenaient tous
deux d’individus caucasiens et d’origine québécoise. Préalablement, le Laboratoire de
référence et cellules souches (LRCS) d’Héma-Québec a confirmé, en sérologie, les
phénotypes PEL+ et PEL- des échantillons. De plus, de précédentes analyses
sérologiques ont démontré la présence d’anticorps anti-PEL dans le plasma des deux
individus PEL-.
2.1.2. Extraction d’ARN
L’ARN des échantillons PEL+ et PEL- a été extrait à partir du sang total préalablement
congelé à -20ºC dans du RNA Later (Life Technologies Inc., Burlington, Ontario). Le
protocole d’extraction d’ARN provenait de la trousse commerciale RiboPure™-Blood Kit
(Life Technologies Inc.) et il a été suivi à la lettre selon les instructions du fabricant. L’ARN
purifié était dosé au NanoDrop® (Thermo Scientific, Delaware, États-Unis), un
spectrophotomètre qui mesure l’absorbance à 260 nm. Une fois dosé, l’ARN était aliquoté,
puis congelé à -80ºC pour toute la durée du projet.
2.1.3. Design d’amorces pour les RT-PCR
Pour les ARNm dont le laboratoire ne possédait pas encore d’amorces spécifiques à
utiliser en RT-PCR, des amorces ont dû être sélectionnées. La sélection des amorces
s’est faite avec l’application Primer3 intégrée dans le logiciel Geneious (Biomatters Ltd,
Nouvelle-Zélande) à partir de la séquence complète des ARNm. Une fois sélectionnées,
les amorces étaient recherchées dans une base de données pour s’assurer de leur
24
spécificité. Un total de 25 nmoles de chaque amorce a été commandé chez Integrated
DNA Technologies Inc. (San José, Californie).
2.1.4. Amplification par RT-PCR
La majorité des amplifications par RT-PCR ont été faites avec la trousse commerciale
OneStep RT-PCR kit (Qiagen, Toronto, Canada). Les réactions PCR étaient effectuées
dans un volume final de 50 µl qui contenait de 75 ng à 170 ng d’ARN, 10 µl de tampon 5X,
0,4 mM de dNTP (Qiagen), 40 U d’inhibiteur de RNAse (Life Technologies Inc.), 0,6 µM de
chacune des amorces et 2 µl du mélange d’enzymes (Qiagen) provenant de la trousse.
L’amplification des ARNm avait lieu dans les thermocycleurs GeneAmp® PCR system
9700 (Life Technologies Inc.). Les protéines ciblées pour l’amplification de leur ARNm sont
présentées dans le tableau 2.2..
Tableau 2.2. : Description des protéines dont l’ARNm a été ciblé pour les analyses génomiques[6, 36]
.
25
Les programmes des thermocycleurs variaient selon les ARNm amplifiés. Les ARNm des
molécules : aquaporine-1, CD55, CD59, RhD, ERMAP, FLOT-1, GBGT1, Kx et Oka ont été
amplifiés dans les conditions suivantes :
}
Pour leur part, les ARNm des molécules : bande 3, CD47, GLUT-1, SLC14A1 et RhAG
étaient amplifié dans les conditions suivantes :
}
L’ARNm de RhCE était amplifié dans les conditions suivantes :
}
}
L’ARNm de la glycophorine A était amplifié dans les conditions suivantes :
}
L’ARNm de la glycophorine B était amplifié dans les conditions suivantes :
}
}
26
Finalement, l’amplification de l’ARNm de la protéine CD238 était faite dans les conditions
suivantes :
}
Puis, pour le séquençage, une PCR semi-nichée a été nécessaire à la suite de la RT-PCR
pour la protéine CD238. La PCR semi-nichée, tout comme la PCR nichée, consiste à faire
deux amplifications PCR successives, en utilisant, lors de la deuxième amplification PCR,
une ou deux amorce(s) différente(s) de celle(s) utilisée(s) lors de la première amplification.
Donc, la PCR semi-nichée, dans ce cas, s’est faite dans les conditions suivantes :
}
Les détails concernant ces amplifications, notamment la séquence des amorces utilisées,
sont présentés en annexe (Tableau A.1.).
2.1.5. Amplification des exons 1 à 5 du gène codant pour la glycoprotéine CD44
Puisque l’amplification en une seule étape de la séquence codante de l’ARNm de la
protéine CD44 s’est avérée infructueuse, les exons 2 à 5 ont été amplifiés par PCR
classique selon le protocole décrit dans l’article de Poole et collaborateurs à partir de
l’ADN génomique[37]. Étant donné l’échec de l’amplification de l’exon 1 basée sur le
protocole décrit dans l’article, d’autres amorces ont été sélectionnées selon la même
méthode que celle décrite précédemment. Seuls les exons 1 à 5 ont été ciblés pour être
amplifiés et séquencés, puisque ceux-ci codent pour les parties extramembranaires de la
glycoprotéine CD44.
27
Tableau 2.3. : Conditions expérimentales pour l'amplification des exons 1 à 5 de l'ARNm de la glycoprotéine
CD44.
Protéine Groupe sanguin
Gène Exon Tm des
amorces (°C)
Amorce sens 5'→ 3'
Amorce anti-sens 5'→ 3'
Taille du fragment
(pb)
CD44 Indian IN
1 - GGACAGATGGGA
AATGAGTGG GTTTAGCGCAAAT
CCCAGCCC 1445
2 65 TGTTAACCAGGCT
GGTCTTGAG AGTTCTAAGCCCA
GCTGCCTG 430
3 60 TAACTCGGTTGTT
GAAACCTCCG AGCTGAGCTCCA
AAGACCAGG 341
4 60 GCTTCCACAGTG
CCTGATATAG TACCACAGAGAA
CACACCTGAG 427
5 60 TCTCCCACCACTGGATAGATAGG
GTGCAATGCTCAGGAAGGTCAG
439
Sauf pour la Tm (qui correspond à X°C dans l’équation ci-dessous) qui change selon l’exon
amplifié, l’amplification PCR de chaque exon était faite selon la méthode suivante :
}
Pour des raisons techniques, l’exon 1 n’a pas été amplifié.
2.1.6. Amplification de la séquence codante de SMIM1 par PCR classique
Étant donné que la séquence codante de l’ARNm de la protéine SMIM1 du groupe
sanguin Vel était de petite taille (237 pb), il était possible de l’amplifier par PCR classique
en utilisant l’ADN génomique. Les réactions PCR étaient effectuées dans un volume final
de 50 µl qui contenait de 75 ng à 170 ng d’ADN, 5 µl de tampon PCR 10X (Roche,
Mississauga, Ontario), 0,2 mM de dNTP (Life Technologies Inc.), 0,6 µM de chacune des
amorces et 2,5 U d’enzyme AmpliTaq® Gold (Celera, Alameda, Califonie). Le programme
d’amplification PCR était le suivant :
}
28
2.1.7. PCR nichée de l’amplicon de l’aquaporine-1 et PCR à demi nichée du
deuxième fragment de l’ARN messager du CD238
Dans deux cas, parce qu’il s’agissait de plus longs fragments (>1000 pb), une autre PCR
était faite à partir de l’ADN complémentaire provenant de l’amplification précédente de
l’ARNm. Dans le cas de l’ARNm de l’aquaporine-1 du groupe sanguin Colton, la PCR
nichée était faite selon la méthode suivante :
}
Pour ce qui est du deuxième fragment de l’ARNm de la protéine CD238, la PCR à demi
nichée était faite selon la méthode suivante :
}
Ces amplifications permettaient d’obtenir assez d’ADN pour la purification et l’envoi au
séquençage.
2.1.8. Purification et dosage des amplicons
À la suite des amplifications RT-PCR et PCR, les divers amplicons devaient être purifiés
avant d’être envoyés au séquençage. Lorsqu’il n’y avait qu’une seule bande sur le gel
d’agarose, les amplicons étaient purifiés par RapidTip® (D-Mark Biosciences, Toronto,
Canada) selon les instructions du fabricant. Dans les cas où les amplifications ne se
traduisaient pas en une seule bande sur le gel, les amplicons étaient purifiés à l’aide du
MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen) selon les instructions du fabricant. En résumé, les
bandes correspondant aux fragments d’intérêt étaient découpées au scalpel, puis l’ADN
était libéré lors de la fonte de l’agarose. Ensuite, l’ADN était purifié dans un système de
colonne. La colonne est conçue pour retenir l’ADN, alors que ce dernier est purifié lors
d’une étape de lavage et finalement recueilli lors d’une étape finale d’élution. Ces deux
étapes sont effectuées par centrifugation.
29
Le dosage des amplicons non purifiés était effectué avec le marqueur de masses
moléculaires Low DNA mass ladder (Life Technologies Inc.). Une quantité de 235 ng de
ce marqueur était déposée sur un gel d’agarose 1%. La création d’une courbe standard à
partir du marqueur permettait de doser 1 µl de chaque amplicon et d’obtenir la
concentration de chaque échantillon. Le dosage sur gel d’agarose avait comme avantage
de prouver la présence d’un seul fragment d’ADN et de s’assurer que ce dernier
correspondait bel et bien au fragment d’intérêt.
Par souci d’économie de temps, les amplicons précédemment purifiés par RapidTip®
étaient dosés au NanoDrop®.
2.1.9. Clonage de l’amplicon correspondant à l’ARNm de CD47
Afin d’améliorer la qualité des séquences obtenues à la suite de la RT-PCR, la séquence
de l’ARNm du CD47 a dû être clonée. Le vecteur utilisé, le pDrive Cloning Vector
provenait de la trousse commerciale PCR CloningPlus kit (Qiagen).
Tout d’abord, le clonage était précédé d’une amplification de la séquence à cloner par RT-
PCR dans les conditions énoncées précédemment. Le programme du thermocycleur était
le suivant :
}
Ensuite, les produits PCR étaient dosés sur gel d’agarose 1% avec le marqueur de
masses moléculaires Low DNA mass ladder afin de s’assurer que la quantité d’amplicons
soit suffisante pour procéder au clonage. Une fois dosés, les amplicons étaient purifiés
avec les RapidTip®. Pour faciliter la réaction de ligation, il y avait ajout de queues poly-A
aux produits PCR selon la méthode suivante : 4 µl de produits PCR purifiés (environ
250 ng d’ADN), auxquels sont ajoutés 0,5 µl de tampon Taq 10X (Life Technologies Inc.),
1 mM de dATP (Life Technologies Inc.) et 2,5 U de Taq polymérase (Life Technologies
Inc.). Le volume total de la réaction était de 5,5 µl. L’ajout de queues poly-A se faisait à
72°C pendant 10 minutes, suivi d’un refroidissement à 4°C.
30
La réaction de ligation de l’insert (la séquence de l’ARNm du CD47) dans le vecteur, ainsi
que celle de la transformation dans les EZ Competent Cells (Qiagen) étaient toutes les
deux effectuées selon les instructions du fabricant. Les cellules compétentes,
précédemment incubées dans un bain-marie à 37°C pendant 1h avec de légères
agitations sporadiques, étaient mises en culture sur des géloses contenant le milieu Luria-
Bertani (LB), préparé de façon standard et contenant de l’ampicilline (Sigma-Aldrich,
Oakville, Ontario) à une concentration de 0,1 mg/ml. Les géloses étaient placées à 37°C
toute la nuit. La sélection des colonies recombinantes se faisait selon la méthode
colorimétrique standard des colonies bleues/blanches, basée sur l’hydrolyse du 5-bromo-
4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) en présence d’isopropyl β-D-1-
thiogalactopyranoside (IPTG), lorsqu’il y a présence du gène lacZ dans le plasmide.
Chacune des colonies recombinantes (blanches) était déposée dans 5 ml du même milieu
de culture LB-ampicilline et incubée à 37°C pendant 8 h sous agitation. Ensuite, 5 ml du
bouillon de culture était incorporé dans 45 ml du milieu LB-ampicilline et le 50 ml total était
incubé à 37°C sous agitation pendant toute la nuit.
La purification de l’ADN plasmidique était effectuée à l’aide la trousse commerciale
Hispeed™ Plasmid Purification Midi Kit (Qiagen) selon les instructions données par le
fabricant. L’ADN plasmidique purifié était dosé à 260 nm au NanoDrop®, puis envoyé au
service de séquençage.
2.1.10. Séquençage et analyse des résultats
Tous les amplicons purifiés étaient séquencés à la Plate-forme d’analyses génomiques de
l’Université Laval. Les amorces utilisées pour le séquençage étaient les mêmes que celles
utilisées lors des amplifications RT-PCR et PCR. Une fois reçues, les séquences étaient
analysées avec le logiciel Geneious et comparées avec les séquences standards
retrouvées sur le site du National Center of Biotechnology Information[38].
31
2.2. Analyses protéomiques
2.2.1. Préparation de globules rouges fantômes
Afin de faciliter les analyses protéomiques, des globules rouges fantômes, c’est-à-dire des
globules rouges dépourvus d’hémoglobine, ont été préparés selon le protocole suivant.
Tout d’abord, un tube de sang total, recueilli dans un tube contenant de l’EDTA, était
centrifugé à 1430 x g pendant 20 minutes afin d’isoler les globules rouges. Un culot de
300 µl de ces derniers était prélevé et lavé 5 fois avec de la saline (NaCl 0,9%).
Ensuite, le culot était suspendu dans du tampon phosphate de sodium 5 mM pH 8,0
jusqu’à un volume final de 15 ml. La suspension était incubée 30 minutes sur glace, puis
centrifugée pendant 20 minutes à 10 000 x g avec le frein activé. Cette étape, qui
commençait par la suspension du culot dans le tampon sodium phosphate, était répétée 2
fois et effectuée entièrement sur glace.
Les globules rouges fantômes étaient ensuite suspendus dans un volume final de 1 ml de
tampon sodium phosphate et 2 µl de cette suspension était dosée au NanoDrop® pour
avoir une idée de la concentration en protéines. Finalement, 10 µl d’EDTA 0,5 M (Thermo
Scientific) et 10 µl d’Halt™ Protease Inhibitor (Thermo Scientific) étaient ajoutés avant que
les globules rouges fantômes soient aliquotés et congelés à -80°C pour la durée du projet.
2.2.2. Traitement des globules rouges fantômes à la ficine
Le protocole était celui effectué de manière standard par le LRCS d’Héma-Québec.
Premièrement, afin de procéder au traitement enzymatique, le sang total était centrifugé à
1430 x g pendant 20 minutes afin d’isoler les globules rouges. Ensuite, ces derniers
étaient lavés avec de la saline jusqu’à l’obtention d’un surnageant clair. Une suspension
de globules rouges à 1%, toujours dans la saline, était ensuite préparée. La ficine
concentrée à 10X (fournie par le LRCS) était préalablement diluée à une concentration
finale de 1X dans du tampon phosphate salin (PBS : 0,8 M Na2HPO4 et 0,2 M KH2PO4 à
pH 7,4, 145 mM NaCl, pH total 7,3). L’enzyme était ajoutée à un volume 3 fois supérieure
à celui du culot de globules rouges et la réaction était incubée dans un bain-marie à 37°C
32
pendant 15 minutes. Les globules rouges traités étaient ensuite lavés 3 fois avec de la
saline en centrifugeant à 600 x g pendant 10 minutes chaque fois.
2.2.3. Électrophorèse SDS-PAGE et coloration des gels
Dans le but d’observer le motif de migration des protéines des globules rouges fantômes
PEL- versus celui des globules rouges fantômes PEL+, environ 20 μg de protéines de
globules rouges fantômes étaient déposés sur gel de polyacrylamide à 12%, en conditions
réductrices ou non. Les conditions non-réductrices consistaient à omettre le DTT du
tampon d’échantillon et à ne pas faire bouillir les échantillons avant que ces derniers
soient déposés sur gel. Toutes les électrophorèses SDS-PAGE étaient faites à l’aide du
montage Mini-PROTEAN® Tetra Cell (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, Ontario). Selon
l’analyse à effectuer, les colorants utilisés pour les gels étaient le Bio-Safe Coomassie
Stain (Bio-Rad) ou le SYPRO® Ruby Protein Gel Stain (Life Technologies Inc.). Les deux
colorants étaient utilisés selon les instructions données par le fabricant. Les gels étaient
visualisés et analysés avec l’appareil Alpha Imager (Proteinsimple™, Santa Clara,
Californie) ou le ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare, Baie d’Urfe, Québec).
2.2.4. Spectrométrie de masse
Toutes les analyses en spectrométrie de masse étaient effectuées à la Plate-forme de
protéomique du Centre de génomique de Québec, situé au Centre hospitalier de
l’Université Laval (CHUL). L’appareil utilisé était le TripleTOF 5600 (AB SCIEX, Concord,
Ontario). Une fois reçus, les résultats étaient analysés à l’aide du logiciel Scaffold3
(Oregon, États-Unis).
2.2.5. Adsorption-élution des anticorps anti-PEL
Le but de cette méthode était de fixer de manière spécifique les anticorps anti-PEL sur des
globules rouges PEL+, puis d’éluer ces anticorps afin de les utiliser comme anticorps
primaires en immunobuvardage. Afin de procéder à l’adsorption-élution des anti-PEL, la
trousse commerciale ELU KIT™ PLUS (Immucor Inc., Géorgie, États-Unis) a été utilisée
selon les instructions du fabricant. Pour faciliter l’adsorption et encourager la spécificité de
33
la liaison à l’antigène PEL, les globules rouges utilisés étaient O-. Ainsi, les antigènes A, B
et D étaient absents de la surface des globules rouges. Avant de procéder à l’élution, le
test de Coombs était effectué pour tester l’efficacité de l’adsorption. Ensuite, 2 µl des
protéines adsorbées étaient dilués dans 20 µl de saline. Puis, deux gouttes d’anti-IgG-C3d
(Immucor Inc.) étaient ajoutées et la réaction était centrifugée pendant 20 secondes avant
d’observer l’agglutination des globules rouges au microscope. Finalement, l’éluat final
contenant les anticorps anti-PEL était aliquoté, puis congelé à -80°C.
2.2.6. Purification des IgG totales du plasma PEL- par Fast Protein Liquid
Chromatography (FPLC)
Afin d’isoler les anticorps anti-PEL de deux échantillons de plasma, les IgG totales
contenues dans ceux-ci étaient purifiées par Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC).
Les deux plasmas, congelés à -80°C après avoir été isolés du sang total, ont été obtenus
après le consentement et l’approbation du comité d’éthique d’Héma-Québec. Les deux
échantillons de plasma provenaient du même individu, mais ont été prélevés à des temps
différents, soit en 2001 et en 2008. D’abord, un volume de 1 ml de chaque plasma était
ajouté à 1 ml de PBS avant d’être filtré à 0,22 µM. Les deux échantillons filtrés étaient
injectés dans une colonne de protéine G (HP SpinTrap, GE Healthcare) et cette dernière
était lavée avec du PBS jusqu’à ce que toutes les IgG aient été fixées sur la colonne.
Ensuite, les IgG étaient éluées avec de la glycine (100 mM, pH 2,3), puis immédiatement
neutralisées avec du Tris (tris(hydroxyméthyl)aminométhane)-HCl (1 M, pH 9,0).
Finalement, les IgG purifiées étaient envoyées au LRCS pour être testées en cartes-gel.
Ce test permettait de confirmer l’efficacité de la purification des anticorps anti-PEL du
plasma.
2.2.7. Fractionnement des IgG totales purifiées par focalisation isoélectrique
Dans le but d’isoler plus spécifiquement les anticorps anti-PEL, un échantillon des IgG
préalablement purifiées par FPLC a été soumis à une focalisation isoélectrique. Cette
méthode permettait de séparer les IgG selon leur point isoélectrique (pI). La focalisation
isoélectrique était effectuée à l’aide de l’appareil automatisé ÄKTA FPLC™ system (GE
Healthcare). Afin de générer un gradient de pH entre 6,0 et 9,6, la colonne Polybuffer
34
Exchanger 94 (GE Healthcare) était équilibrée avec le tampon de départ (25 mM
éthanolamine, pH 9,6). L’échantillon d’IgG purifiées était dilué dans ce même tampon
avant d’être injecté dans la colonne. L’élution était faite avec le tampon Polybuffer 96
ajusté à pH 6,0 (Ge Healthcare). Au final, huit fractions d’IgG ont été recueillies. Chaque
fraction a été testée en carte-gel par le LRCS dans le but d’identifier celle(s) où la réaction
d’agglutination entre les anticorps anti-PEL et les globules rouges PEL+ avait lieu.
2.2.8. Tests d’agglutination en carte-gel
Afin de tester l’efficacité des différentes méthodes de purification des IgG totales du
plasma, effectuées dans le but d’isoler les anticorps anti-PEL, des tests d’agglutination ont
été faits par le personnel du LRCS. Contrairement aux tests d’agglutination faits en tubes,
ceux effectués dans le cadre de ce projet étaient faits à l’aide des cartes-gel 1D-Micro
Typing System (Ortho Clinical Diagnosis, Markham, Canada). Chaque carte-gel contenait
cinq microtubes où il était possible d’observer une seule réaction d’agglutination à chaque
fois.
Tout d’abord, une suspension de globules rouges PEL+ à 2% était incubée avec 25 μl des
diverses préparations biologiques contenant les IgG totales pendant 1 heure à 37ºC dans
la chambre de réaction.
35
Figure 2.1. : Principe d'agglutination en carte-gel. Adaptée de [8]. D’abord, les globules rouges sont placés
dans la chambre de réaction en présence du liquide qui doit être testé (plasma ou autre). Ensuite, le tout est
incubé pendant une certaine période de temps à 37°C. Ensuite, la carte-gel est centrifugée et les globules
rouges, agglutinés ou non, passent ou non au travers de la colonne. Finalement, l’intensité de l’agglutination
peut être visualisée par le fait que les globules rouges ont été plus ou moins retenus à travers le gel (Figure
2.2.).
À la suite de l’incubation des globules rouges PEL+ avec le plasma contenant les
anticorps anti-PEL ou avec les IgG purifiées par FPLC et de la centrifugation de la carte-
gel, il était possible d’observer, s’il y avait lieu, l’agglutination des globules rouges PEL+
avec les anticorps anti-PEL. La colonne contenait des billes d’acrylamide et de
l’antiglobuline anti-IgG dans une solution LISS (Low Ionic Strenght Saline) tamponnée.
Cette solution permettait de neutraliser, en partie, la charge négative présente à la surface
des globules rouges et ainsi, favoriser l’agglutination de ces derniers[6]. Alors que les
globules rouges qui n’étaient pas agglutinés se déposaient au fond de la colonne et
formaient un culot bien défini, ceux qui avaient agglutiné restaient coincés dans le gel.
.
36
Figure 2.2. : Interprétation des résultats d'agglutination obtenus en carte-gel. Adaptée de [39].
La force de la réaction d’agglutination était variable et elle était interprétée selon une
échelle de réactivité qui allait de 0 (aucune agglutination) à 4+ (tous les globules rouges
semblaient avoir agglutiné) (Figure 2.2.). Ce test permettait de s’assurer que les anti-PEL
étaient bel et bien conservés à la suite des diverses purifications.
2.2.9. Immunobuvardages de type Western
Dans le but d’identifier un complexe immun de manière spécifique avec des préparations
biologiques contenant des anti-PEL, 20 µg de globules rouges fantômes PEL+ et PEL-,
préalablement dosés en protéines (en mesurant l’absorbance de ces dernières à 280 nm
en utilisant le coefficient d’absorption de l’albumine bovine) étaient déposés et migrés sur
gel de polyacrylamide à 12%. Les conditions réductrices et non-réductrices ont toutes les
deux été testées. Par la suite, les globules rouges fantômes étaient transférés sur une
membrane de PVDF (EMD Millipore, Massachusetts, États-Unis) à 100 V pendant 1 heure
à 22°C. La membrane était préalablement bloquée avec la solution commerciale
StartingBlock™ (TBS) Blocking Buffer (Thermo Scientific) et cette même solution était
utilisée pour diluer les anticorps primaire et secondaire. Les anticorps primaires, toujours
utilisés dans une dilution 1 :1000, étaient : le plasma contenant les anti-PEL, les IgG
purifiées par FPLC et certaines fractions d’IgG purifiées fractionnées selon leur point
isoélectrique. Les anticorps secondaires utilisés étaient des anti-IgG humains spécifiques
37
à certaines chaînes d’anticorps (spécifiques aux fragments Fc ou Fab, ou aux chaînes
lourde et légère), provenant de souris ou de chèvre (Jackson ImmunoResearch,
Pennsylvanie, États-Unis). De plus, ils étaient tous couplés à une peroxydase. L’analyse
des bandes obtenues au terme de la réaction de chimiluminescence était effectuée à
l’aide de l’appareil ImageQuant LAS 4000. Les bandes obtenues étaient comparées pour
tenter d’identifier un complexe immun reconnu sur les globules rouges fantômes PEL+,
mais absent des globules rouges fantômes PEL-.
2.2.10. Observation de l’expression des protéines CD55 et CD59 par
immunobuvardage de type Western
Dans le but de visualiser le niveau d’expression des protéines CD55 et CD59 à la surface
des globules rouges fantômes PEL- et de comparer celui-ci avec celui à la surface des
globules rouges fantômes PEL+, un immunobuvardage de type Western a été tenté. Les
anticorps primaires utilisés étaient un anti-CD55 (Cedarlane, Burlington, Ontario) et un
anti-CD59 (Cedarlane), dilués selon les recommandations du fabricant. Les anticorps
secondaires utilisés étaient tous couplés à une peroxydase et dilués dans les mêmes
conditions que celles énoncées précédemment pour les autres immunobuvardages de
type Western. Ces deux immunobuvardages ont été tentés en conditions réductrices et
non-réductrices.
2.2.11. Immunoprécipitation en conditions non-dénaturantes
Dans le but d’isoler l’antigène PEL et d’en identifier la base moléculaire en spectrométrie
de masse, une immunoprécipitation en conditions non-dénaturantes a été tentée. Le but
de procéder en conditions non-dénaturantes était de préserver le plus possible la structure
de l’antigène, ainsi que celle des anticorps anti-PEL. Le protocole d’immunoprécipitation a
été adapté d’un protocole déjà existant[40]. Les solutions utilisées étaient toutes à 4ºC et
les centrifugations se faisaient aussi à cette température. De plus, toutes les
manipulations se faisaient sur glace. Tout d’abord, un culot de 500 μl de globules rouges
était lavé trois fois dans du PBS 1X en centrifugeant à 16 000 x g pendant une minute.
Ensuite, 1 ml d’une suspension de globules rouges à 2% (environ 1,5 x 108 cellules) était
centrifugé à 2200 x g pour éliminer ensuite le surnageant. Les globules rouges étaient
38
lysés (tampon de lyse non-dénaturant, fraîchement préparé : 1% Triton X-100, 50 mM
Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,02% sodium azide, 10 mM iodoacétamide,
1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), inhibiteur de protéases 1X (Thermo
Scientifics)) pendant 30 minutes. Afin de recueillir les fractions membranaires, le lysat était
ensuite lavé par centrifugation pendant 15 minutes à 16 000 x g. Les étapes de lyse et de
lavage étaient effectuées une seconde fois. Le culot de membranes de globules rouges
était ensuite gardé sur glace.
Le support utilisé pour l’immunoprécipitation était des billes de protéines G (GE
Healthcare) diluées dans du PBS. Les billes étaient conjuguées avec 5 μl d’IgG totales
provenant du plasma contenant des anti-PEL, purifiées précédemment par FPLC. Les
billes et les IgG étaient incubées pendant 2 h 30 à 4ºC sur un portoir rotatif. Les IgG qui
n’étaient pas fixées aux billes étaient ensuite récoltées en centrifugeant le mélange
pendant deux secondes à 16 000 x g. Finalement, les billes conjuguées aux anti-PEL
étaient suspendues dans du tampon de lyse.
Pour l’immunoprécipitation, du sérum d’albumine bovine (BSA) concentré à 10% était
ajouté aux billes conjuguées aux anti-PEL en même temps que le culot de membranes de
globules rouges resuspendu était ajouté. Ce mélange était incubé pendant 2 h à 4ºC sur
un portoir rotatif. Par la suite, le culot était centrifugé pendant cinq secondes à 16 000 x g
afin de recueillir, dans le surnageant, les protéines non fixées. Ensuite, les billes étaient
lavées huit fois avec 1 ml de tampon de lavage (0,1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl
pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,02% sodium azide), en centrifugeant pendant deux
secondes à 16 000 x g. Encore dans les mêmes conditions, les billes étaient lavées deux
fois avec 1 ml de PBS. Une fois le surnageant recueilli, les billes de protéines G couplées
à l’antigène étaient envoyées telles qu’elles en spectrométrie de masse.
2.2.12. Immunoprécipitation avec crosslinking
Afin de lier de manière covalente l’antigène PEL aux anticorps spécifiques anti-PEL, une
immunoprécipitation avec un agent permettant le crosslinking a été tentée. Le protocole,
ainsi que la préparation des solutions, ont été adaptés de l’article de Hamada et
collaborateurs[41]. Il est à noter que les solutions étaient préparées avec le détergent Igepal
39
CA-630 (Sigma-Aldrich) en remplacement du Nonidet-40 proposé dans l’article. Les billes
utilisées étaient les mêmes que celles utilisées lors de l’immunoprécipitation en conditions
non-dénaturantes. À la fin de l’expérience, les billes étaient envoyées telles qu’elles en
spectrométrie de masse.
3. Résultats
3.1. Analyses génomiques
3.1.1. Amplification par RT-PCR des différents ARNm codant pour les protéines
d’intérêt
Les résultats du séquençage de la partie codante des différents ARNm sont résumés dans
l’annexe I (Tableau A.2.). Les résultats pour les protéines de la bande 3 et du GLUT-1 ne
sont pas présentés. Cependant, les résultats obtenus pour ces deux protéines, bien qu’ils
ne soient pas complets, ne laissent pas croire qu’elles soient associées à l’antigène PEL.
Comme le démontrent les résultats, certains SNP n’étant pas répertoriés dans la littérature
ont été identifiés. Cependant, en comparant ces SNP entre les individus PEL- et PEL+,
aucun lien n’a pu être fait entre ceux-ci et le phénotype PEL-.
3.1.2 Amplification des exons 2 à 5 du gène codant pour la glycoprotéine CD44
Les exons 2 à 5 du gène codant pour la glycoprotéine CD44 ont été séquencés et
analysés pour l’individu PEL-. Ces séquences ont été comparées à celles d’un individu
PEL+, ainsi qu’aux séquences de référence[38]. Finalement, aucune mutation particulière
n’a pu être identifiée dans l’ADN de l’individu PEL-.
40
3.2. Analyses protéomiques
3.2.1. Traitement des globules rouges fantômes à la ficine
La ficine est une enzyme protéolytique fréquemment utilisée en sérologie érythrocytaire.
Elle permet, notamment, d’éliminer certaines composantes extramembranaires des
antigènes des glycophorines A et B. Éliminer ces antigènes de la surface des globules
rouges PEL+ permet d’augmenter, lors des immunobuvardages, les chances de détecter
des protéines de plus faible abondance qui pourraient être masquées par celles présentes
en plus grande quantité. En fait, la glycophorine A et la bande 3 sont les protéines les plus
présentes à la surface des globules rouges avec chacune 1 000 000 copies par cellule.
Figure 3.1. : Résultat du traitement des globules rouges fantômes à la ficine en immunobuvardage de type
Western. Puits 1 : Globules rouges fantômes non traités à la ficine (30 µg). Puits 2 : Globules rouges fantômes
traités à la ficine (30 µg). 2A, AB, 2B, A, B : Portions extramembranaires des antigènes érythrocytaires des
glycophorine A (A) et glycophorine B (B). Anticorps primaire utilisé : Monoclonal Anti-Glycophorin A,B (α, δ)
(Sigma).
41
Le traitement des globules rouges fantômes à la ficine a été confirmé par
immunobuvardage. Comme le démontre la Figure 3.1, le traitement enzymatique a
fonctionné puisque la majorité des épitopes reconnus par les anticorps anti-glycophorine A
et anti-glycophorine B ont disparu. Ainsi, ces globules rouges fantômes ont pu être utilisés
parallèlement avec ceux non traités à la ficine.
3.2.2. Coloration de gels SDS-PAGE et envoi de bandes en spectrométrie de masse
Les motifs de migration des gels colorés au SYPRO® Ruby ont été observés, puis
comparés (Figures 3.2. et 3.3.). Le but était d’identifier des bandes différentes entre les
puits contenant les globules rouges fantômes PEL+ et celui contenant les globules rouges
fantômes PEL-. Dans un premier gel, cinq bandes ont été identifiées. Comme le démontre
la Figure 3.2., les bandes 1 et 3 présentes dans les puits contenant les globules rouges
fantômes PEL+ sont, bien qu’à la même masse moléculaire, beaucoup plus intenses que
la bande 2 retrouvée dans le puits contenant les globules rouges fantômes PEL- et qui se
trouve à la même position, soit à un peu moins de 25 kDa. Comme il était prévu au départ,
les globules rouges fantômes PEL+ traités à la ficine (puits C) montrent deux bandes qui
sont absentes des puits A et B. En tenant compte du fait qu’il pouvait s’agir de protéines
de plus faible abondance qui pourraient être masquées dans le puits A, les bandes 4 et 5
ont été découpées et envoyées pour être analysées en spectrométrie de masse.
42
Figure 3.2. : Premier gel de polyacrylamide (12%) qui a permis l'envoi de bandes en spectrométrie de masse.
Puits A : Globules rouges fantômes PEL+ non traités à la ficine (20 µg). Puits B : Globules rouges fantômes
PEL- non traités à la ficine (20 µg). Puits C : Globules rouges fantômes PEL+ traités à la ficine (20 µg). Bandes
1, 2, 3, 4 et 5 : Bandes découpées et envoyées en spectrométrie de masse. Colorant utilisé : SYPRO® Ruby.
Les résultats obtenus en spectrométrie de masse n’ont pas permis de cibler de manière
spécifique une protéine qui pourrait être la base moléculaire de l’antigène PEL.
Cependant, certaines protéines étant la base moléculaire de certains groupes sanguins
ont été identifiées : la glycoprotéine CD44 du groupe sanguin Indian, le transporteur d’ATP
ABCB6 du groupe sanguin Langereis, la protéine CD55 du groupe sanguin Cromer et
celle ERMAP du groupe sanguin Scianna. À la lumière de ces résultats et considérant que
l’antigène PEL pourrait aussi être le résultat d’une mutation dans une protéine déjà
identifiée comme étant la base moléculaire d’un groupe sanguin, les ARNm de ces
protéines ont été ciblés pour être séquencés et analysés.
Lors d’un deuxième essai d’électrophorèse SDS-PAGE effectué dans les mêmes
conditions, d’autres protéines ont pu être identifiées (Figure 3.3.). Comme le démontre la
figure, les protéines identifiées sont toutes différentes de celles identifiées dans le gel
précédent. Les bandes A et C semblent être identiques dans les puits 1 et 3 contenant les
43
globules rouges fantômes PEL+. Cependant, la bande D identifiée dans le puits 2
contenant les globules rouges fantômes PEL- est plus intense et il n’y a aucune bande ni
au-dessus ni en dessous, contrairement aux bandes A et C. Pour ces raisons, elles ont
toutes été envoyées pour être analysées en spectrométrie de masse. Finalement, la
bande B a été découpée puisqu’elle semblait être plus intense dans les puits 1 et 3 que
dans le puits 2.
Figure 3.3. : Deuxième gel de polyacrylamide (12%) qui a permis l'envoi de bandes en spectrométrie de
masse. Puits 1 : Globules rouges fantômes PEL+ non traités à la ficine (20 µg). Puits 2 : Globules rouges
fantômes PEL- non traités à la ficine (20 µg). Puits 3 : Globules rouges fantômes PEL+ traités à la ficine
(20 µg). Bandes A, B, C et D : Bandes découpées et envoyées en spectrométrie de masse. Colorant utilisé :
SYPRO® Ruby.
Tout comme lors du premier essai, les résultats obtenus en spectrométrie de masse n’ont
pas permis d’identifier spécifiquement une protéine candidate à porter l’antigène PEL. Les
motifs de migration observés, différents lors de chaque essai, étaient probablement dus à
la variabilité de l’abondance des protéines trouvées dans chacun des aliquots
d’échantillons. À la suite des résultats obtenus pour la coloration des gels de
polyacrylamide, une autre approche a été tentée.
44
3.2.3. Envoi des globules rouges fantômes PEL+ et PEL- en solution pour être
analysés en spectrométrie de masse
Afin d’avoir une idée du protéome complet des globules rouges fantômes PEL+ et PEL-,
ceux-ci ont été envoyés directement en solution pour être analysés en spectrométrie de
masse. Le nombre de protéines identifiées était d’environ 80 pour chaque échantillon.
Après une analyse approfondie de chaque protéine identifiée, seules celles qui avaient
une composante membranaire et qui étaient exprimées intrinsèquement sur les globules
rouges ont été considérées. Après la comparaison des protéines identifiées dans les
globules rouges fantômes PEL+ versus celles identifiées dans les globules rouges
fantômes PEL-, une seule protéine candidate est ressortie du lot : la flottilin-1. Cette
dernière était présente dans l’échantillon des globules rouges fantômes PEL- et absente
de celui des globules rouges fantômes PEL+. La flotillin-1 est une protéine membranaire
exprimée par plusieurs types de cellules et elle est impliquée dans la formation des
calvéoles au sein de ces mêmes cellules[36]. Malheureusement, l’analyse de la séquence
codante de son ARNm chez l’individu PEL- a permis d’éliminer la flotillin-1 des protéines
candidates à porter l’antigène PEL, car aucun polymorphisme n’a pu être identifié.
45
3.2.4. Purification des IgG totales du plasma PEL- par FPLC
L’efficacité de la purification des IgG totales du plasma contenant des anti-PEL a été
testée en carte-gel par le LRCS. Les résultats obtenus démontrent que la purification a été
efficace (Figure 3.4.). En fait, l’intensité de l’agglutination des anticorps anti-PEL sur les
globules rouges PEL+ dans les échantillons purifiés était la même que celle observée
avec le plasma, donc avant la purification. D’une part, le gel LISS fait référence au fait que
pour cet essai, les globules rouges PEL+ ont été traités préalablement dans la solution
LISS. D’autre part, le gel papaïne fait référence au fait que pour cet essai, les globules
rouges PEL+ ont été traités à la papaïne, une enzyme protéolytique qui clive les liens
disulfures entre les acides aminés basiques et aussi, entre les résidus leucine et
glycine[42].
46
Figure 3.4. : Test d'efficacité de la purification des IgG totales effectuée par FPLC. Méthode effectuée par le
LRCS selon les procédures standards en sérologie érythrocytaire. 2001 : Échantillon découlant du don de
plasma PEL- prélevé en 2001. 2008 : Échantillon découlant du don de plasma PEL- prélevé en 2008. Avant
purification : Utilisation directe du plasma PEL-. Après purification : Utilisation des IgG purifiées par FPLC. Le
volume de chaque échantillon testé était le même dans chaque colonne.
47
3.2.5. Séparation des IgG totales selon leur point isoélectrique par
chromatofocalisation
Les résultats de la séparation des IgG totales précédemment purifiées par FPLC sont
illustrés à la figure suivante. Les résultats obtenus démontrent que les IgG ont été éluées
majoritairement selon quatre points isoélectriques (Figure 3.5.). Ces derniers
correspondent à la valeur de l’axe des ordonnés à chaque maximum de la courbe. Il est à
noter que le premier maximum illustre l’élution de quelques IgG à pH 8,5, mais qu’il
contient surtout du tampon d’élution et que la hauteur de ce pic est caractéristique de la
méthode. En résumé, les IgG ont été éluées principalement à des pH variant de 8,5 à 6,5.
Les 8 fractions recueillies ont été envoyées au LRCS pour être testées en cartes-gel.
Figure 3.5. : Séparation des IgG totales préalablement purifiées par FPLC en huit fractions selon leur point
isoélectrique. Les huit fractions sont indiquées en rouge.
48
3.2.6. Tests d’agglutination sur les fractions d’IgG purifiées séparées par
chromatofocalisation
Les huit fractions obtenues lors de la chromatofocalisation ont été testées en carte-gel par
le LRCS dans le but de voir si les anticorps anti-PEL n’auraient pas été isolés à un pI
particulier. Les résultats des tests d’agglutination sont montrés à la Figure 3.6. Il y a
présence d’agglutination pour toutes les fractions, sauf pour la dernière. De plus, le
nombre de globules rouges agglutinés est supérieur dans les fractions 0, 1 et 2. Pour ce
qui est des fractions 3 à 6, l’intensité de l’agglutination semble être la même. Ces résultats
démontrent que les anti-PEL n’ont pas été isolés spécifiquement selon un pI, mais qu’ils
sont plutôt répartis dans les sept premières fractions (fraction 0 à 6). Comme le nombre
d’anticorps anti-PEL isolés dans chaque fraction devrait être directement proportionnel à
l’intensité de la réaction d’agglutination, ce sont les fractions 0, 1 et 2 qui ont été utilisées
pour les immunobuvardages de type Western.
Figure 3.6. : Tests d’agglutination effectués en carte-gel pour les huit fractions obtenues lors de la
chromatofocalisation. La méthode a été effectuée par le LRCS selon les procédures standards en sérologie
érythrocytaire. Un volume égal de chaque fraction a été utilisé dans chaque colonne. La concentration en IgG
de chaque fraction est inconnue.
49
3.2.7. Adsorption-élution des anticorps anti-PEL
Le test de Coombs a été effectué sur des globules rouges PEL+ avec le plasma PEL-
précédemment déplété en anticorps anti-PEL. Un plasma négatif provenant d’un don de
sang total d’un individu de groupe AB+, dont le plasma ne contient pas d’anti-A, d’anti-B et
d’anti-D, a été utilisé comme contrôle négatif. En utilisant la méthode des tubes, les
résultats obtenus démontrent une agglutination de niveau 1+ pour les globules rouges
PEL+ mis en présence du plasma contenant des anti-PEL et aucune agglutination n’est
observée lorsque ces mêmes globules rouges sont mis en présence du plasma négatif.
3.2.8. Immunobuvardages de type Western
Bien que plusieurs échantillons biologiques aient été utilisés comme anticorps primaire
dans cette technique, aucune tentative n’a permis d’identifier un complexe immun
susceptible d’être lié à l’antigène PEL. Outre le bruit de fond important lors de l’utilisation
du plasma, les IgG purifiées par FPLC n’ont rien reconnu de manière spécifique. Des
immunobuvardages ont été effectués plusieurs fois avec les mêmes échantillons, avec
plusieurs anticorps primaires et secondaires différents et en conditions réductrices et non-
réductrices. Dans toutes les conditions testées, aucun résultat concluant n’a été obtenu,
comme le montre en exemple la Figure 3.7.
50
Figure 3.7. : Exemple d'immunobuvardage de type Western effectué avec les fractions 0 et 1 d'IgG purifiées
par chromatofocalisation. Fraction 0 : Première fraction recueillie lors de la chromatofocalisation qui a été
utilisée comme anticorps primaire. Fraction 1 : Deuxième fraction recueillie lors de la chromatofocalisation qui
a été utilisée comme anticorps primaire. Marqueur : Precision Plus Protein™ Dual Color Standards (Bio-Rad)
(10 µl). PEL+ non réduits et PEL- non réduits : Globules rouges fantômes PEL+ ou PEL-, déposés sur gel
sans avoir été bouillis et dont le tampon d’échantillon ne contient pas de DTT (20 µg). PEL+ réduits et PEL-
réduits : Globules rouges fantômes PEL+ ou PEL-, qui ont été bouillis avant d’être déposés sur gel et dont le
tampon d’échantillon contient du DTT.
3.2.9. Observation de l’expression des protéines CD55 et CD59 par
immunobuvardage de type Western
Puisque les érythrocytes expriment tous les protéines CD55 et CD59 et que ces dernières
avaient été identifiées dans les échantillons PEL+ et PEL- lors des analyses en
spectrométrie de masse, CD55 et CD59 ont été ciblées pour être candidates à porter
l’antigène PEL. Les résultats obtenus à la suite des immunobuvardages étaient identiques
dans les deux conditions testées, soit en conditions réductrices et non-réductrices. En fait,
aucune des deux protéines CD55 et CD59 n’a été reconnue de manière spécifique, que ce
51
soit dans les échantillons de globules rouges fantômes PEL+ ou dans ceux PEL- (résultats
non montrés).
4. Discussion
4.1. Analyses génomiques
Les résultats obtenus lors des analyses génomiques n’ont malheureusement pas permis
d’identifier une quelconque mutation qui aurait pu expliquer la présence de l’antigène PEL.
Cependant, ces résultats n’écartent pas la possibilité que l’antigène PEL soit la
conséquence d’une mutation dans une protéine déjà associée à un groupe sanguin. En
fait, certaines mutations situées ailleurs que dans les exons, notamment dans les
promoteurs des gènes, peuvent indirectement affecter la reconnaissance d’un antigène
exprimé par une protéine. En fait, les promoteurs des gènes sont des séquences très
conservées qui régulent l’expression des gènes par la liaison à des facteurs de
transcription[43]. Les SNP présents dans ces régions conservées diminuent l’activité
transcriptionnelle des gènes et la quantité d’ARNm est en corrélation directe avec la
sévérité du phénotype et dépend du type de séquence qui a été mutée, ainsi que de sa
position par rapport au codon d’initiation[43]. Ainsi, les SNP retrouvés dans les promoteurs
des gènes peuvent amener certaines protéines à être produites en très faible quantité, ce
qui a un impact direct sur la reconnaissance de l’antigène par les anticorps. Aussi, des
mutations sont possibles dans les introns des gènes. En fait, les introns commencent et se
terminent par des sites d’épissage contenant des séquences GT et AG respectivement[44].
Des mutations dans ces sites d’épissage peuvent provoquer, d’une part, une diminution de
la reconnaissance des exons, ce qui peut entraîner la perte de cet exon dans l’ARNm
final, ou d’autre part, produire de nouveaux sites d’épissage et ainsi, incorporer de
nouveaux nucléotides aux exons, donnant ainsi des pseudos-exons[44]. Par exemple,
l’antigène Del résulte de la mutation 1226G>A qui entraîne de nouveaux transcrits
d’ARNm auxquels est ajoutée une séquence de 170 paires de bases provenant de
l’intron 7 du gène RHD[45].
52
Dans le cadre de ce projet de recherche, c’est seulement la partie codante des ARNm qui
a été séquencée et analysée. Bien qu’aucune mutation non répertoriée n’ait été identifiée
de manière spécifique chez les individus PEL-, certaines ont été identifiées chez les trois
individus d’origine québécoise. Il est possible que ces mutations soient de nouveaux
variants, sachant que plusieurs d’entre eux sont spécifiques à certaines populations.
Cependant, pour prouver la présence de nouveaux variants au sein de la population
québécoise, l’analyse de la séquence d’ARNm provenant d’individus PEL- et PEL+ de
différentes origines sera nécessaire.
Dans le cadre de ce projet, les études protéomiques effectuées laissent croire que les
anticorps anti-PEL peuvent reconnaître plusieurs épitopes sur une seule protéine, ou
encore un épitope formé de plusieurs protéines assemblées sous forme de complexe,
comme c’est le cas avec les protéines du groupe sanguin Rh. En fait, l’assemblage des
protéines RhD, RhCE et celui de la glycoprotéine RhAG sous forme de complexe dans la
membrane plasmique des globules rouges semble être essentielle à l’expression des
antigènes du groupe sanguin Rh[7]. Le complexe formé est un tétramère composé de deux
molécules RhAG et de deux molécules RhD ou RhCE stabilisées par l’association des
domaines N- et C-terminal[7]. Étant donné que l’analyse des complexes protéiques dans
leur forme native est une tâche ardue, les analyses génomiques ont plutôt été effectuées
en fonction de l’hypothèse qui veut que les anticorps anti-PEL reconnaissent une protéine
déjà identifiée comme étant la base moléculaire d’un groupe sanguin, mais qui aurait subi
des modifications dans la séquence codante de l’ARNm. Ainsi, la protéine codée lors de la
traduction présenterait au moins un épitope différent qui pourrait être la cible des anticorps
anti-PEL. À la suite de la comparaison des séquences codantes des individus PEL- avec
ceux PEL+, il a été observé qu’aucune mutation n’est susceptible d’être liée à l’antigène
PEL. Comme il a été mentionné précédemment, les effets des SNP sur la structure de la
protéine dépendent de la nature des acides aminés touchés, ainsi que de leur position au
sein de la protéine. La décision d’analyser seulement la séquence codante des ARNm a
été prise principalement en fonction du temps alloué pour compléter le projet de
recherche. En fait, bien que les séquences des promoteurs et des introns auraient pu être
analysées, il aurait été beaucoup trop long de séquencer entièrement chaque gène. Tout
de même, l’analyse de la séquence codante des ARNm a permis d’identifier les mutations
potentielles qui pourraient avoir un impact direct sur la structure des protéines codées par
53
ces ARNm. Une fois de plus, les résultats provenant des analyses génomiques n’illustrent
pas les modifications post-traductionnelles possibles chez la potentielle protéine porteuse
de l’antigène PEL.
4.2. Analyses protéomiques
4.2.1. La purification des anticorps anti-PEL du plasma
Diverses méthodes ont été employées pour purifier et isoler les anticorps anti-PEL
provenant du plasma de l’individu PEL- : l’adsorption-élution, la purification des IgG totales
par FPLC, la chromatofocalisation et les immunoprécipitations, avec et sans crosslinking.
Le but premier de purifier les anticorps anti-PEL du plasma était de procéder à des
immunobuvardages de type Western plus spécifiques que ceux effectués en utilisant le
plasma comme anticorps primaire. Le problème rencontré avec l’utilisation du plasma
comme anticorps primaire était un bruit de fond trop important sur les films lors de la
révélation. Même en diluant davantage le plasma et l’anticorps secondaire, le bruit de fond
demeurait problématique. Ce résultat s’explique par le fait que le plasma contient
beaucoup de molécules autres que les IgG et que celles-ci peuvent se fixer de manière
non spécifique à certaines protéines ou autres molécules présentes à la surface des
globules rouges fantômes.
Tous les échantillons résultant des techniques de purification des anticorps anti-PEL ont
été testés en cartes-gel par le LRCS pour en observer l’agglutination et ainsi, pour
déterminer l’efficacité de chacune de ces techniques. Dans ce cas-ci, les tests
d’agglutination étaient la meilleure technique envisageable, étant donné que c’est
seulement par ce principe qu’il est possible d’observer la présence des anticorps anti-PEL,
lorsque ceux-ci se fixent à l’antigène PEL.
4.2.2. Adsorption-élution des anticorps anti-PEL
Dans le cadre de la méthode d’adsorption-élution, les tests d’agglutination ont été faits en
tubes et analysés au microscope. Bien que la méthode en tubes soit encore utilisée dans
54
les laboratoires de sérologie érythrocytaire, la méthode en cartes-gel permet une
interprétation des résultats beaucoup plus facile. Contrairement à l’autre méthode, elle
n’est pas dépendante de la force appliquée par l’expérimentateur lorsqu’il brasse les
tubes. S’ils sont brassés trop vigoureusement, les globules rouges agglutinés peuvent se
séparer les uns des autres et le résultat peut être faussé.
Le résultat d’agglutination de 1+ obtenu lors du premier test de Coombs démontre que les
anticorps anti-PEL ont bel et bien été fixés sur les globules rouges PEL+. Par contre, le
résultat obtenu à la suite du test d’agglutination effectué avec l’éluat final s’est avéré
négatif. Une cause probable qui pourrait expliquer ce résultat est que le protocole
d’adsorption-élution nécessite une élution acide. Bien que l’éluat d’anti-PEL soit neutralisé
tout de suite après l’élution et non en temps réel comme lors de l’élution en FPLC, il n’en
demeure pas moins que les anticorps ont pu être dénaturés en présence de l’acide. Ainsi,
la dénaturation des anti-PEL empêcherait toute forme d’agglutination avec l’antigène. Une
autre cause possible à ce résultat est que la durée de l’incubation des globules rouges
PEL+ avec l’éluat final n’était peut-être pas assez longue. La période de temps pendant
laquelle l’agglutination se produit peut varier en fonction des anticorps et des antigènes
impliqués dans la réaction. Ainsi, l’incubation de 15 minutes à 37ºC n’était peut-être pas
suffisante pour permettre aux anti-PEL de se fixer à l’antigène. Aussi, le ratio entre le
nombre d'anticorps présents dans l’éluat et le nombre de sites antigéniques présents à la
surface des globules rouges sont tous les deux inconnus. Ainsi, il se peut que
l’agglutination n’ait pas pu avoir lieu ou qu’elle ait été tellement faible qu’elle n’a pas pu
être observée au microscope. En effet, le protocole demande de secouer légèrement les
tubes avant d’observer le résultat d’agglutination. Cependant, des globules rouges
agglutinés très faiblement auraient pu être séparés à la suite du mouvement des tubes.
L’intensité d’agglutination observée de 1+ est faible, considérant qu’un résultat de 3+ avait
été obtenu avec les mêmes échantillons cinq ans auparavant. Le résultat de 1+ peut aussi
s’expliquer par la durée de congélation des échantillons, soit douze ans et cinq ans. Même
si les échantillons sont congelés à -80ºC et que ces conditions sont propices à leur
conservation, la structure des anticorps du plasma a pu être altérée durant toutes ces
années. Ainsi, la spécificité de la liaison entre les anticorps anti-PEL et l’antigène peut être
diminuée, ce qui pourrait expliquer les résultats obtenus. Puisque ces échantillons de
55
plasma étaient les seuls échantillons disponibles, l’éluat final provenant de l’adsorption-
élution a quand même été utilisé comme anticorps primaire pour les immunobuvardages
de type Western.
4.2.3. Les immunobuvardages de type Western
Les immunobuvardages de type Western ont été effectués avec plusieurs préparations
biologiques contenant des anti-PEL. Ces dernières ont été utilisées comme anticorps
primaire.
Le premier anticorps primaire testé a été le plasma congelé provenant d’un individu PEL-.
Les deux échantillons de plasma disponibles ont été prélevés chez le même individu, mais
à des temps différents, soit en 2001 et en 2008. Les deux échantillons de plasma ont été
testés comme anticorps primaire et les résultats obtenus n’ont pas été satisfaisants. Bien
qu’il n’ait pas été possible de détecter un complexe immun, le bruit de fond présent sur les
films à la suite de la révélation était trop important pour tirer une conclusion. Bien qu’aucun
complexe immun n’ait été reconnu spécifiquement par les anti-PEL présents dans le
plasma, le bruit de fond était un obstacle majeur.
Le deuxième anticorps primaire testé a été les IgG totales purifiées du plasma par FPLC.
L’efficacité de la purification a été testée en cartes-gel. Comme le démontrent les résultats
obtenus, les IgG purifiées par FPLC avaient la même force d’agglutination que le plasma.
Finalement, les anticorps secondaires étaient tous couplés à une peroxydase, mais ils
différaient à reconnaître certaines parties des anticorps. Les parties reconnues étaient soit
les chaînes légère et lourde, le fragment Fc ou les fragments F(ab). L’utilisation d’une
gamme différente d’anticorps secondaire, en parallèle avec le même anticorps primaire,
donnait comme avantage de cibler la spécificité des anticorps anti-PEL lorsqu’ils étaient
fixés à l’antigène.
Les raisons pouvant expliquer le manque de résultats concluants sont multiples. Tout
d’abord, les plasmas contenant les anticorps anti-PEL avaient été congelés en 2001 et en
2008. Bien qu’ils aient été conservés à -80°C tout ce temps, il n’y a aucune information
56
disponible à propos du titre de l’anticorps. En fait, la proportion d’anticorps polyclonaux
anti-PEL présents dans le plasma est peut-être trop faible pour qu’il soit possible de
percevoir un signal lors des immunobuvardages.
4.2.4. Observation de l’expression des protéines CD55 et CD59 par
immunobuvardage de type Western
Dans le cas des protéines CD55 et CD59, celles qui ont été ciblées avec des anticorps
monoclonaux spécifiques, les résultats obtenus sont difficiles à interpréter. Les protéines
CD55 et CD59 avaient été identifiées lors des analyses en spectrométrie de masse.
L’absence de reconnaissance des deux protéines dans les échantillons de globules
rouges fantômes est surprenante[36]. En fait, bien que tous les globules rouges expriment
ces deux protéines, il est possible que leur structure tridimensionnelle ait été modifiée lors
de la préparation des globules rouges fantômes. L’anticorps anti-CD55 a été utilisé contre
les globules rouges fantômes selon un protocole déjà publié, donc il s’agissait d’un
anticorps qui avait déjà été testé avec ce type de cellules. D’une part, l’efficacité de
l’anticorps anti-CD55 a été confirmée en utilisant ce dernier pour cibler d’autres types de
cellules, par exemple des cellules HeLa, qui sont connues pour exprimer la protéine
CD55. D’autre part, l’anticorps anti-CD59 n’a pas été testé avec les autres types de
cellules. Les résultats obtenus lors des différents essais et le fait que la séquence codante
de l’ARNm de la protéine CD59 avait été analysée ont été la raison de l’abandon de la
mise au point des immunobuvardages ciblant cette protéine. Il en a été de même pour la
protéine CD55.
Plusieurs essais ont été effectués avec les deux anticorps et les résultats ont été les
mêmes à chaque fois. L’hypothèse la plus probable est que les globules rouges fantômes
aient subi d’importantes modifications au sein de leur membrane plasmique lors de leur
préparation, ce qui aurait entraîné plusieurs changements dans la structure de certaines
protéines membranaires, dont CD55 et CD59. En fait, la procédure implique plusieurs
inversions de la membrane, ce qui aurait pu entraîner l’exposition des protéines
membranaires du côté cytoplasmique.
57
4.2.5. Les immunoprécipitations avec et sans crosslinking
Tout d’abord, la première immunoprécipitation a été envisagée pour tenter d’isoler
l’antigène PEL. L’accès à des anticorps anti-PEL et des globules rouges PEL+ étaient les
réactifs nécessaires pour procéder à cette méthode. Bien que plusieurs protocoles soient
disponibles pour effectuer ce type d’expérience, celui décrit en conditions non
dénaturantes cadrait mieux dans ce projet. Ces conditions permettaient de préserver le
plus possible l’intégrité de l’antigène, ainsi que celle des anticorps.
Les résultats obtenus à la suite de l’analyse en spectrométrie de masse ont permis de
cibler une protéine en particulier, la flottilin-1. Malheureusement, la séquence de l’individu
PEL- ne différait en rien de la séquence normale. Ainsi, la flottilin-1 a pu être éliminée de
la liste des protéines candidates.
L’immunoprécipitation avec crosslinking a été envisagée dans le but de lier de manière
covalente les anticorps anti-PEL à l’antigène PEL. En fait, lors d’une immunoprécipitation
classique, lorsque la liaison antigène-anticorps n’est pas très solide, les lavages qui
précèdent l’élution finale peuvent faire décrocher l’antigène lié aux anticorps spécifiques,
qui eux sont liés au support utilisé, donc aux billes de protéine G dans ce cas-ci. Puisque
les liaisons covalentes sont plus puissantes que celles normalement impliquées dans les
liaisons antigène-anticorps, en créer une entre les anticorps PEL et l’antigène aurait dû
avoir comme effet d’augmenter les chances de capter l’antigène PEL lors de
l’immunoprécipitation, et ainsi de pouvoir le détecter lors des analyses subséquentes en
spectrométrie de masse. Les résultats obtenus à la suite de l’immunoprécipitation avec
crosslinking n’ont pas comblé les attentes. En fait, aucune protéine n’a été identifiée
comme étant susceptible d’être la base moléculaire de l’antigène PEL. Ces résultats
peuvent démontrer qu’une liaison covalente ne s’est pas formée entre les anticorps et
l’antigène. Sinon, ils peuvent laisser un indice à propos du fait que la base moléculaire de
l’antigène PEL n’est peut-être pas une protéine.
58
4.2.6. Les analyses en spectrométrie de masse
Dans la découverte de nouvelles protéines, la spectrométrie de masse s’avère souvent
l’étape ultime[46]. Dans le cadre de ce projet de recherche, cette technique a été utilisée
maintes fois. Puisque la spectrométrie de masse permet d’identifier une quantité
importante de protéines dans un seul échantillon et que certaines peuvent provenir de
contaminants, les protéines potentielles à porter l’antigène PEL devaient avoir une
composante membranaire et être exprimées à la surface des érythrocytes.
La spectrométrie de masse a été utilisée notamment lorsque des bandes susceptibles de
contenir l’antigène PEL ont été découpées dans les gels de polyacrylamide. Cette
approche a été la première à être employée. Il s’agissait de comparer les motifs de
migration des globules rouges fantômes PEL+ traités ou non à la ficine et les globules
rouges fantômes PEL-. Les bandes qui différaient dans l’un ou l’autre des échantillons
étaient découpées, puis envoyées en spectrométrie de masse pour identifier les protéines
qu’elles contenaient. Évidemment, cette technique a été la première à être employée
parce qu’elle est très limitée. Étant donné que la quantité de globules rouges fantômes
déposée sur gel était d’environ 20 μg, il est possible que, à cause de sa faible abondance,
que la protéine portant l’antigène PEL ne soit pas identifiable à l’œil nu. En fait, la quantité
de bandes qu’il est possible de voir sur un gel d’acrylamide est inférieure au nombre de
protéines totales contenues dans la membrane plasmique des globules rouges. De plus,
parce que les globules rouges fantômes sont des globules rouges dont la membrane est
percée à plusieurs endroits, les protéines exposées sur gel ne sont pas seulement des
protéines membranaires. En fait, lors de la préparation des globules rouges fantômes, les
trous faits dans la membrane plasmique pour évacuer l’hémoglobine des cellules amènent
l’inversion de la membrane plasmique à certains endroits, exposant ainsi des protéines
intracellulaires à la surface de la membrane[33]. Ces dernières sont considérées comme
des contaminants dans ce cas-ci, puisqu’il est impossible que l’une de ces protéines soit la
base moléculaire de l’antigène PEL. Ce propos découle du fait que les réactions antigène-
anticorps font intervenir seulement des protéines qui ont une composante extracellulaire.
Pour contrer cette limite et dans le but d’avoir une idée du protéome complet d’un globule
rouge transformé en globule rouge fantôme, des globules rouges fantômes PEL+ et PEL-
en solution ont été envoyés tels quels pour être analysés en spectrométrie de masse.
59
Aussi, les résultats des immunoprécipitations ont été envoyés intégralement en
spectrométrie de masse. Dans tous les cas sauf un, aucune protéine susceptible de porter
l’antigène PEL n’a été identifiée. Cependant, comme il a été mentionné précédemment,
l’analyse génomique de la flottilin-1 a permis de l’éliminer de la liste des protéines
candidates.
Finalement, les résultats non concluants obtenus en spectrométrie de masse sont peut-
être causés par le fait qu’avant qu’elles soient détectées par l’appareil, les protéines
contenues dans un échantillon doivent être coupées en peptides par l’action de la trypsine.
La trypsine est une enzyme qui clive les chaînes d’acides aminés après les résidus lysine
et arginine[47]. Puisqu’elle permet de former plusieurs peptides à partir d’une protéine, c’est
l’enzyme qui est la plus utilisée en spectrométrie de masse. Cependant, dans le cas de
l’antigène PEL, il est possible que ce dernier soit résistant au traitement enzymatique par
la trypsine. Notamment, c’est ce qui s’est produit lors de la découverte de la base
moléculaire de l’antigène Vel du groupe sanguin du même nom, la protéine SMIM1.
L. Arnaud et collaborateurs ont démontré que les peptides présents dans SMIM1 étaient
très résistants à la trypsine lors des analyses en spectrométrie de masse[48]. Ainsi, en
faisant digérer la protéine reconnue de manière spécifique par immunobuvardage avec la
chymotrypsine plutôt que la trypsine, ils ont obtenu des résultats concluants[48]. S’il s’avère
que c’est ce qui se produit avec l’antigène PEL, il est normal qu’aucun peptide n’ait été
détecté lors des analyses en spectrométrie de masse. Cependant, étant donné les coûts
de ces analyses et les résultats peu satisfaisants obtenus avec les autres enzymes selon
les spécialistes de la plate-forme, aucune autre enzyme que la trypsine n’a été testée
dans le cadre de ce projet.
4.2.7. Électrophorèses IEF
Dans le but d’identifier la base moléculaire de l’antigène PEL, d’autres méthodes de
protéomique ont été testées. Les résultats obtenus à la suite de ces méthodes ne sont pas
présentés dans les résultats.
60
À la suite des électrophorèses SDS-PAGE et de l’envoi de bandes de gels en
spectrométrie de masse, des électrophorèses IEF ont été tentées. Cette méthode permet
de séparer les protéines selon leur point isoélectrique. Dans le cadre de ce projet, la
migration des globules rouges fantômes à travers le gel n’était pas optimale et de plus, il
n’était pas possible de tirer une quelconque conclusion quant aux résultats obtenus.
L’électrophorèse IEF est plus efficace lorsque les échantillons à séparer sont des
protéines purifiées. Dans ce cas-ci, puisque le but était d’identifier la base moléculaire de
l’antigène PEL, il n’était pas possible d’utiliser des échantillons qui avaient un taux de
pureté aussi élevé. Puisque les résultats obtenus n’étaient pas concluants, les
électrophorèses IEF ont été abandonnées après quelques tentatives.
4.2.8. Électrophorèses en deux dimensions (2D)
L’électrophorèse en deux dimensions est en fait deux électrophorèses effectuées l’une à
la suite de l’autre. Il s’agit d’une électrophorèse IEF suivie d’une électrophorèse SDS-
PAGE. Donc, tout comme les deux méthodes employées séparément, l’électrophorèse en
2D permet de séparer les protéines, d’une part selon leur point isoélectrique et d’autre
part, selon leur masse moléculaire. Contrairement aux deux électrophorèses effectuées
séparément, cette méthode permet la visualisation d’une plus grande quantité de
protéines sur un seul gel. Cependant, comme le nombre de protéines présentes au sein
du protéome du globule rouge a été chiffré à 2289 récemment, il demeure impossible de
toutes les voir sur un seul gel[49]. Malgré ce fait, l’électrophorèse en 2D est, à ce jour,
encore utilisée pour visualiser en entier le protéome des globules rouges[40, 46].
Dans le cadre de ce projet de recherche, quelques tentatives infructueuses ont été faites.
L’équipement disponible pour effectuer les gels 2D a été le principal obstacle à l’obtention
de résultats concluants. La première électrophorèse, l’IEF, était effectuée dans des
capillaires de gel. Ensuite, ces capillaires devaient être coupés aux extrémités pour que
les carottes de gel puissent migrer dans le puits du gel d’électrophorèse SDS-PAGE.
Cette méthode n’est plus la méthode employée. Maintenant, les électrophorèses en 2D
sont faites en bandes, de manière à ce qu’aucune protéine ne soit perdue lors du
changement de type d’électrophorèse.
61
5. Conclusion
Bien que la base moléculaire de l’antigène PEL n’ait pas été élucidée, ces travaux de
maîtrise ont permis de toucher à un grand nombre de méthodes d’analyses différentes,
que ce soit en biochimie, en biologie moléculaire ou en protéomique. Étant donné les
types d’échantillons PEL- disponibles et leur nombre, des études génomiques, effectuées
en parallèle de nouvelles études protéomiques, restent la voie à suivre pour découvrir la
base moléculaire de l’antigène PEL. Actuellement, l’obstacle principal à cette découverte
est l’absence d’un anticorps monoclonal spécifique à l’antigène PEL. La création de cet
anticorps nécessiterait d’abord l’isolement de plasmocytes qui sécrètent l’antigène PEL
chez un individu PEL-. Cependant, dans le cadre de ce projet de maîtrise, l’accès à ces
cellules était impossible et le temps alloué était un facteur limitant.
Au final, la découverte de la base moléculaire de l’antigène PEL pourrait permettre le
développement d’un test de génotypage sanguin automatisé et l’élaboration d’une banque
de donneurs PEL-, qui sont répertoriés au nombre d’environ dix à ce jour au Québec. De
ce fait, les individus connus comme étant PEL- doivent faire des dons autologues pour
être en mesure d’être transfusé éventuellement.
L’analyse des séquences codantes des divers ARNm a permis, du moins en ce qui a trait
aux protéines déjà liées à un groupe sanguin, d’éliminer plusieurs d’entre elles qui étaient
candidates à porter l’antigène PEL. Cependant, les analyses génomiques effectuées dans
le cadre de ce projet ne sont que la pointe de l’iceberg, étant donné que certaines
mutations peuvent se trouver aussi bien dans les promoteurs des gènes que dans les
introns. De plus, certaines protéines subissent des modifications post-traductionnelles.
Outre toutes les modifications possibles d’une protéine déjà associée à un groupe
sanguin, il est aussi probable que l’antigène PEL soit porté par une protéine membranaire
qui est totalement inconnue à ce jour.
Les résultats obtenus tout au long de ce projet de maîtrise démontrent la difficulté
d’effectuer des études protéomiques, en particulier lorsque très peu de renseignements
sont disponibles à propos de la molécule recherchée, qui était, selon l’hypothèse, une
protéine dans ce cas-ci.
62
Plusieurs méthodes différentes ont été testées, mais toujours avec les mêmes échantillons
et il n’a pas été possible d’identifier un quelconque complexe immun et ce, avec tous les
échantillons biologiques disponibles contenant des anticorps anti-PEL. Il serait primordial
de reprendre les immunobuvardages de type Western avec comme anticorps primaire,
des IgG totales purifiées du plasma d’un individu qui montre un titre d’anticorps élevé par
rapport aux anticorps anti-PEL. Aussi, la mise au point de la technique qui permet de
visualiser la liaison de l’antigène PEL avec les anticorps anti-PEL en cytométrie en flux
pourrait permettre d’identifier l’isotype d’immunoglobuline des anticorps. Cependant, la
création d’un anticorps monoclonal serait ce qui permettrait d’obtenir le plus d’indices par
rapport à ce qu’est la base moléculaire de l’antigène PEL.
Finalement, la découverte de la base moléculaire des antigènes érythrocytaires sera
toujours d’une importance capitale en médecine transfusionnelle puisqu’elle est à la base
du génotypage sanguin. En constante évolution depuis quelques années, cette méthode
permet entre autres d’expliquer plusieurs cas complexes rencontrés en sérologie
érythrocytaire. De plus, le génotypage de masse permet d’identifier les variants au sein
des différentes populations et de créer des banques de donneurs de sang rare. Ainsi, il
devient possible de fournir efficacement les diverses populations qui, partout dans le
monde, sont de plus en plus multiculturelles.
63
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66
Annexe I
Tableau A.1. : Paramètres utilisés pour l'amplification RT-PCR des ARNm des protéines ciblées.
Tm des amorces Amorce sens Amorce anti-sens Taille du fragment
(°C) 5'→3' 5'→3' (pb)
Aquaporine -1 Colton CO 1* 55 AGCATGGCCAGCGAGTTCAA GTGTCTACAGTATGGATTTCAC 897
1 55 ATGGAGGAGCTGCAGGATGA GGATGAGCCAGAAGCCGATC 1494
2 55 CATCTACTTTGCTGCACTGT ATGGCCACTTCGTCGTATTC 1474
CD47 CD47 1 60 GTCCTGCCTGTAACGGCGGC CCCCAACAGTGAATCATCAAGGCCA 972
CD55 Cromer CROM 1 57 CCACGAGGCTTCTGCTTACT ATGTGATTCCAGGACTGCCTT 1429
CD59 CD59 1 57 GAGGCTGGAAGAGGATCTTGG GCTGCAGAGAACCCACTCAA 908
CD147 (Oka) OK OK 1 61 AATCATGGCGGCTGCGCTGT GTGCTGCCCGCTGCTCTTCA 769
1 59 TTTCCTGGACCCCAGTCCTCC GTCTGAGGGGACCAGTCCCTG 588
2* 59 AGATAGACAGATGGAAGGTG CTGTGGCATCTTTGGTAACC 2232
Ce RH RHCE 1 65/60† CACAGGATGAGCTCTAAGTAC CAAATCTGTCTCTGACCTTGTTTC 1398
D RH RHD 1 55 CACAGGATGAGCTCTAAGTAC TAAATGGTGAGATTCTCCTC 1446
ERMAP Scianna SC 1 63,5 ATGCGCTTGCCTGCTCCCTG GGTTGGGCCAGGCGACTGAA 1611
FLOT-1 FLOT1 1 57 AGGAAAGCTGGTCTGCGAG CCCCTTCAAGACAAGGCACA 1558
1 55 CAATGCATCGCCGGAGACTGG[50] GGTCAGCTCCTCAGGCAGCTG[50] 1046
2 59 GCGAGGGGACAGCCTCATCCG GACAGGGCTGGTCTGCACGC 1202
GLUT-1 SLC2A1 1 55 AGCCCAGCAGCAAGAAGCTG TGCTCCTGAGAGATCCTTAG 1533
Glycophorine A MNS GYPA 1 54 CTCATGATCTCAGGATGTAT TGCTCCTGAGAGATCCTTAG 482
Glycophorine B MNS GYPB 1 64/55† CTCATGATCTCAGGATGTAT AAGATCAGGCAGCATGCAG 276
RhAG RHAG RHAG 1 60 GCCTGTGAAGCTCTCAGTGTGCC GGTTCCAGCTGGCTGTGGTCA 1298
SLC14A1 Kidd SLC14A1 1 64 CCACTGCCTTCTGCTGCCAGG GGGAGGGTGAAGACGGGGAGG 816
XK Kx XK 1 55 TTCGTGGCCGAGACAACGGC GTGATGCCTTGGGTTGCCCC 1511
SMIM1 Vel SMIM1 1 62 GGAATTCTCGCTTGGTCCC AGAGAGGAGGCTGTAGCTG 1155
*Le fragment a nécessité une PCR supplémentaire.†Contraitement aux autres qui ont 40 cycles pour chaque température, la première température est pendant 10 cycles et la deuxième, 30 cycles.
CD238 Kell KEL
GBGT1 Forssman GBGT1
Protéine Groupe sanguin Gène Fragment(s)
Bande 3 Diego DI
67
Tableau A.2. : SNP identifiés à la suite du séquençage des ARNm de différentes protéines membranaires érythrocytaires.
Position Base* A.a. codé(s) Commentaire Position Base* A.a. codé(s) Commentaire Position Base* A.a. codé(s) Commentaire
Colton Aquaporine-1 494 G/G (Ho) Gly 494 G/G (Ho) Glycine 494 G/A (Hé) Gly/Asp
Kx Kx x x x I.S.N. x x x I.S.N. x x x s/o
Kidd Jk 475 A/A (Ho) Ile N.R. 475 A/G (Hé) Ile/Val N.R. 475 A/A (Ho) Ile N.R.
568 G/G (Ho) Ala N.R. 568 G/T (Hé) Ala/Ser N.R. 568 G/G (Ho) Ala N.R.
588 A/G (Ho) Pro 588 A/G (Ho) Pro 588 A/G (Hé) Pro
688 G/G (Ho) Val N.R. 688 G/T (Hé) Val/Phe N.R. 688 G/G (Ho) Val N.R.
838 G/A (Hé) Asp/Asn 838 G/A (Ho) Asp/Asn 838 G/A (Hé) Asp/Asn
MNS GYPA 38 A/C (Ho) Glu/Ala N.R. 38 A/C (Ho) Glu/Ala N.R. 38 A/C (Ho) Glu/Ala N.R.
59 T/C (Hé) Leu/Ser 59 T/T (Ho) Leu 59 T/C (Hé) Leu/Ser
71 A/G (Hé) Glu/Gly 71 A/A (Ho) Glu 71 A/G (Hé) Glu/Gly
72 G/T (Hé) Glu/Asp 72 G/G (Ho) Glu 72 G/T (Hé) Glu/Asp
93 T/C (Ho) Thr N.R. 93 T/C (Ho) Thr N.R. 93 T/C (Ho) Thr N.R.
GYPB 143 C/T (Hé) Thr/Met 143 C/C (Ho) Thr 143 C/T (Hé) Thr/Met
251 C/G (Hé) Thr/Ser 251 C/G (Ho) Ser 251 C/G (Hé) Thr/Ser
Ok Oka 195 C/C (Ho) Asp 195 C/T (Hé) Asp N.R. 195 C/T (Hé) Asp N.R.
234 C/C (Ho) Ser 234 C/G (Hé) Ser N.R. 234 C/G (Hé) Ser N.R.
327 T/C (Hé) Ala 327 T/T (Ho) Ala 327 T/T (Ho) Ala
537 T/T (Ho) Asp 537 T/C (Ho) Asp N.R. 537 T/C (Ho) Asp N.R.
684 C/T (Hé) Ile 684 C/C (Ho) Ile 684 C/C (Ho) Ile
Rh CE x x x s/o 676 G/C (Hé) Ala/Pro x x x s/o
D 907 C/T (Hé) Leu
x CD47 100 A/G (Ho) Asn/Asp x x x I.S.N. x x x s/o
899 A/G (Ho) Gln/Arg
RhAG RhAG x x x I.S.N. x x x I.S.N. x x x s/o
Scianna ERMAP 54 C/C (Ho) Leu 54 C/T (Hé) Leu 54 C/C (Ho) Leu
76 C/C (Ho) His 76 C/T (Hé) His/Tyr 76 C/C (Ho) His
587 A/A (Ho) Asn 587 A/A (Ho) Asn 587 A/A (Ho) Asn
600 C/G (Ho) Asp/Glu N.R. 600 C/C (Ho) Asp 600 C/C (Ho) Asp
Cromer CD55 x x x I.S.N. x x x I.S.N. x x x s/o
x CD59 x x x I.S.N. x x x I.S.N. x x x s/o
x FLOT1 x x x I.S.N. x x x I.S.N. x x x s/o
Vel SMIM1 x x x I.S.N. x x x I.S.N. x x x s/o
Légende
A : adénine C : cytosine GYPA : glycophorine A Ile : isoleucine Phe : phénylalanine Thr : thréonine
Ala : alanine G : guanine GYPB : glycophorine B I.S.N. : identique à la séquence normale Pro : proline Tyr : tyrosine
Asn : asparagine Gln : glutamine Hé : hétérozygote Leu : leucine Ser : sérine Val : valine
Asp : aspartate Glu : glutamate His : histidine Met : méthionine s/o : messager non séquencé
A.R. : à reprendre Gly : glycine Ho : homozygote N.R. : non rapporté dans la littérature T : thymine
Individu contrôle (PEL+) Individu 2 (PEL-) Individu 3 (PEL-)Système sanguin Protéine