HASIL DAN PEMBAHASANIdentifikasi Bakteri dengan Pewarnaan.

Jenis-jenis pewarnaan pada kuman.Pewarnaan yang dilakukan pada kuman banyak ragam dan jenisnya. Selama ini dikenal lima macam proses pewarnaan, yaitu sebagai berikut :1. Pewarnaan negative

- Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang.- Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta.Cara pewarnaan negatif :

Sediaan hapus teteskan emersi lihat dimikroskop

Metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

2. Pewarnaan sederhana- Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)- Tujuan hanya untuk melihat bentuk selPewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).

3. Pewarnaan Tahan AsamPewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat Alkohol-asam, dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses sehingga menghasilkan warna merah.

4. Pewarnaan structural / khusus- Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri kapsul, spora, flagel dll

a. Pewarnaan kapsulPewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.

b. Pewarnaan sporaDinding spora relative tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat.

c. Pewarnaan flagelPewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

d. Pewarnaan nucleoidPewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA.

5. Pewarnaan diferensial- Menggunakan lebih dari satu macam zat warna- Tujuan untuk membedakan antar bakteri- Contoh: Pewarnaan Gram, Pewarnaan Bakteri Tahan AsamTujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.

Langkah-langkah Pembuatan Preparat Oles dan Teknik Pewarnaan Pada Kuman.

Teknik pewarnaan kuman yang kami lakukan pada praktikum ini adalah teknik pewarnaan sederhana dan teknik pewarnaan gram. Untuk teknik pewarnaan sederhana bertujuan untuk melihat morfologi dari bakteri, baik itu bentuk koloninya maupun bentuk individunya. Langkah pertama yang harus dilakukan adalah menyiapkan preparat olesan dari bakteri. Preparat yang akan diolesi bakteri ini di fiksasi dulu sebanyak 3 kali dengan api untuk menghilangkan kuman dan lemak di preparat baru kemudian di lap dengan tissue. Bakteri yang digunakan adalah bakteri B. subtilis, E. coli, dan St. Aureus. Bakteri-bakteri ini dioleskan pada bagian oval preparat, yang sebelumnya sudah ditandai dengan sepidol, penandaan bagian oval ini untuk membantu meletakkan olesan mikroba dengan tepat. Sebelum preparat dioleskan bakteri, preparat diolesi terlebih dahulu dengan NaCl steril, tujuannya karena NaCl steril merupakan garam fisiologi dari bakteri.

Langkah selanjutnya adalah menggenangi olesan bakteri pada preparat tersebut dengan zat warnakristal violet atau biru metilenselama 1-2 menit. Kemudian preparat dimiringkan dan dibilas dengan air hinggazat warna hilang atau sedikit sekali. Selanjutnya adalah keringkan air pada permukaan preparat dengan kertas serap lalu amati morfologi bakteri pada masing-masing preparat di bawah mikroskop.Selain teknik pewarnaan sederhana, kami juga melakukan teknik pewarnaan gram, teknik ini bertujuan untuk mengidentifikasi suatu bakteri apakah dia termasuk ke dalam bakteri gram negatif atau bakteri gram positif. Langkah-langkah dalam pewarnaan ini hampir sama dengan langkah pada pewarnaan sederhana yakni membuat preparat oles dari ketiga bakteri diatas. Bedanya adalah pada beberapa reagen yang ditambahkan. Pertama, bakteri pada preparat ditetesi kristal violet selama 1 menit. Lalu kelebihan kristal violetdibuang dengan memiringkan kaca objek dan bilas dengan air mengalir secara perlahan. Preparat ditiriskan, lalu diberi larutan iodium gram selama 2 menit, kelebihan iodium dibuang dengan memiringkan kaca objek lalu dibilas dengan air seperti kristal violet. Langkah selanjutnya adalah preparat dicuci dengan etanol 95% setetes demi setetes selama 30 detik atau sampai zat ungu kristal tidak tampak lagi mengalir dari preparat, setelah dirasa warna menghilang cuci perlahan lalu tiriskan. Terakhir adalah dengan menambahkan pewarna safranin selama 30 detik pada preparat, kemudian kelebihan safranin dibuang dan dibilas dengan air. Preparat yang masih basah ditiriskan dan diserap dengan menekankan kertas serap disekitarnya.Amati preparat olesan bakteri yang sudah diwarnai tersebut di bawah mikroskop.

Jadi, dapat disimpulkan bahwa bahan-bahan pereaksi yang digunakan dalam pewarnaan gram adalah : Zat warna utama (violet kristal) Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan untuk melunturkan zat warna utama. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.Perbedaan dari bakteri gram negatif dengan bakteri gram positif.

Seperti yang kita ketahui bakteri dibagi menjadi bakteri gram negatif dan bakteri gram positif, pembagian atas keduanya didasarkan pada beberapa perbedaan, berikut perbedaan bakteri gram negatif dan bakteri gram positif :

Ciri-ciri bakteri gram negative :-Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer-Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat dalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit dan tidak mengandung asam laktat.-Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.-Tidak resisten terhadap gangguan fisik

Ciri-ciri bakteri gram positif :- Struktur dindingnya tebal- Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal- Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin- Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit- Lebih resisten terhadap gangguan fisik. Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

SifatBakteri gram positif (+)Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding selKandungan lipid rendah (1-4%)Kandungan lipid tinggi

Ketahanan terhadap penisilinLebih sensitifLebih tahan

Penghambatan oleh pewarna basa (VK)Lebih dihambatKurang dihambat

Kebutuhan nutrisiKebanyakan spesies relatif kompleksRelatif sederhana

Ketahanaa terhadap perlakuan fisikLebih tahanKurang tahan

Berdasarkan hasil pengamatan dibawah mikroskop, untuk bakteri yang termasuk gram positif akan terlihat berwarna ungu, dimana warna ungu ini sendiri merupaka warna dari kristal violet yang sebelumnya diteteskan, warna ini melekat dengan kuat karena peptidoglikan dari bakteri gram positif tebal. Sedangkan untuk bakteri gram negatif akan terlihat warna merah, dimana warna merah ini merupakan warna dari pewarna safranin yang diteteskan terakhir kali, warna ini melekat dan warna ungu sama sekali tidak terlihat karena peptidoglikan dari bakteri gram negatif relatif tipis sehingga ia tidak mampu mempertahankan warna ungu layaknya bakteri gram positif.