IDENTIFIKASI GEN SITOKROM B (Cyt b) BABI HUTAN PADA
KORNET SAPI DI YOGYAKARTA DENGAN METODE POLYMERASE
CHAIN REACTION
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Laurensia Kusumaningtyas Theodorus
NIM: 178114026
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2021
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
IDENTIFIKASI GEN SITOKROM B (Cyt b) BABI HUTAN PADA
KORNET SAPI DI YOGYAKARTA DENGAN METODE POLYMERASE
CHAIN REACTION
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Laurensia Kusumaningtyas Theodorus
NIM: 178114026
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2021
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
Persetujuan Pembimbing
IDENTIFIKASI GEN SITOKROM B (Cyt b) BABI HUTAN PADA
KORNET SAPI DI YOGYAKARTA DENGAN METODE POLYMERASE
CHAIN REACTION
Skripsi yang diajukan oleh :
Laurensia Kusumaningtyas Theodorus
NIM : 178114026
telah disetujui oleh
Pembimbing Utama
(Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc.) 15 Juni 2021
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
Pengesahan Skripsi Berjudul
IDENTIFIKASI GEN SITOKROM B (Cyt b) BABI HUTAN PADA
KORNET SAPI DI YOGYAKARTA DENGAN METODE POLYMERASE
CHAIN REACTION
Oleh :
Laurensia Kusumaningtyas Theodorus
178114026
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Pada tanggal: 15 Juli 2021
Mengetahui
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Dekan
(Dr. apt. Yustina Sri Hartini)
Panitia Penguji Tanda Tangan
1. Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. ……………...
2. Dr. apt. Christine Patramurti ……………...
3. Dr. Jeffry Julianus, M.Si. ……………...
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini
tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan
dalam kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana
layaknya karya ilmiah.
Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah
ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-
undangan yang berlaku.
Yogyakarta, 15 Juni 2021
Penulis
(Laurensia Kusumaningtyas Theodorus)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :
Nama : Laurensia Kusumaningtyas Theodorus
Nomor Mahasiswa : 178114026
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
“Identifikasi Gen Sitokrom b (Cyt b) Babi Hutan Pada Kornet Sapi Di
Yogyakarta Dengan Metode Polymerase Chain Reaction”
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-
ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,
mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media
lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun
memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai
penulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : 23 Juli 2021
Yang menyatakan
(Laurensia Kusumaningtyas Theodorus)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
ABSTRAK
Daging babi hutan merupakan bahan pangan hewani yang diharamkan
bagi umat muslim dan menjadi masalah di Negara Indonesia karena dicampur
dengan daging sapi khususnya dalam suatu produk olahan daging sapi seperti
kornet. Hal ini bermasalah karena produk olahan tersebut tidak dapat dibedakan
secara makroskopis. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi ada atau
tidaknya kandungan babi hutan menggunakan marker sitokrom b DNA
Mitokondria pada produk kornet sapi di Yogyakarta dengan metode Polymerase
Chain Reaction (PCR). PCR merupakan teknik amplifikasi potongan DNA
(Deoxyribonucleic Acid) yang diinginkan secara in vitro pada daerah spesifik
yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida dengan bantuan enzim
polymerase.
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif kualitatif dengan teknik
purposive sampling. Isolasi DNA dilakukan pada subyek uji yakni 5 sampel
produk kornet sapi dengan merk berbeda yang diperoleh dari supermarket wilayah
Yogyakarta. Analisis produk PCR menggunakan teknik elektroforesis. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa proses amplifikasi tidak terjadi pada fragmen
DNA berukuran 398 bp pada lima sampel kornet sapi sehingga dapat disimpulkan
bahwa kandungan gen sitokrom b babi hutan (Sus scrofa) tidak teridentifikasi
pada kelima sampel kornet sapi yang diperoleh dari supermarket wilayah
Yogyakarta.
Kata kunci : kornet sapi, DNA Mitokondria, sitokrom b, PCR, elektroforesis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
ABSTRACT
Wild boar meat is an animal food that is prohibited by Muslims and is a
problem in Indonesia because it is mixed with beef, especially in processed beef
products such as corned beef. This is problematic because the processed product
cannot be differentiated macroscopically. This study aims to identify the presence
or absence of wild boar using Mitochondrial DNA cytochrome b markers in
corned beef products in Yogyakarta with the Polymerase Chain Reaction (PCR)
method. PCR is a technique of amplification of the desired DNA
(Deoxyribonucleic Acid) fragments in vitro in a specific area that is bounded by
two oligonucleotide primers with the help of polymerase enzyme.
This research is a qualitative descriptive study with purposive sampling
technique. DNA isolation was carried out on test subjects, namely 5 samples of
corned beef products with different brands obtained from supermarkets in
Yogyakarta area. Analysis of PCR products using electrophoresis techniques. The
results showed that the amplification process did not occur in the 398 bp DNA
fragment in five samples of corned beef, so it could prove that the content of the
cytochrome b gene of wild boar (Sus scrofa) was not identified in five samples of
corned beef obtained from supermarkets in Yogyakarta.
Keywords : corned beef, Mitochondrial DNA, cytochrome b, PCR, electrophoresis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
DAFTAR ISI
HALAMAN COVER ............................................................................................ i
HALAMAN JUDUL ........................................................................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................... iii
HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................... v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN ..................................................... vi
ABSTRAK ........................................................................................................ vii
ABSTRACT ....................................................................................................... viii
DAFTAR ISI ...................................................................................................... ix
DAFTAR TABEL .............................................................................................. xi
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xii
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xiii
BAB I .................................................................................................................. 1
A. Latar Belakang .......................................................................................... 1
B. Rumusan Masalah ..................................................................................... 3
C. Keaslian Penelitian .................................................................................... 3
D. Tujuan Penelitian ...................................................................................... 4
E. Manfaat Penelitian .................................................................................... 4
BAB II ................................................................................................................. 5
A. Kornet ....................................................................................................... 5
B. Babi hutan (Sus scrofa) ............................................................................. 5
C. DNA Mitokondria ..................................................................................... 6
D. Gen Sitokrom b ......................................................................................... 7
E. Polymerase Chain Reaction (PCR) ............................................................ 8
F. Landasan Teori ........................................................................................ 10
G. Hipotesis ................................................................................................. 11
BAB III.............................................................................................................. 12
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ............................................................... 12
B. Variabel dan Definisi Operasional ........................................................... 12
C. Bahan penelitian ...................................................................................... 13
D. Alat Penelitian ......................................................................................... 14
E. Tata Cara Penelitian ................................................................................ 14
F. Analisis Hasil .......................................................................................... 18
BAB IV ............................................................................................................. 19
A. Optimasi Preparasi Sampel ...................................................................... 19
B. Isolasi DNA ............................................................................................ 20
C. Analisis Kualitatif Isolat DNA................................................................. 22
D. Identifikasi Gen Sitokrom b..................................................................... 23
E. Analisis Produk PCR ............................................................................... 27
BAB V ............................................................................................................... 31
A. Kesimpulan ............................................................................................. 31
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
B. Saran ....................................................................................................... 31
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 32
LAMPIRAN ...................................................................................................... 36
BIOGRAFI PENULIS ....................................................................................... 48
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR TABEL
Tabel I. Kondisi PCR ......................................................................................... 17
Tabel II. Fragmen DNA hasil produk PCR ......................................................... 28
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur DNA Mitokondria (Butler, 2005) .......................................... 7
Gambar 2. Wilayah Target Gen Sitokrom b Babi Hutan (NCBI, 2013) ................. 8
Gambar 3. Hasil Elektroforesis Isolat DNA Sampel Tanpa Perlakuan ................ 20
Gambar 4. Hasil Elektroforesis Isolat DNA Sampel dengan Perlakuan ............... 20
Gambar 5. Wilayah Target Gen Sitokrom b Sapi (NCBI, 2009) ......................... 24
Gambar 6. Hasil Optimasi Suhu Annealing Produk PCR Kontrol Daging Babi .. 26
Gambar 7. Hasil Optimasi Suhu Annealing Produk PCR Kontrol Daging Sapi ... 26
Gambar 8. Hasil Analisis Kualitatif Produk PCR dengan Primer Reverse Sapi ... 27
Gambar 9. Hasil Analisis Kualitatif Produk PCR dengan Primer Reverse Babi .. 28
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Perhitungan Jumlah Sampel ........................................................... 37
Lampiran 2. Hasil elektroforesis isolat DNA ...................................................... 38
Lampiran 3. Hasil elektroforesis Produk PCR .................................................... 39
Lampiran 4. Informasi Pemakaian FavorPrep™ ................................................. 40
Lampiran 5. Informasi Produk DNA Ladder ...................................................... 43
Lampiran 6. Informasi Produk Nucleic Acid Gel Stain ....................................... 45
Lampiran 7. Pemakaian ExelTaq™ PCR Master Dye Mix ................................. 46
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Indonesia merupakan negara dengan mayoritas penduduknya beragama
Islam dan kehalalan adalah persyaratan mutlak bagi setiap muslim untuk
mengkonsumsi makanan (Zulfahmi, 2015). Menurut Undang-Undang Republik
Indonesia Nomor 33 Tahun 2014 Pasal 17 dan 18 dinyatakan bahwa dalam Proses
Produk Halal (PPH) bahan baku, bahan olahan, bahan tambahan, dan bahan
penolong yang berasal dari bangkai, darah dan babi diharamkan atau dilarang
untuk dikonsumsi umat Islam. Dengan demikian, seluruh produk pangan yang
mengandung unsur babi di dalamnya diharamkan dalam Islam untuk dimakan,
padahal sejumlah produk makanan berbahan dasar daging ditemukan tercampur
dengan daging babi, terutama pada makanan olahan daging sapi seperti kornet
(Puspitasari dkk., 2019). Kandungan daging babi pada produk olahan seperti
kornet menjadi susah karena tidak dapat dibedakan secara makroskopis
(Andriyani dkk., 2019). Hal ini terjadi karena sering kali produk olahan tersebut
sudah dihancurkan dan dicampur dengan berbagai bahan lain (Puspitasari dkk.,
2019).
Menurut Fibriana dkk. (2012) kasus makanan berbahan dasar daging
dicampur dengan babi marak terjadi di Indonesia sejak tahun 80-an sampai
sekarang. Pencampuran daging babi tersebut bertujuan untuk menurunkan harga
produksi menjadi relatif lebih murah dibandingkan jika menggunakan bahan
daging sapi asli. Penggantian daging sapi dengan daging babi sebagai bahan dasar
atau bahan tambahan tersebut sebagian besar tidak diinformasikan kepada
konsumen. Oleh karena itu, deteksi cemaran babi pada produk makanan perlu
dilakukan untuk melindungi konsumen (Puspitasari dkk., 2019). Salah satu jenis
metode pendeteksian yang umum dilakukan dalam mendeteksi komponen babi
dan turunannya adalah metode berbasis DNA yaitu PCR (Polymerase Chain
Reaction) (Fadhlurrahman dkk., 2015) baik konvensional PCR, Multipleks PCR,
maupun yang terbaru adalah Real Time PCR (Rachmawati dkk., 2018).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
Penelitian yang dilakukan (Wijaya dkk., 2018) menemukan bahwa tiga
merk kornet sapi yang diperoleh dari supermarket di sekitar wilayah Kedungmudu
negatif mengandung babi menggunakan PCR. Berikutnya, ada pula penelitian
yang dilakukan (Rahayu dkk., 2020) yaitu satu produk kornet sapi dan satu
dendeng dari total empat sampel (dua produk kornet sapi dan dua produk
dendeng) diperoleh dari market ditemukan mengandung babi hutan dilihat dari
nilai Ct (threshold cycle) dibawah 30 menggunakan Real Time PCR. Teknik PCR
dipilih sebagai alat identifikasi karena mempunyai akurasi tinggi dalam
mendeteksi ada tidaknya campuran daging babi dalam daging segar maupun
produk daging olahan (Wardani and Sari, 2015).
PCR merupakan teknik amplifikasi potongan DNA yang diinginkan
secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer
oligonukleotida dengan bantuan enzim polymerase (Wardani and Sari, 2015).
Penggunaan DNA mitokondria (mtDNA) dalam analisis PCR dapat meningkatkan
sensitivitas karena setiap sel memiliki sekitar seribu mitokondria dan setiap
mitokondria memiliki sepuluh salinan DNA (Jain dkk., 2007). Gen-gen yang
paling sering digunakan sebagai penanda jenis hewan atau daging diantaranya
adalah sitokrom b (cyt b), 12S dan 16S subunit ribosom RNA dan daerah
displacement loop (D-loop). Gen sitokrom b yang dipilih pada penelitian ini
karena gen sitokrom b dapat digunakan untuk membedakan material yang berasal
dari jenis hewan yang berbeda. Kekhasan dari gen sitokrom b diantaranya yaitu
adanya daerah yang hampir sama untuk semua jenis hewan tetapi juga terdapat
daerah yang spesifik untuk setiap jenis hewan. Kedua daerah tersebut berada
dalam satu gen sehingga dalam penggunaannya untuk membedakan beberapa
jenis hewan relatif lebih akurat (Primasari, 2011). Hal ini yang membuat peneliti
tertarik untuk melakukan penelitian tentang identifikasi gen sitokrom b babi hutan
(Sus scrofa) pada kornet sapi di Yogyakarta dengan metode Polymerase Chain
Reaction.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
B. Rumusan Masalah
Apakah terdapat kandungan gen sitokrom b babi hutan (Sus scrofa) pada
produk kornet sapi di Yogyakarta dengan metode Polymerase Chain Reaction
(PCR)?
C. Keaslian Penelitian
Terdapat beberapa penelitian terkait kandungan gen sitokrom b babi
hutan (Sus scrofa) dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) yang telah
dilakukan para peneliti sebelumnya, yakni sebagai berikut :
1) Penelitian yang dilakukan oleh Fitrilia dkk. (2017) dengan judul “Deteksi
Kandungan Gen Sitokrom b (Cyt b) Babi pada Bakso yang Beredar di Kota
Jambi Menggunakan Teknik Polymerase Chain Reaction”. Penelitian ini
bertujuan untuk mendeteksi adanya kandungan gen sitokrom b babi bakso
yang beredar di kota Jambi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sampel
bakso yang beredar di Kota Jambi yang dideteksi menggunakan teknik
Polymerase Chain Reaction tidak ditemukan gen sitokrom b sebagai penanda
gen babi.
2) Penelitian yang dilakukan oleh Wijaya dkk. (2018) dengan judul “Deteksi
Daging Babi Pada Tiga Merk Kornet Sapi Berdasarkan Gen Cytochrome b
dengan Metode PCR”. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi
campuran daging babi pada tiga macam merk kornet sapi berdasarkan primer
spesifik P14. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tiga merk kornet sapi yang
diperoleh dari supermarket di sekitar wilayah Kedungmudu negatif
mengandung babi.
Berdasarkan hasil penelusuran pustaka, penelitian mengenai identifikasi
gen sitokrom b babi hutan pada produk kornet sapi di Yogyakarta dengan metode
Polymerase Chain Reaction (PCR) belum pernah dilakukan. Penelitian ini
berbeda dari penelitian sebelumnya dalam hal subyek penelitian dan tempat
pengambilan sampel.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
D. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi kandungan gen
sitokrom b babi hutan (Sus scrofa) pada produk kornet sapi di Daerah Istimewa
Yogyakarta dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR).
E. Manfaat Penelitian
1. Manfaat Teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tambahan dan
memperkaya pengetahuan ilmiah terutama di bidang kefarmasian tentang
identifikasi gen sitokrom b babi hutan pada produk kornet sapi di Daerah
Istimewa Yogyakarta dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR).
2. Manfaat Praktis
Penelitian ini diharapkan dapat menjadi bahan referensi bagi praktek
kefarmasian untuk mencegah kandungan gen sitokrom b babi hutan pada produk
olahan daging sehingga tetap aman untuk dikonsumsi masyarakat tertentu yang
memiliki pantangan terhadap daging babi. Selain itu, penelitian ini diharapkan
dapat menjadi pertimbangan bagi penelitian selanjutnya, baik dari segi variabel,
metode dan subyek penelitian yang digunakan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Kornet
Corned Beef atau Kornet adalah salah satu jenis produk olahan daging
sapi yang banyak digunakan dalam resep masakan Indonesia. Kornet daging sapi
diolah dengan cara diawetkan dalam air garam (brine), yaitu air yang dicampur
dengan larutan garam jenuh. Kemudian dimasak dengan cara simmering, yaitu
direbus dengan api kecil untuk menghindari hancurnya tekstur daging sapi.
Tujuan pembuatan kornet daging sapi adalah untuk tetap dapat
memperoleh produk daging sapi yang berwarna merah, awet dan praktis. Bahan
dasar pembuatan kornet adalah daging sapi yang digiling. Daging tersebut kaya
protein yang mempunyai kemampuan untuk mengikat air dan membentuk emulsi
yang baik. Bahan tambahan yang diperlukan adalah garam dapur, nitrit, alkali
fosfat, bahan pengisi, air, lemak, gula, dan bumbu (Cahyono dkk., 2018).
B. Babi hutan (Sus scrofa)
Babi hutan merupakan mamalia berkuku (hoofed) yang mempunyai
tulang belakang dan berjalan dengan menggunakan empat kaki (Swindle, 2007).
Klasifikasi taksonomi dari babi hutan adalah sebagai berikut :
Kingdom : Animalia
Filum : Chordata
Kelas : Mammalia
Subkelas : Theria
Infrakelas : Eutheria
Ordo : Artiodactyla
Famili : Suidae
Subfamili : Suinae
Genus : Sus
(Irekhore, 2012)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
Babi hutan adalah hewan omnivora. Kelompok omnivora mengonsumsi tumbuhan
dan hewan. Seekor babi hutan memiliki moncong hidung, mata dan buntut kecil
yang mungkin berombak, kaku atau lurus. Babi hutan memiliki tubuh yang
gempal, kaki pendek, dan bulu yang kasar. Ada empat jari pada masing-masing
kakinya, dengan dua jari tengah besar yang digunakan untuk berjalan. Babi hutan
dengan nama ilmiah Sus scrofa berwarna coklat kehitaman dan memiliki bulu
yang agak tebal pada seluruh badan dengan berat berkisar antara 50-350 kg
(Irekhore, 2012; Widowati, 2013).
C. DNA Mitokondria
Mitokondria adalah organel yang ada di hampir semua sel eukariotik
dalam jumlah mulai dari satu salinan hingga beberapa ribu per sel (Desler dkk.,
2011). Fungsi utama dari mitokondria adalah untuk regenerasi ATP (Adenosine
Triphosphate) dengan fosforilasi oksidatif (Lackie dkk., 2007). Mitokondria
sering disebut sebagai pembangkit energi dalam sel karena ATP yang dihasilkan
digunakan oleh sel sebagai sumber energi untuk berbagai aktivitasnya (Wandia,
2001). Mitokondria memiliki molekul DNA tersendiri dengan ukuran kecil yang
susunannya berbeda dengan DNA inti (Solihin, 1994).
Genom mitokondria adalah molekul DNA untai ganda (double stranded
DNA molecule) berbentuk sirkuler dengan panjang basa 15,7 sampai 19,5 kb.
Pada sebagian besar mamalia, mtDNA (DNA mitokondria) memiliki panjang basa
sekitar 16 kb yang berisi 13 gen penyandi protein yakni 3 subunit sitokrom
oksidase (CO I-III), 7 subunit NADH-dehidrogenase (ND 1-6 dan ND 4L), 2
subunit ATP-ase (6 dan 6L), dan sitokrom b (Cyt b); 2 gen rRNA yakni 12S dan
16S; dan 22 tRNA yang semuanya terlibat dalam proses fosforilasi oksidatif
(OXPHOS). Daerah penyandi (coding) meliputi 90% dari seluruh genom
mitokondria dan sisanya 10% merupakan daerah bukan penyandi (non coding).
Daerah bukan peyandi (non coding) utama terletak pada wilayah displacement-
loop (D-loop). Bagian lain dari daerah bukan penyandi terletak pada gugus tRNA
antara gen CO I dan ND 2 (Ladoukakis and Zouros, 2017; Wandia, 2001).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
Gambar 1. Struktur DNA Mitokondria (Butler, 2005)
DNA mitokondria (mtDNA) diwarisi secara keseluruhan dari ibu tanpa
rekombinasi (Butler, 2005). Molekul mtDNA merupakan molekul polimer rantai
ganda, yang terdiri dari rantai heavy (H) strand dan rantai light (L) strand. H-
strand kaya akan purin (adenin dan guanin), sedangkan L-strand didominasi
pirimidin (timin dan sitosin) (Hidayat, 2017). Jumlah molekul DNA mitokondria
(mtDNA) di dalam sel bisa sangat bervariasi. Setiap sel dapat mengandung
ratusan mitokondria sehingga mtDNA yang ada pada setiap sel bisa mencapai
ribuan. Hal ini menyebabkan tingkat keberhasilan mtDNA menjadi lebih besar
dibandingkan DNA nukleus sebagai marker pada sampel biologis yang mungkin
telah rusak karena panas atau lembab (Butler, 2005).
D. Gen Sitokrom b
Gen sitokrom b merupakan gen yang terletak di DNA Mitokondria pada
daerah penyandi tepatnya pada heavy strand untuk menyandi protein sitokrom b.
Gen ini banyak digunakan untuk meneliti hubungan spesies dari genus atau famili
yang sama. Sitokrom b termasuk satu dari 11 komponen protein-protein yang
disebut kompleks III. Kompleks III dalam mitokondria berperan dalam proses
fosforilasi oksidatif untuk menghasilkan ATP sebagai sumber energi untuk
berbagai aktivitas dalam sel (Gao dkk., 2015; Wandia, 2001; Widayanti dkk.,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
2004). Analisis mtDNA sitokrom b efektif dalam mengidentifikasi spesies asal
untuk sampel biologis (Butler, 2005). Gen sitokrom b dapat digunakan sebagai
penanda genetik karena berdasarkan posisinya, gen ini mempunyai region yang
lebih kekal dan beragam sehingga dalam identifikasi spesies tidak menimbulkan
keambiguan (Farias dkk., 2001). Genom utuh mitokondria dari Sus scrofa (babi
hutan) memiliki panjang sekuen 16.613 bp (base pair). Target gen sitokrom b
mitokondria dari Sus scrofa berada pada rentang wilayah 15.399-15.796 (NCBI,
2013).
Gambar 2. Wilayah Target Gen Sitokrom b Babi Hutan (NCBI, 2013)
E. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik amplifikasi
potongan DNA yang diinginkan secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi
oleh dua buah primer oligonukleotida dengan bantuan enzim polymerase
(Wardani dan Sari, 2015). Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-
ulang antara 20-30 kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap yaitu :
1) Denaturasi (denaturation)
Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai
tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan
putusnya ikatan hidrogen DNA diantara basa-basa yang komplemen.
Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi cetakan
(template) bagi primer. Denaturasi biasanya dilakukan pada suhu 90-95˚C.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
2) Penempelan primer (annealing)
Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju ke daerah
spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini,
ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada
cetakan (template). Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50-60˚C.
Selanjutnya, DNA polimerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut
akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan
reaksi polimerase selanjutnya.
3) Pemanjangan (elongasi/extention)
Umumnya, elongasi ini terjadi pada suhu 72˚C. Primer yang telah menempel
tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP
yang komplemen dengan template oleh DNA polimerase.
Selain ketiga proses tersebut, biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan
berikut.
1) Pra-denaturasi
Tahap ini dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan
kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA polimerase.
2) Final elongasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72˚C) selama 5-15 menit
untuk memastikan bahwa setiap untai tunggal yang tersisa sudah diperpanjang
secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir.
(Irianto, 2017)
Dengan menggunakan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan
DNA ribuan bahkan jutaan kali dari semula (Irianto, 2017). Target PCR yaitu
asam nukleat (DNA) untai ganda yang diekstraksi dari sel dan didenaturasi
menjadi asam nukleat untai tunggal (Nollet dan Toldrá, 2011). Metode PCR dapat
dilakukan dengan menggunakan komponen dalam jumlah yang sangat sedikit.
Berikut terdapat beberapa komponen utama dalam proses PCR yaitu :
1) Cetakan DNA (DNA Template) yaitu fragmen DNA yang akan
dilipatgandakan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
2) Primer yaitu suatu urutan nukleotida pendek (15-25 basa nukleotida)
digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Primer yang berikatan
dengan segmen awal sekuen DNA template yang ingin diamplifikasi disebut
primer forward, sedangkan primer yang berikatan dengan segmen akhir pada
sekuen DNA template yang ingin diamplifikasi disebut primer reverse.
3) Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dCTP.
4) Enzim DNA polimerase yaitu enzim yang mengkatalisis reaksis sintesis DNA
PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing mempunyai tiga tahapan
berulang.
5) PCR buffer merupakan buffer yang digunakan untuk PCR dan umumnya
tersusun atas KCl, Tris-Cl dan MgCl2.
(Irianto, 2017)
F. Landasan Teori
Daging merupakan bahan pangan yang dikonsumsi masyarakat sebagai
sumber protein. Namun, daging seperti daging babi hutan tidak bisa dikonsumsi
oleh semua kalangan karena dapat menyebabkan gangguan kesehatan pada
beberapa golongan serta adanya pantangan untuk agama tertentu. Menurut
Puspitasari dkk. (2019), sejumlah produk makanan berbahan dasar daging
ditemukan tercampur dengan daging babi hutan, terutama pada makanan olahan
daging sapi salah satunya adalah kornet. Pada penelitian yang dilakukan oleh
Rahayu dkk. (2020), terdapat satu produk kornet sapi dan satu produk dendeng
dari total empat sampel positif mengandung daging babi hutan berdasarkan nilai
Ct (threshold cycle) dibawah 30 menggunakan metode Real Time PCR. Gen
sitokrom b yang terdapat dalam DNA mitokondria merupakan salah satu marker
yang potensial untuk mendeteksi spesies dari genus atau famili yang sama. DNA
mitokondria memiliki jumlah salinan DNA yang tinggi, sehingga cocok untuk
analisis dengan jumlah DNA terbatas atau DNA yang mudah terdegradasi.
Pengidentifikasian gen sitokrom b mtDNA (DNA mitokondria) dapat
dilakukan dengan metode PCR. PCR merupakan teknik amplifikasi potongan
DNA yang diinginkan secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
buah primer oligonukleotida dengan bantuan enzim polymerase (Wardani dan
Sari, 2015). Menurut Tanabe (cit Fibriana dkk., 2012) PCR mempunyai
sensitivitas yang tinggi karena berhasil mendeteksi gen sitokrom b babi pada
sampel daging segar dan daging olahan. Oleh karena itu, metode ini dapat
digunakan untuk mendeteksi kandungan daging babi pada daging olahan seperti
kornet.
G. Hipotesis
Terdapat kandungan gen sitokrom b babi hutan yang dibuktikan dengan
terbentuknya pita dengan panjang 398 bp pada produk kornet sapi di Yogyakarta
dengan metode PCR.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan adalah deskriptif kualitatif dimana
sampel akan dideteksi dengan metode PCR dan rancangan penelitian yang
dilakukan merupakan penelitian observasional karena tidak dilakukan intervensi
pada variabel bebas.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel Utama
a) Variabel bebas dalam penelitian ini adalah isolat DNA dari kornet daging
sapi yang diperoleh dari supermarket wilayah Yogyakarta.
b) Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah produk PCR yang
dideteksi dengan elektroforesis.
2. Variabel pengacau
a) Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah ketepatan desain
primer dan kemurnian isolat DNA.
b) Variabel pengacau tidak terkendali dalam penelitian adalah proses
pembuatan sampel daging kornet sapi, bahan baku yang digunakan untuk
mengolah produk kornet sapi dan kualitas bahan baku.
3. Definisi Operasional
a) Kornet sapi adalah produk olahan daging sapi yang beredar di supermarket
wilayah Yogyakarta.
b) Gen sitokrom b babi hutan merupakan gen target yang akan diidentifikasi
menggunakan PCR.
c) PCR merupakan metode enzimatis untuk melipatgandakan atau
mengamplifikasi DNA dalam waktu singkat secara in vitro.
d) Primer adalah potongan DNA yang urutan nukleotidanya komplemen
dengan urutan nukleotida dalam cetakan DNA (DNA template).
e) Produk PCR adalah DNA hasil amplifikasi dengan panjang pita 398 bp.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
f) Elektroforesis adalah teknik pemisahan berdasarkan pergerakan molekul
(ion, molekul, makromolekul) dalam medan listrik dan digunakan untuk
analisis kualitatif produk PCR.
g) Suhu annealing adalah suhu yang digunakan pada tahap annealing agar
primer menuju daerah spesifik dan menempel dengan tepat pada fragmen
DNA target.
h) Jumlah siklus amplifikasi adalah jumlah pengulangan tahapan
denaturation, annealing dan extension dalam PCR agar memperoleh
produk PCR yang optimum.
C. Bahan penelitian
1. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging babi
hutan segar (kontrol positif babi), daging sapi segar (kontrol positif sapi) dan
sampel kornet daging sapi. Primer forward universal: 5’ GAC CTC CCA GCT
CCA TCA AAC ATC TCA TCT TGA TGA AA 3’, primer reverse sapi: 5’ CTA
GAA AAG TGT AAG ACC CGT AAT ATA AG 3’, primer reverse babi hutan:
5’ GCT GAT AGT AGA TTT GTG ATG ACC GTA 3’ diadopsi dari Matsunaga
dkk. (1999), kit isolasi DNA (FavorPrep Tissue Genomic DNA Extraction Mini
Kit) yang terdiri dari FATG1 buffer, FATG2 buffer, Proteinase K, W1 Buffer,
wash buffer, dan elution buffer, Tris-Borate-EDTA Buffer (10x), gel agarosa,
etanol absolut, water for injection (WFI), FluoroVue™ Nucleic Acid Gel Stain
(10.000x) SMOBiO, DNA ladder 100 bp (SMOBiO), loading dye, ExcelTaq™
5X PCR Master Dye Mix (berisi Taq DNA Polymerase, reaction buffer, MgCl2,
dNTP), akuabides (ddH2O).
2. Kriteria subyek uji
Subyek uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah kornet daging
sapi sebanyak 5 sampel dengan merk berbeda, belum melewati masa kadaluwarsa,
dan berlabel halal yang diperoleh dari supermarket wilayah Yogyakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
D. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Bio-Rad-T100™
thermal cycler, elektroforesis (Sigma Aldrich), kit isolasi DNA (FavorPrep™
Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit) yang berisi FATG mini column,
collection tube, elution tube, dan micropestle, microsentrifuge tube, tabung PCR,
yellow tip, blue tip, mikropipet (Soccorex Swiss), vortex (Fisher Scientific), water
bath, microwave, centrifuge, mortar stamper, neraca analitik digital, UV
Transiluminator (Fischer Scientific), kamera, alat-alat gelas.
E. Tata Cara Penelitian
1. Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel kornet daging sapi dilakukan oleh peneliti.
Sebanyak 5 sampel kornet daging sapi dengan merk yang berbeda diperoleh dari
Daerah Istimewa Yogyakarta dengan teknik purposive sampling, kemudian
dilakukan replikasi 3 kali untuk setiap sampel.
2. Optimasi preparasi sampel
a. Preparasi Sampel tanpa perlakuan. Preparasi sampel tanpa perlakuan
dilakukan sebelum isolasi DNA yaitu masing-masing sampel kornet daging sapi
ditimbang sebanyak 1 gram kemudian dimasukan ke dalam mortar dan dihaluskan
menggunakan stamper.
b. Preparasi Sampel dengan perlakuan. Preparasi sampel dengan
perlakuan dilakukan sebelum isolasi DNA yaitu masing-masing sampel kornet
daging sapi ditimbang sebanyak 5 gram ke dalam gelas beaker 50 ml kemudian
ditambahkan sedikit air yang dihangatkan pada suhu 80˚C lalu diaduk. Sampel
dipindahkan ke gelas beaker 500 ml kemudian gelas beaker sebelumnya dibilas
menggunakan air hangat dan dituangkan ke gelas beaker 500 ml. Larutan sampel
ditambahkan air hangat sekitar 300 ml kemudian diletakkan di atas water bath
selama 2 jam sambil diaduk. Selanjutnya, larutan sampel didinginkan di suhu
ruangan kemudian disaring. Sampel yang telah diberi perlakuan tersebut
kemudian ditimbang 50 mg dan dihaluskan menggunakan mortar dan stamper.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
3. Preparasi kontrol positif dan negatif
Preparasi kontol positif dan negatif sebelum isolasi DNA perlu
dilakukan. Daging babi hutan segar sebagai kontrol positif babi dan daging sapi
segar sebagai kontrol positif sapi dihaluskan menggunakan mortar dan stamper.
4. Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Tissue Genomic DNA
Extraction Mini Kit. Daging babi hutan segar (kontrol positif babi), daging sapi
segar (kontrol positif sapi), dan sampel kornet daging sapi masing-masing yang
sudah dipreparasi sebelumnya ditimbang 25 mg dan dipindahkan ke tabung
mikrosentrifuge 1,5 mL kemudian dihaluskan menggunakan mikropestel.
Sebanyak 200 µl FATG1 buffer ditambahkan ke dalam sampel dan dihaluskan
menggunakan mikropestel. Proteinase K sebanyak 20 µl ditambahkan ke dalam
campuran sampel, divorteks lalu diinkubasi pada suhu 60˚C selama 3 jam. Sel
dilisiskan dengan cara menambahkan FATG2 buffer sebanyak 200 µl, divorteks
dan diinkubasi kembali pada suhu 70˚C selama 10 menit. Setelah diinkubasi,
ditambahkan etanol absolut sebanyak 200 µl lalu divorteks. FATG mini column
dipasangkan dengan 2 ml collection tube dan sampel dipindahkan ke dalam FATG
mini column tersebut kemudian disentrifugasi pada kecepatan 17.000 xg selama 1
menit. Collection tube sebelumnya dibuang dan FATG mini column dipasangkan
dengan 2 ml collection tube yang baru. Berikutnya FATG mini column
ditambahkan 400 µl W1 buffer dan disentrifugasi pada kecepatan 17.000 xg
selama 1 menit kemudian collection tube tersebut dibuang. FATG mini column
dipasangkan dengan 2 ml collection tube yang baru lalu ditambahkan 750 µl Wash
buffer dan disentrifugasi pada kecepatan 17.000 xg selama 1 menit. Collection
tube tersebut dibuang dan dipasangkan lagi 2 ml collection tube terakhir yang
baru pada FATG mini Column dan disentrifugasi pada kecepatan 17.000 xg
selama 3 menit untuk mengeringkan kolom. FATG mini column yang sudah
dikeringkan kemudian dipasangkan dengan 1,5 ml tabung mikrosentrifuge lalu
ditambahkan 100 µl elution buffer yang telah dipanaskan ke tengah membran
FATG mini column sampai benar-benar terserap. Selanjutnya disentrifugasi pada
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
kecepatan 17.000 xg selama 2 menit untuk mengelusi DNA. DNA yang telah
berhasil dielusi tersebut kemudian disimpan pada suhu -20˚C.
5. Penyiapan Gel Agarosa
Pada penelitian ini, terdapat dua konsentrasi gel agarosa yang digunakan
yaitu 1,0% dan 1,5%. Gel agarosa 1,0% digunakan untuk mengidentifikasi
kemurnian isolat DNA, sedangkan gel agarosa 1,5% digunakan untuk
mengidentifikasi produk PCR. Pembuatan gel agarosa 1,0% dilakukan dengan
cara melarutkan 0,25 g agarosa dalam 1x larutan TBE sebanyak 25 mL, lalu
dipanaskan menggunakan microwave sekitar 5 menit hingga larut. Sebanyak 2,5
µL larutan Nucleic Acid Gel Stain ditambah lalu diaduk hingga homogen. Larutan
tersebut dituang ke dalam cetakan yang telah diberi sisiran pada bagian tepi dan
gel dibiarkan mengeras. Setelah mengeras, sisiran dicabut hingga terbentuk
sumur-sumur sebagai tempat dimasukkannya sampel yang akan diidentifikasi.
Pembuatan gel agarosa 1,5% dilakukan dengan cara melarutkan 0,375 g agarosa
dalam 1x larutan TBE sebanyak 25 mL, lalu dipanaskan menggunakan microwave
sekitar 5 menit hingga larut. Sebanyak 2,5 µL larutan Nucleic Acid Gel Stain
ditambahkan lalu diaduk hingga homogen. Larutan tersebut dituang ke dalam
cetakan yang telah diberi sisiran pada bagian tepi dan gel dibiarkan mengeras.
Setelah mengeras, sisiran dicabut hingga terbentuk sumur-sumur sebagai tempat
dimasukkannya sampel yang akan diidentifikasi.
6. Analisis Kualitatif Isolat DNA
Analisis kualitatif isolat DNA dilakukan dengan metode elektroforesis.
Gel agarosa 1,0% ditempatkan ke dalam gel tray lalu diberi larutan buffer 1x TBE
hingga permukaan gel terendam. Isolat DNA sebanyak 5,0 µl dicampurkan
loading dye sebanyak 1,0 µl di atas plat tetes. Campuran tersebut dimasukkan ke
dalam sumur-sumur gel menggunakan mikropipet dan salah satu sumuran gel diisi
dengan 100 bp DNA ladder sebanyak 3,0 µL sebagai marker. Elektroforesis
dijalankan pada tegangan 110 volt selama 30 menit. Hasil elektroforesis diamati
di bawah lampu UV Transilluminator dan didokumentasikan menggunakan
kamera. Panjang pita akan diketahui dengan cara menarik garis lurus masing-
masing pita sampel DNA dengan posisi pita DNA ladder.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
7. Optimasi PCR
Gradien suhu yang digunakan yaitu 55,6°C;58,4°C;60,5°C;62,2°C; dan
64°C. Kondisi PCR yang digunakan dicantumkan pada Tabel I. Siklus amplifikasi
dari tahap denaturasi hingga ekstensi diulangi sebanyak 30 kali.
Tabel I. Kondisi PCR
Kondisi PCR Suhu Waktu
Pra Denaturasi 95˚C 3 menit
Denaturasi 95˚C 15 detik
Gradien Suhu Annealing 55,6˚C
58,4˚C
60,5˚C
62,2˚C
64 ˚C
30 detik
Ekstensi 72˚C 30 detik
Ekstensi akhir 72˚C 1 menit
8. Identifikasi Gen Sitokrom b
Identifikasi gen sitokrom b dilakukan dengan menggunakan primer
forward universal: 5’ GAC CTC CCA GCT CCA TCA AAC ATC TCA TCT
TGA TGA AA 3’, primer reverse sapi: 5’ CTA GAA AAG TGT AAG ACC CGT
AAT ATA AG 3’, primer reverse babi hutan: 5’ GCT GAT AGT AGA TTT GTG
ATG ACC GTA 3’ diadopsi dari Matsunaga dkk. (1999). Sebanyak 10 µl
SMOBio ExcelTaq 5X PCR Master Dye Mix TP1200, 0,5 µl forward primer, 0,5
µl reverse primer babi, 1 µl DNA template, 3.0 µl isolat DNA dan ditambahkan
nuclease free water hingga volume total sebanyak 30 µl untuk mengidentifikasi
kandungan babi. Sedangkan untuk yang mengandung sapi (negatif mengandung
babi), sebanyak 10 µl SMOBio ExcelTaq 5X PCR Master Dye Mix TP1200, 0,5
µl forward primer, 0,5 µl reverse primer sapi, 1 µl DNA template, 3.0 µl isolat
DNA dan ditambahkan nuclease free water hingga volume total sebanyak 30 µl.
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan mesin thermal cycler. Kondisi PCR
yang digunakan yaitu pra-denaturasi pada suhu 95˚C selama 3 menit, dilanjutkan
dengan denaturasi pada suhu 95˚C selama 15 detik, annealing pada suhu 58,4˚C
selama 30 detik, ekstensi pada suhu 72˚C selama 30 detik. Siklus amplifikasi ini
dilakukan sebanyak 30 kali dan diakhiri dengan ektensi akhir (final extension)
pada suhu 72˚C selama 1 menit.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
9. Analisis Produk PCR Menggunakan Teknik Elektroforesis
Analisis produk PCR dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel
agarosa 1,5% sebagai fase diam. Gel agarosa 1,5% ditempatkan ke dalam gel tray
lalu diberi larutan buffer 1x TBE hingga permukaan gel terendam. Produk PCR
diambil sebanyak 5,0 µl lalu dimasukan ke dalam sumur-sumur gel menggunakan
mikropipet. Salah satu sumuran gel diisi dengan 3,0 µl DNA ladder sebagai
marker kemudian elektroforesis dijalankan pada tegangan 110 volt selama 30
menit. Hasil elektroforesis dievaluasi dengan lampu UV Transilluminator dan
didokumentasikan menggunakan kamera.
F. Analisis Hasil
Hasil yang dianalisis adalah ada atau tidaknya kandungan gen sitokrom b
babi hutan. Apabila terdapat kandungan gen sitokrom b babi hutan maka akan
terbentuk pita berukuran 398 bp, namun jika tidak terdapat kandungan gen
sitokrom b babi hutan maka akan terbentuk pita berukuran 274 bp.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Optimasi Preparasi Sampel
Pada penelitian ini, kornet sapi digunakan sebagai sampel, daging sapi
segar sebagai kontrol positif sapi diperoleh dari supermarket dan daging babi
segar sebagai kontrol positif babi diperoleh dari pasar yang berada di wilayah
Yogyakarta. Sampel kornet sapi yang diambil yaitu sebanyak lima merk berbeda
menggunakan teknik Purposive Sampling. Menurut Gay dkk. (2012), purposive
sampling merupakan suatu teknik pengambilan sampel dengan menentukan
kriteria sampel yang diyakini dapat mewakili suatu populasi.
Sampel kornet sapi terlebih dahulu dipreparasi sebelum memasuki
tahapan isolasi DNA. Kontrol positif berupa daging babi segar dan daging sapi
segar juga dipreparasi untuk mempermudah proses lisis saat dilakukan isolasi
DNA. Replikasi sampel sebanyak tiga kali dilakukan dengan tujuan untuk
memastikan hasil yang diperoleh akurat (Rau dkk., 2018). Kornet sapi merupakan
produk daging sapi yang melalui tahapan pengolahan salah satunya adalah
perlakuan kimiawi (penambahan pengawet nitrit). Hal ini bisa mempengaruhi
hasil isolasi DNA. Optimasi preparasi sampel dilakukan untuk mengetahui proses
preparasi terbaik yang digunakan pada proses isolasi DNA (Cahyono dkk., 2018;
Erwanto, 2018). Preparasi sampel dengan perlakuan dilakukan untuk memisahkan
kandungan nitrit yang ada pada sampel kornet sapi. Tujuan dilakukan pemisahan
ini agar kandungan nitrit tidak mengganggu proses isolasi DNA. Hasil isolasi
DNA sampel yang dipreparasi dengan perlakuan (Gambar 3) menunjukkan DNA
yang lebih terlihat dibandingkan dengan isolasi DNA sampel yang dipreparasi
tanpa perlakuan (Gambar 2). Dengan demikian, preparasi sampel dengan
perlakuan merupakan metode preparasi yang paling baik untuk proses isolasi
DNA sampel kornet.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Gambar 3. Hasil Elektroforesis Isolat DNA Sampel Tanpa Perlakuan
Keterangan :
M : DNA ladder sebagai marker
1-5 : Isolat DNA produk kornet sapi tanpa perlakuan KB : Kontrol positif babi (isolat DNA daging babi segar)
KS : Kontrol positif sapi (isolat DNA daging sapi segar)
Kondisi elektroforesis : Fase diam gel agarosa 1%; fase gerak larutan TBE 1x; tegangan 110 Volt, waktu running 30 menit; volume injeksi 6 μL; DNA ladder 3 μL
Gambar 4. Hasil Elektroforesis Isolat DNA Sampel dengan Perlakuan
Keterangan : M : DNA ladder sebagai marker
1-5 : Isolat DNA produk kornet sapi dengan perlakuan
KB : Kontrol positif babi (isolat DNA daging babi segar)
KS1 : Kontrol positif sapi (isolat DNA daging sapi segar) KS2 : Kontrol positif sapi (isolat DNA daging sapi segar)
Kondisi elektroforesis : Fase diam gel agarosa 1%; fase gerak larutan TBE 1x; tegangan
110 Volt, waktu running 30 menit; volume injeksi 6 μL; DNA ladder 3 μL
B. Isolasi DNA
Isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari partikel-partikel
lain seperti lipid, protein, polisakarida, dan zat lainnya (Hariyadi dkk., 2018).
Prinsip utama dari isolasi DNA yaitu pengancuran (lisis), ekstraksi atau
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian
3000 bp
Isolat
DNA
100 bp
3000 bp
100 bp
Isolat
DNA
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
DNA (Hidayati dkk., 2016). Lisis merupakan perusakan dinding sel, dan proses
lisis ini bisa dilakukan dengan cara fisik maupun kimia. Pemurnian DNA
merupakan proses untuk memisahkan DNA dari lisat sel (protein, karbohidrat,
lipid) dan kontaminan lain (Wardani dan Sari, 2015).
Isolasi DNA dilakukan menggunakan FavorPrep™ Tissue Genomic DNA
Extraction Mini Kit. Tahap awal isolasi DNA adalah proses perusakan atau
penghancuran membran dan dinding sel yang bertujuan untuk mengeluarkan isi
sel (Hidayati dkk., 2016). Pada penelitian ini, proses lisis menggunakan FATG1
buffer, FATG2 buffer dan penambahan Proteinase K. Menurut Mulyani dkk.
(2011), buffer lisis diperlukan untuk memecah membran sel agar dapat
mengeluarkan DNA genom. Protein dihilangkan menggunakan proteinase K.
Enzim proteinase K berperan untuk menghancurkan protein (Kamaliah, 2017).
Penggunaan vorteks dalam proses isolasi DNA bertujuan untuk membantu proses
lisis (Mulyani dkk., 2011). Selain itu, inkubasi dilakukan pada suhu 60˚C selama
3 jam kemudian suhu dinaikan hingga 70˚C selama 10 menit serta perlu dibolak
balik bertujuan untuk mendukung degradasi protein dan larutan buffer dapat
melisiskan sel dengan sempurna (Mulyani dkk., 2011). Protein yang telah rusak
bersama komponen hasil lisis lainnya dipisahkan melalui sentrifugasi (Irianto,
2017). Sampel disentrifugasi dengan kecepatan tinggi agar komponen yang
berukuran lebih besar atau lebih berat akan mengendap membentuk sedimen pada
bagian bawah tabung (Langga dkk., 2012). Menurut Bettelheim dan Landdesberg
(cit., Hutami dkk., 2018) setelah disentrifugasi, campuran akan terpisah menjadi
dua fase yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aqueous (air) berada
pada lapisan atas. DNA akan berada pada fase aqueous sementara makromolekul
protein, lipid, dan polisakarida akan berada pada fase organik.
Pemurnian DNA dalam proses isolasi dilakukan dengan penambahan
etanol absolut. Hal tersebut menyebabkan penurunan kelarutan asam nukleat
dalam air sehingga DNA mengalami presipitasi membentuk endapan DNA pada
bagian bawah tabung (Hutami dkk., 2018). Endapan DNA dicuci menggunakan
dua jenis buffer yang terdapat pada kit isolasi yaitu W1 buffer dan wash buffer.
Menurut Mulyani dkk. (2011), pencucian bertujuan untuk menghilangkan residu
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
etanol dan senyawa lain yang ikut mengendap bersama dengan DNA. DNA
dielusi menggunakan elution buffer. Larutan elution buffer berfungsi untuk
menghasilkan purifikasi DNA (DNA yang benar-benar murni) (Utami dkk.,
2013). Isolat DNA yang telah diperoleh disimpan di dalam freezer bersuhu -20˚C
(Marwayana, 2015). Kemurnian dari isolat DNA dapat ditentukan dari ada
tidaknya komponen lain seperti protein dan RNA dengan menggunakan
elektroforesis (Hidayati dkk., 2016).
C. Analisis Kualitatif Isolat DNA
Isolat DNA diuji secara kualitatif dengan elektroforesis menggunakan gel
agarosa 1% dalam larutan TBE 1x (Tris Borate EDTA) yang ditambahkan Nucleic
Acid Gel Stain. Elektroforesis merupakan suatu teknik untuk memisahkan
molekul menggunakan medan listrik berdasarkan ukuran molekul. Kecepatan
migrasi molekul DNA tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media
gel yang dilalui DNA, dan arus listrik. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga
akan bergerak menuju kutub positif dalam medan listrik (Irianto, 2017; Novitasari
dkk., 2014). Nucleic Acid Gel Stain berfungsi sebagai pewarna agar DNA dapat
tervisualisasi di bawah UV Transilluminator (Hidayati dkk., 2016; Utami dkk.,
2013). Nucleic Acid Gel Stain dirancang dengan tujuan menggantikan ethidium
bromida (EtBr) yang bersifat mutagen dan karsinogenik (Crisafuli dkk., 2015;
Maftuchah dkk., 2014). Isolat DNA dicampurkan dengan loading dye yang
mengandung gliserol dan bromofenol biru sebelum melakukan proses
elektroforesis untuk menambah densitas DNA dan sebagai penanda migrasi DNA
(Fatchiyah dkk., 2011; Novitasari dkk., 2014).
Hasil elektroforesis yang tervisualisasi di bawah UV transilluminator
berupa pita-pita DNA. Pita tebal dan terang secara kualitatif mengindikasikan
konsentrasi isolasi DNA yang dihasilkan tinggi sedangkan pita yang tipis
mengindikasikan konsentrasi DNA yang dihasilkan kecil (Hidayati dkk., 2016).
Hasil elektroforesis pada Gambar 3 menunjukkan terbentuknya pita tunggal dan
tebal pada isolat DNA kontrol daging babi maupun daging sapi. Sedangkan pada
isolat DNA produk kornet sapi terlihat smear pada sampel nomor 4. Genom yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
smear pada hasil elektroforesis disebabkan karena tidak utuhnya DNA yang
terisolasi. Smear tersebut disebabkan karena DNA yang diperoleh rusak atau
sudah terfragmentasi (Mulyani dkk., 2011; Novitasari dkk., 2014). Jumlah DNA
yang diekstraksi dalam daging olahan akan berkurang, khususnya pada produk
olahan yang telah melalui proses autoklaf berkisar antara 7-9 μg / 300 mg karena
makanan olahan seperti kornet melibatkan perlakuan autoklaf. Pada prinsipnya,
sterilisasi autoklaf menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Suhu didalamnya
dapat mencapai 115-125˚C dan tekanan uapnya mencapai 2-4 atm, sehingga pada
autoklaf semakin tinggi tekanannya, maka suhu yang dihasilkan semakin tinggi.
Tekanan yang diberikan menyebabkan suhu yang dihasilkan >100˚C dan suhu ini
mengakibatkan terjadinya degradasi pada DNA. Kemampuan DNA yang
terdegradasi untuk mengikat pewarna dalam elektroforesis gel akan berkurang
(Calderón-Franco dkk., 2020; Chandrika dkk., 2010; Farmawati dkk., 2015;
Rahayu dkk., 2020). Dengan demikian, tidak ada pita DNA yang muncul pada
produk kornet sapi.
D. Identifikasi Gen Sitokrom b
Gen sitokrom b merupakan gen yang terletak pada DNA mitokondria dan
memiliki variasi urutan sekuen antara satu spesies dengan spesies lainnya
sehingga gen ini banyak digunakan untuk meneliti hubungan spesies dari genus
atau famili yang sama (Farias dkk., 2001; Gao dkk., 2015). Amplifikasi gen
sitokrom b pada penelitian ini dilakukan dengan metode PCR. Komponen-
komponen yang diperlukan dalam proses amplifikasi dengan metode PCR yaitu
template DNA, primer, enzim DNA polymerase, dNTPs (Deoxynucleotide
triphosphates, buffer PCR dan konsentrasi Mg2+ (Fatchiyah dkk., 2011).
Keberhasilan amplifikasi DNA tergantung dari ketepatan primer yang
digunakan (Prakoso dkk., 2016). Proses amplifikasi gen sitokrom b dilakukan
dengan menggunakan primer forward universal: 5’ GAC CTC CCA GCT CCA
TCA AAC ATC TCA TCT TGA TGA AA 3’, primer reverse sapi: 5’ CTA GAA
AAG TGT AAG ACC CGT AAT ATA AG 3’, primer reverse babi hutan: 5’
GCT GAT AGT AGA TTT GTG ATG ACC GTA 3’ diadopsi dari Matsunaga
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
dkk. (1999). Identifikasi adanya kandungan gen sitokrom b babi menggunakan
primer forward universal dan primer reverse spesifik babi serta ditunjukkan
dengan terbentuknya pita berukuran 398 bp. Sedangkan untuk mengindentifikasi
tidak adanya kandungan babi dan memastikan bahwa sampel mengandung sapi
menggunakan primer forward universal dan primer reverse spesifik sapi serta
ditunjukkan dengan terbentuknya pita berukuran 274 bp. Daerah penempelan
primer untuk gen sitokrom b babi terletak pada urutan basa 15.399-15.796
(Gambar 1), sedangkan daerah penempelan primer gen sitokrom b sapi terletak
pada urutan basa 14.571-14.844 (Gambar 4). Primer berfungsi sebagai pembatas
fragmen DNA target yang akan diamplifikasi. Setiap satu fragmen target,
memerlukan sepasang primer yang sesuai dengan DNA target (Maitriani dkk.,
2015).
Gambar 5. Wilayah Target Gen Sitokrom b Sapi (NCBI, 2009)
Pembuatan DNA template merupakan proses pertama yang dilakukan
dalam metode PCR. DNA template adalah DNA untai ganda yang membawa basa
fragmen atau gen yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan
target (target sequence) (Utami dkk., 2013). Pada proses PCR, terdapat tiga
tahapan penting yaitu denaturasi, penempelan primer (annealing), dan ekstensi.
Pada tahap denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai
tunggal. Suhu yang digunakan pada tahap ini adalah 95˚C. Hal ini dikarenakan
suhu yang tinggi dapat menyebabkan putusnya ikatan hidrogen yang
menghubungkan dua untai DNA.
Annealing merupakan tahap terjadinya penempelan primer pada DNA
template. Pencarian kondisi optimal dari suhu annealing dilakukan sebab primer
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
dapat menempel pada DNA template apabila suhu yang digunakan merupakan
suhu optimum, sehingga suhu yang digunakan dalam tahap annealing merupakan
faktor penting keberhasilan amplifikasi DNA dengan metode PCR. Jika suhu
annealing terlalu tinggi maka penempelan primer pada DNA template akan lepas
sehingga produk PCR tidak terbentuk, sebaliknya jika suhu annealing terlalu
rendah maka akan terjadi penempelan primer pada DNA template tidak spesifik
sehingga menghasilkan produk PCR yang juga tidak spesifik (Hidayati dkk.,
2016; Irianto, 2017). Primer yang digunakan pada penelitian ini mengacu pada
Matsunaga dkk. (1999). Pada penelitian tersebut dilakukan dengan metode
multipleks PCR sedangkan pada penelitian ini menggunakan metode unipleks
PCR. Metode multipleks PCR menggunakan beberapa pasang primer untuk
mengamplifikasi lebih dari satu sekuen target DNA sehingga kondisi optimal PCR
pada suhu annealingnya akan berbeda dengan metode unipleks PCR yang hanya
membutuhkan satu pasang primer untuk mengamplifikasi satu sekuen target DNA
yang dituju (Butler, 2005). Selain itu, reagen mix PCR pada penelitian Matsunaga
dkk. (1999) mengandung taq DNA polimerase yang berbeda dengan taq DNA
polimerase yang terdapat dalam reagen mix PCR pada penelitian ini. Dengan
demikian, hal-hal tersebut yang mendasari perlunya dilakukan optimasi kondisi
PCR pada suhu annealing.
Hasil optimasi suhu annealing untuk kontrol positif daging babi
ditunjukkan pada Gambar 5 dan untuk kontrol positif sapi segar pada Gambar 6.
Amplifikasi gradien PCR dari fragmen gen sitokrom b spesifik babi maupun
fragmen gen sitokrom b spesifik sapi menggunakan suhu annealing yang
bervariasi dari suhu 55˚C-64˚C. Amplifikasi gradien PCR dilakukan untuk
menentukan suhu annealing yang optimum untuk pengujian dengan menggunakan
primer yang telah dirancang (Che Man dkk., 2012).
Hasil elektroforesis pada Gambar 5 menunjukkan bahwa terbentuk pita
tebal dan tunggal pada seluruh variasi suhu annealing dengan ukuran 398 bp,
sehingga suhu annealing untuk penempelan primer reverse spesifik gen sitokrom
b babi optimum untuk semua variasi suhu. Hasil elektroforesis pada Gambar 6
menunjukkan bahwa terbentuk pita tebal dan tunggal pada variasi suhu 60,5˚C,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
58,4˚C, 55,6˚C dengan ukuran 274 bp, sehingga suhu annealing untuk
penempelan primer reverse spesifik gen sitokrom b sapi pada variasi suhu 60,5˚C,
58,4˚C, 55,6˚C. Dengan demikian, suhu annealing yang optimum dan digunakan
pada penelitian ini yaitu 58,4˚C.
Tahap ekstensi merupakan tahap sintesis DNA. Tahap ekstensi dilakukan
pada suhu 72˚C. Suhu ini adalah suhu yang optimal bagi Taq DNA polymerase
untuk mensintesis pita-pita DNA baru dengan cara memanjangkan rantai primer
(Bintang, 2018). Hasil dari produk PCR yang telah diamplifikasi dianalisis
menggunakan elektroforesis.
Gambar 6. Hasil Optimasi Suhu Annealing Produk PCR Kontrol Daging Babi
Keterangan: M : DNA ladder
Kondisi elektroforesis : Fase diam gel agarosa 1,5%; fase gerak larutan TBE 1X;
tegangan 110 Volt, waktu running 30 menit; volume injeksi
5 μL
Gambar 7. Hasil Optimasi Suhu Annealing Produk PCR Kontrol Daging Sapi
Keterangan:
M : DNA ladder
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Kondisi elektroforesis : Fase diam gel agarosa 1,5%; fase gerak larutan TBE 1X;
tegangan 110 Volt, waktu running 30 menit; volume injeksi
5 μL
E. Analisis Produk PCR
Hasil produk PCR dianalisis secara kualitatif dengan elektroforesis
menggunakan gel agarosa 1,5%. Konsentrasi gel agarosa pada analisis produk
PCR lebih besar daripada konsentrasi gel pada analisis isolat DNA. Hal ini
disebabkan molekul yang ukurannya lebih kecil akan bermigrasi lebih cepat
melalui pori-pori gel dan ukuran DNA produk PCR relatif lebih kecil sehingga
rongga untuk molekul bermigrasi saat elektroforesis harus lebih rapat (Irianto,
2017). DNA ladder sebagai marker juga perlu ditambahkan saat elektroforesis.
Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker
berfungsi untuk mengetahui ukuran DNA hasil amplifikasi sehingga amplifikasi
dengan PCR dapat diketahui berhasil atau tidak sesuai target (Utami dkk., 2013).
Gambar 8. Hasil Analisis Kualitatif Produk PCR dengan Primer Reverse Sapi
Keterangan :
M : DNA ladder (marker)
S1 : Kontrol sapi sebagai pembanding (produk PCR) S2 : Kontrol sapi sebagai penegas (produk PCR)
1-5 : Produk PCR dari isolat DNA kornet sapi
Kondisi elektroforesis : Fase diam gel agarosa 1,5%; fase gerak larutan TBE 1x; tegangan 110 Volt, waktu running 30 menit; volume injeksi 5 μL; DNA ladder 3 μL
Produk PCR
dengan panjang
pita 274 bp
3000 bp
100 bp
200 bp
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Gambar 9. Hasil Analisis Kualitatif Produk PCR dengan Primer Reverse Babi
Keterangan : M : DNA ladder (marker)
KB : Kontrol positif babi (produk PCR)
1-5 : Produk PCR dari isolat DNA kornet sapi Kondisi Elektroforesis : Fase diam gel agarosa 1,5%; fase gerak larutan TBE 1x;
tegangan 110 Volt, waktu running 30 menit; volume injeksi 5 μL; DNA ladder 3 μL
Produk PCR dari isolat DNA dinyatakan positif mengandung babi
apabila hasil visualisasi tersebut membentuk pita DNA tunggal dan tebal dengan
ukuran 398 bp sesuai dengan kontrol positif babi. Sebaliknya, produk PCR dari
isolat DNA dinyatakan mengandung sapi atau negatif mengandung babi apabila
hasil visualisasi tersebut membentuk pita DNA tunggal dan tebal dengan ukuran
274 bp sesuai dengan kontrol positif sapi. Hasil elektroforesis produk PCR yang
menggunakan primer reverse sapi ditunjukkan pada Gambar 7. Hasil
elektroforesis menunjukkan terbentuknya pita berukuran 274 bp pada daging sapi
dan sampel kornet sapi. Sedangkan, hasil elektroforesis produk PCR yang
menggunakan primer reverse babi ditunjukkan pada Gambar 8. Hasil
elektroforesis menunjukkan terbentuknya pita berukuran 398 bp pada daging babi.
Ketebalan pita DNA hasil amplifikasi dipengaruhi oleh jumlah DNA yang
terisolasi. Semakin banyak DNA yang terisolasi maka semakin tebal pita DNA
begitupun sebaliknya (Wijaya dkk., 2018).
Tabel II. Fragmen DNA hasil produk PCR
Sampel Kode
Sampel
Primer Teramplifikasi Ukuran
pita
Daging sapi S1 Reverse sapi 274 bp
Daging sapi S2 Reverse sapi 274 bp
Kornet 1 1 Reverse sapi - -
Produk PCR
dengan panjang
pita 398 bp
3000 bp
100 bp
300 bp
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
Kornet 2 2 Reverse sapi - -
Kornet 3 3 Reverse sapi - -
Kornet 4 4 Reverse sapi 274 bp
Kornet 5 5 Reverse sapi - -
Daging babi KB Reverse babi 398 bp
Kornet 1 1 Reverse babi - -
Kornet 2 2 Reverse babi - -
Kornet 3 3 Reverse babi - -
Kornet 4 4 Reverse babi - -
Kornet 5 5 Reverse babi - -
Pada tabel II disajikan data hasil pengamatan fragmen DNA produk PCR.
DNA yang teramplifikasi dengan primer reverse sapi membentuk pita berukuran
274 bp adalah kontrol positif daging sapi dan sampel kornet sapi nomor 4. Pada
sampel 1,2,3 dan 5 tidak menunjukkan terjadinya amplifikasi karena tidak
terbentuk pita sejajar dengan kontrol positif sapi yaitu 274 bp. Hal ini disebabkan
karena DNA terdegradasi akibat proses pemanasan menggunakan suhu >100˚C
(Che Man dkk., 2007). Pemanasan menggunakan suhu tinggi >100˚C yang
dipengaruhi karena adanya tekanan dari uap air dalam proses autoklaf pada
produk daging akan menyebabkan degradasi DNA (Rahayu dkk., 2020). Selain
suhu dan tekanan, durasi saat mengolah daging juga mempengaruhi kualitas
DNA. Semakin lama durasi dan semakin tinggi suhu yang digunakan untuk
mengolah daging maka dapat menyebabkan degradasi DNA, akibatnya DNA pada
produk daging olahan terfragmentasi dan menyebabkan DNA menjadi sulit untuk
teramplifikasi (Erwanto, 2018). Di samping itu, persentase daging sapi yang ada
pada setiap sampel kornet serta proses pembuatan dari setiap pabrik berbeda-beda
sehingga hal ini menjadi penyebab terjadinya amplifikasi pada sampel 4 namun
tidak pada sampel 1,2 3, dan 5. DNA yang teramplifikasi dengan primer reverse
babi membentuk pita berukuran 398 bp adalah kontrol positif daging babi sesuai
sekuen target gen sitokrom b babi. Pada sampel produk kornet 1 sampai 5 tidak
ada pita yang terbentuk dengan panjang berukuran 398 bp. Proses amplifikasi
pada sampel 1 sampai 5 tidak terjadi karena tidak ada primer yang menempel pada
DNA template sehingga disimpulkan bahwa gen sitokrom b babi tidak
teridentifikasi pada 5 sampel produk kornet sapi.
Hasil ini berbeda dengan penelitian yang dilakukan oleh Wijaya dkk.
(2018). Metode yang digunakan pada penelitian Wijaya dan penelitian ini sama
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
yaitu metode PCR konvensional. Namun, pada penelitian ini tidak semua sampel
kornet sapi teramplifikasi dengan primer reverse sapi ataupun primer reverse babi,
sedangkan pada penelitian Wijaya dkk. (2018) semua sampel kornet sapi dapat
teramplifikasi. Faktor yang dapat mempengaruhi perbedaan antara penelitian ini
dan penelitian yang dilakukan oleh Wijaya dkk. (2018) adalah jumlah kandungan
daging sapi pada produk kornet sapi yang berbeda-beda dan pengolahan kornet
sapi yang menyebabkan DNA pada beberapa sampel telah terdegradasi akibat
proses autoklaf sebelum dilakukannya isolasi DNA. Dengan demikian, hal ini
merupakan kondisi yang tidak terduga dan tidak mampu diatasi (force major).
Metode isolasi DNA yang digunakan oleh Wijaya dkk. (2018) adalah
metode Phenol Chloroform Isoamil Alcohol (PCIA) yang disebut juga metode
ekstraksi DNA konvensional (tanpa kit), sedangkan pada penelitian ini digunakan
metode isolasi DNA dengan kit atau disebut juga metode Double Spin Column.
Perbedaan antara kedua metode ini yaitu pada metode PCIA, esktrak DNA yang
diperoleh berupa pellet transparan dapat teramati secara langsung sehingga
mempermudah peneliti untuk memastikan keberadaan ekstrak DNA sedangkan
metode Double Spin Column menggunakan membran silika untuk memerangkap
DNA yang telah keluar dari sel (Marwayana, 2015). Namun, perbedaan metode
isolasi tidak mempengaruhi hasil isolat DNA kornet sapi secara signifikan karena
pada proses isolasi DNA menggunakan kedua metode ini tetap melalui tahapan
penambahan etanol absolut. Menurut Aini dkk. (2011), DNA yang terdegradasi
menjadi untai tunggal atau nukleotida bebas larut dalam etanol pada saat proses
pencucian sehingga dapat mengurangi jumlah DNA yang diperoleh. Dengan
demikian, faktor adanya perbedaan metode isolasi DNA antara metode PCIA dan
metode Double Spin Column tidak mempengaruhi hasil isolasi DNA.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat ditarik kesimpulan
sebagai berikut :
1. Metode PCR menggunakan gen sitokrom b babi memiliki kemampuan untuk
membedakan secara spesifik kandungan babi dan sapi pada produk kornet
dengan ukuran pita 398 bp untuk babi dan 274 bp untuk sapi.
2. Kelima produk kornet sapi yang diperoleh dari supermarket wilayah
Yogyakarta tidak ditemukan adanya kandungan babi.
B. Saran
1. Penelitian lebih lanjut dapat dilakukan dengan menggunakan marker dari
mitokondria DNA selain gen sitokrom b
2. Penelitian lebih lanjut dapat dilakukan menggunakan metode PCR seperti
droplet digital (ddPCR) yang mampu mendeteksi secara akurat dan sensitif
meskipun melalui proses pemanasan dan tekanan dalam daging olahan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
DAFTAR PUSTAKA
Aini, A.N., Ria, P., Aminin, A.L.N., 2011. Pemurnian DNA Plasmid Puc19
Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea. Jurnal Sains dan
Matematika, 19(2), 47–53.
Andriyani, E., Fais, N.L., Muarifah, S., 2019. Perkembangan Penelitian Metode
Deteksi Kandungan Babi untuk Menjamin Kehalalan Produk Pangan Olahan.
Journal of Islamic Studies and Humanities, 4(1), 104–126.
Bintang, M., 2018. Biokimia : Teknik Penelitian, 2nd ed. Penerbit Erlangga,
Jakarta.
Butler, J.M., 2005. Forensic DNA Typing, Elsevier Academic Press.
Cahyono, H.B., Yuliastuti, R., Amanati, L., 2018. Pengaruh Penggorengan
Terhadap Kandungan Nitrit Dalam Kornet. Jurnal Teknologi Proses dan
Inovasi Industri, 3(2), 57–62.
Calderón-Franco, D., Lin, Q., van Loosdrecht, M.C.M., Abbas, B., Weissbrodt,
D.G., 2020. Anticipating Xenogenic Pollution at the Source: Impact of
Sterilizations on DNA Release From Microbial Cultures. Frontiers in
Bioengineering and Biotechnology, 8(171), 1–13.
Chandrika, M., Maimunah, M., Zainon, M.., Son, R., 2010. Identification of The
Species Origin of Commercially Available Processed Food Products by
Mitochondrial DNA Analysis. International Food Research Journal, 17(1),
867–875.
Che Man, Y.B., Aida, A.A., Raha, A.R., Son, R., 2007. Identification of Pork
Derivatives in Food Products by Species-Specific Polymerase Chain
Reaction (PCR) for Halal Verification. Food Control, 18(7), 885–889.
Che Man, Y.B., Mustafa, S., Khairil Mokhtar, N.F., Nordin, R., Sazili, A.Q.,
2012. Porcine-Specific Polymerase Chain Reaction Assay Based on
Mitochondrial D-loop Gene for Identification of Pork in Raw Meat.
International Journal of Food Properties, 15(1), 134–144.
Crisafuli, F.A.P., Ramos, E.B., Rocha, M.S., 2015. Characterizing the Interaction
between DNA and GelRed Fluorescent Stain. European Biophysics Journal,
44(1), 1–7.
Desler, C., Marcker, M.L., Singh, K.K., Rasmussen, L.J., 2011. The Importance
of Mitochondrial DNA in Aging and Cancer. Journal of Aging Research,
2011(17), 1–10.
Erwanto, Y., 2018. Molecular Based Method Using PCR Technology on Porcine
Derivative Detection for Halal Authentication, in: Abdurakhmonov, I. (Ed.),
Genotyping. IntechOpen, pp. 65–84.
Fadhlurrahman, Wardani, A.K., Endrika, W., 2015. Deteksi Gelatin Babi Pada
Soft Candy Menggunakan Metode PCR-RFLP Sebagai Salah Satu
Pembuktian Kehalalan Pangan. Jurnal Teknologi Pertanian, 16(2), 81–88.
Farias, I.P., Ortí, G., Sampaio, I., Schneider, H., Meyer, A., 2001. The
Cytochrome b Gene as a Phylogenetic Marker: The Limits of Resolution for
Analyzing Relationships Among Cichlid Fishes. Journal of Molecular
Evolution, 53(2), 89–103.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
Farmawati, D., Wirajana, I., Chandra Yowani, S., 2015. Perbandingan Kualitas
Dna Dengan Menggunakan Metode Boom Original Dan Boom Modifikasi
Pada Isolat Mycobacterium Tuberculosis 151. Jurnal Kimia, 9(1), 41–46.
Fatchiyah, Arumingtyas, E.L., Widyarti, S., Rahayu, S., 2011. Biologi Molekular
Prinsip Dasar Analisis.
Fibriana, F., Widianti, T., Retnoningsih, A., Susanti, 2012. Deteksi Daging Babi
Pada Produk Bakso di Pusat Kota Salatiga Menggunakan Teknik Polymerase
Chain Reaction. Biosantifika, 4(2), 106–112.
Fitrilia, Deswinar, Raihana, N., 2017. Deteksi Kandungan Gen Sitokrom b (Cyt b)
Babi pada Bakso yang Beredar di Kota Jambi Menggunakan Teknik
Polymerase Chain Reaction 6(01), 21–25.
Fitriya, R.T., Ibrahim, M., Lisdiana, L., 2015. Keefektifan Metode Isolasi DNA
Kit dan CTAB/NaCl yang Dimodifikasi pada Staphylococcus aureus dan
Shigella dysentriae. LenteraBio, 4(1), 87–92.
Gao, L., Xia, W., Ai, J., Li, M., Yuan, G., Niu, J., Fu, G., Zhang, L., 2015.
Development of Multiplex PCR Assay for Authentication of Cornu Cervi
Pantotrichum in Traditional Chinese Medicine Based on Cytochrome b and
C oxidase Subunit 1 Genes. The Journal of DNA Mapping, Sequencing, and
Analysis, 27(4), 2989–2992.
Gay, L.R., Mills, G.E., Airasian, P.W., 2012. Educational Research :
Competencies for Analysis and Applications. Pearson, New Jersey.
Hariyadi, S., Narulita, E., Rais, M.A., 2018. Perbandingan Metode Lisis Jaringan
Hewan dalam Proses Isolasi DNA Genom pada Organ Liver Tikus Putih (
Rattus norvegicus ) The Comparison Lysis Methods of Animal Tissue in
Genomic DNA Isolation Process in Liver Organ of White Rat ( Rattus
Norvegicus ). Proceeding Biology Education Conference, 15(1), 689–692.
Hidayat, T., 2017. DNA Mitokondria (mtDNA) Sebagai Salah Satu Pemeriksaan
Alternatif Untuk Identifikasi Bayi Pada Kasus Infantisida. Jurnal Kesehatan
Andalas, 6(1), 213–221.
Hidayati, H., Saleh, E., Aulawi, T., 2016. Identifikasi Keragaman Gen BMPR-1B
(Bone Morphogenetic Protein Receptor IB) pada Ayam Arab, Ayam
Kampung dan Ayam Ras Petelur Menggunakan PCR-RFLP. Jurnal
Peternakan, 13(1), 1.
Hutami, R., Bisyri, H., Sukarno, S., Nuraini, H., Ranasasmita, R., 2018. Ekstraksi
DNA dari Daging Segar untuk Analisis dengan Metode Loop-Mediated
Isothermal Amplification (LAMP). Jurnal Agroindustri Halal, 4(2), 209–
216.
Iqbal, M., Buwono, I.D., Kurniawati, N., 2016. Analisis Perbandingan Metode
Isolasi DNA Untuk Deteksi White Spot Syndrome Virus (WSSV) pada
Udang Vaname (Litopenaeus vannamei). Jurnal Perikanan Kelautan, 7(1),
54–65.
Irekhore, O.T., 2012. General Overview of Pig Production, Enterprise Selection
Establishment.
Irianto, K., 2017. Biologi Molekuler. Penerbit Alfabeta, Bandung.
Jain, S., Brahmbhatt, M.N., Rank, D.N., Joshi, C.G., Solanki, J. V., 2007. Use of
cytochrome b gene variability in detecting meat species by multiplex PCR
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
assay. Indian Journal of Animal Sciences, 77(9), 880–881.
Kamaliah, K., 2017. Perbandingan Metode Ekstraksi Dna Phenol-Chloroform Dan
Kit Extraction Pada Sapi Aceh Dan Sapi Madura. BIOTIK: Jurnal Ilmiah
Biologi Teknologi dan Kependidikan, 5(1), 60.
Lackie, J.M., Blackshaw, S.., Brett, C.., Curtis, A.S.G., Dow, J.A.T., Edwards,
J.G., Lawrence, A.J., Moores, G.R., 2007. The Dictionary of Cell and
Molecular Biology, 4th ed. Academic Press, California.
Ladoukakis, E.D., Zouros, E., 2017. Evolution and Inheritance of Animal
Mitochondrial DNA: Rules and Exceptions. Journal of Biological Research-
Thessaloniki, 24(2), 1–7.
Langga, I.F., Restu, M., Kuswinanti, T., 2012. Optimalisasi suhu dan Lama
Inkubasi dalam Ekstraksi DNA Tanaman Bitti (Vitex cofassus Reinw) serta
Analisis Keragaman Genetik dengan Teknik RAPD-PCR. Jurnal Sains &
Teknologi, 12(3), 265–276.
Maftuchah, Winaya, A., Zainudin, A., 2014. Teknik Dasar Analisis Biologi
Molekuler. deepublish, Yogyakarta.
Maitriani, L.K.B., Wirajana, I.N., Yowani, S.C., 2015. Desain Primer untuk
Amplifikasi Fragmen Gen inhA Isolat 134 Multidrug Resistance
Tuberculosis (MDR-TB) dengan Metode Polymerase Chain Reaction. Cakra
Kimia (Indonesian E-Journal of Applied Chemistry), 3(2), 89–96.
Marwayana, O.N., 2015. Ekstraksi Asam Deoksiribonukleat (DNA) dari Sampel
Jaringan Otot. Oseana, 15(2), 1–9.
Matsunaga, T., Chikuni, K., Tanabe, R., Muroya, S., Shibata, K., Yamada, J.,
1999. A Quick and Simple Method For The Identification of Meat Species
and Meat Products by PCR Assay 51(1), 143–148.
Mulyani, Y., Purwanto, A., Nurruhwati, I., 2011. Perbandingan Beberapa Metode
Isolasi Dna Untuk Deteksi Dini Koi Herpes Virus (Khv) Pada Ikan Mas
(Cyprinus Carpio L.). Jurnal Akuatika Indonesia, 2(1), 244185.
NCBI, 2013. Sus scrofa Mitochondrion Complete Genome.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000845.1?report=genbank,
diakses pada tanggal 15 Desember 2020
NCBI, 2009. Bos Taurus Mitochondrion, Complete Genome.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_006853.1?report=fasta&from=14
514&to=15653, diakses pada tanggal 14 Mei 2021
Nollet, L.M.L., Toldrá, F., 2011. Safety Analysis of Foods of Animal Origin.
CRC Press, New York.
Novitasari, D.A., Elvyra, R., Roslim, D.I., 2014. Teknik Isolasi dan Elektroforesis
DNA Total Pada Kryptopterus apogon (Bleeker 1851) dari Sungai Kampar
Kiri dan Tapung Hilir Kabupaten Kampar Provinsi Riau. Jurnal Online
Mahasiswa FMIPA, 1(2), 258–261.
Prakoso, S.P., Wirajana, I.N., Suarsa, I.W., 2016. Amplifikasi Fragmen Gen 18S
rRNA Pada DNA Metagenomik Madu Dengan Teknik PCR (Polymerase
Chain Reaction). Indonesian Journal of Legal and Forensic Sciences, 2(3),
45–47.
Primasari, A., 2011. Sensitivitas Gen Sitokrom B ( Cyt b ) Sebagai Marka
Spesifik Pada Genus Rattus dan Mus Untuk Menjamin Keamanan Pangan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
Puspitasari, R.L., Elfidasari, D., Perdana, A.T., 2019. Deteksi Kandungan Babi
pada Makanan Berbahan Dasar Daging di Kampus Universitas Al Azhar
Indonesia. Jurnal Al-Azhar Indonesia Seri Sains dan Teknologi, 5(2), 66.
Rachmawati, Y., Rokhim, S., Munir, M., Agustina, E., 2018. Deteksi Kontaminan
Fragmen DNA Pengkode cyt b Babi Pada Sampel Softgelcandy Tak Berlabel
Halal. Indonesia Journal of Halal, 1(1), 25–30.
Rahayu, W.P., Dianti, A.R.W., Nurjanah, S., Pusparini, N., Adhi, W., 2020.
Detection of DNA Pork in Processed Meat Products with Real-Time
Polymerase Chain Reaction. Food Research, 4(5), 1719–1725.
Rau, C.H., Yudistira, A., Simbala, H.E.I., 2018. Isolasi, Identifikasi Secara
Molekuler Menggunakan Gen 16S rRNA, Dan Uji Aktivitas Antibakteri
Bakteri Simbion Endofit Yang Diisolasi Dari Alga Halimeda opuntia.
Pharmacon, 7(2), 53–61.
Solihin, D.D., 1994. Peran DNA Mitokondria (mtDNA) dalam Studi Keragaman
Genetik dan Biologi Populasi pada Hewan. HAYATI Journal of Biosciences,
1(1).
Swindle, M.M., 2007. Swine in The Laboratory.
Utami, S.T., Kusharyati, D.F., Pramono, H., 2013. Pemeriksaan Bakteri
Leptospira pada Sampel Darah Manusia Suspect Leptospirosis menggunakan
Metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Balaba, 9(02), 74–81.
Wandia, I.N., 2001. Genome Mitokondria. Jurnal Veteriner,.
Wardani, A.K., Sari, E.P.K., 2015. Deteksi Molekuler Cemaran Daging Babi pada
Bakso Sapi di Pasar Tradisional Kota Malang Menggunakan PCR
(Polymerase Chain Reaction). Jurnal Pangan dan Agroindustri, 3(4), 1294–
1301.
Widayanti, R., Solihin, D.D., Sajuthi, D., 2004. Kajian Penanda Genetik Gen
Cytochrome B pada Tarsius sp. Jurnal Sain Veteriner, 24(1), 1–8.
Widowati, E.W., 2013. Desain Primer Sitokrom B (cyt b) Sebagai Salah Satu
Komponen PCR (Polymerase Chain Reaction) Untuk Deteksi DNA Babi,
Laporan Penelitian Individual.
Wijaya, H., Darmawati, S., Kartika, A.I., 2018. Deteksi Daging Babi pada Tiga
Merek Kornet Sapi Berdasarkan Gen Cytochrome b dengan Metode PCR.
Prosiding Seminar Nasional Mahasiswa Unimus, 1(1), 157–162.
Zulfahmi, 2015. Deteksi Kontaminan Babi Pada Produk Makanan Menggunakan
Teknologi DNA Molekuler. Kutubkhanah: Jurnal Penelitian Sosial
Keagamaan,.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
Lampiran 1. Perhitungan Jumlah Sampel
Menurut Gay dkk. (2012), penentuan jumlah sampel pada penelitian
deskriptif, yaitu minimal 10% dari jumlah populasi yang luas, dan minimal 20%
dari jumlah populasi yang relatif kecil (kurang dari sama dengan 30). Berdasarkan
hasil survey terkait jumlah populasi kornet sapi yang tersebar di Daerah Istimewa
Yogyakarta yaitu 19-23 merk, sehingga perhitungan sampelnya sebagai berikut.
20% × 19-23 merk = 3,8-4,6 merk ~ 3-5 merk
Jumlah sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 5 merk kornet
sapi. Dengan demikian, jumlah ini sudah memenuhi persyaratan sampel untuk
penelitian deskriptif. Hal ini diperkuat pada penelitian Wijaya dkk. (2018) yang
juga merupakan penelitian deskriptif menggunakan 3 sampel kornet sapi, dimana
jumlah 3 ini sudah berada di rentang populasi sampel kornet sapi pada
perhitungan di atas.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
Lampiran 2. Hasil elektroforesis isolat DNA
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
Lampiran 3. Hasil elektroforesis Produk PCR
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
Lampiran 4. Informasi Pemakaian FavorPrep™
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
Lampiran 5. Informasi Produk DNA Ladder
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
Lampiran 6. Informasi Produk Nucleic Acid Gel Stain
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
Lampiran 7. Pemakaian ExelTaq™ PCR Master Dye Mix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi dengan judul “Identifikasi Gen Sitokrom
b (Cyt b) Babi Hutan Pada Kornet Sapi di Yogyakarta
dengan Metode Polymerase Chain Reaction” memiliki
nama lengkap Laurensia Kusumaningtyas Theodorus.
Penulis lahir di Sorong pada tanggal 11 September 1999
dan merupakan anak kedua dari pasangan Hengky
Theodorus dan Skolastika Anugerah Witanti. Pendidikan
formal yang telah ditempuh penulis yaitu TK Santa Agnes Kota Sorong (2003-
2005), SD Willibrordus I Kota Sorong (2005-2011), SMP YPPK St. Don Bosco
Kota Sorong (2011-2014) dan SMA YPPK Agustinus Kota Sorong (2014-2017).
Penulis melanjutkan pendidikan sarjana S1 pada tahun 2017 di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama masa perkuliahan, penulis aktif
mengikuti organisasi dan kegiatan kemahasiswaan. Organisasi yang diikuti
penulis adalah Unit Kegiatan Mahasiswa (UKM) Jalinan Kasih Mahasiswa
Katolik (JKMK) sebagai Wakil Ketua UKM JKMK periode 2018/2019 dan Badan
Eksekutif Mahasiswa Farmasi (BEMF) sebagai contact person BEMF sekaligus
koordinator Hubungan Masyarakat periode 2018/2019 serta sebagai wakil
gubernur eksternal BEMF periode 2019/2020. Kegiatan kemahasiswaan yang
pernah diikuti penulis seperti anggota Divisi Acara Pelepasan Wisuda II 2017,
anggota Divisi Bandzen TITRASI 2018, anggota Divisi Pendamping Kelompok
TITRASI 2019 dan steering committee FACTION#4 2019. Penulis juga aktif
mengikuti Unit Kegiatan Fakultas (UKF) Paduan Suara Farmasi (PSF)
“Veronika” dan berpartisipasi dalam lomba Vocal Group pada acara USD Talent
2019 dan berhasil meraih juara 1. Penulis juga berpartisipasi dalam kegiatan
Pengabdian Masyarakat sebagai Volunteer Traditional Medicine Campaign 2017
dan pernah menjadi salah satu peserta Student Exchange Program 2020 di
Mahasarakham University (MSU) Thailand. Selain itu, penulis aktif sebagai
asisten dosen dalam Praktikum Biologi Sel Molekuler 2018 dan 2019, Praktikum
Mikrobiologi 2019 dan 2021, dan Praktikum Pharmaceutical Care 3 2021.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI