IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
OPTIKASI FASE MOBIL PADA HPLC UN'M ANALISIS CAMPURAN
PARASETAMOL, KOFEINA DAN PROPIFENAZON
ifcl;' /dcJ Ice o
.'I.IL .. ItPUSTAJIi.ull
• ... SRSITAS Ala.IIA"-&"t ,---=1 U II. A B A 'I' A I
TESIS Diajukan Untuk Memenuhi Persyaratan Pendidikan
Pascasarjana Program Studi Ilmu Farmasi
OLEH : SRI POEDJIARTI
UNIVERSITAS AIRLANGGA FAKULTAS PASCASARJANA
1988
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
TESIS
DIAJUKAN UNTUK MEMENUHI PERSYARATAN
·PENDIDIKAN PASCA~ARJANA PROGRAM GELAR
PROGRA~ STUDI ILMU FARMASI
01eh
Sri Poedj iarti
NIM: 098410072 M
Disetujui oleh pemb~bing
"----=----,,....,.,-.....,,.---Dr so. Soem.adi
NIP: 130189849
Program Studi
NIP
.--===----------------
Cholies Zaihi
NIP : 130355372
130517154
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
•
PANTIA PENILAI / PENGUJI TESIS
Ketua Drs. LB. Pasha
Anggota . Drs. Soemadi . Dr. Ami Soewandi J.S
Dr. 1I. Zainuddin
Dr. Gunawan Indrayanto
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
UCAPAN TERIHA KASIH
Atas berkat rahmat Allah yang maha kuasa, tesis inl
dapat diselesaikan untuk memenuhi persyaratan Pendidikan
Pascasarjana Program Gelar , Program stud! llmu Farmasi,
Fakultas Pascasarjana Universitas Airlangga.
Untuk itu terima kasih yang sedalam-dalamnya saya sampaikan
kepada
Universitas Airlangga khususnya Fakultas Farmasi, yang
telah memberikan kesempatan untuk menglkutl Program
Pendidikan Pascasarjana dan Fakultas Pascasarjana yang telah
mengelola program pendidikan Pascasarjana.
Tim Manajemen Program Doktor TMPD}
Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia,
memberikan biaslswa selama pendidikan.
Jurusan Kimia Farmasi Fakultas Farmasi
Departemen
yang telah
Universitas
Airlangga, yang telah menyediakan £asilitas selama peneliti
an.
perpustakaan Universitas Airlangga, yang telah
menyedlakan acuan-acuan yang sangat membantu selama penelltl
an.
Drs. Soemadi dan Dr. H.Zainuddln, yang telah membimbing
dan banyak memberikan saran selama penelitlan.
Dr. Gunawan Indrayanto, yang telah membantu dalam
pengoperasian HPLC.
11
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
iii
Semua pihak yang tidak dapat saya sebut satu persatu,
yang telah memberikan dorongan moral maupun material selama
saya mengikutl program pendidikan Pascasarjana.
Suam!, anak-anak dan seluruh keluarga yang memberlkan
pengertian serta dorongan hlngga selesainya tests inl.
Semoga Allah SWT memberikan balasan yang setlmpal.
Amin.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
ABSTRAK
Dalam usaha untuk mendapatkan kondisi optimal pada
anallsis sediaan analgesik campuran parasetamol, kofeina dan
propifenazon dengan HPLC, telah dilakukan optimasi fase
mobil, Buhu kolom dan pH.
Hasil optimasi fase mobil menggunakan campuran metanol-
air dengan cara "window diagram", dldapatkan kondisi optimal
pada campuran metanol-air dengan perbandingan masing-masing
65\ dan 35\ .
Berdasarkan kriteria hargaot dan Rs pada optimasl suhu
kolom dan pH dihasilkan kondisi optimal pada pH = 7 dan suhu o
kolom 50 C.
Aplikasi anal isis kuantitatif dilakukan terhadap serbuk
campuran parasetamol, kofeina dan propifenazon sesua! formula
sediaan memberikan ketelltian yang cUkup baik untuk
parasetamol ( "recovery" 102,58\ dan KV 1,49% ) dan
propifenazon ("recovery" 98,80\ dan KV 2,83\), sedangkan
ketelitlan untuk kofeina kurang balk ("recovery" 96,88\ dan
KV 9,70\). Hasil uji t menunjukkan ketepatan yang baik untuk
kofeina dan proplfenazon ( tidak ada perbedaan yang bermakna
antara kadar rata-rata yang dlperoleh dengan kadar
sesungguhnya dan ketepatan yang kurang balk untuk
parasetamol ada perbedaan yang bermakna antara kadar
rata-rata yang dlperoleh dengan kadar sesungguhnya ) pada
derajat kemaknaan 0(= 0,05
iv
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
DAFTAR lSI
UCAPAN TERIHA KASIH ............................ .
ABSTRAK ••• ...................................... DAFTAR lSI ... ................................... DAFTAR TABEL. .................................. DAFTAR GAMBAR. . .............................. . DAFTAR LAMP IRAN •
BAB
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
I. PENDAHULUAN .................................
II.
1. Latar belakang · ......................... . 2. Permasalahan · ........................... . 3. Tujuan penelitian ........................
TINJAUAN PUSTAKA · ......................... . 1. Tinjauan tentang HPLC
1.1. Teari dasar
................... · ......................... .
1.2. Kromatografi fase balik · ............. . 1.3. Optimasi dalam kromatografi cair
1.3.1 .Optimasi fase mobil · ............. . 1. 3.2 .Optimasi suhu dan pH · ............. .
1.4. Analisis kuantitatif .................. 1.5. Peralatan · ........................... .
·2. Tinjauan tentang bahan obat ................•
2.1. Parasetamol · ........................... . 2 .2.
2.3.
Propifenazon ............................ .
Kofeina . ................................ .
v
Halaman
il
iv
v
ix
xi
xiii
1
1
4
5
6
6
6
1/'
16
18
22
23
24
21
28
28
28
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
III. BAHAN, ALAT DAN METOOE ••••.•• .•••••••••..• 30
1. Bahan ..•...••............••.......•...• 30
2. Alat •....•..•••..••••..•...•....••.•••. 30
3. Hetode ...•...........••...•.........••• 31
3.1. Uji kualitatif bahan obat yang digunakan 31
3.2. Pembuatan larutan sampel .... ..••.••.. 31
3.2.1.Pernbuatan larutan standar tunggal ••• ~1
3.2.2.Pembuatan l~rutan sampel campuran
parasetamol,Kofeina dan propifenazon
3.3. Optimasi parameter •.•••••••••••.••••• 32
3.3.1.0ptimasi fase mobil................. 32
3.3.2.Penentuan campuran fase mobil optimal 33
3.3.3.Penentuan suhu optimal ".............. 33.
3.3.4.Penentuan pH optimal •...••.•.••••.•• 33
3.4. Penetuan Kadar parasetamol,kofeina dan
propifenazon dalam sampel ............ 33
3.4.1.Pembuatan sampel campuran parasetamol,
kofelna dan proplfenazon ........... . 34
3.4.2.Penetuan kurva kalibrasi campuran
parasetamol, kofeina dan proplfenazon 34
3.4.3.Pembuatan larutan sampel
................... 3.4.4.Perhitungan kadar
3.5. Analisa data .........................
35
35
3.5
IV. HASIL PENELITIAN •.•..••••••••••••••••.•.••. 37
I.Hasil uji kualitati£ palasetamol, kofeina
d 'f 3.7' an propl enazon ........................ .
vi
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
1.1. Penentuan spektra absorbs! ........... .
1. 2. Penentuan suhu lebur ................. .
2. Optimasi parameter ..................... .
2.1. Optimasi fase mobil .................. .
2.1.1. Penentuan harga Rs dan 0(. dengan fase
mobil asetonitril-air ............... .
2.1.2. Penentuan harga Rs dan 0( dengan fase
mobil metanol~air
2.2. Penentuan suhu kolom optimal ......... .
2.3. Penentuan pH optimal ................. .
3. Penentuan kadar parasetamol, ko£eina dan
propifenazon dalam sampel .... : ......... .
3.1. Penentuan kurva kalibrasi campuran
parasetamo!, kofeina dan propifenazon .
3.2. Penentuan kadar campuran parasetamol,
kofeina dan propifenazon dengan metode
standar eksternal ..................... 3.3. Perhitungan kadar ..................... 4. Analisa data ........................... .
V. PEMBAHASAN . ............................. . VI. KESIMPULAN ............................... VI I . SARAN -SARAN ............................. .
VIII. OAFTAR PUSTAKA .......................... .
r-------WI all.
nlIlPUSTAI~ • nlTBaSIT A.S A.lllU ..... I
IUJlA .... Y4
37
37
45
45
45
51
56
56
62
62
:67
68
68
74 . '. eo
.81
82
vU
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
DAFT AR TABEL
TABEL
1. Retensi relatif (C() dan resolusi (Rs) dari
parasetamol terhadap kofeina dan propifena-
zon dengan fase mobil asetonitril-air ••.•.
2. Retensi relatif (c() dan resolusi (Rs) dari
parasetamol terhadap kofeina dan propifena-
zon dengan lase mobil metanol-air
3. Retensi relatif (ae) dan resolusi (Rs) dari
parasetamol terhadap kofeina dan propifena-
zon dengan lase mobil metanol-air ( 65:35 )
pada suhu yang berbeda ••••••••••••••••••••
4. Retensi relatif (c(.) dan resolusi (Rs) dari
parasetamol terhadap kofeina dan propifena-
zon dengan fase mobil metanol-air ( 65:35 ) o
suhu 50 C pada pH yang berbeda •..•••••••••
5. Hasil pengamatan penetapan kadar
parasetamol, ko£eina dan propifenazon dalam
sampel dengan HPLC ...................... 6. Hasil penetapan kadar parasetamol dalam sam-
pel dengan metode standar eksternal
7. Hasil penetapan kadar kofeina dalam sampel-
dengan metode standar eksternal •. , ••.•••..
8. Hasil penetapan kadar propifenazon dalam
sampel dengan metode standar eksternal ....
Lx
Halaman
46
51
56
58
70
71
72
73
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
9. Waktu retensi dari parasetamol, kofeina dan
propifenazon dengan fase mobil metanol-air
dalam berbagai perbandingan •..•....•..•••• 76
x
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
DAFTAR GAMBAR
GAMBAR
1. Spektra absorbsi parasetamol dalam pelarut-
metana! ................................... 2. Spektra absorbsi kofeina dalam pelarut
metanal ........... ~ ....................... . 3. Spektra absorbsi propifenazon dalam pelarut
metano! .................................... 4. Termogram DSC parasetamol ................ .
5. Termogram DSC kofeina .................... .
6. Termogram DSC propifenazon ............... .
7. Kromatograrn dengan fase mobil rnetanol-air
masing-masing 50%:50\, 60\:~O%, 65\:35\
dan 70\:30% .............................. .
8. Kromatogram dengan fase mobil
air masing-masing 40%:60\,
asetonitril-
50'1.: 50'1. dan
60%:40% .•••.••••••••••••••••••••••••••••••
9. Kurva hubungan harga 0( dengan fase mobi 1
asetonitrl1-air pada berbagai macam
perbandingan ............................. .
10.Kurva hubungan harga Rs dengan £ase mobil
asetonitril-air pada berbagai macam
perbandingan ............•.................
11. Kurva hubungan harga oc:: dengan fase mobIl
metanol-air pada berbagai rnacam perbanding-
an ........................................ xi
Halaman
38
39
40
42
43
44
47
48
49
50
53
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
12. Kurva hubungan harga Rs dengan fase mobil
metano!-air pad a berbagai macam perbanding-
an ........................................ 13. "Window diagram" untuk pemisahan
parasetarnol, kofeina dan propifenazon .....
14. Kromatogram dengan fase mobil metanol-air o 0 0
(65:35) pada suhu 30 C, 40 C dan 50 C ...
15. Kurva hubungan suhu dengan harga oc ,dengan
fase mobil metanol-air (65:35) ........... .
16. Kurva hubungan suhu dengan harga Rs dengan
lase mobil metano!-air (65:35) ............ 17. Kromatograrn dengan lase mobll metanol-air
o (65:35), suhu 50 C pada pH=3, pH=4, pH=5,
pH=6 dan pH=7 ............................ 18. Kurva hubungan pH dengan harga OC dengan
0
fase mobil metano!-air (65:35), suhu 50 C . 19. Kurva hubungan pH dengan harga Rs dengan
0
fase mobil metanol-air (65:35), suhu 50 C . 20. Kurva kalibrasi parasetamol ....•...••.••..
21. Kurva kalibrasi kofelna .................. .
22. Kurva kalibrasi propifenazon .............•
23. Kromatogram ana1isis kuantitatif campuran
parasetamol, kofeina dan propifenazon .....
54
55
57
59
60
61
63
64
65
55
67
69
xii
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
DAFT AR LAMP I RAN
LAMP IRAN
1. Uji t kadar rata-rata "recovery"
parasetamol dengan kadar sesungguhnya ....
2. Uji t dari rata-rata "recovery"
ko£eina dengan kada"r sesungguhnya •••••.••
3. Uji t dari rata-rata "recovery" propifena-
zon ....................................... 4. Hasli penetapan kadar campuran parasetamol,
kofeina dan propifenazon dengan HPLC
menggunakan standar eksternal .. ~ ......... . 5. Tabe 1 t .................................. .
6. Koefisien korelasi r xy •••..•••.••••.•••.••
7. Hasll perhitungan adanya korelasi linier
antara konsentrasi dan area ••.•••••..•..
xiii
Halaman
86
87
BB
B9
9~
91
92
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
1. Latar belakang.
BAS I
PENDAHULUAN
Produksi obat-obatan di Indonesia dalam dua dekade
.terakhir ini mengalami perkembangan yang sangat pesat baik
dalam jenis maupun jumlahnya. Termasuk di dalamnya ohat-obat
golongan
campuran.
analgesik, baik dalam bentuk tunggal maupun
Dari jumlah sediaan analgesik yang beredar di Indonesia
lebih ku~ang 35\ adalah kombinasi yang mengandung parasetamol
(1) • Dimana 10\ kombinasi tersebut adalah campuran
parasetamol, kofeina dan propifenazon yang diformulasi selain
untuk mengurangi des is parasetame1 dan prepifenazon, juga
untuk efek potensiasi dan memperkecil efek samping. Sedangkan
kofeina ditambahkan untuk menaikkan ni1ai
sakit (2).
ambang rasa
Berdasar kenyataan diatas, maka perlu dicari suatu meto-
de analisis kuantitatif maupun kualitatif yang dapat
diandalkan untuk kontrol kualitas obat guna menjamin mutu
ohat yang sedang diproduksi maupun yang telah beredar.
Penentuan kadar parasetamol dalam campuran obat
analgesik sangat sul1t dan memerlukan waktu yang cukup lama.
cara-cara yang selama ini diqunakan antara lain metode
spektrofotometri lembayung-ultra untuk campuran parasetamol
vitamin C (3), metode spektrofotometri in1 mempunyai kerugian
1
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
2
yaitu waktu analisisnya relatif lebih lama dan untuk
penentuan kadar secara simultan masing-masinq komponen dalam
campuran obat analgesik terse but harus mempunyai panjang
gelombang maksimum yang berbeda (4). Metode volumetri tidak
dapat digunakan secara langsung oleh karena dlperlukan
pemisahan komponen-komponennya terlebih dahulu. Misalnya
titrasi bebas air untuk penentuan kadar parasetamol, tidak
dapat dilakukan secara simultan dengan obat-obat yang
bersifat basa misalnya kofeina (5).
Untuk beberapa campuran parasetamol dalam sediaan obat
analgesik dapat dipisahkan dan sekaligus ditentukan kadarnya
dengan kromatografi cair tekanan tinggi ( HPLC ) (6,7).
Sampai saat in1 penentuan kadar kombinasi parasetamol,
kofeina dan propifenazon dengan HPLC belum pernah dilaporkan.
Sejak tahun 1967 HPLC merupakan salah satu metode
anal isis yang banyak dikembangkan untuk analisis obat-
obatan. Untuk mendapatkan
anal isis bidang farmasi
gambaran perkembangan
antara lain dengan
HPLC dalam
meninjau
banyaknya publikasi mengenai anal isis obat-obatan memakai
HPLC dalam jurnal-jurnal antara lain Journal of
Pharmaceutical Sciences atau Journal of Chromatography,
dimana ditemukan 5 - 10 publlkasi analisis obat dengan HPLC
setiap bulan pada tahun 1983 (8). Pada tahun 1984 92\
diantara obat-obatan baru yang didaftarkan ke FDA, memakai
HPLC sebagai metode analisisnya (9).
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
3
Geja!a in1 disebabkan karena HPLe mempunyai selektivitas
yang tinggl dan dapat digu.nakan untuk penetapan senyawa-
senyawa balk yang menguap, yang tidak menguap maupun yang
terurai karena pemanasan (10).
Ada beberapa parameter pada anal isis HPLC yang
mempengaruhi hasil anallsisnyai untUk mendapatkan pemisahan
yang terbaik dengan waktu anal isis yang relatif singkat
parameter-parameter t~rsebut dapat dioptimasikan (11) •
Optimasi dapat dilakukan terhadap kolom (fase diam), fase
mobil, suhu dan pH.
Menurut tear! solvofobik dari Horvath (12) yang
didasarkan pada polaritas solut dan £ase mobil, maka ada
beberapa macam cara optimasi £ase mobil yang dikemukakan oleh
para ahli antara lain: cara diagram tiga titik kapasitas
faktor (13), cara komputer (14), cara "window diagram"
(13,15,16) dan cara segi tiga dari Snyder (17).
Optimasi kolom jarang dilakukan karena biasanya kolom
yang dipakai sudah tertentu (panjang, ukuran partikel, cara
paking) (9).
Pada pemisahan dengan HPLC, perubahan suhu kolom
ditujukan untuk mempercepat analisis. Kenaikan suhu, pada
beberapa kasus dapat menyebabkan penurunan harga kapasitas
faktor (k) dari komponen. Besarnya pengaruh suhu kolom pada
barga kapasitas faktor ini berbeda untuk komponen-komponen
sampel tertentu. Efek ini telah terbukti dapat mempertinggi
selektivitas (IS).
r-- .. --1-"'-1-.----- l
t J1Il!.PUSTA&:....... \ -UIYBltSlTAS AlRh.,C.:~~1I t
'UitABAYA ~._ ---------_.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
4
Pengaturan pH dapat mengubah waktu retensi, oleh karena
so!ut-solut yang mengion akan berantaraksi lebih kuat dengan
lase mobil dari pada solut-solut yang tidak mengion. Sehingga
solut-solut yang mengion akan dielusi lebih cepat.
Beberapa keunggulan lain dari HPLC adalah . . dapat
digunakan untuk analisis kuantitatif campuran obat sekaligus
tanpa melakukan pemisahan terlebih dahulu, "reproducible" dan
waktu anal iSis yang slngkat (19).
2. Permasalahan.
cara analisis kombinasi obat analgesik secara simultan
dengan metode-metode : spektrofotometrl lembayung ultra dan
titrasi volumetri masih dijumpai kesulltan-kesulltan. Pada
penggunaan metode HPLC didapat hasil yang relatif memuaskan
dengan melakukan optimasi. parameternya.
Pada umumnya anal isis sediaan-sediaan analgesik dapat
dilakukan dilakukan dengan car a HPLC, antara lain karena
adanya perbedaan polaritas dari masing-masing komponen
analgesik.
Sampai saat ini , anal isis campuran parasetamol, kofeina
dan propifenazon belum pernah dilaporkan
Berdasarkan hal-hal tersebut diatas, maka timbul
permasalahan apakah campuran parasetamol, kofeina dan
propifenazon dapat dianalisis dengan metode HPLC melalui
optimasi parameter-parameternya.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
5
3. Tujuan penelitian.
Bertitik tolak dart permasalahan yang telah diuraikan
dlatas, maka tujuan penelitian In1 adalah mendapatkan keadaan
kondisi parameter optimal pada anal isis HPLC untuk campuran
parasetamol, kofeina dan propifenazon.
Untuk mencapai tujuan itu dilakukan tahapan-tahapan :
1. Pemilihan dan optimasi fase mobil, optimasi suhu kolom dan
optimasi pH, yang dlukur berdasar kriteria harga resolusi
(Rs) dan harga retensi relatif (ot).
2. Pengujian hasil optimasi yang didapat, untuk analisis
contoh sediaan tablet campuran parasetamol, kofeina dan
propifenazon yang dibuat sesuai formula sediaan dan
diukur dengan ketepatan dan ketelitian pada 0(= 0,05 dan
replikasi lima kali. •
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
10 Tinjauan tontanq HoPoLoCo
Kromatografi terutama kromatografi cair sangat luas
digunakan untuk pemisahan dan analisis kimia. Tetapi sejak
diperkenalkan kroma~ografi gas oleh James dan Martin (20),
maka penggunaan kromatografi ca~r boleh dikatakan tidak
berkembang. Baru sejak 1967 krornatografi cair mengalami
kemajuan yang dramatis dan dapat menyaingi krornatografl
gas dalam hal kecepatan analisis, selektivitas dan
sensitivitas. Teknik yang baru in1 dikenal sebagai HPLC
(High Performance Liquid Chromatography) (20,21).
Meskipun kolom yang dlpakai pada HPLe relatif pendek
dibandingkan dengan kromatografi gas, tetapi kesulitan
pemisahan dapat diatasi karena HPLe mempunyai selektifitas
tingqi 0 Hal itu dipero1eh melalui pemilihan fase
mobil,pengaturan perbandingan fase mobil dan dapat
digunakan bermacam macam mekanisme pemisahan rnisalnya
adsorpsi, petukaran ion atau partisi (21).
Usaha pengembangan penggunaan kromatografi cair
pertarna tama dilakukan dengan pemilihan kolom yang lebih
efisien dan pengaturan fase mobil •
1.1. Teori dasar
Hekanisme pemisahan yang mendasari HPLC adalah proses
6
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
7
adsorpsi, partisi, pertukaran ion atau permeasi gel,
dimana mekanisme terse but pada dasarnya ada satu
kesamaan konsep yaitu konsep distribusi solut dalam
sistem dua fase yang dlnyatakan dengan koefisien
distribusi ( K ).
Distribusi solut dalam dua fase tersebut, yaitu
fase diam dan fase mobil dapat terjadl karena perbedaan
gaya adsorpsi . (kromatografi adsorps i) kelarutan
(kromatografl partial) afinltas terhadap resin penukar
ion (kromatografl pertukaran ion) atau ukuran/berat
molekul solut (kromatografl permeasi) (19).
Prinsip dasar yang dapat digunakan untuk semua tipe
kromatografi di atas adalah mekanisme pemisahan
berdasarkan perlstiwa partisl (22).
Dalam kromatografi partisl cair-cair, peristiwa
pemisahan dapat diterangkan melalui skema sebagai berikut:
------------------------------------------------------1
Fase mobil (M) 'I'" 1 -------------'t 1 1 1 1
------------------1----1-----1-----1------------------1 1 1 1
Fase dlam (8) 1 1 1 1 1 1 .v 1
------------------------------------------------------Fase mobil berfungsi sebagai pembawa dan penggerak
solut, yang akan bergerak sepanjang kolom (fase diam)
dengan kecepatan konstan.
Distribusi molekul salut (sampel) diantara dua fase
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
8
diatur oleh konstante kesetimbangan, yang dikenal
sebagai koefisien distribusi It, dalam hal partisl
disebut dengan koefisien partisi. Partisi adalah
proses dinamis dimana molekul selama bergerak rnengalami
kesetimbangan (keluar-masuk diantara dua fase) sehingga
pada suatu waktu tertentu perbandingan konsentrasi rata-
rata solut menurut hukum dist~ibusi sebagai berikut :
Cs K = ( 1 )
Cm
Cs = konsentrasi solut dalam fase diam
em = konsentrasi solut dalam fase mobil
Harga K menentukan perbandingan konsentrasi solut dalarn
dua fase. Bila harga K besar, maka Cs relatif lebih
besar dari pada em dan mo!eku!-molekul solut terse but
secara rata-rata akan tinggal lebih lama dalam fase
dlam. Pada kesetlmbangan dinamis fraksi waktu (terhadap
total waktu) yang dialami solut berada dalam fase mobil
ekivalen dengan fraksi solut (terhadap jumlah total
solut) yang berada dalam fase mobil.
Blla fraksi waktu solut dalam fase mobil adalah t,
maka
jumlah solut dalam fase mobil t = -------------------------------------______ _
jumlah total solut dalam fase mobil dan diam
Cm • Vm = ------------------
Cm . Vm t Cs . Vs
3
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
9
dimana Vm = volume fase mobil
Va = volume fase diam
Biia pembilang dan penyebut dibagi dengan Cm.Vm maka:
1 t = ----------------
l+Cs.Vs
Cm.Vm
1 = ----------------
Vs 1 + K -------
Vm
bila Vs K = k f
Vrn maka
1 t = --------- ( 2 )
1 + k t
dimana k I disebut fat tar kapasitas, yaitu perbandingan
jumlah molekul solut dalam £ase diam dan fase mobil.
Jarak tempuh solut (d) dalam pergerakannya
dlsepanjang fase diam adalah sama- dengan hasil kali
kecepatan linier fase mobil ~), dengan fraksi waktu
solut berada dalam fase mobil (t), maka dart persamaan 2
di atas didapat
1 d = Al -------- ( 3 )
1 + k I
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
10
Waktu yang dlbutuhkan solut untuk menempuh jarak
sepanjang kolom L, disebut waktu retens i « tL.
Darl definisi dan persamaan 3 maka :
L tr = ----- ( 1 + k' )
,u
tr = tm ( 1 + k' ) ( 4
dimana trn = waktu yang diperlukan molekul fase mobil
menempuh kolom • C. tm = L/jU ) (22, 23).
Pengukuran waktu retensi tidak dapat dipakai untuk
mengidentifikasi suatu komponen, karena tr dltentukan
oleh susunan dan cara kerja kolom, sehingga tr adalah
karakteristlk terhadap suatu komponen, tetapi tidak
spesifik. Haka untuk dapat mengidentifikasi suatu
komponen dapat dipakai parameter lain yang disebut
retensi relatif (0() dengan jalan membandingkan waktu
retensi komponen terse but dengan waktu retensi standar
pada kondisi kromatografi yang sarna
dapat dirurnuskan sebagai berikut
tr - tm oC =
tr* - tm
Retensi relatif
dirnana tr* = waktu retensi dari standar
tm = waktu yang diperlukan un~uk mengelusi
kornponen yang tidak ditahan oleh kolorn.
tr = waktu retensi dari kornponen sampel.
disini tm pada kondisi kromatografi yang sarna adalah
konstan (23).
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
11
untuk pemisahan ~ua kornponen, maka harga adalah
perbandingan waktu retensi dari komponen A dan a, dapat
dinyatakan seperti persamaan berikut :
tr B 0<: =
tr A
Sebagai pembilang adalah waktu retensi yang leblh
besar (24).
Hartin dan Synge mengernukakan adanya kesamaan
antara proses yang terjadl dalam kromatografi kolom dan
kolom destilasi fraks! yang disesuaikan dengan konsep
teeri pelat. Digambarkan bahwa kolom pada kromatografl
partisi terdiri dari sejumlah besar Delat teQritis iRl
yaitu sekat-sekat datal dimana terjadl kesetlmbangan
solut diantara fase mobil dan £ase dlam. Satu pelat
teoritis analog dengan satu unit mesln Craig ( akan
menghasilkan pemisahan yang sarna ).
Jumlah pelat teoritis (N) dapat dihitung secara
emplris dari kromatogram yang terjadl gambar 1 ) I
yai tu :
4 tr 2 N = ------ J ( 5 )
W
tr = waktu retensi.
W = lebar puncak kromatografi.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
12
'. Gambar 1 Hasil kromatogram sebuah komponen dalam
HPLC.
Banyaknya pelat tear i tis dapat digunakan sebagai
ukuran efisiensi kolom. Berdasarkan konsep in1 keadaan
ideal dapat didekati dengan cara meningkatkan jumlah
pelat teoritis, yang dapat dilakukan dengan cara mem-
perpanjang kolom yang digunakan. Tetapi cara In1 ter-
nyata tidak membantu banyak, sebab dengan memperpanjang
kolom dua kali lipat penyempitan lebar puncak yang
diperoleh hanya Vi dar i semula (23).
Besaran lain yang berhubungan dengan pelat teoritis
adalah HEIf. ("Height equivalent to a theoretical plate")
yaitu ukuran besarnya ruang atau unit kolom yang di
tempati oleh satu pelat teoritis ( = H). Dapat diru-
muskan sebagai berikut :
L H = ----- dar! persamaan 5, maka
N
L W 2 H = [ 1
16 tr
Keadaan ideal dicapai bila harga H mendekati 0 yang
dapat dilakukan dengan cara mengatur faktor-faktor yang
mempengaruhi harga H tersebut (23).
i .
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
13
Hal yang penting dalam melakukan pemisahan komponen
adalah dapat terpisahnya masing-masing komponen yang
dinyatakan sebagai derajat pemisahan atau Resolusi (RS).
Resolusi dari dua komponen seperti terlihat pada gambar
2 yang mempunyai waktu retensi ttl lebar dasar
puncak WI adalah
2 Rs = ----------------~----
~" ==:;/\t-'rl
~w~- -,.H --w;::.;r;....·_--
Gambar 2 Hasil kromatogram dua komponen
Untuk suatu pemisahan yang baik ( kedua puncak kom-
ponen terpisah sempurna hingga garis dasarnya ) maka
harga Rs hendaknya lebih besar dari 1,5 (22,23) Tetapi
untuk mencapai resolusi yang cukup pada pemisahan sampel
yang terdiri banyak komponen adalah sangat sukar. Cara
umum untuk memperbaiki resolusi adalah sebagai berikut :
1. Meningkatkan ~tr = tr2 dapat dilakukan
antara lain dengan :
a. meningkatkan panjang kolom L.
b. memperbaiki faktor pemisahan
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
14
tr 2 0<: =
tr 1
dengan merubah fase diarn dan fase mobil
2. Hempersempit lebar puncak (W) antara lain dengan:
a.menggunakan partikel paking kolom yang lebih
keell dan bentuknya seragam.
b.menlngkatkan area an tar fase, dilakukan dengan:
- optimasl·kecepatan aliran fase mobil.
- mengurangi jumlah sampel.
- menurunkan diameter kolom (23).
1.2. Kromatografi fase balik (Reversed phase chromatography).
Kelom bersifat non polar terdlri dar! ligand non polar
yang terikat pada permukaan partike! slIika mikro
porous. Dikenal beberapa macam kolom RPe antara lain:
- O.D.S.(Oktadesil sllan) : C 18.
- O.S.(Oktll allan) : C 8.
- C.N.(Sianopropil).
- Fenil etil.
Kerangka fase diam non polar dar! kolom RPC dapat
digambarkan sebagal berikut
c, c, c, C, I I I I
HO - 51- 0" SI _ 0 _Si_ D _ 5i
I /\ I /\ 0 0 0 0" 0 0
"=2,8,18 I / \ / \ -Si _ 0 - s, - 0 - s. - o - 50
- 0 _ ,,-I I I I I
P E R M U K A A N S I L I K A
Gamhar 3 . Kerangka fase diam kolom RPC. .
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
15
Fase mobil yang digunakan dalam RPC bersifat polar me
rupakan campuran metanal, asetonitril atau tetrahldro
furan dengan air.
Proses pemlsahan HPLC sebagian besar (70%J dl1akukan
memakai kolom RPC yang memiliki
antara lain :
keuntungan-keuntungan
- dapat digunakan dengan lingkup yang lebih luas.
- pada paklng RPC c~pat diperoleh kesetimbangan.
- solven organik yang digunakan lebih sedikit.
- pengoperasiannya lebih mudah.
Peristiwa
polaritas
terelusi
pemisahan pada RPC didasarkan atas perbedaan
solut. Molekul-molekul yang lebih polar akan
lebih dahulu dan molekul-molekul yang kurang
polar akan terelusi kemudian. In1 disebabkan karena
molakul-molekul polar berinteraksi relatif lebih kuat
dengan £ase mobil dan molekul-molekul yang kurang polar
akan diikat oleh fase diam (17).
Perbedaan kecepatan elusi solut dalam RPC dlnyatakan
sebagai waktu retensi atau faktor kapasitas, yaitu hasil
interaksi antara komponen- komponen sampel dan £ase diam
dalam kolom (6).
Mekanisme ikatan solut dengan rantai hidrokarbon pada
kolom RPC digambarkan oleh teori solvo£obik, yang secara
skematik dapat digambarkan sebagai berikut :
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
16
..... ' .. , sv
18·J7 • LG : •
SL :+- ~= gaya tarik
· ~ -= ikatan LG & SL
~\ LG = ligand non polar
SL = salut
SV = solven
Gambar 4 Ikatan antara solut dan ligand non
polar dari permukaan fase diam dalam RPe.
Garnbar diatas, terlihat adanya pengikatan dart LG dan SL
yang akan diperrnudah oleh penurunan luas permukaan
molekul SL yang berhubungan dengan solven. Blia daerah
kontak didalam ikatan dan tegangan permukaan sernakin
besar, maka lkatan SL (salut) dan LG (fase diam) sernak!n
kuat. Sebaliknya gaya tarik ("attractive interaction")
antara salut dengan solven disebabkan karena gugus-gugus
polar dalam solut mengurangi kekuatan ikatan. Jadi
kekuatan ikatan salut dengan ligand non polar pad a
permukaan Ease diam dihasilkan oleh perbedaan antara dua
efek diatas (12).
1.3. Optimasi dalam kromatografi cairo
Optimasi dalam pemisahan kromatografi calr adalah hal
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
17
yang penting, walaupun tidak mungkin melakukan optimasi
semua parameternya. Pada umumnya kriteria yang
dlgunakan untuk melakukan pemisahan beberapa komponen
dalam sampel adalah kualitas pemisahan, yang dihubungkan
dengan waktu pemisahan. Untuk in1 petlu diketahui e£ek-
efek yang mempengaruhi pemisahan •
Ada dua efek utama yang mempengaruhi mekanisme pernisah-
an yaitu :
Efek fislka, yaitu efek yang berhubungan dengan
f~ktor-faktor efisiensi kolom yang biasanya dlukur
dengan jumlah pelat teoritis (n) dan faktor kapasitas
( k ' ) •
Efek kimia I yaitu e£ek yang digambarkan oleh faktor
selektivitasOC::.
Pengaruh efek kimia dan fisika dalam pemisahan
digambarkan dalam persamaan sebagai berikut :
Vfl' k' « - 1 Rs = . ( ----- ) . (------- J
4 1 + k' oC
Dengan mempertimbangkan efek fisika, jika pakingnya
balk, ukuran partikel kelom keell ( 3 - 10 ~m maka
ternyata bahwa harga k" lebih kurang 1 10 akan
menghasilkan resolusi yang balk (11).
Dari efek-efek kimla dan fisika pada persamaan diatas
tidak dapat diramalkan pengaruh komposisi fase mobil
atau suhu terhadap retensi relati£ dari komponen yang
berbeda .
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
18
Lima variabel yang digunakan untuk mengubah
selektifitas kimia pada sistim kromatografi cair, yaitu:
- komposis! fase mobil
- komposisi fase diam
- suhu
- pH atau efek 10nik lain
- kesetlmbangan kimia sekunder
1.3.1. Optimasi fase mobil
Teari solvofobik dar! Horvath (12) menunjukkan bahwa
efek fase mobil adalah penting dalam pemisahan RPC
Pendekatan sistematik dimulai dengan konsep seql tiga
selektifitas solven yang dipakai dalam pengernbangan
dasar strategi pada optimasi komposisi fase mobil
(11) •
Beberapa cara optimasi fase mobil antara lain :
a. Diagram tiqa titik faktar kapasitas (kO) atau waktu
retensi (tr).
Diagram in1 menunjukkan dengan mudah komposisi fase
mobil yang diperlukan untuk menghasilkan suatu
pernisahan •
Secara garis besar tabapan yang dilakukan adalah :
Pertama, mencari komposisi isokratis dari fase
mobil biner ( didapat dari elusi gradien ).
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
19
Kedud, mencari sistem biner yang lain dengan cara
yang sarna diatas atau memakai diagram isaeluotropik
dari Schoenmakers et a1 (25) yang menunjukkan fase
biner lain dengan kekuatan yang sarna
Ketiga, dilakukan elusi terhadap sarnpel dengan
memakai tiga macam £ase mobil yaitu A , B dan
kombinasi A dan B masing-masing 50 \ dan dibuat ta-
bel waktu retensi dari ketiga fase mobIl diatas
Keempat, dibuat diagram tiga titik seperti gambar 5
dibawah in1 :
, k
~ ~ 1 y
,
A .% 50 B oA
Gambar 5 Diagram tiga titik untuk pemisahan
tiga komponen.
Dari diagram diatas dapat dll1hat bahwa Ease mobil
A tidak dapat memisahkan komponen Y dan Z, beqitu
pula fase mobil B . Dengan memakai kombinasi £ase
mobil A dan B rnasing-rnasing 50 \ maka kornponen X, Y
dan Z dapat terpisah (13).
111
,,-----------------------------------------
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
20
b. Cara " window diagram II
c.
Tahapan pertama dan kedua pada cara ini sarna dengan
cara diagram tiga titik I kemudian dibuat "window
diagram" berdasar data perbandingan waktu retensi.
Dari kurva dapat diketahui fase mobil optimum, yang
dltunjukkan oleh puncak yang tertinggi, seperti
terlihat pacta gambar berikut (lS)
'allo It:!
r A,L:::::::::~.~%rA~~--~.
Gambar 6 : "Window diagram" untuk pernisahan komponen
X,Y,Z
Cara segi tlga Snyder
Tahapan yang dilakukan pada cara in1 yaitu
Pertama, memilih kondisi umum yang
diinginkan, misalnya waktu analisis maksimum yang
diinglnkan, suhu kolorn dan kecepatan aliran fase
mobil. Kemudian mencari satu serf kondisi isokratls
yang memuaskan dengan cara elusi gradien atau
membuat 1 serf data elusi isokratik dengan
menurunkan persentase fase mobil secara bertahap.
Kromatogram yang didapat tidak mutlak semua
komponen harus terpisah sempurna. Komposisi £ase
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
21
mobil in1 diletakkan pada posisi A dalam segi tiga
optimasi pada garnbar 7.
Kedua, mencari kondisi isoeluotropik dari dua fase
mobil yang berbeda , berdasarkan kekuatan solven
atau dengan cara mengeliminasikan pada suatu nomo-
gram ( gambar 8 ). Kedua fase mobil in1 diletakkan
pada posisi B da·n C seqi tiga optimasi (gambar 7)
•
Gambar 7
" . 50/50
A
"IDle
• • .. 33/33 / 33
"C 50/50
." . B.'-,--__ ~~--.....J·a
Optlmasl fase mobil dengan cara II Seq!
T 19a Snyder "
60 DO 100 120 140 • I-+-t-I +I-t--l-H--il-+I -I -I- -\-1- ;-1 A celonll die I 'II a lor
o :;>0 40 un ." I..JIHI-+I-+I +1-11---t-+-1-11 MulhunollWulor
""
• " " ." '1 Tolrahydroluran/Walo r
Gambar 8 Nomogram isoeluotropik fase mobil pad a
kromatogra~i eair fase balik (RPe)(1?).
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
22
Ketiga, membuat empat kromatogram lagi dengan
komposisi fase mobil seperti yang dltunjukkan
titik-titik pada seqi tiga optimasl (gambar 7).
Hasil dari tujuh kromatogram dari tujuh macam fase
mobil dipilih yang memberikan pemisahan yang
terbaik (11,17,25).
1.3.2. Optimasi suhu dan pH
Kenaikkan a~au penurunan pH dapat merubah retensi
terutama pada solut yang terionisasi denqan kenalkkan
atau penurunan pH .Karena 501ut-solut 1n1 dalam bentuk
terionkan akan berinteiaksi lebih kuat dengan fase ,
mobil dari pada solut yang tidak terionkan, sehingga
akan terelusi lebih cepat (17).
Perubahan Buhu tidak digunakan secara luas untuk
merubah selektifltas dalam kromatografi call, walaupun
demikian Snyder et al (11), telah menunjukkan patensi
selektifitas pemisahan terhadap perubahan suhu .
Efek suhu dan pH dapat digambarkan sebagai variabel
terpisah terhadap fase mobil, karena masing-masing
sedikit pengaruhnya pada fase mobil. Menurut Glajach
dan Kirkland (11 ) dimungkinkan untuk melaku
kan optimasi pada jarak pH 3 - 8 dan suhu 300 - 70 0 C
dengan kombinasi fase mobil pada kolom RPC.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
23
1.4. Analisis kuantitatlf dengan HPte
Analisis kuantitatif dalam HPte didasar kan pada prinsip
bahwa tinggi puncak atau luas puncak kromatogram
adalah berbanding linier dengan konsentrasi solut (22).
Analisis HPte dapat dilakukan dengan tiga metode yaitu :
- metode standar eksternal
- metode standar internal
- metode adisi st'andar •
1.4.1. Metoda standar eksternal
Pada. cara In1 harus dibuat kurva kalibrasi dart satu
seri larutan standar yang konsentrasinya mendekati
• larutan sampel. ,Kurva kalibrasi dibuat antara luas
puncak tinggi puncak ) berbanding konsentrasi. Kadar
sampel diperoleh dengan menginterpolasikan pada grafik
yang dldapat. Bl1a dipakai metoda in1 maka seluxuh
tahapan anal isis harus di standarkan
mengurangi kes~lahan anal iSis (22).
1.4.2. Hetode standar internal
, untuk
Pada cara ini balk sampel maupun standar, dltambahkan
suatu komponen (standar internal) dengan konsentrasi
tertentu. Kurva kalibrasi dibuat antara ratio luas
(tinggi) puncak zat (sampel) terhadap lua. (tlnggi)
puncak standar internal dengan konsentrasi. Standar
internal yang dipakai harus mempunyai sifat fisika dan
kimia sarna atau harnpir sarna dengan zat yang akan
ditentukan dan mempunyai harga Rs (resolusl) yang
cukup balk pada proses analisis (22)., -ru.
"ItPUSTAI:.u. •• ... -''''BRSIT AS A1ltlJ./J(JQA':
.. IUIl.ABAV" { ......
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
24
1.4.3. Hetode adisi standa~ .
Pada cara in1 ditambahkan zat yang sarna dengan sampel
yang akan dltentukan kadarnya. Paling sediklt
diperlukan tiga konsentrasi yang berbeda Kurva
kalibrasi dibuat antara luas (tinggi) puncak dengan
jumlah penambahan
ekstrapolasl dapat
sesungguhnya.
1.5. Peralatan
standar.
dltentukan
Dengan
kadar
melakukan
sampel yang
Komponen utama pada HPLC adalah sistem pompa tekanan
tinggi, kolom dengan partikel fase diam yang keell dan
sistem detektor dengan sensitivitas tinggi. Syarat umum
untuk bag ian alat-alat itu adalah tahan tekanan dan ko
rosi, tidak bocor dan detektornya bervolurne mati yang
rendah (20).
Reservoir ~ mobil-
Dapat dibuat dari gelas atau baja tahan karat. Volume
nya tergantung dari tujuan analisa yang akan dilakukan.
Sebelum digunakan, fase mobil harus dibebaskan dari gas
yang terlarut ( degassing ) untUk mencegah terjadinya
penyumbatan pada kolom dan gangguan pada garis dasar
(base line) yang tergantung kepekaan detektornya.
Degassing dapat dilakukan dengan cara, dipanaskan sambil
diaduk dan direfluks, divakumkan, atau dlgetarkan dengan
qetaran ultrasonik (20,26).
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
25
Sistem pompa
Pompa HPLC digunakan untuk mendo~ong fase mobil melalui
kolom , biasanya dibuat dari gelas I baja tahan karat,
Teflon dan Sapphire. Tekanan pada sistem pompa dapat
mencapai 5000 psi pada kecepatan aliran fase mobil 3ml
per meni t. Pada analisa rutin, untuk menghasllkan
kecepatan aliran 2ml per menit tekanan diatur hanya
sampai 500 psi .. Aliran fase mobil dar! pompa harus
bebas dari pulsa-pulsa, karena dapat mengganggu
detektor. Kecepatan aliran yang dihasilkan dari pompa
harus reprodusibel dan konstan. Berdasar klasifikasinya
pompa HPLC dapat dibedakan menjadl 2 tipe, yaitu pompa
dengan kecepatan aliran konstan dan pompa dengan
tekanan konstan. Masing-masing tipe rnempunyal keuntungan
dan kerugian sendiri tergantung cara yang dipakai.
Sistem pompa ini dilengkapi dengan manometer untuk
memonitor tekanan pompa ), pengatur katup-katup tekanan
dan pencampur fase mobil (19,20).
F i 1 ter
Karena kecilnya diameter dari pipa-pipa yang digunakan
dalam HPLC, maka untuk mencegah penyumbatan digunakan
suatu penyaring ( filter) yang diletakan antara pompa
dan kolom. Filter ini harus tahan tekanan dan biasanya
digunakan filter tahan karat dengan diameter 2 um.
Filter juga perlu dipasang diantara reservoir dan pompa
untuk mencegah kerusakan katup pompa karena debu. Oleh
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
26
karena itu fase mobil dan larutao sampel sebelum
dilakukan dengan HPLC harus dibebaskan dar! partikel-
partikel yang tidak larut dengan alat khusus (19,20).
Injektor
Dikenal sistem injektor dengan septum dan sistem injek-
tor tanpa septum yang masing-masing mempunyai keuntung-
an dan kerugian sendiri. Untuk menginjeksikan sampel
dapat d~gunakan dua cara, yaltu :
on flow method, terutama bila digunakan tekanan ku-
.rang 1000 psi.
stop flow method, untuk cara inl aliran fase mobil
dihentikan sementara sarnpel diinjeksikan ke dalam
injektor.
Kalom untuk HPLC bervariasi, tergantung tipe pemisahan
yang diinginkan dan karakter fisika dar! mater! paklng.
dibuat dari baja tahan karat dengan presisi tinggi. Oi-
ameter dalam (internal diameters) sangat menentukan ha-
511 analisis. Untuk penggunaan analisis diameter kolom
pada umumnya 2,1 mm, 3,2 rom dan 4,5 mm. Panjang kolom
/ populer antara 10 - 39 em dan berbentuk lurus. Pa-yang
king kolom yang berdiameter keell 3 dan SUm )
digunakan untuk kolom yang pendek (10 - 15 em) karena
tingginya eflsiensi kolom yang diperoleh dan besarnya
penurunan tekanan. Kolom yang berbentuk U dan spiral
dapat menurunkan efisiensi kolom (20,27).
Sambungan kolom harus dibuat sedemikian rupa sehingga
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
27
volume mati keell dan .dan dicegah terjadinya ruang-ruang
yang menyebabkan sampel terkumpul dan diencerkan oleh
£ase mobil. Sambungan kolom biasanya berdiameter dalam
2,5 - 5 mm (20).
Pengatur suhu kolom
Kontrol suhu kolom pada HPLC sangat penting untuk men-
jaga reprodusibilitas hasil. Sebagai gambaran pada suao·
tu pemisahan kenaikan suhu 6 C dapat menyebabkan pe-
ngurangan waktu retensi sebesar 30 \ . Hal in1 terutama
bila digunakan kolorn RPC atau pertukaran ion.
Untuk kontrol suhu dapat dipakai pengatur s,uhu berke
mampuan dari suhu kamar sampai 60° C, dengan kepekaan
kurang lebih 0,2 0 C.
DetektoI"
Tujuan penggunaan detektor adalah untuk mengukur
konsentrasi sampel dalam fase mobil dan menghasilkan
sinyal listrik yang sebanding dengan konsentrasi sam-
pel (26). Detektor yang dipakai untuk HPLC adalah :
- detektor fotometrik .
- detektor refraktometer.
- detektor elektro kimia.
- detektor radio aktif.
Pada penelitian in1 digunakan detektor fotometrik
lembayung ultra pada panjang gelombang 254 nm.
2. Tinjauan tentang bahan obat.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
28
2.1. Parasetamol.
Parasetamol merupakan serbuk hablur berwarna putih,
larut dalam 70 bagian air, larut dalam 7 bagian etanol
(9S\},sangat sedikit larut dalam kloroform dan larut
dalam larutan alkali hidroksida (29). Mempunyai rumus
bangun sebagai berikut :
Panja~g gelombang serapan maksimum dalam metanal adalah
249 nm ( 29,30), melebur o
172 C (29).
pada jarak lebur 169
2.2. Propifenazon ( Isopropil antipirina ).
Propifenazon merupakan serbuk putih, tidak berbau dan
berasa pahit. Hempunyai rumus bang un sebagai berikut ;. ... •
°C=r~ '<><,Y'" CHo
Propifenazon larut dalam 400 baglan air, cepat larut
dalam alkohol dan kloroform (31,32). Panjang gelombang
serapan maksimum dalam metanal adalah 247 nm dan 275 nm o
dan mempunyai suhu lebuz: 103' C (30).
2.3. Kofeina ( 1,3,7 tz:imetilksantina ).
Kofeina mez:upakan sez:buk atau habluz: bentuk jarum,
bez:warna putih dan be rasa pahit. Hempunyai rumus bangun
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
29 o C"" o ."
sebagai berikut Ii •
Kofeina dapat larut dalam 46 bag ian air, larut dalam 66
bag ian etanol (95\), larut dalam 7 bagian kloroform dan
sukar larut dalam eter (29,31). Panjang gelombang
serapan maksimum dalam metana! adalah 272 nm dan rnelebur o
pada jarak suhu lebur 235 - 237,5 C (29).
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
BAB III
BAHAN, ALAT DAN METODE
1. Bahan
Selaln yang tersebut di bawah in1 adalah dari derajat
analitlk, sedangkan air adalah air bidestilata
a. Parasetamol, prod.uks i P. T. Riacima Abadi, Jakarta,
No.Batch JUP-214-1.
b. Isopropil antipirina (propifenazon), dari P.T.Hoechst
Pharmaceutical, Jakarta, No.Batch 227L856.
c. Kofeina, produksi E.Merck (4125156).
d. Metanal, derajat kromatografi, J.T.Beaker (9093-3).
e. Asetonitril, derajat kromatografi, B.D.H. UN No.1648.
2. Alat.
"High Performance Liquid Chromatograph" I Shimadzu LC SA,
dilengkapi dengan :-"Column oven unit eTO 2A"
filter Ultipor
-Rekarder "Chromatopac CR 2A (X)
-Detektor "Spectrophotometric gPO-I".
-Kolom O.D.S Zorbax (4,6 mm x 25cm)
-Penyaring millipore, dengan membran
TM N yang mempunyai
66 pori O,2..u •
Spectrofotometer, ItShimadzu Double Beam Spectrophotomete'r
U.V.260".
Differential scanning calorimeter Shimadzu DSC 30
dilengkapi dengan :-unit kontrol suhu DT.30
-rekorder R.22T
30
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
31
-sampel holder SeC-30
pH meter Fisher.
3. Hetode
3.1. Uji kualitatif terhadap bahan obat yang digunakan yaitu
denqan melakukan reaks! warna (spot test), menetapkan
spektra dengan alat spektrofotometer.
Henentukan Buhu Ie bur yang dl1akukan dengan D.S.C.
3.2. Pembuatan larutan sampel.
Sampel yang dlpakai adalah parasetamol, kofeina dan
propifenazon dalam bentuk tunqqal dan campuran dengan
konsentrasi masing masing 50 ppm dllarutkan dalam
pelarut metanal.
3.2.1. Pembuatan larutan standar tunggal.
Dibuat larutan standar tunggal parasetamol, kofelna
dan propifenazon masing masinq denqan kadar 50 ppm , dengan cara sebagai berikut . . Timbang seksama
parasetamol,kofeina dan propifenazon masing masinq 50
mg kemudian masing masing dilarutkan dalam metanol
sampai volume tepat 100,0 ml, kemudian masing masinq
dipipet sebanyak 1,0 ml dimasukkan kedalam 1abu ukur
10 ml dan ditambahkan metanol sampai volume tepat 10,0
ml.Larutan larutan tersebut sebelum digunakan disaring
melalui penyaring millipore.
3.2.2. Pembuatan larutao campuran parasetamol, kofeina dan
propifenazon sebagai larutao sampel
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
32
01 timbang seksama parasetamol, kofeina dan
propifenazon masing masing sebanyak 50 mg, bersama
sarna dilarutkan dalam metanol sampai volume tepat
100,0 mI. Dari larutan in1 dipipet I,D ml dan
diencerkan dengan metano! sampai volume tepat 10,0 mI,
didapat larutan sampel yang mengandung parasetamol,
kofeina dan propifenazon masing masing 50 ppm. Larutan
in1 sebelum digunakan dlsarlng rnelalui penyaring
millipore.
3.3. Optlmasi parameter
3.3.1. Optimasi eluen (fase mobil).
a. Pembuatan eluen campuran metanol-air
Dibuat lima macam eluen campuran metanol dan air
dengan konsentrasi masing masing 3D, 40, 50, 60 dan 70
% metanol. Semua larutan tersebut sebelum
dlsaring melalui penyaring millipore dan
"degassing" denqan getaran ultrasonlk.
b. Pembuatan eluen campuran asetonitril-air.
digunakan
dilakukan
Dibuat empat macam eluen campuran asetonitril dan air
dengan konsentrasi asetonltril masing masing 3D, 40,
50, ·dan 60 % .Semua larutan terse but sebelum digunakan
disarinq melalui saringan millipore dan dilakukan
"degassing" dengan getaran ultrasonik
tarutan sampel diatas dielusi menurut cara Snyder (17)
dengan fase mobil campuran metanol air dengan lima
,
"--------------------------------
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
33
perbandingan, dan campuran macam
dengan
menggunakan
empat
HPLC
macam
asetonitril-air
perbandingan,
Keadaan optimal dltentukan
berdasarkan kriteria harga Rs (resalusi) dan harga
retensi relatif (ot).
3.3.2. Penentuan campuran fase mobil optimal.
Penentuan fase mobil yang optimal dilakukan menurut
cara diagram Window (15).
3.3.3. Penentuan suhu optimal dari fase mobil optimal.
Oilakukan elusi sampel dengan £ase mobil optimal
dengan tiga macam temperatur. Keadaan optimal
berdasarkan kriteria harga Rs dan oC
3.3.4. Penentuan pH optimal dari fase mobil optimal dan suhu
optimal.
Dilakukan elusi sampel dengan £ase mobil optimal dan
suhu optimal dan yang dibuat dengan lima macam pH
dengan rnenambahkan larutan Hel 0,1 N sampai pH yang
dlkehendaki. Keadaan optimal dltentukan berdasarkan
harga Rs dan oC •
3.4. Penentuan kadar parasetamol, kofeina dan propifenazon
dalam sampel. Dilakukan penentuan kadar sampel campuran
parasetamol, kofeina dan propifenazon dengan
perbandingan yang sesuai formula sediaan yaitu 5:1:3
menggunakan fase mobil, pH dan temperatur
menurut cara standar eksternal.
optimal
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
34
3.4.1. Pembuatan sampel campuran parasetamol,kofeina dan
propifenazon.
Dibuat serbuk campuran parasetamol,kofeina dan pro-
pifenazon dengan perbandingan 5 : 1: 3, ditimbang
parasetamol 500 mg, kofeina 100 mg, propifenazon 300
mg dan serbuk pengisi 400 mg. Digerus sampai homagen.
3.4.2. Penentuan kurva kalibrasi parasetamol,kofeina dan
propifenazon.
Dibuat larutan tunggal murni parasetamol, kofeina dan
propifenazon dalam metanal dengan konsentrasi
parasetamol maslng-maslng 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm dan
150 ppm; konsentrasi Kofeina 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm dan
25 ppmj konsentrasi propifenazon 10 ppm, 25 ppm, 50
ppm dan 75 ppm. Kemudian dilakukan elusi terhadap
larutan-larutan diatas dengan fase mobil metanol-air
terpilih dan suhu terpilih, kecepatan fase mobil 1 ml
per menit. Dari data kromatogram yang didapat,
dibuktikan apakah luas area mempunyai korelasi yang
linier dengan konsentrasi dengan rumus
n. ~xy -':!x. ~y
rxy V "i-~~~ 7-=-"i;;-iT-)"i ~~-;;2--=-(~;-)2} Bila ada korelasi ( rxy > r tabel ) (lampiran 6), maka
dilanjutkan dengan perhitungan persamaan garis
regresi, dengan rumus
Y = B x + A
n.lxy - ,lx. SOY
B = -~~-i;2--=-(-i; )2
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
35
EY - B.:Ex A = ------------_ ( 33 ) •
n
3.4.3. Pembuatan larutan sampel.
Ditimbang teliti sampel butir 3.4.1. kurang lebih 290
mg (yang setara dengan 200 mg campuran bahan obat
berkhasiat) dilarutan dalam metanal sampai volume
tepat 100,0 mI. Kemudian disaring dengan kertas
saring. Dipipet -I,D ml filtrat dan diencerkan dengan
metanal sampai volume tepat 10,0 mI. Didapat larutan
sampel yang mengandung 200 ppm bahan berkhasiat.
Larutan in1 kemudian disaring melalui penyar Ing
millipore.
3.4.4. Perhitungan kadar.
Untuk mengetahui harga "recovery" ,( \ kadar yang
didapat kembal i) dapat
sebagai berikut
kdr Recovery =---- x 100 \
5.5
Keterangan
dihitung dengan
kdr = kadar yang ditunjukkan pad a kromatogram
5.S = kadar sesungguhnya (yang ditimbang)
3.5. Analisa data.
cara
Untuk mengetahui ketepatan akurasi dari hasil
percobaan, maka digunakan uji t dengan rumus
(Al-X)v"
+ t = ---------------SD
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
36
Keterangan
t = harga tetapan yang harganya tergantung pada
derajat bebas ( " degree of freedom" ) dan
peluang ( "probabi 11 ty" ) . .... = harga benar = 100 \.
V x - l! r so = "standard deviasl" = ---------------N - 1
Bila harga t perhltungan lebih keel! dari t tabel maka
dikatakan ketepatannya baik, karena tidak ada perbedaan
yang bermakna aotara " recovery " dengan kadar
sesungguhnya.
untuk mengetahul ketelitian (presisi) dari hasil
percobaan, maka digunakan rumus berikut :
so K V = X 100 \
x
K V = koefisien variasi.
Dalam hal ini, sernakin keel! harga koefisien variasi
sernak!n teliti.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
BAB IV
HASIL PENELITIAN
1. Hasil uji kualitatif terhadap parasetamol, kofeina dan
propifenazon.
Uji kualitati£ dilakukan penetapan spektra absorbsi
dan suhu lebur.
1.1. Penentuan spektra absorbsi, penentuan in1 dilakukan di
daerah panjang gelombang lembayung ultra dengan
menggunakan spektrofotorneter yang dilengkapi dengan alat
pencacat spektra. Hasi! yang diperoleh tertera pada
gambar 1,2 dan 3. Dari spektra lembayung ultra yang
didapat ternyata bahwa parasetamol rnenunjukkan adanya 2
puncak absorbs! yaitu pad a 251,8 nm dan 203,9 nm.
Ko£eina menunjukkan adanya 2 puncak absorbsi yaitu pada
A272,3 nm dan A206,4 nm. Propifenazon menunjukkan 3
puncak absorbs! yaitu pada ]"'275,5 nm, "-247,2 nm dan
A 202,8 nm. Dari spektra dapat disimpulkan bahwa
parasetamol,kofeina dan propifenazon memenuhi syarat
kemurnian karena puncak absorbsi ketiganya sesual
dengan data pus taka (29,30,31,32). Puncak dalam spektra
absorbsi pada daerah 200-206 nm ada1ah "cut off"
dari metanol sebagai pelarut.
1.2. Penentuan suhu lebur.
Penentuan in1 d11akukan dengan menggunakan D.S.C yang
dilengkapi alat pencatat. Termogram yang diperoleh ter-
37
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
r+-t-i -L
I
I ; - ~
200
1.
".f
, , ~~ . ,
-_,?o.
o . ,
-z.--,
I
250
38
i.
Gambar 1 : Spektra absorbs! parasetamol dalam pelarut metanal.
-. -.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
• • • • " • • ·
· ~
I . , ,
· , · , ., , J' . , -
i , · ,
"
"
, -.- I , , , , , I , , ,
" , --en- ,
, , , , .. , , , , i , i , , , , , , , , , , ,
-j r--+-- ,
, , , , , , ! , , , , , '.
2 ••
, , i , , , i , I , , , , I , , , , , , I , , , , , I , , , , , , , i , , , I , , I , , i , , , , , , , , , , ,
, , , , , , , , , , i , , , I , ,
, , , , , , , , , , , , , , , , , , I , , , , , , , . , ,
, , , , , , I , , , , i , , I ,
, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , i , , , , , , , , , , !
, , , I , , , I , , , , :
, : , , , ! , , : , , , , , ,
, , I I , i , : , , , , , , , , , , , , , , , , , ! I ! : , , , , , , , ,
, I i : , , , , , ,
)
, , , , , , , , I , i , , , , i , I , i I I , , , , , , , I I , , , , i , ; , I I I I I I , , I I , , , I , , , , I I , I , , , , , , , , , , , I , , I I
I , I , I , . , i '" i I , , , , , N I I I , I , . , I , i , , I , , , I , , , I Z I , i , , , , , , , , , , , I , , I
, , , I I -+ , , • i , , , ,
'" , , , I I , , , OJ , , , , I ~ I
, I :- .
, , , , , , , , , , , , I I I , , -, • , , , I , , , I ,
, , , I i --!--, ~+. , I ,
, , , , , : , . , , , , ! , , , , , , , , , , ! i I , , , , , ,
, , , : I , I , , : , ! , , , I , , , , , ! , : I , I , , , , , ! , ,
i , , , , I , , , , , , , 2 •• 300 I
Gambar 2 : Spektra absorbs! kofeina dalam pelarut metanal.
39
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
.
I '\
I I I I I I I \, I I I I ! I I I I I I I , I
! I I I I I I I I I I
" , I I I I I I " lit i '
I
r-j--
• · , ., ,..,-. • • .. -or' ~!-e-· ~
I I I I ! I I I I
I I " I i
-1_-"- 1-1 ;~i
I , ~
tJ I ,
, , I t-j-I
" , I '! I I I I Ii I
: ! ' j 1.1 i , , i ,
. --'- I I -,--- I
: -+ ~ I Ii, ! ,
, , /--. ~;" ,
~',
I I '
200 l
I I , I 1 , I I
I
! : 1\), ~l ]'1"- I r; I
z I
I ! -riJ I
'-, ! ! I~ I I
, ,
250
I I I I , I
1"0' ~-
.1 U'I
'- -". I VI' ,2 , I
I-L~ '-1 ' ! 'C·: I .,
j -l : 1-
t- ' , r---;---i ! I
I , ' I I , I ,
, ! J ••
I ;
,
, , , ,
f.---i.,..-:..... I _ I , .
, , lY " -;-- X
, .~
I I r u~':' H- "!.-, ,
300 I
Gambar 3 : Spektra absorbsi propifenazon dalam pelarut
metanol •
40
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTIi
41
tera pada gambar 4,5 dan 6.Ketlga termogam yang didapat
menunjukkan bahwa parasetamol melebur pada suhu 172,3° C
kofeina pada suhu 237,1° C dan propifenazon pada suhu o 103,17 C.
Berdasar data spektra lembayung ultra dan suhu lebur
diatas dapat dlsimpulkan bahwa Parasetamol, Kofeina dan
Propifenazon yang diperiksa memenuhi syarat kemurnian
(29,30,31,32) •
1.3. Uji kualitatif dengan reaksl warna ( spot test ).
1.3.1. Parasetamol.
a. Larutan sampel dalam air dltambahkan larutan besi
( I I I ) klorida akan terjadl warna biru ( 29 )
(memenuhi)
b. Sampel dldidihkan dengan 1 ml asam klorida selama 3
menit, kemudian ditambahkan 10 ml air, didlnginkan
tidak terbentuk endapan. Kemudian ditambahkan
larutan kalium bikromat 0,1 N, maka akan terjadl
warna violet yang tidak berubah menjadi merah (29)
(memenuhi) .
1.3.2. Kofeina.
Lebih kurang 5 mg sarnpel dilarutkan dalam 1 ml asam
klorida dalam cawan porselin, ditambahkan 50 mg kalium
klorat dan diuapkan di atas tangas air hingga kering.
Kemudian cawan diletakkan terbalik di atas bejana yang
berisi beberapa tetes amonia, rnaka slsa pengeringan
akan berwarna violet (29) (memenuhi).
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
42
• :;: '
... i ... _, ...
! " I ' ~ ,
','
, ,
Gambar 4 : Termogram OSC parasetamol •
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
43
. 100 150 200 25Q,
____ ~) .Oe
Gambar 5 : Termogram OSC kofeina •
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
o o
,
J I -'-. ~!
---c;ra
40
, . . . . j ~ --"">- ., ,
.~
-'--~ -' , o- , ..
f-
"
60
-!::--=-; ---'---,
-r r-, F
l::
~
C-, ! , L ! L
;
~
0 0
",,'
""I'
. , ,..1......-.....1----1_
J
.'-,
o·
80
", .. --.1
100 ____ +) tOe
Gambar 6 . . Termogram osc propifenazon
--F ....-o g
1-
L-J ~~_ _ .,J---=-_o_:"-'-""-
.-t
.\.
F-·~I-.j
, , ~~ , a
·0
-~.l-=-""-i 0,
_. :::
120
•
44
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
45
1.3.3. propifenazon.
Larutan sampel dalam air ditambahkan larutan DAB hldre
klorida akan terjadi warna violet (memenuhl).
2. Optimasi parameter.
2.1. Optlmasi fase mobil.
Dllakukan elusi larutan standar tunggal (3.2.1) dan
larutan campuran (3.2.2) dengan kondlsi kromatografl
sebagai berikut '- kolom ODS Zorbax
- suhu percobaan 40° C
- detektor u.v (254 nm)
- volume sampel yang diinjekkan 10,IUI
- kecepatan aliIan £ase mobil 1 ml/mnt
Kromatogram dengan fase mobil metanol-air dapat dilihat
pada gambar 7 dan dengan £ase mobil asetonitrl1-air
gambar 8.
2.1.1. penentuan harga Rs dan DC dengan lase mobil
asetonltril-air .
Berdasar kromatogram gambar 8 dapat dihitung harga Rs
dan 0( yang hasllnya dapat dillhat pada tabel 1.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
46
Tabel 1 Retens! relatif (OC) dan resolusi (Rs) dari
parasetamol
propl£ena zon
asetonltrll-alr.
terhadap
dengan
ko£eina
fase
dan
mobIl
-----------------------------------------------------
PERSENTASE ASETONITRIL
Rs loe 30 40 50 60
-----------------------------------------------------oC_ 1 1,18 1,10 1,05 1,06
IX - 2 > 23,5 4,95 3,00 2,37
Rs - 1 1,01 0,28 0,32 0,53
Rs - 2 • 6,65 5,62 .3,75
Keterangan :
OC 1 : parasetamol-kofeina.
OC 2 parasetamol-propifenazon.
Rs-l : parasetamol-kofeina.
Rs-2 parasetamol-proplfenazon.
Dari data pada tabel 1 dapat dlbuat grafik hubungan
antara persentase asetonitrll dengan hargac(,terl1hat
pada gambar 9, dan hubungan persentase asetonltrl1
dengan harga Rs yang terlihat pada gambar 10.
Dari tabel 1 terllhat bahwa fase mobil campuran
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
L6L', J Of: : Ol. J q?''-'
• 0 < :'c'; . ~ 3
I
47
I _PH~l:::· • ... 0
L8v'3 "' .. ... O£ : .:19 0
"' 2fv'S 0>
C . -.. .., ... - . ~ m e I
0>
I l;jtllS C ... ~ • m e c
0 L6L'S 14 N ... m
0.: 09
m c I " .... ...
0 ... C 0-
SS.!.'£: I
.
809': ) . . .
T I l~~lS
... 2SS'Lt ~
m 0 .., 14 W 0-e • • 14 .... 0-... ...
.c 0 •• 0 '" e .. .. ... C
" 0 ... ~ "" " m ... ... C 0
" >l C ." II m '" 0> ~ C "'
,.
" '" ." .. .... ... 0 e "' e m 10 m 14
.., 0> • " 0 ... .. .., 0 m m <f 14 e .. " 0 ... 0-14 0 H
'" 10 0. .. 00 : 0':
1I LH'v il d ft:3':'
I l~tllS' -- - '-
IR - P
erpustakaan Universitas A
irlangga
TES
ISO
PTIM
ALIS
AS
I FAS
E M
OB
IL ...S
RI P
OE
DJIA
RTI
'" II>
'"
Q Q
'" II> Cl.
•• •• Q Q ~ '" '" '" '" oS' ,
"- "" .. ," .. Cl. Cl. , . ,
'" ;. '" , <V
'" , "-
,
- , -"'- 0-0 0 l- I-- ~
l- I-0: '" a: .0; l- I-
"' "' ---------
Gamber 8 : Kromatogram denQsn fase mobil asetonltrl1-air mssing -
mas1ng 40%:60%. 50%:50% dan 60%:40% •
P.parasetamol ; K.kofei~e ; Pr-proplfenazon •
.. Cl.
0>
'" '" In
0 .,. ••
0
'"
l> CD
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
2.
15
I.
r 5
~-- oC:2
··----~.----_.. ______ c 0(1
• 30 40 50 o. ----tl ')bASETONITRIL
Gambar 9 : Kurua hubungan harga 0( dengan fase mobil aseto
"itril - air pada berbagai macam perbandingan •
49
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
'0
R.
, ~". __________ ----_"R"
• o 30 '0 '0 .0
----+) % ASETONITRIL
Gambar 10 : Kurva hubungan harga Rs dengan fase mobil 85etonitril - air pads berbagai macam perbandingan •
50
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
51
asetonitril-aiz: pada' semua perbandlngan hasil resolusi
parasetamol dan ko£eina kurang dari 1 ( < 1). dengan
mellhat kromatogram gambaI: 8 terlihat bahwa
parasetamol dan kofeina tldak terpisahkan, sehlngga
pada optimasi selanjutnya lase mobil campuran
asetonitril air tidak dipakai.
2.1.2. Penentuan harga Rs dan OC dengan fase mobil
metanol-air.
Berdasar kromatogram gambar 1 dapat dihltung barga Rs
dan oC dengan rumus pada (21,22,23) yang hasilnya
dapat dilihat pada tabel 2.
Tabe1 2 Retensi relatif (CIC) dan resolusi (Rs) dart
parasetamol terhadap kofeina dan
propifenazon dengan fase mobil
metanol-air.
PERSENTASE HETANOL
oC / Rs 30 40 50 60 65 70
-----------------------------------------------------oc_ 1 2,20 2,12 1,58 1,41 1,35 1,32
0<_ 2 > 22 15,20 6,24 3,31 2,52 1,94
0<_ 3 7,40 7,20 3,87 2,35 1,87 1,47
Rs - 1 1,16 5, 74 4,38 3,48 2,35 1,80
Rs - 2 > 46 22,57 21,07 13,05 8,64 5,16
.j;-
I '
,; V A. r.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
Keterangan
oc- 1
'" - 2
'" - 3
Rs-l
parasetamol - kofeina.
parasetamol - proplfenazon.
ko£eina - propifenazon.
parasetamol - kofeina.
Rs-2 par-asetamol - propifenazon.
52
Dari data dalam tahel 2 da,pat dibuat kurva hubungan
konsentrasi metanal dengan harga oc yang terlihat pad a
gambar II, dan kurva hubungan antara konsentrasi
metano! dan harga Rs yang terllhat pada gambar 12.
Berdasar tabel 2 dan gambar 11, 12 terlihat bahwa £ase
mobil yang balk untuk pemlsahan parasetamol, kofeina
dan proplfenazon adalah fase mobil dengan kon'sentrasi
metana! 60 \ dan 70 t. Haka untuk mendapatkan fase
mobil yang optimal dibuat satu macam 1ag1 fase mobil
campuran metanol-air dengan konsentrasi metanal 65 t.
Dengan membuat kurva retensi relatif (OC) terhadap
konsentrasi metanol menurut cara" window diagram"
(15) yang hasilnya dapat dilihat pada gambar 13, dapat
disimpulkan bahwa fase mobil yang terbaik
pemisahan campuran
Propifenazon adalah
Parasetamol, Kofeina
campuran metanol-air
untuk
dan
dengan
perbandlngan 65 : 35. Resoluslnya dapat dilihat pada
kromatogram gambar 7 .
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
o
•
'0 ----~. % METANOL
40
53
oC. '------•• --~.~ .. , «,
50 10 .5 70
Callbar 11 : Kurua hubungan harga 0( dengan fase .obll ... tanol -
air pada berbagai maca. perbandlnoan •
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
00
"
Rs
10
•
•
30 40 eo 8Ii •
---..... , Ok METANOL
Ga.bar 12 : Kurva hubungan harga Rs dengan fase mobil metanol-air pada berbagai .acam perban -
dingan •
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
17
15
0(3 .. __ _ ...
5
0( ..... ---i
• 3. 4. 50 eo e5 70
----•• '16METANOL
Gambar 13 : "Window diagram n untuk memisahkan parasetamol, kofeina dan propifenazon •
55
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
"
•
55
2.2. Penentuan 5uhu keloID optimal dari fase mobil terpilih.
Dilakukan elusi sampel menggunakan £ase mobil metanol-
air perbandingan 65 : 35 dengan tiga macam suhu yaitu
30 ° C,400 C dan 50° C K t t . d' . rama ogram yang er)a 1
terlihat pada gambar 14 .
dapat
Dari kromatogram diatas dapat dihitung harga -= dan Rs
dari optimasi suhu ( tabel 3 ).
Tabel 3 Retensi relatif (OG) dan resolusi (Rs) dari
parasetamol terhadap kofeina dan proplfenazon
dengan £ase mobil metanol-air pada suhu yang
berbeda.
SURU (0 C )
'" / Rs
oc - 1
'" - 2
Rs - 1
Rs - 2
Keterangan . . oc- 1 parasetamol
cC - 2 parasetamol
Rs - 1 parasetamol
Rs - 2 parasetamol
,
30 40
1,41 1,35
2,77 2,52
2,74 2,35
9,33 8,64
- kofeina.
- propifenazon.
- kofeina.
- propifenazon.
50
1,29
2,29
2,27
7,87
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
." ." ." 0 0 OJ ". • 0 .. • " " ~
~ ~
., .:: :0:
"' 00 '" OJ
'" ". ... If) . " "' "- .,-, ... ". OJ "-
'0 "- '" "' '" ,,-, , .,. , .
- - ----
G.mbar 14 : Kromatogra. dengan fasa _Obi1 metanol-air (65:35) pada suhu 30De, 400 dan 50 De
It)
_ 57
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
58
Dengan membuat kurva suhu terhadap harga cC dan Rs yang
dapat dilihat pada gambar 15 dan 16 disimpulkan suhu
optimal adalah 500 c.
2.3. Penentuan pH optimal dari £ase mobil optimal dan Buhu
optimal.
Dilakukan elusi sampel menggunakan fase mobil metanol-
air 65 3S ) suhu 50 C dengan lima macam pH yaitu
pH = 3, pH = 4, pH = 5, pH = 6· dan pH = 7. Kromatogram
yang teijadl dapat terlihat pada gambar 17.
Dari kromatogram (gambar 17 ) dapat dlhitung harga OC
dan harga Rs, hasilnya dapat terlihat pada tabel 4
dari lima macam pH.
Tabel 4: Retensi relatif (cC) dan resolusi (Rs) dari
parasetamol terhadap kofeina dan propifenazon
dengan fase mobil metanol-air ( 65: 35 )
pacta pH berbeda.
pH
CC / Rs
3 4 5 6 7
oc- 1 1,30 1,30 1,30 1,29 1,29
OC - 2 2,48 2,42 2,42 2,35 2,29
Rs 1 2,40 2,34 2,34 2,28 1,83
Rs - 2 8,82 8,42 8,42 8,47 8,10
-------------------------------------------------------
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
53
3
2
0( II.. --1
• 3. 4. 5. ---ot) .oe
Gambar 15 : Kurva hubungan suhu dengan harga oC t dengan fase
mobil metanol-air (65 : 35) •
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
60
,. Rs.
R.
---,,--_ ... R. I
• 3 • 4. 5.
, .OC
-16
~ Rs dengan Gambar • Kurva hubungan suhu dengan harga • fase mobil metanol-air (65 • • 35) •
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
SL'£
L • Hd 2tZ'8
2 '" -
806'~
'9 • Hd
292 '8 8 I '" -
l I I '9
S • Hd
882 '8 . -t.. ";_ '" --
I '9
" D Hd 82'8
C '"
~d 882'9
£ • Hd
)I Sle'e
d ' "
-
.. '-_ 0_0
I l~t'lS
) HH1~
J l~~lS
Jl H~lS
I HH1S
-
~
'" .., •• • '" Ie ... ~ .
:I: .. 0-... " C I " .... "0 o C Ie " . ... " m 0-" . '" .... . ... :z: .D 0-o • e <t • m :z: " 0-~ .. . .., C • " :z: '" a. C
OJ " " "0
" e a.
" .. u '" 0 o 0 ... '" " e " o .<: .. " '" ., .. .. " .D
!I
61
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
62
Keterangan
oc- 1 parasetamol - kofeina.
0<: - 2 parasetamol - propifenazon.
Rs - 1 parasetamol - kofeina.
Rs - 2 parasetamol - propifenazon.
Dengan membuat kUIva pH terhadap harga« dan Rs yang
hasilnya dapat dilihat pada gambar 18 dan 19, dapat
dlsimpulkan pH optimal adalah pH = 7.
3. Penentuan kadar parasetamol, kofeina dan propifenazon
dalam sampel.
3.1. Penetuan kurva linier campuran parasetamol, kofeina dan
propifenazon.
Kurva linier hubungan luas area dan konsentrasi dari
parasetamol, kofeina dan propifenazon yang terlihat pada
gambar 20, 21 dan 22 dapat disimpulkan bahwa campuran
parasetamol, kofeina dan propifenazon dengan konsentrasi
campuran 50 ppm sampai 200 ppm masih menunjukkan
hubungan yang linier, dengan koefien korelasi untuk
parasetamol 0,9870, kofeina 0,9934 dan propifenazon
0,9998 (perhitungan dapat dilihat pada lampiran 7).
3.2. Penentuan kadar parasetamol, kofeina dan propifenazon
dalam campuran dengan metoda standar eksternal.
Dilakukan elusi terhadap larutan standar eksternal dan
larutan sampel dengan kondisi kromatografi
berikut :
sebagai
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
63
•
..._--.,---.,------.,------ -a 0(.
2
•• ----.----.----... ---..... 0( 1
o , 2 3 • • • 7
___ -+. pH
Gamber 18 : Kurva hubungan pH dengan harga oC dang an fase mobIl
.etanol~air (65 : 35), suhu 500 e
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
64.
1.
• ............._-_.-.----..
1t Rs 8
•
It_
• "
2 ~R.I
• 1 2 3 • 5 • 7 ____ • pH
Gambar 19 : Kurva hubungan pH dengan harga Rs dengan fase mobil metanol-air (65:35). suhu 50°C
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
3500
3000
2000
1500
AREA
11000
aoo
•
•
00 .. 100
----.... XONSENTRASI (ppm)
Gamba_~: Kurva kallbrasi parasetamol •
65
•
100
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
66
20.
2 ••
AREA
•••
• o •• .0 20
----~I KONSENTRASI ( ppm)
Gamber 21 : Kurva kalibrasi kofeina •
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
67
AREA
[
o 25 75
----.... KONSENTRASI (ppm)
Gambar 22 : Kurva kalibrasi propifenazon •
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
- kolom ODS zorbax
fase mobil metanal - air 65 35
- suhu percobaan 50° C
- kecepatan fase mobil 1 ml/menit
- detektor u.v ( 254 nm )
- volume sampel yang diinjekkan lOJUl
- pH = 7
68
Pad a penelitian in1 dilakukan repllkasi sebanyak lima
kali. Kromatogram yang terjadl dapat dilihat pada
gambar 23.
3.3. Perhitungan kadar.
Perhitungan
terlihat pada
4. Analisa data.
kadar dl1akukan
tabel 5.
oleh komputer, hasilnya
Dar! hasil perhitungan kadar yang diperoleh (tabel 5 )
dllakukan perhltungan "recovery" yang dapat dilihat pad a
tabel 6, 7 dan 8, dapat disimpulkan ketelitian parasetamol
dan propifenazon adalah baik. Sedangkan dari uji t yang
hasilnya dapat dilihat pada lampiran 1, 2 dan 3 dapat
dlsimpulkan kofeina dan propifenazon menunjukkan ketepatan
yang baik pada derajat kemaknaan CC= 0,05 (33).
Hasil penetapan kadar campuran parasetamol, kofeina dan
propifenazon dapat dilihat pada lampiran 4.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
ryLIBPATION MADE IN IDE~TIFICRTION FILE 7 MnDE! 121 WINDOW 5
NAME TIME
2 PAPASETAMOL 2.59 (OrEIN 3.34 PROP! FENAZOti 6.-16
':;41'lPEL ,~
,~;TAP.T 1
( C-R2AX CHANNEL .SAf'lF'LE NO REPORT NO
1 o 777
6.147
FACTOR
€to ('11)299584 O.OP)15.'56 0.00557634
FILE METHOD SAMPLE ~T
COtlC
11 1. 8 22 66.1
7 44
100
PK/-lO TIME AREA MK I DNO CONC NAME
69
2.59 -. :3.35 c .-. 6.147 ,
36325 2233
1170?
V 1 2 3
110.3227 PARASETAMOl 22.7266 KOFEItI 65.2797 PROPIFENAZON
---------TaTel 50770 198.3291
~amba~ : Kromatogra. analisis kuantitatif ca.puran
parasetamol,kofeina dan proplfenazon .
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
T: .. ocl 5 ! :.i:a3il pcr,,-:;::..nutan p~nctapun k:.tdar Par<!zct9..flJ.ol,
dan :-'ropif'enazon dalam sampel dengan HPLG.
70
... " . LO.l. elr . .:::..
==================~=====================~===~~===~~============
No. sampel
1
2
3
4
5
Kadar yang diperoleh dari kromatogram (ppm)
Parasetamol
107.7C. 106.31
107.16
116.05 114.58 115.00
113.16 114.00 113.03
118.14 117.13 115.23
110.32. 111.22 114.25
I .
!~ofe ina
30.26 28.96 23.19
20.16 21.62 17.82
21.44 22.30 20.05
23.85 23.96 24.07
22.72 23.06 28.91
I I I
Propifenazon
56,20 53.06 53.06
65.59 67.17 68.62
67.20. 66.81 64.60
68.09 62.81 65.72
65.28 66.26
70.25
==============================================================
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
71
metode stando.r eksternal.
=========T=================T=~=~============T=~===============~
. Kadar dalam : Kadar Y3.~ dipe-; Persentase "reco-No. sampel' roleh darl kroma; ver)"
sampel () togram (,' ppm (ppm) "
1 105,96
2. 111 ,00
3 111,16
4 . 111 ,72
5 110,31
107,0622
115,2161
113,4011
116,838
111,9347
Rata-rata (%)
SD K. V.
101,0402
103,7982
102,0161
104,5811
101,4728
102,5817
1,5331
1,4946 ===============================================================
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
72
Taber 7 : Hasil p~net<.ipan kad~ kofeina dalam sampel dengan me
tode standar eksternal.
=============================================================== ! Kadar yang d' I Kadar dalam ~pe-. Persentase ureco-No. sampel ! roleh dar! kroma! ve%1'11
sampel (ppm) togram (% (ppm)
1 30,88 29,1402 94,3659 !
2 ! 22,25 19,8712 ! 83,3088
3 22,28 21,2683 95,4591
4 22,28 23,966 107,5673
5 24,01 24,9027 103,718 ! ! ! --------------------------------------------------------------
Rata-rata (%)
3D
K. V.
96,8838 9,4007 9,7031
==============================================================
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
73
Tabel 8 : Hasil penetapan kG.dar propifenazon do.lam sampel de
ngan metode standar' eksternal.
=====================~========================================
No. sampel
1
2
3
4
Kadar dalam sampel
(ppm)
57,92
66,61
66,65
66,58
5 66,46
! Kadar yang ! roleh dari
togram (ppm)
54,5637 . , 67,1287
dipe-' kr
; Persentase 11 reco-oma. very-II
! (%)
94,2053
100,7787
66,2078. 99,3365
65,545 98,4455
67,2673 101,2147 , , ---------~---------------------------------~------------------
Rata-rata (%) SD K.V.
98,7961 2,7960 2,8301
==============================================================
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
BAB V
PEHBAHASAN
Pada awal dari penelitian in1 dilakukan optimasi fase
mobil berdasar cara segi tiga dari Snyder (16). Untuk
mendapatkan fase mobil awal dari seg1 tiga Snyder (17)
dilakukan elusi isokratis menggunakan fase mobil campuran
metanal dan 'air dengan komposis! awal metana! 20\ berdasar
hasil penelitian yang telah dilakukan peneliti lain (5).
Karena fase mobil campuran metanol-air dengan persentase
metanal 20\ menghasilkan waktu retensi propifenazon yang
relatif lama (lebih dari 90 menit), meka untuk selanjutnya
dilakukan elu51 isokratis dengan persentase metanol yang
lebih besar, yaitu masing-masing 30\, 40\, 50\, 60\ dan 70\ •
Dari 5 macarn komposisi fase mobil dlatas, fase mobIl
dengan persentase metanol 60% menunjukkan pemisahan yang
cukup baik dan waktu retensi relatif singkat (lebih kuran,g 10
menit) . Kemudian dilakukan satu seri elusi isokratis
menggunakan
persentase
menyesuaikan
fase mobil campuran asetonitril-air
asetonitril 30\, 40\, 50\, dan 60\
kondisi isoeluotropik terhadap fase
dengan
untuk
mobil
metanol-air diatas (60\ metanol) berdasar segi tiga Snyder.
Menurut nomograf dari Schoenmaker (17,25), kondisi
isoeluotropik terhadap campuran metanol-air dengan
74
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
75
perbandingan masing-masing 60\ dan 40% adalah campuran
asetonitril-air dengan perbandingan masing-masing 50\ dan 50\
Tetapi berdasarkan kromatogram yang didapat, fase mobil
campuran asetonitri!-air ( 50 : 50 ) tidak dapat memisahkan
parasetamol dan kofeina ( gambar 8 ), karena terlihat puncak
kromatogram parasetamol dengan
melihat kurva gambar" 9 dan 10
kofeina
terlihat
berimpit. Dengan
bahwa harga Rsl
(reselusi parasetamol dan kofeina") pada semua persentase
asetonitril kurang dari satu dan harga~ kurang lebih satu.
Harga Rs untuk suatu pemisahan yang baik adalah )1,5 (20,22)
dan hargaCC)l (24). Kenyataan ini menunjukkan bahwa nomograp
dari schoenmaker menunjukkan perbedaan antara ramalan secara
teoritis dengan empiris (25). Berdasar hasil elusi pemisahan
parasetamol, kofeina dan proplfenazon dengan fase mobil
metanol-air telah didapatkan pemisahan yang cukup baik; maka
optimasi selanjutnya tidak dilakukan dengan cara Snyder
tetapi dilakukan menurut cara "window diagram" dengan fase
mobil campuran metanol-air.
Dengan mengamati "window diagram" yang terjadi,
disimpulkan bahwa pemisahan campuran parasetamol, kofeina dan
propifenazon adalah fase mobil dengan persentase 40\ metanol
karena terjadi puncak yang tertinggi pada "window diagram ll,
tetapi resolusinya terlalu besar. Dari lima macam elusi
isokratis campuran metanol - air yang telah dilakukan diatas,
dan berdasarkan kriteria harga aC (QC)l ) dan Rs (Rs )1,5),
juga hasil kromatogramnya ( gambar 7), dapat disimpulkan
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
76
bahwa pemisahan yang balk terjadl pada fase mobil dengan
persentase 60' metanal dan 70% metanal. Haka untuk optimasi
dilakukan satu lagi elusi isokratis menggunakan £ase mobil
dengan persentase diantara persentase terse but yaltu 65\
metanal, ternyata resolusinya paling baik dan waktu
analisisnya relatif singkat (7 menit).
Pengaruh polaritas bermacam-macam fase mobil terhadap
waktu retensi salut p~da kromatografi cair fase balik (RPC)
dapat dilihat pada tabel berikut:
Tabel 9 Waktu retensl (dalam menit) dar! parasetamol,
kofeina dan propifenazon dengan fase mobil
metanol-air dalam berbagai perbandingan.
-------------------------------------------------------------PERSENTASE HETANOL
30 40 50 60 65 70 -------------------- ._---------------------------------------
------------------ -----------------------------------------Parasetamol
Kofeina
Propifenazon
3,17
6,98
> 70
3,14 2,80 2,61 2,55 2,47
6,66 4,52 3,73 3,41 3,27
47,8 17,54 8,80 6,35 4,80
-------------------------------------------------------------
Terlihat bahwa makin tinggi konsentrasi metanol dalam £ase
mobil makin keeil waktu retensinya. Hal in1 dapat
dlterangKan bahwa mekanisme pemlsahan pada kromatografi fase
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
77
balik berdasarkan teori solvofobik terutama disebabkan karena
efek fase mobil (12,17). Dalam hal in1 molekul-~olekul salut
yang lebih polar akan dielusi lebih dahulu karena molekul
polar berantaraksi lebih kuat dengan fase mobil yang relatif
polar, sedangkan molekul-molekul yang kurang polar mempunyai
gaya tolak terhadap fase mobil yang relatif polar dan akan
ditarik oleh fase diam yang non polar, sehingga akan dielusi
kemudian.
Urutan elusi untuk senyawa-senyawa yang digambarkan pada
kromatogram gambar 7 dan tabel 9 (parasetamol diikuti
kofeina kemudian propifenazon), dapat dijelaskan berkaitan
dengan strukturnya, dimana polaritas parasetamol (mempunyai
gugus para hidroksi dengan amina sekunder) > kofeina
(mempunyai 2 gugus karbonil dan gugus amina tersier dengan
pasisi orto) > propifenazon (mempunyai 1 gugus karbonil dan
gugus amina tersier dengan posisi orto). Demikian pula halnya
dengan harga ex; (gambar 11), dimana makin besar persentase
metanal harga 0(. mak1n keell, hal In1 sesuai dengan teor1
solvofobik yang telah dijelaskan. Makin besar konsentrasi
metanol dalam fase mobil, makin lemah ikatan solut dengan
"ligand" non polar fase diam (12).
Dari hasil optimasi suhu dengan rentang 300
terlihat bahwa baik harga·~ maupun Rs akan menurun dengan
kenaikan suhu. Hal ini dapat dijelaskan bahwa kelarutan
kornponen-komponen sampel (parasetamol, kofeina dan
propifenazon) dalam fase mobil semakin besar dengan kenaikan
suhu , sehingga menurunkan waktu retensi dan memperkeeil harga
OC dan Rs.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
78
HasiI optimasi pH dengan r~ntang 3 - 7 ternyata bahwa harga
OC ralatif tidak dipengaruhi oleh perubahan pH. Demikian pula
halnya dengan harga Rs , telatif tidak dipengaruhi cleh
perubahan pH. Hal in1 dapat dijelaskan bahwa pada rentang pH
3 7 parasetamol (asam lemah), kofeina (basa lemah) dan
propifenazon (basa lemah) relatif tidak mengalami ionisasi,
sehingga kepolaran ketiganya pada rentang pH tersebut diatas
telatif tetap dan relatif tidak merubah harga CC dan Rs.
Berdasarkan hal itu maka pH yang dipi1ih adalah pH = 7,
karena ketiga komponen diatas pad a pH tersebut tidak
bermuatan; sehingga urutan pemisahannya didasarkan pada si£at
hidrofobiknya. Sifat hidrofobik parasetamol (mempunyai gugus
para hidroksi) < kofeina (mempunyai 2 gugus karboni!) <
propifenazon (mempunyai 1 gugus karbonil).
Hasil optimasi parameter fase mobil, suhu kolom dan pH
diaplikasikan dalam anal isis kuantitatif campuran
parasetamol, kofeina dan propifenazon dengan perbandlngan
sesual formula sediaan yaitu 5 : 1 : 3 (1) menggunakan metode
standar eksternal. Kriteria hasil anal isis kuantitatif ini
adalah ketepatan (akurasi) dan ketelitian (presisl). Sebagai
ukuran dari ketepatan adalah' "recovery" (' hasil yang
diperoleh kembali) ,. Hasi! analisls kuantitatif disebut
mempunyai ketepatan yang baik jika tidak ada perbedaan yang
bermakna (pada derajat kemaknaan tertentu) antara harga
sesungguhnya dengan "recovery". Adapun sebagai ukuran dari
ketelitlan dapat digunakan koefisien variasi (KV). Analisis
" . " _.· .. i""" "
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
79
dianggap teliti jika harga ~V sekecil mungkin.
Berdasarkan hasi! perhitungan uji t pada
(perhitungan dapat dilihat lampiran 1,2 dan 3)
OC =0,05
dapat
dinyatakan ada perbedaan yang bermakna dari persentase
"recovery" parasetamol dan tidak ada perbedaan yang bermakna
dari persentase kofeina dan propifenazon. Sedang dari
perhitungan KV didapatkan harga KV untuk parasetamol adalah
1,49, kofeina adalah 9,70 dan propifenazon adalah 2,83
(lampiran 4). Besarnya harga KV kofeina disebabkan karena
kecl1nya kadar ko£eina dalam campuran sampel.
Hasil anal isis kuantitatif campuran parasetamol, kofeina
dan propifenazon dapat disimpulkan bahwa dengan menggunakan
metode standar· eksternal , parasetamol menunjukkan
yang kurang baik (ada perbedaan yang bermakna
ketepatan
dari \
"recovery") dan ketelitian yang baik. Propi£enazon
menunjukkan ketepatan dan ketelit1an yang balk sedangkan
ko£elna menunjukkan ketepatan yang balk (tldak ada perbedaan
yang bermakna dari persentase "recovery") dan ketelitian yang
kurang balk (harga KV besar).
Besarnya kesalahan yang ditlmbulkan dengan cara metode
standar eksternal in1 dlsebabkan antara lain karena kesalahan
-kesalahan pada waktu ekstraksl dan perbedaan volume
penglnjekslan antara replikasi (9,22) karena pada penelltian
In1 penginjeks1an sampel d1lakukan secara manual.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
'BAB VI
KESIMPULAN
Da~i hasil pe~cobaan dan pembahasan diatas
disimpulkan hal-hal sebagai berikut :
dapat
1. Be~dasa~kan hasil optimasi "window diag~am", fase mobil
yang terbaik untuk pemisahan campuran parasetamol,
kofeina dq,n p~opifeilazon dengan kolom "ODS Zo~bax" adalah
campuran metano1 dan air (65: 35) pada suhu kolom
50 0 C dan pH = 7.
2. Analisls kuantitatlf campuran parasetamol, kofeina dan
propifenazon dengan formulasi 5 : l: 3 dengan metode
standar eksternal, pada kondisi optimal menunjukkan
ketepatan yang baik untuk kofeina dan propifenazon serta
ketepatan yang kurang balk untuk parasetamol. Dari
perhitungan harga KV menunjukkan ketelitian yang baik
untuk parasetamol dan propifenazon serta ketelitian yang
relatif kurang baik untuk kofeina.
80
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
agar
BAB VII
SARAN-SARAN
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan disarankan
1. Dilakukan penelitian optimasi fase mobil dengan cara lain,
misalnya : diagram tiga titik kapasitas faktor atau cara
seg1 tiga Snyder te·rhadap campuran parasetamol, kofeina
dan propifenazon dengan metode analisis HPLC.
2. Dilakukan penelitlan dengan metode anal isis HPLC terhadap
campuran parasetamol, kofeina dan propifenazon rnenggunakan
metode standar internal.
81
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
BAB nIl
DAFTAR PUSTAKA
1. Martone Winotoprajoko, dkk . 1985. lnformasi SDesialite
Obat Indonesia. Vol 5 . 19FI Jakarta. p. 129 - 142.
2. Goodman, L.S and Gilman, A
Basis of Therapeutic • 7th
Inc. New York .
1985 • The Pharmacological
ed, Mac. Hillan Publishing Co
3. Lily Julinda . 1985. Penerapan metode spektrofotometrik
pada penetapan Kadar asam askorbat dan asetaminofen dalarn
campuran ", Skr ips i . Fakul tas Farmasi Unalr.
4. Hulja, H dan Syahrani, A. 1987 Aplikasi analisis
spektrofotometri uv-vis • Hecphiso Grafika • p. 31.
5. Noardin, M.A ,dkk . 1983 . Penetapan Kadar parasetamol
secara spektrofotometri dengan pereaksi asam nitrit
Proceeding Konggres Ilmiah L[!L ~ • p. 342 - 345.
6. Haddad, P. Hutchins, Sand Tuffy, M
Performance Liquid Chromatography of some
1983. High
Analgesic
compounds. ~ QL chemical Education, 60 . 2 . p. 166
168.
7. Cas Gupta.v 1980. Simultaneous quantitation of
Acetaminophen, Aspirin, Coffein, Codein phosphat,
Phenacetin and Salicylamide by HPLC. ~ QL Pharm. ~ .
69 . 1 . p. 110 - 112.
82
-
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
83
8. Mtinson, J,W (1984) HPLe, Theory, Instrumentation, and
Pharmaceutical applications. Pharmaceutical Analysis ~
R. Edited by Munson, J.W., Marcel Dekker Inc. p. 15-
154
9. Indrayanto ,G 1987. Aplikasi HPLC untuk kontrol
kualitas obat-obatan . Simposium HPte . Surabaya
10. Logawa, B 1983 Faktor-faktor yang mempengaruhi
pengembanqan metode ana!isis dengan HPLe Proceeding
Konggres Ilmiah ~ lY . p. 346 - 350.
11. Glajach, J.L and Kirkland, J.J. 1983 Optimization
of selectivity in Liquid Chromatography Analitical
Chemistry . 55 2. p. 319 A - 336 A.
12. Horvath, C and Helander, W.J . 1977 ~ Chromatogr. Sci.
15 . p. 393.
13. Costanzo, S.J 1986 . Selection of a mobile phase
optimization technique in HPLe . ~ ~ ChromatQgr. ~ •
24 • p. 89 -94.
14. Sabate,
1983
L.G, Diaz, A.H, Tomas, X.H, and Gassiot,
Computer Assisted optimization in HPLC .
Chromatogr. ~ . 21 . p. 439 - 43.
M.M
,L" IlL.
15. Issaq H.J., Huschick G.M., and Janini G.M. 1983 A
Graphic representation of binairy mobile phase
optimization in RP - HPLC . ~ ~ ChroroatQgr . 6 p.
259 - 69.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
84
16. Deming S.N,. and Michael,L.H.T . 1978 . Optimization of
reverse phase Liquid Chromatographic separation of weak
organic acids . Analitical Chemistry. 50 • 4 • p. 546 ~
48.
17. J.T Baker Chemical Co . 1985 . "PLC Solvent Reference
Manual . p. 4 - 3.
18. Henschen A" Peter Hupe K,. Lottspeich F,. Voelter W
1985 Intrumentratlon H.lgh Perfornance Liguid
Chromatograp9Y in Biochemistry. VHC Publishers p.
79 - 137.
19. Dr. Ami Soewandi J.S., Dr. Indrayanto. G. , Dr.
Zainuddin. H" 1986 . Kursus Instrumen Fakultas Farmasi
UNAIR • Paket E
20. Hamilton R.J.,Sewelt P.A . 1977 . Introduction ~ High
Performance Liguid Chromatograohy . Chapman and Hall
London.
21. Michaelis A.F., Cornish D.W., Vlvilecchia R • 1973 . HIgh
Pressure Liquid Chromatography . ~ ~ Pharmaceutical
W. . 62 • 9 . p. 1399 - 1416.
22. Skoog D.A,. 1985 High Performance Liquld
Chromatography Princiles 2L Instrumental Analysis
3 Ed. Saunders College Publishing .
23. Pecsok R.L,. Shields D.L,. Cairns T,. McWilliam I.G
1976 Chromatography Modern Methods 2L Chemical
Analysis 2nd Ed . John Wiley & Sons . p. 41 - 53.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
85
24. Julia Kantasubrata • 1~87 • Kalom HPLC . Simposium HPLC .
Surabaya.
25. Schoenmakers P.J,. DraueD A.C,. Billiet H.A.H,. and de
Galan L 1982 . A Simple procedure for the rapid
optimization of reverse phase separations with ternary
mobil phase mixtures. ChrQrnatographia • 15 • 688 - 96.
26. Snyder R.L. 1983 . Solvent degassing for HPLC . ~ ~
Chrornatogr. Sci • ·21
27. McNair H.M 1982
Chrornatogr. ~ . 20
p.65-69.
Equipment for HPLC - V
p. 537 - 50.
28. Shlmadzu HPLC. Column Temperatur control
of Shimadzu HPLC LC - SA System
Application
29. Farmakope Indonesia 1979. Ed.III. Departemen Kesehatan
Republik Indonesia p. 37, 175
30. Clark E.C.C . 1971 IsolatioD and Identification 2L ~
in Pharmaceutical Body FluId and Post material The
Pharmaceutical Press . p.
31. The Merck Index . 1976 . An Encyclopedia of Chemical
Drugs. 9 th Ed. Merck & Co, Inc. Rahway - New York.
5,188,887.
and
p.
32. Martindale, ~ Extra Pharmacopoeia 1977, Wade, A.
(Ed)The Pharmaceutical Press, London. p. 268, 276, 340.
33. Daniel,W.W. 1978. Biostatistics. A Foundation for
Analysis in The Health Sciences. 2nd Ed. John Wiley &
Sons. New York.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
86
liji t kadar r:..ta-r:tta "recovery" Parasetarr:ol de
ngan kadar·sesu~guhnya.
==================================================
Sampel Parasetamol dalam %
1 101,0402
2 103,7982
3 102,0161
4 ,104,5811
·5 101,4728 ! ==================================================
x = 102,5817
SD = 1,5332
t hitung = 3,7653
t tabel 0,05(4) = 2,1318
t hi tung > t tabel.
Jadi ada perbedaan yang bermakna antara kadar rat~
rata yang diperoleh dengan kadar sesungguhnya.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
S7
LUf'l-:-::iran 2 : :Jji t k::l.dt:.::> r;Ltd.-rata II rec ovcry" kofeina c.engan k'l
dar sesunGEuhnya.·
==========================~======~================
o"lampel Kofeina dalam %
1 94.3659
2 83.3088
3 95.4591
4 107.5673
"5 103.718 I
================================================== x = 96.8838
SD = 9.4007
t = 'U- X)Vn-SD - = 0.74
t tabel 0.05(4) = 2.1318
t hitung < t tabel.
Jadi tidak ada perbedaan yang bermakna antara ka
dar rata-rata yang diperoleh dengan kadar sesung-
guhnya.
-
! .'
.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
Larrniran 3
88
~ji t ~8.dar rQ.tG.-r'~ta "recovery!! propifenazon de
ngan kadar sesun2guhnya.
==================================================
Sampel Propifenazon dalam %
1 94,2053
2 100,7787
3 99,3365
4 '98,4455
5 101,2147 ! ==================================================
x = 98,7961
SD = 2,7960
t l U - x) Vn' 0,9628 = = SD
t tabel 0,05(4) = 2,1318
t hitung < t tabel.
Jadi tidak ada perbedaan yang bermakna antara ka
dar rata-rata yang diperoleh dengan kadar sesung-
guhnya.
Sci . _Uh 'i',
IR -
Per
pust
akaa
n U
nive
rsita
s A
irlan
gga
TES
ISO
PTI
MA
LIS
AS
I FA
SE
MO
BIL
...
SR
I PO
ED
JIA
RTI
01
'" L:q;;pir:Jn 1 : IIasil penctapan kadar cnmpuran Parasetamol, Kofeina dan Propifenazon dengan
HilLC mcnggunoJ{an standar eksternal.
=============t========';=======l:=:!::==============::!:=======:!:========================-========= . ! Kadar yans diperoleh da-!
i :::::_:~~~;;!~~~~:::_i:=_~:~::~~r~~~l _________ l _____ ~~~~~:~::~_~_:_~ ___ _ 1\"0. ~ ~\l:lpe 1
P K Pr P K Pr P !K!Pr
1 105,96 30,88 57,92 !107,0622!29,1402!54,5637!101,0402!94,3659!94,2053 ! ! ! ! ! !
2 111,00 22,25 66,61 !114,2161!19,8712!67,1287!103,7982!83,3088!100,7787 ! ! ! ! ! !
:; 111,16 22,28 66,65 !113,4011!21,2683!66,2078!102,0161!95,4591! ! ! ! ! ! !
99,3365
4 111,72 22,28 66,58 !116,838 !23,966 !65,545 !104,5811!107,567! 98,',455 ! ! ! ! ! !
5 ! 110,31 ! 24,01 ! 66,46 !111,9347!24,9027!66,2673!101,4728!103,718!101,2147 I 1 I f I I , t I . . . . . . . . . ----------------------------------------------------------------------------------------
Rata-rata (%l SD K. V.
!102,5817!96,8838! 98,7961 1,5332! 9,4007! 2,7960 1,4946! 9,7031! 2,8301
========================================================================================
I\ctcrangan : P = Paru3ctumol.
K = I\ofe ina.
Pr = Fropifenazon.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
90
Lampiran-2 : Tabel uji t.
rerccnlilc$ or rhe I [)islrihUlioll
, :1.1201 ' .. d. r. /." I" ( ,;~ t." ,~
. l,078 6.JI)8 12.706 )1.821 63.657 2 1.886 2.9200 4.J027 6.965 9.920'8 3 1.638 2.35J·' 3.ISB • ..,.11 5.8409 4 un :U:1I8 2.7764 ~.747 4.6041 , 1.476 2.0150 2 . .5706 . J.J6S 4.0321
• 104·10 1.9-1)2 2.'1·169 ].I11J 3.7074 7 1.415 1.894(, 2.]f\II(, 2.998 J.4995 , LJ97 1.8595 2.]060 2.896 JJSS4
• IJlIJ 1.8)]1 2.2622 2.821 3.2"98 10 1.372 1.8115 2.2281 2.'164 3.169) II 1.363 1.1959 2.2010 2.718 3.10.58
" . I.J~6 1.71123 2.1188 2.681 l,OMS IJ I.JSO 1.7109 2.1601 2.650 3.012) 14 1.J4S 1.7613 2.1448 2.624 2.97(i8
" 1.)41 I.7SJO 2.131.5 2.602 2.9467
" 1.131 1.7459 2.1199 2J8J 2.9208 17 I.))) 1.7396 2.1098 2 . .567 2.8982 18 1,]30 1.7341 2.1009 2.552 2.8784
I. 1.328 1.7291 2.0930 2.539 2.8609 20 1.325 1.7247 2.0860 2J28 2.845) 21 1.32] 1.7207 2.0796 2 . .518 2.8314 22 1.]21 1.1171 2.0739 2.508 2.8188 23· 1.319 1.7139 2.0G87 2.500 2.8073
24 I.3IB 1.1109 2.0639 2.492 2.7969
" 1.316 1.7081 2.0':9': 2.48': 2.7874 26 1.315 1.70.56 2.05!'i!'i 2.479 2.7787 27 1.]14 1.7033 2.0518 2.473 2.7707 28 1.J13 1.7011 2.0484 2.467 2.7633
2' 1.311 1.6991 2.0452 2.462 2.7564-
JO 1.310 1.697] 2.0421 2.4H 2.7500
3' 1.3062 1.6896 2.0)01 lA38 2.7239 40 1.3011 1.6839 1.0111 2.42) 2.704.5
" 1.)007 1.67'14 2.0141 2.412 2.68'6 50 1.2987 I J,75') 2.008(, 2.403 H,]71l
60 1.29S9 1.6707 2.0003 2.390 2.(,(.03
70 1.2938 1.6M,,) 1.9945 1.381 2.60180
'0 1.2n2 1.(,(,4 I 1.9901 2.314 1.6)88
90 1.1910 1.(,620 1.9867 2.)(,8 2.6316 I~) 1.2901 1.(,(,()2 1.91140 2.3601 2.6U,o 120 1.2887 1.6577 1.9799 2.35K 1.6115 1<. 1.2876 I.(,SSH 1.9771 2.351 2.6114 160 1.2869 /.(,S4S I. 974'J 2.)SO 2.W70
180 1.286] J.(,H<I 1.9733 2.)017 2.6035
200 1.2858 l.bS.!S 1.'1719 2.345 2.(,IJO(, w 1.282 1.645 1.96 2.326 l.HG
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
91
LBmpiran . 6 . , • ! Koefisien korelesi rxy ,
1!eiiurut derajat kemeknean 5% dan 1 %
CO .. funOsCOUJlc ..... ".., nil ,,"-,,'1) I~~ LhWOf s.. ... lfK ... ~· ..
Oqnnol . ",,,,,,01 F"""'m 'l1 1% r-.. ~ I~ -_ . ...
• .• " .- ~.: . '" .'" , ."'" .... .. -", ." -J .Ill .", ,. .p. ..:" • OIl .14. :~ ... -: ." . , .;~ J>o '" .lO. .oJ 6 .!O1 JS4 ,. -'" .'" 7 ... JOt . lC .... .'" • .631 ]0, " .JU ..IiI 9 .., no .. -"" '" 10 J76 Jill ., -'" ··m II SS) . .... 50 Xl J~ .. " .. $)1 .16 • to ~ '" •
" 514 .• " •• 1£ .... " .'" .m .. ~17 .W
" . .:U: .... to ~ ,q 16 ~ .... .00 .... "." 17 • .a!06 SIS I:!S .. ,. -'" II '" ... , .50 .. " -"Ii
" .... H .'" ,.. .'" .11'
• '" ."::3 ~J1 1OO .'U .. " " :0 "" ... "" .. " .. ."" ~" ,.. ."" '" -
" ". "0' , ... .,~ .• 11 -DikuUp daric-: Sn.edecor, G.W. end I'I.G. Cochran.
J.974, Statistical Methods.. Sixth Edition. The Iowa State University
i Press, Ames loWe, U.S.A •• p.557 :.
IR - Perpustakaan Universitas Airlangga
TESIS OPTIMALISASI FASE MOBIL ... SRI POEDJIARTI
Hasil perhitungan adanya korelasi linier an tara
konsentrasi dan area •
parasetamol
x
25
50
100
150
r xy
A
B
y
5017
11946
27178
34270
= 0,9870
,. 12,3621.
= 23,9743
x
5
10
15
25
kofelna
r xy
A
B
y
564
1136
1368
2356
= 0,9934
~ 160,4571
= 86,9486
r xy tab (0,05) = 0,950
x = konsentrasi
y • area
propifenazon
X Y
10 1770
25 4428
50 8824
75 12957
txy
,. 0,£998
A
8
= 103,1786
~ 172,4143
92