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Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena)
Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad
1) Uno stampo a singola elica
2) un innesco specifico (primer)
3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S
ha bisogno di:
4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza
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La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegueindefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro
distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotiditrifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché
posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’
Terminazione della catena
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DNA stampo a singola elica
3’-GGCTAAC
3’-GGCTAAC5’ 3’
Ibridazione conIl primer
+ [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi
ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP
-CCG ddA -ddC-C ddC
-CC ddG-CCGATT ddG
-CCGA ddT-CCGAT ddT
Sequenza: 5’-CCGATTG
A C G T
-CCGATT ddG-CCGAT ddT-CCGA ddT-CCG ddA-CC ddG-C ddC-ddC
GT
T
AGCC
Schema di sequenziamento a terminazione di catena
Direzione dilettura
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Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti
Coniugando a ciascun ddNTPun diverso marcatore fluorescente, è
possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio
e caricare il tutto in solo pozzetto di gel
ddA
ddC
ddT
ddG
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Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e leinformazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.
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Fluorescent DNA Sequencing
A G T A C T G G G A T C
GelElectrophoresis
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Detection of Fluorescently Tagged DNA
DNA FragmentsSeparated by
Electrophoresis
Output to Computer
Scanning Laser Excites
Fluorescent Dyes
Optical Detection System
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Fluorescent DNA Sequencing Data
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Fluorescent DNA Sequence Trace
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Overview of Facts Asserted
• 2.91 billion base pairs (bp)
• 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA
• 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s)
• less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins
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Structure of the genome