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Il sistema maggiore di
istocompatibilità: struttura e
tipizzazione HLA
Prof. Amedeo Amedei
Dipartimento Medicina Interna
Scuola
1
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Major Histocompatibility Complex
Gruppo di geni polimorfici costituito da 30 unità (ad oggi): cromosoma 6 (uomo), 17 ( topo).
Proteine Tradotte: Proteine del MHC espresse sulla membrana cellulare, 21 Idrossilasi,
Frazioni del complemento C4B,C4A,BF e C2, Proteina chaperone HSP70 , proteine della
famiglia del TNF.
Due principali classi MHC: la classe I (MHC-I: tre copie per ogni cromosoma) e la classe II
(MHC-II: sei copie per ogni cromosoma). Essi sono responsabili di situazioni fisiologiche, e
talvolta patologiche, nettamente differenti nell'ambito dell'organismo.
I prodotti dei geni MHC-I sono antigeni direttamente implicati nel fenomeno del rigetto, quelli
che derivano dall' MHC-II sono attivi nei fenomeni di cooperazione cellulare che si verificano
nell'ambito della risposta immunitaria.
Nell'uomo l'MHC prende il nome di Human leukocyte antigen (HLA).
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Major Histocompatibility Complex
Le molecole di Classe I vengono espresse pressoché su tutte le cellule nucleate (in cellule
prive di nucleo, come i globuli rossi, poco espressi) e sono formate da un polipeptide
transmembrana di 44.000 dalton, codificato dall'MHC, associato alla β2-microglobulina, una
molecola invariante di 15.000 dalton codificata dal cromosoma 15.
Le molecole HLA di Classe II sono presenti solo su alcune cellule immunocompetenti: APC
(antigen presenting cell), quali cellule dentritiche, linfociti B e macrofagi. Inoltre la loro
presenza, anche su queste cellule, non è costante, ma soggetta a modulazione, a seconda
dello stato di attivazione della cellula. Questa espressione viene modulata dalla presenza o
meno di alcune interleuchine.
Le molecole di Classe II sono proteine di membrana eterodimeriche, formate cioè da una
catena α (che varia fra i 33.000 e i 34.000 dalton), e da una catena β (fra i 28.000 e i 29.000
dalton), entrambe codificate dall'MHC. C'è poi una terza catena, detta invariante, che non
attraversa la membrana cellulare.3
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Major Histocompatibility Complex
Sia le molecole di classe I che quelle di classe II fungono da bersaglio per i linfociti T, che
regolano la risposta immunitaria. Affinché un antigene venga legato su una molecola di
membrana MHC dev'essere processato ( processo al termine del quale si legherà ad una
molecola MHC classe I o II).
Processazione in fase citosolica (comune per proteine di derivazione virale) l'Ag si
legherà ad MHC I implicando l'attivazione dei linfociti T "citotossici" o "CD8+", effettori
diretti delle risposta immunitaria specifica cellulo-mediata, che lisano le cellule che li
hanno attivati.
Processazione esclusivamente in vescicole endosomiali (tipico per proteine di
derivazione batterica), L'Ag si legherà ad una molecola MHC II ed attivazione dei
linfociti T "helper" o "CD4+". Questi svolgono la propria attività producendo citochine
che contribuiranno all'attivazione di linfociti B(linea Th2) o all'attività citotossica dei
linfociti T CD8+ o dei fagociti mononucleati ( lineaTh1).
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Sistema HLAInsieme di geni localizzati sul cromosoma 6 (6p21.3)
Parte della regione genetica MHC (Major Histocompatibility Complex)
MHC = 4 x 106 paia di basi (0,1 % genoma nucleare):
HLA classe I
HLA classe II
HLA classe III (complemento, ormoni, altri geni indefiniti)
1/3 della porzione
Struttura Molecolare dei geni: simile per i geni di classe I e II
sequenza di introni (non codificanti e di regolazione) ed esoni (codificanti)
Piccole differenze che rispecchiano differenze strutturali 5
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HLA Classe I
3 loci funzionanti: HLA-A, HLA-B, HLA-C
Glicoproteine altamente polimorfe espresse sulla membrana cellulare
Classe I : geni codificano per la catena a dell’eterodimero a/b
b = b2-microglobulina (cromosoma 15), fondamentale per l’espressione del complesso
Sruttura: 4 regioni extracellulari: 3 a (a1,a2, a3) 1 b2-microglobulina
Catena a = aa idrofobici (ancoraggio) + regione intracitoplasmatica
Elevato Polimorfismo: 50-100 alleli (topo – uomo)
Esigenza Tipizzazione (impossibile trovare due individui uguali)6
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HLA Classe I
Meccanismi alla base della eterogenicità:
Sostituzioni di singoli nucleotidi
Ricombinazioni Reciproche
Conversioni Geniche
Espressione:Tutte le cellule nucleate (no eritrociti)
Eccezioni: cell. Nervose, spermatozoi, cell.ossee
Differenza di concentrazione
Fibroblasti
Cell. Nervose
Cell. Muscolari
APC
Bassi Livelli Alti Livelli
Funzione HLA Classe I:
Presentazione Peptidi ai T CD8
Domini a1 ed a2 7
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HLA Classe II
Espressione: numero limitato di cellule
Cell. Epiteliali del Timo
APC
Precursori Mieloidi ed Eritroidi
Struttura : catena a + catena b (legame no covalente)
Nell’uomo = 3 Famiglie di geni e proteine: HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP
Caratteristica = Elevato Polimorfismo
Geni per le classi degli eterodimeri a/b : DR = DRb1, DRb2, DRa
DQ = DQb e DQa
DP = DPb e DPa
Dopo stimolazione con INF-g
Trasformazione neoplastica
Cell. Endoteliali
Cell. Gastriche
Linfociti T
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HLA Classe II
Ruolo: presentazione peptidi ai linfociti T helper
Le differenti molecole di classe II = responsabili varietà individuale della risp. Imm. Ag
Regolazione della risposta immune: cell. epiteliali del Timo = tolleranza del self
Restrizione del fenomeno citotossico per i linfociti T CD4+ citotossici
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Major Histocompatibility Complex
•Regione genomica conservatapresente in tutti vertebrati
Negli anfibi
(xenopus) sono
presenti geni di
classe I,II e III in
stretto linkage tra
loro, il che
suggerisce l’ipotesi
che questa regione
possa essere
presente da più di
370 milioni di anni
MHC
Human Leukocyte Antigen
HLA
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The biological importance of HLA
Nature had certainly not maintained a polymorphism such as that of HLA only to frustrate transplant
surgeons.
(Ceppellini, 1967)
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•Legame del peptide alle molecole di MHC di classe II all’interno di particolari vescicole
•Espressione del complesso MHC-peptide sulla superficie cellulare
•Riconoscimento del complesso da parte dei linfociti TH
•Processamento dell’Ag in specifici compartimenti cellulari con generazione di frammenti peptidici
•Endocitosi dal compartimento extracellulare all’interno delle APC
Processamento e presentazione dell’Ag: tappe principali
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Presentazione dell’antigene in associazione a molecole MHC di classe I
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HLA
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Le molecole di classe I sono il risultato dell’assemblaggio di una catena pesante a codificata dai geni MHC e da una catena leggera, la b2-microglobulina il cui gene è situato sul cromosoma 15.
La catena pesante è suddivisa in tre porzioni (dominii) di cui la 1° e la 2°
sono polimorfiche.
Molecole HLA
Struttura terziaria
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dominio a1 dominio a2 dominio a3
Posizione nella sequenza
le posizioni da ~60 a 83; da 92 a ~120 e da ~ 145 a 165.
Queste aree sono anche chiamate regioni ipervariabili (HVR - in analogia con la terminologia delle immunoglobuline).
La variabilità è massima in tre regioni dei primi due dominii:
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Le molecole di classe II, sostanzialmente simili a quelle di classe I, sono costituite da una catena a e una catena b codificate da geni della regione MHC.Entrambe le catene hanno due dominii e partecipano, con il primo, alla formazione della tasca ABC:la diversità è situata nel dominio-b1, dell’esone 2,
Catena a
Catena b
Struttura terziaria
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Base Molecolare dei tipi e delle varianti MHC
POLIMORFISMO
Presenza ad in singolo locus genetico di varianti (alleli) con
frequenza >1% in una popolazione.
I geni MHC presentano il massimo grado di polimorfismo noto
I tipi e le varianti delle molecole MHC di un individuo non variano nel corso
della sua vita.
La diversità delle molecole MHC esiste soprattutto a livello di popolazione.
Ciò è in netto contrasto con la diversità dei recettori dei linfociti T e B e delle
immunoglobuline che si riscontra nell’individuo stesso.
POLIGENIA
Molti geni MHC di classe I e di classe II codificano per tipi
differenti di molecole MHC con un range di specificità di
legame per il peptide da presentare
Monogenia : un gene è responsabile da solo per la presenza di un
carattere (p.e. gene del daltonismo nell’uomo):
Poligenia : per determinare un carattere specifico servono diversi
geni che si possono trovare anche su diversi cromosomi
POLIGENIA ADDITIVA: Quando ogni gene, preso
singolarmente, avrebbe un effetto piuttosto limitato, ma in grado
di cumularsi con l'azione modesta, ma simile, degli altri Poligéni.
POLIGENIA COMPLEMENTARE: (geni modificatori) Quando
l'azione dei poligéni non si somma, ma contribuisce parzialmente
alla formazione di un carattere complesso.
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HLAPosizione: braccio corto cromosoma 6 (6p21.3), a circa 6.000 Kb dal centromero una parte della regione MHC, che si estende
per circa 4 milioni di paia di basi (pb), circa 0.1 % del genoma nucleare
MHC = 2/3 geni HLA I e II, 1/3 HLA classe III (fattori complemento, ormoni, shock protein …)
Disposizione (a partire dal centromero):
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HLA
Regione HLA: circa 4.000kb, 3 serie di loci
che codificano per 3 tipi di molecole diverse
Classe I, II e III.
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Mappa dettagliata della regione HLA
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HLA map 2005
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Codominanza• La codominanza è un evento genetico che si riscontra quando due alleli si manifestano entrambi
in modo completo, e quindi entrambi sono riconoscibili negli eterozigoti, dal punto di vista del fenotipo.
• La codominanza si manifesta negli individui diploidi o poliploidi. Un individuo diploide (come l'uomo) è dotato di un doppio assetto cromosomico, i due cromosomi di una stessa coppia cromosomica porteranno due alleli (uno per ogni cromosoma) per uno stesso gene. Gli alleli possono essere uguali e dominanti (omozigote dominante), uguali e recessivi (omozigote recessivo) o diversi (eterozigote). Nell'eterozigote un allele (dominante) può prevalere sull'altro (recessivo) ed il fenotipo è determinato solo da un allele (quello dominante). In alcuni casi la dominanza può non essere completa ed in altri casi si può manifestare la codominanza: entrambi gli alleli si manifestano nel fenotipo.
• Un esempio è il sistema sanguigno A,B,0, che è costituito da 3 alleli (IA,IB,I0), la cui combinazione determina 4 fenotipi (gruppi sanguigni): tipo A (IAIA o IAI0 ), B (IBIB o IB I0), 0 (I0 I0) ed AB (IA IB), IA IB sono dominanti su I0 e codominanti fra loro. Ogni allele specifica per un antigene (gli individui A avranno l'antigene A, i B l'antigene B, gli 0 nessun antigene e gli AB entrambi) che verrà riconosciuto da un anticorpo (tenendo presente che generalmente un individuo non produce anticorpi contro se stesso). Così un individuo A avrà l'antigene A, se il suo sangue viene trasferito in un individuo B, questo riconoscerà l'antigene come estraneo e svilupperà una azione immunitaria. I globuli rossi verranno agglutinati portando ad insufficienza nell'azione di alcuni organi ed anche la morte. Gli individui AB esprimono entrambi gli antigeni (codominanza) e quindi non sviluppano anticorpi, per questo sono detti accettori universali. Gli individui 0 non esprimono alcun antigene e quindi sono detti donatori universali. 26
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genetica HLA
A1 A2
A3A1 A2A3 A1 A11 A2 A11
alleli codominanti
Es. locus A
X
A11A3
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genetica HLA
A1B8DR3
A2B12DR7
A11B13DR5
A3B7DR2
i geni MHC tendono ad essere ereditati en bloc (aplotipi)
A1B8DR3
A3B7DR2
A2B12DR7
A3B7DR2
A1B8DR3
A11B13DR5
A2B12DR7
A11B13DR5
X25% identità
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l’entità del polimorfismogenetica HLA
Se consideriamo solo i loci ABC, sono possibili:
* v. “linkage disequilibrium”
Gli alleli HLA hanno mediamente bassa frequenza nella popolazione, tranne alcune eccezioni, e sono assai numerosi.
266HLA C
830HLA B
489HLA A
489 x 830 x 266 = 107.961.420 teoriche* combinazioni alleliche!
Estrema variabilità inter-individuale
30
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A B C DRB1 attesi
Alleli 489 X 830 X 266 X 463 = 49.986.137.460
NUMERO TEORICO
COMBINAZIONI ATTESE
31
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5 10 15 20 25
A*01010101 - ----TCC CAC TCC ATG AGG TAT TTC TTC ACA TCC GTG TCC CGG CCC GGC CGC GGG GAG CCC CGC TTC ATC GCC GTG GGC
A*02010101 --T --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- - -- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --A --- ---
30 35 40 45 50
A*01010101 TAC GTG GAC GAC ACG CAG TTC GTG CGG TTC GAC AGC GAC GCC GCG AGC CAG AAG ATG GAG CCG CGG GCG CCG TGG A*02010101 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- -G- --- --- --- --- --- --- ---
55 60 65 70 75
A*01010101 ATA GAG CAG GAG GGG CCG GAG TAT TGG GAC CAG GAG ACA CGG AAT ATG AAG GCC CAC TCA CAG ACT GAC CGA GCG
A*02010101 --- --- --- --- --T --- --- --- --- --- GG- --- --- --- --A G-- --- --- --- --- --- --- C-- --- -T-
80 85 90 95 100
A*01010101 AAC CTG GGG ACC CTG CGC GGC TAC TAC AAC CAG AGC GAG GAC G|GT TCT CAC ACC ATC CAG ATA ATG TAT GGC TGC -----A*02010101 G-- --- -- - --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- -C- -|- - --- --- --- G-- --- -GG --- --- --- ---
1. in molteplici variazioni nucleotidiche nella sequenza
§ primi 100 codoni
§
Il polimorfismo e la specificità antigenica consiste:
(cui corrispondono sostituzioni aminoacidiche)
33
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•Tipo di incrocio = “Assortative mating”: Positive assortative mating or Negative assortative mating
Il polimorfismo, anche nella regione HLA, è il risultato di eventi casuali (mutazioni, conversione genica, ecc.).
Il suo mantenimento a livelli così elevati è il risultato dell’azione di forze selettive nel corso dell’evoluzione, tra cui sopratutto:
• Pressione selettiva da parte di agenti patogeni = “Pathogen-driven balancing selection” (PDBS) → + probabile.Pathogen-driven selection and worldwide HLA class I diversity (Curr Biol. 2005 June 7; 15(11): 1022–1027)
come si mantiene il polimorfismogenetica HLA
34
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Molecole MHC differenti sono in grado di legare diversi tipi di peptidi antigenici; pertanto gli eterozigoti per MHC presentano una grande varietà di peptidi patogeni in confronto a soggetti omozigoti.
1) vantaggio dell’eterozigote
Maggiore resistenza ad agenti patogeni
Vantaggio riproduttivo (fitness)
Con incremento degli eterozigoti rispetto agli altri genotipi
35
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2) selezione frequenza–dipendente
La selezione si ritiene che abbia favorito i genotipi MHC rari in quanto i patogeni avrebbero maggiore probabilità di sviluppare meccanismi atti a evitare l’immunità MHC-dipendente sostenuta da genotipi comuni.
Maggiore resistenza ad agenti patogeni
Vantaggio riproduttivo (fitness)
la frequenza di alleli rari tende ad aumentare mentre la frequenza degli alleli comuni tende a diminuire (polimorfismo dinamico).
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Evolution of pathogens to evade MHC-mediated
antigen presentation
In south east China & Papua New Guinea up to 60% of
individuals express HLA-A11
HLA-A11 binds an important peptide of Epstein Barr Virus
Many EBV isolates from these areas have mutated this peptide
so that it can not bind to HLA-A11 MHC molecules
Suggests that selective pressures may operate on MHC polymorphism
Replacement substitutions occur at a higher
frequency than silent substitution
Evolution of the MHC to eliminate pathogens
In west Africa where malaria is endemic HLA-B53 is commonly
associated with recovery from a potentially lethal form of malaria
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unioni preferenziali basate su una maggiore diversità per geni MHC rispetto ad unioni casuali.
In questo caso l’MHC viene utilizzato per agire contro una identità genetica per loci altamente polimorfici al fine di conservare l’eterozigosi.
-tipo di incrocio = “assortative mating”:
38
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Applicazioni della Tipizzazione
Tissutale
Pazienti candidati al trapianto di midollo osseo o organi solidi
HLA di urgenza (possibile donatore in punto di morte)
Riconoscimento di paternità
Associazione tra HLA e malattie
Ricerca Biomedica39
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HLA e trapianti:
Alla ricerca del donatore istocompatibile
40
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Trapianto del midollo osseo e delle cellule
staminali
• Compatibilità HLA essenziale (per i trapianti solidi importante ma non imprescindibile)
• Persone HLA identiche: coppia formata da fratelli (uguali anche nelle zone non caratterizzate) o non consaguinei (fenotipi uguali ma non aplotipi)
• Preferenza donatore :1) gemello monozigote, 2) fratello HLA genotipicamente identico (25%), 3)familiare HLA compatibile (3-4 %), 4) donatore non apparentato HLA fenotipicamente identico, 5) donatore non apparentato diverso per 1 o + caratteristiche HLA, 6) familiare aploidentico.
• 70% dei TMO non donatore fra i familiari
• La frequenza genica è differente da popolazione a popopolazione
• Linkage disequilibrium (associazioni negative e positive)
• Aplotipi ancestrali (1/3 in alcune popolazioni caucasiche)
• 6.500.000 (3.500.000 tipizzati anche per DR) 80 % almeno un volontario HLA-ABDR, con anche compatibilità DRB1* (50%)
• Oggi tipizzazione ad alta risoluzione anche per gli alleli DRB,DQB1* e DPB1*
41
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Ricerca di donatore non consaguineo
• Il paziente tipizzato: HLA classe I ed i loci DRB1*, DRB3*, DRB4*, DRB5* e DQB1*
• Standard IBMDR (Italian Bone Marrow Donor Registry ): compatibile quando fenotipicamente identico almeno per HLA-AB e gli alleli DRB1* (in diverse occasioni: anche differenze per una caratteristica HLA di classe I)
42
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HLA e malattie
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HLA & Malattie
Alcune malattie sono associate alla presenza di un determinato HLA
Definire una frequenza significativamente elevata rispetto alla popolazione sana
RR = Frequenza Atg HLA negli affetti
Frequenza Atg HLA nei sani
RR > 1 = Associazione positiva
RR < 1 = Associazione negativa
RR = 1 = No Associazione
Malattie a patogenesi immunitaria con caratt. a comune:
eziologia multifattoriale
familiarità (comp. ered. polig.) 47
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HLA & Malattie
48
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HLA-B27
Spondilite anchilosante
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HLA come fattore di rischio nelle
malattie autoimmunitarie
Modello 1
alcune molecole HLA presentano meglio peptidi patogeni
simili a peptidi “self” alle cellule T
il risultato sarà una risposta autoimmunitaria
Modello 2
alcune molecole HLA sono più o meno efficienti nella
presentazione di peptidi “self” alle cellule T
il risultato sarà una mancata selezione negativa e
conseguente risposta autoimmunitaria
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53
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Diabete di tipo I• Nei giovani diabetici gli antigeni DR3 e/o DR4 sono presenti nel 97% dei casi
(contro il 60% della popolazione); il genotipo DR3/DR4 ricorre nel 30% dei casi (contro il 6% della popolazione). Nella nostra etnia il DR4 sembra conferire maggiore rischio rispetto al DR3. La presenza di entrambi fa aumentare il rischio di quasi 10 volte (sempre nei confronti della popolazione).
• Sono particolarmente a rischio i fratelli HLA identici di un giovane diabetico: si ammalano di diabete nel 58% dei casi. Sono a rischio anche i fratelli HLA aploidentici che ammalano nel 37% dei casi
• Per i soggetti HLA DR3 e/o DR4 è auspicabile la tipizzazione degli alleli DQ
• La presenza di una acido aspartico alla posizione 57 dell'HLA DQb si è dimostrata fortemente protettiva per l'insorgenza del diabete. D'altra parte, la presenza nella stessa posizione degli aa Alanina, Valina o Serina, predispone allo sviluppo del diabete. Un analogo discorso può essere fatto in alcuni soggetti per l'arginina alla posizione 52 dell'HLA DQa
• E' possibile che queste regioni HLA siano implicate nel legame di peptidi importanti per l'inizio della reazione autoimmune contro il pancreas. Secondo calcoli matematici però, l'HLA è in grado di spiegare solo il 35 % circa della suscettibilità genetica.
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Celiachia
• Condizione necessaria per sviluppare la celiachia è infatti la presenza sulla membrana delle cellule immunocompetenti di una molecola HLA di classe II (codificata dagli alleli a 0501 e b 0201), in grado di legare con alta affinità peptidi di gliadina e di presentarli agli specifici linfociti T.
• Quando la tipizzazione HLA veniva effettuata con tecniche sierologiche questa configurazione prendeva il nome di DQ2.
• In realtà non sempre al fenotipo DQ2 (identificato per via sierologica) corrisponde la presenza dell'eterodimero caratteristico della celiachia. L'eterodimero "celiaco" è sempre presente quando al DQ2 si associa il DR3 (aplotipo DQ2-DR3) e in soggetti con aplotipo DQ2-DR7/DR5. Nel primo caso, l'analisi di linkage ci mostra che sullo stesso cromosoma sono presenti sia i geni della catena a, A0501, che quelli della b, B0201, (configurazione in cis). Nel secondo caso i due geni si trovano su cromosomi diversi (in trans): sul cromosoma che esprime la specificità sierologia DR7 è presente la sequenza B 0201 per la catena b mentre sul cromosoma che esprime DR5 la sequenza A 0501 per la catena a.
• In una minoranza dei celiaci (8%) la predisposizione è legata al DQ8 associato al DR53, ugualmente dotato di alta affinità per la gliadina.
• Per quanto necessario, l'HLA non è però sufficiente a far sì che si sviluppi la malattia. Solo una piccola parte dei soggetti con gli HLA descritti (presenti quasi nel 40% della popolazione) hanno la celiachia.
• L'assenza degli HLA tipici ha comunque un elevato valore predittivo negativo nella diagnosi di celiachia.
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Celiachia
• Alcune molecole HLA sono state selezionate dall'evoluzione per la loro capacità di legare e presentare proteine appartenenti ai patogeni più comuni
• Tra questi HLA, probabilmente è anche il DQ2, tipico del soggetto celiaco,
(presente complessivamente in circa il 30% della popolazione)
• Semplificando, possiamo ipotizzare che nell'era pre-agricola l'utilità dell'HLA DQ2 nella risposta alle infezioni (allora comuni) sia stata di gran lunga più importante della sua dannosità dovuta al riconoscimento del glutine (che in quell'epoca era quasi assente dall'alimentazione umana). Per questo motivo questo HLA sarebbe stato trasmesso così frequentemente dai nostri antenati.
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HLA e Ricerca
• Determinazione dei peptidi immunodominanti
• Immunoterapia
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Immunodominanza
• Peptidi più immunogeni di altri
• Programmi specifici in grado di predire quali peptidi di una singola proteina sono più immunodominanti
• http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html
• http://www.imtech.res.in/raghava/propred/
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ESAT-6:
mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqkwdatateln
nalq
http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html
HLA A1 - 9 mers
Max. score that could've been reached using this molecule type 50
Rank Start position Sequence % of max. score Score
1 61 ATELNNALQ 40 % 20
2 0 MTEQQWNFA 36 % 18
3 42 WGGSGSEAY 34 % 17
4 46 GSEAYQGVQ 32 % 16
5 21 VTSIHSLLD 30 % 15
6 27 LLDEGKQSL 26 % 13
7 28 LDEGKQSLT 26 % 13
8 9 GIEAAASAI 20 % 10
9 22 TSIHSLLDE 20 % 10
10 56 KWDATATEL 20 % 10
11 14 ASAIQGNVT 18 % 9
12 29 DEGKQSLTK 16 % 866
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http://www.imtech.res.in/raghava/propred/
ESAT-6:
mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqk
wdatatelnnalq
DRB1_0101:
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSE
AYQGVQQKWDATATELNNALQ
DRB1_0307:
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEA
YQGVQQKWDATATELNNALQ
67
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HLA ed IMMUNOTERAPIA
Cancro gastrico
68
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ADENOCARCINOMA GASTRICO
SUDDIVISO FENOTIPICAMENTE IN:
• Carcinoma di “tipo intestinale”
(+ frequente, prevalenza uomini > 50 anni)
• Carcinoma di “tipo diffuso”
(- frequente, uomini/donne: 45 anni) 69
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Carcinogenesi
70
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Trattamenti
(Consolidati)
Asportazione del tumore primitivo e
dell’intera rete linfatica di drenaggio
Rimozione chirurgica + Chemioterapia
Rimozione chirurgica + Radioterapia
Tasso di sopravivenza 5 anni: 15-35 %
87 % recidive loco-regionali 71
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Trattamenti (Innovativi)
Inibitori dell’ EGFR
Agenti Anti-angiogenesi
Promotori dell’apoptosi
Immunoterapia Specifica (Pub med: 749 citazioni/119
rev.)72
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Immunoterapia
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Antigeni Tumore-Associati
CDX1- CDX2
ITF (Intestinal-Trefoil Factor)
MAGE-1
MAGE-2
MAGE-3
c-ErB-1
c-ErB-2
Sart (1/2/3)
lck
Her-2/neu74
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Scopo
Livello locale (isolamento e caratterizzazione fenotipica/
funzionale dei linfociti intratumorali)
Livello periferico (isolamento e caratterizzazione
fenotipica/ funzionale dei linfociti dal sangue periferico)
Verificare risposta T specifica per antigeni (peptidi) tumorali in pazienti con adenocarcinoma gastrico
75
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MESSA IN COLTURA DEL TESSUTO
NEOPLASTICOPRELIEVO
FRAMMENTAZIONE
LAVAGGI
TERRENO DI COLTURA (rIL-2)
(7gg RPMI 1640 + 50U IL-2)
LINEE CELLULARI T ATTIVATI
CLONAZIONE
AD ALTA EFFICIENZA
SPECIFICITA’
PRODUZIONE CITOCHINE
FUNZIONI CITOTOSSICHE 76
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Peptidi Usati (GCAA)
• SART: Squamous cell carcinoma antigen recognized by T cells
• Cyp: Peptidylprolyl isomerase B (cyclophilin B)
• lck: lymphocyte-specific protein tyrosine kinase
• ART: adenocarcinoma antigen
• EIF4BP: elF-binding protein
• ppMAPkkk: partial putative mitogen-activated protein kinase kinase kinase
• WHSC2: Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 2 protein
• UBE2V: ubiquitin-conjugating enzyme variant Kua
• HNRPL: heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L
Amedei A .Cancer Immunol Immunother. 2009
14
16
77
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Pazienti
Età media: 68 anni
Asportazione del tumore primario
No chemioterapia
No immunosoppressione, Autoimmunità
No Infezioni
Amedei A .Cancer Immunol Immunother. 2009
Aplotipo Pazienti
5: HLA- A02/24
8: HLA-A02
7: HLA-A24
8
78
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79
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Linfociti T GCAA-specifici infiltrano il tessuto neoplastico
Cloni T CD4+: 65/437 (15 %)
Cloni T CD8+: 59/316 (18 %)
30: peptidi HLA-A24
35: peptidi HLA-A02
29: peptidi HLA-A24
30: peptidi HLA-A02
Pazienti
Controlli
Cloni T CD4+: 0/282
Cloni T CD8+: 0/12080
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Repertorio delle GCAA-specificità dei cloni T
40
31
81
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Clonicità dei linfociti T GCAA-specifici
Batteria di 24
anticorpi
monoclonali
(TCR Vß
Repertoire Kit,
Beckman
Coulter): Vß1,
Vß2, Vß3, Vß4,
Vß5.1, Vß5.2,
Vß5.3, Vß7.1,
Vß7.2, Vß8,
Vß9, Vß11,
Vß12,Vß13.1,
Vß13.2,Vß13.6
Vß14, Vß16,
Vß17, Vß18,
Vß20, Vß21.3,
Vß22 Vß23.
82
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Effetto sulla proliferazione dei cloni GCAA-specifici
degli Ab-HLA-I/II
38/65 (58%) = HLA class I-ristretti Circa 1 clone CD4+ per paziente83
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Riferimenti Bibliografici
84
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Profilo Th1 dei cloni T TIL-derivati
Stimolazione: 48 Ag(10mg/ml) +
5 x 105 APC autologhe irradiate
17% CD4+ = Th0
25% CD8+ = Th0
85
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Citotossicità (perforina-mediata) indotta dalla
stimolazione con GCAA-peptidi
Cell.Effettrice/Cell. Bersaglio = 10/1
CD4+= 50 Th1 + 11/15 Th0
94%
CD8+= 44 Tc1 + 15 Tc0
100%
I blasti T coltivati con le EBV-B
autologhe, caricate con Ag-specifico e
marcate Cr51 8 h 37 C°
86
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Attività pro-apoptotica (Fas-FasL) dei cloni
TIL-derivatiBlasti stimolati (PMA10 ng/ml + Iono. 1mmol/ml) in presenza di cellule Jurkat Fas+ marcate Cr51 18 h 37 C°
CD4+ = 50/ 65 (77%)
CD8+ = 50/ 59 (85%)87
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88
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Linfociti T GCAA-specifici nel sangue
periferico dei pazienti con AG
PBMC (3x 105) coltivati per 5 gg in presenza di terreno e terreno + GCAA antigene (10mg/ml)
14/ 20 (70%) PBMC pazienti proliferavano in presenza dei peptidi GCAA
4 (HLA-02+/HLA-A24+) : proliferavano a peptidi di ambedue le classi
6 (HLA-02+/HLA-A24-) : proliferavano a peptidi HLA-A02-ristretti
4 (HLA-02-/HLA-A24+) : proliferavano a peptidi HLA-A24-ristretti
6 pazienti + 15 controlli : non proliferavano a nessun peptide
89
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Linee T GCAA-Indotte da PBMC dei
pazienti con Adenocarcinoma gastrico
5 gg di stimolo con il peptide GCAA
7 gg con terreno + rIL-2
10 gg = valutazione intracitoplasmatica CKS
Stimolo (6 h) = Pep (10mg/ml) + a-CD28 (1mg/ml) + a-CD49d (1mg/ml)
16/20 pazienti (80%) = linee GCAA-indotte
4 pazienti = no linee GCAA-indotte
6 pazienti = no proliferazione PBMC
3 pazienti (1.BB, 7.CS, 16.MG) = no
cloni TIL-deriv
90
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Profilo Th1 nelle linee GCAA-Indotte ed
ottenute da PBMC
Media : 11 %
Media : 15 %
91
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Conclusioni (i)Maggioranza dei cloni T (CD4+/CD8+) TIL-derivati e GCAA-peptidi-specifici
mostra profilo citochinico Th1/Tc1
Artefatto della coltura in vitro (rIL-2) ?: studi precedenti mostrano predominanza di
cloni T Th0 isolati da pazienti con gastrite cronica o Th2 se isolati da pazienti con
Asma allergico.
92
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Conclusioni (I)Simili percentuali di cloni T GCAA-peptide-specifici ottenuti dai CD8+ (18 %) e
CD4+ (15%) ottenuti dai TIL della neoplasia gastrica
Repertorio vario delle specificità dei cloni T peptide-specifici ottenuti dai TIL;
Predominanza SART3 (24 cloni) e lck (32)
93
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Conclusioni (i)15% dei pazienti impossibile isolare ed espandere linfociti T GCAA-peptide-specifici
No risposta ? Risposta debole (no rilevabile) ?
100 % cloni CD8+ e 94% cloni CD4+ presentano armamentario citotossicità
(usando E-BVB autologhe + peptidi dei GCAA)
81% cloni TIL – derivati sono capaci di indurre apoptosi Fas-FasL
(usando Jurkat cells + mitogeno)
94
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Conclusioni (i)
I cloni T derivati dai TIL isolati dal tessuto dell’Adenocarcinoma gastrico
mostrano
citotossicità specifica per i peptidi degli antigeni tumorali
Importante requisito per rendere efficace l’immunoterapia del
Cancro Gastrico
95
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Conclusioni (iI)Linfociti T specifici per i peptidi GCAA evidenziati nel sangue periferico del 70 %
Dei pazienti (14/20) con adenocarcinoma gastrico (proliferazione PBMC)
Numero troppo basso di linfociti T tumore-specifici in
circolo (metodica non sensibile)
Confinamento dei linfociti T
tumore-specifici
3/6 pazienti: 1.BB, 7.CS, 16.MG no isolamento linfociti T peptide-specifici
96
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Conclusioni (iI)16/ 20 pazienti indotte linee GCAA-specifiche
Molti linfociti evidenziano IFN-g intracitoplas. (Th1) ma poca/nulla IL-4 (Th0)
Sti
mo
lazio
ne
pe
pti
de
-
sp
ec
ific
a
1.BB, 7.CS, 16.MG no induzione linee T peptide-specifiche
Ipotesi: Incapaci di montare risposta contro cellule della neoplasia gastrica97
![Page 98: Il sistema maggiore di istocompatibilità: struttura e ... · I prodotti dei geni MHC-I sono antigeni direttamente implicati nel fenomeno del rigetto, ... (antigen presenting cell),](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022720/5c65aa4809d3f2966e8d308e/html5/thumbnails/98.jpg)
Linfociti T GCAA-specifici Th1 e con spiccata attività citotossica
Inefficaci nel bloccare la crescita tumorale
98
![Page 99: Il sistema maggiore di istocompatibilità: struttura e ... · I prodotti dei geni MHC-I sono antigeni direttamente implicati nel fenomeno del rigetto, ... (antigen presenting cell),](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022720/5c65aa4809d3f2966e8d308e/html5/thumbnails/99.jpg)
Condizioni In Vivo differenti dalle condizioni di attivazione in vitro
dei linfociti T Tumore-specifici
Inattivazione della risposta immune specifica
Escape tumorale Produzione di fattori bloccanti (cks, etc)
Arruolamento di linfociti T regolatori
99
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Immunoterapia del cancro gastrico :
Illusione o possibilità terapeutica?
A volte il vincitore
è semplicemente chi
non ha mai mollato
Jim Morrison
Non importa, se stai procedendo molto lentamente;
ciò che importa è che tu non ti sia fermato.
Confucio
Possibilità Terapeutica:
Inizio di un cammino ancora lungo
100
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Tipizzazione HLA
(Tissutale)
Tecnica
SierologicaTecnica Biologia
Molecolare
PCR – SSP
PCR – SSO
PCR - RFLP
Test di Linfotossicità Complemento Dipendente
101
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Test di Linfotossicità Complemento
DipendenteAntigeni caratterizzati tramite utilizzo di Alloanticorpi naturali che fissandosi
Agli antigeni HLA che sono presenti sulle cell. bersaglio attivano il complemento
Disporre di una serie di antisieri in grado di riconoscere le diverse specificità HLA
Antisieri monoclonali o alloantisieri
Metodica:Estrazione dei linfociti: una provetta per classe: 4 ml (Classe I) 2 ml (Classe II)
100 ml di biglie immunogenetiche (ant. Specifici per B e T)
Centrifugazione: I linfociti T e B si dispongono a rosetta attorno alle biglie
Portaprovette con magnete; T e B si legano alla parete
Sospensione dei linfociti in PBS
Semina in piastre tipizzanti: 144 pozzi (classe I) e 72 (classe II) contenenti antisieri
Incubazione 40/60 min
Dispensazione del Complemento di coniglio (incubazione 60 min)
Dispensazione di Fluoroquence
Lettura al microscopio a fluorescenza
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Test di Linfotossicità Complemento
Dipendente
103
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Tecnica di Biologia Molecolare
PCR - SSPUso di coppie di primers sequenza specifica: riconoscono in modo specifico un allele
PCR contemporanee ( 96 totali) ciascuna caratt. da una diversa coppia di primers
Primers: stessa lunghezza e temp. di allineamento = unico programma
coppia di primers aspecifici = controllo positivo
primer mix
Molto precisa ma si adatta poco alla grande mole
Fasi: Estrazione del DNA
Amplificazione con primers sequenza-specifici
Rivelazione su gel di Agarosio
Lettura
104
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PCR – SSP
Risultati
105
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PCR – SSP
Risultati
106
![Page 107: Il sistema maggiore di istocompatibilità: struttura e ... · I prodotti dei geni MHC-I sono antigeni direttamente implicati nel fenomeno del rigetto, ... (antigen presenting cell),](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022720/5c65aa4809d3f2966e8d308e/html5/thumbnails/107.jpg)
PCR – SSP
Risultati
107
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Tecnica di Biologia Molecolare
PCR - SSO
Principio: Oligonucleotidi sequenza specifici che si comportano come sonde
che indicano la presenza o l’assenza della seq. caratt, di un allele o gruppo di alleli
Ottimo metodo per la tipizzazione molecolare a bassa risoluzione di
un grande numero di campioni (diagnostica di routine)
Fasi: Estrazione del DNA
Amplificazione con primers oligonucleotidi-sequenza-specifici
Rivelazione su striscia di nylon
Lettura
108
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Tecnica di Biologia Molecolare
PCR – RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
Principio: polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione ottenuti
dalla digestione con enzimi di restrizione di un amplificato di DNA
Metodica : 2 passaggi
Amplificazione specifiche regioni Caratterizzazione Allelica con digestione
Tempo di esecuzione: 10-24 h
Tecnica obsoleta: in passato per tipizzare DP e DQ
109
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La presentazione dell’antigene
Corso per tecnici di laboratorioAnno Accademico 2016-2017
Prof. Amedeo Amedei
110
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Antigeni ed immunogeni
Antigenicità: descrive la capacità dell’antigene a legarsi ad unrecettore, ovvero di essere riconosciuto dal sistemaimmunitario.
Immunogenicità: descrive la capacità di un antigene distimolare una risposta immune
Un antigene può non essere necessariamente un immunogeno
111
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I tre dogmi della presentazione convenzionale dell’antigene
1. Gli antigeni sono riconosciuti dopo digestione (processing)
2. Gli antigeni sono riconosciuti in associazione con le molecoledi istocompatibilità di classe I o II (presentazione)
3. Il riconoscimento degli antigeni extra-cellulari è associatoalla molecola CD4 mentre il riconoscimento degli antigenicitosolici è associato alla molecola CD8 (costimolo)
112
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I tre dogmi della presentazione convenzionale
dell’antigene
1. Gli antigeni sono riconosciuti dopo digestione (processing)
2. Gli antigeni sono riconosciuti in associazione con le molecoledi istocompatibilità di classe I o II (presentazione)
3. Il riconoscimento degli antigeni extra-cellulari è associatoalla molecola CD4 mentre il riconoscimento degli antigenicitosolici è associato alla molecola CD8 (costimolo)
Presentazione MHC-dipendente113
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Altre modalità di riconoscimento dell’antigene
(presentazione non convenzionale)
1. Riconoscimento dei superantigeni
2. Presentazione MHC-indipendente
3. Presentazione attraverso la molecola CD1
4. Cross-presentazione
114
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I tre dogmi della presentazione dell’antigene
1. Gli antigeni sono riconosciuti dopo digestione(processing)
2. Gli antigeni sono riconosciuti in associazione con le molecoledi istocompatibilità di classe I o II (presentazione)
3. Il riconoscimento degli antigeni extra-cellulari è associatoalla molecola CD4 mentre il riconoscimento degli antigenicitosolici è associato alla molecola CD8
115
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APC e risposta T cellulare
TAntigene solubile
+ = Nessuna risposta immune
sangue
116
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APC e risposta T cellulare
APC Th
TAntigene solubile
+ = Nessuna risposta immune
Antigene presentato
= Risposta immunitaria specifica
sangue
117
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APC e risposta T cellulare
APC Th
TAntigene solubile
+ = Nessuna risposta immune
Antigene presentato
= Risposta immunitaria specifica
sangue
proliferazione 118
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APC e risposta T cellulare
APC Th
TAntigene solubile
+ = Nessuna risposta immune
Antigene presentato
= Risposta immunitaria specifica
sangue
proliferazione 119
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Processazione e presentazione degli Ag extracellulari e citosolici
Linfociti CD4 Linfociti CD8
Si NoAPCEndocitosi+
T
sangue
Atg solubile
120
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Processazione e presentazione degli Ag extracellulari e citosolici
Linfociti CD4 Linfociti CD8
No SiAPC+
T
sangue
Transfezione
Plasmide
121
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Processazione e presentazione degli Ag extracellulari e citosolici
Linfociti CD4 Linfociti CD8
No SiAPC
T
sangue
Shock osmotico
122
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Processazione e presentazione degli Ag extracellulari e citosolici
APC
Risposta CD4 Risposta CD8
Si No
No Si
No Si
Trasfezione
APC
Endocitosi
APC
Shock osmotico
+
+
+
I linfociti CD4 riconoscono antigeni solubili mentre le cellule CD8 riconoscono antigeni presenti nel citosol cellulare
123
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Processazione e presentazione degli Ag extracellulari e citosolici
APC
Risposta CD4 Risposta CD8
Si No
No Si
No Si
Trasfezione
APC
Endocitosi
APC
Shock osmotico
+
+
+
I linfociti CD4 riconoscono antigeni solubili presentati in associazione con le molecole di MHC classe II
124
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Processazione e presentazione degli Ag extracellulari e citosolici
La molecola CD4 si lega all’MHC classe II (costimolo)
The immunologicalsynapsis
125
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Processazione e presentazione degli Ag extracellulari e citosolici
La molecola CD4 si lega all’MHC classe II (costimolo)126
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Processazione e presentazione degli Ag extracellulari e citosolici
APC
Risposta CD4 Risposta CD8
Si No
No Si
No Si
Trasfezione
APC
Endocitosi
APC
Shock osmotico
+
+
+
I linfociti CD8 riconoscono antigeni citosolici presentati in associazione con le molecole di MHC classe I
127
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Processazione e presentazione degli Ag extracellulari e citosolici
La molecola CD8 si lega all’ MHC classe I (costimolo)
The immunologicalsynapsis
MHCClass I
CD8
128
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Processazione e presentazione degli Ag extracellulari e citosolici
La molecola CD8 si lega all’ MHC classe I (costimolo)129
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Significato del processing
130
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Significato del processing
131
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MHC class I-dependent presentation
132
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Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
MHCa
MHCb
MHCa
MHCb
Virus X
Virus X
133
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Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
MHCa MHCa
Virus X
sangue sangue
MHCa
cellule infette
cellule infette
Virus X
134
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Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
MHCa MHCa
Virus X
sangue sangue
MHCa
cellule infette
cellule infette
Virus X
135
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Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation MHCb MHCb
Virus X
MHCb sangue sangue
cellule infette
cellule infette
Virus X
136
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Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation MHCb MHCb
Virus X
MHCb sangue sangue
cellule infette
cellule infette
Virus X
137
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Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
138
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Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
MHCa MHCa
Virus X
sangue sangue
cellule infette
cellule infette
Virus X
MHCb
139
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Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation MHCb MHCb
Virus X
sangue sangue
cellule infette
cellule infette
Virus XMHCa
140
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Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
141
![Page 142: Il sistema maggiore di istocompatibilità: struttura e ... · I prodotti dei geni MHC-I sono antigeni direttamente implicati nel fenomeno del rigetto, ... (antigen presenting cell),](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022720/5c65aa4809d3f2966e8d308e/html5/thumbnails/142.jpg)
Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
142
![Page 143: Il sistema maggiore di istocompatibilità: struttura e ... · I prodotti dei geni MHC-I sono antigeni direttamente implicati nel fenomeno del rigetto, ... (antigen presenting cell),](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022720/5c65aa4809d3f2966e8d308e/html5/thumbnails/143.jpg)
MHC class I-dependent
presentation
1° phase processing
143
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La struttura del proteasoma
The proteasome is part of the ubiquitin-dependent degradation process of cytoplasmic proteins. The 26S proteasome is a multicatalytic protease that is found in the cytosol, perinuclear regions and nucleus of eukaryotic cells.
Ubiquitination favors a more efficient peptide presentation
144
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Struttura del proteasoma
The 20S proteasome (2,100 kDa)as an assembly of two outer (α)and two inner (β) heptameric rings.It forms a cylindrical structurewhere proteolysis occurs (β rings) hydrolysis of proteins at theCOOH- terminus of hydrophobic,basic and acidic residues(chymotrypsin-like, trypsin-likeand peptidylglutamyl-peptidehydrolytic activities).This prevents the indiscriminatedegradation of intracellularproteins.
28 sub-units(20S proteasome)
145
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Struttura del proteasoma
The 20S proteasome could be responsible for the degradation of oxidatively damaged proteins, which occurs in an ATP- and ubiquitin-independent manner.
The PA28 (11S) regulatory (REG) complex (180 kDa) opens the channel through the complex, via an ATP-independent process and mediates the degradation of non-ubiquitinated short peptides 146
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Struttura del proteasoma
The outer rings comprise sevendifferent α subunits, withoutcatalytic activity, serving as ananchor for the multisubunitATPase-containing PA700 (19S)regulator (700 kDa) and formingthe 26S proteasome.
7 sub-units
7 sub-units
constitutively or inducibly expressed, and assembled selectively to form complexes with distinct proteolytic characteristics, adapting to altered physiological conditions
+
147
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Struttura del proteasoma
The outer rings comprise sevendifferent α subunits, withoutcatalytic activity, serving as ananchor for the multisubunitATPase-containing PA700 (19S)regulator (700 kDa) and formingthe 26S proteasome.
26S proteasome
7 sub-units
7 sub-units
+
148
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Struttura del proteasoma
The outer rings comprise sevendifferent α subunits, withoutcatalytic activity, serving as ananchor for the multisubunitATPase-containing PA700 (19S)regulator (700 kDa) and formingthe 26S proteasome.
26S proteasome
7 sub-units
7 sub-units
+
8-10AA149
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Assemblaggio del proteasoma
LMP2
LMP7
MECL-1
low-molecular mass polypeptides
multicatalytic endopeptidase complex-like-1
150
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Assemblaggio del proteasoma
LMP2
LMP7
MECL-1
IFNs+
+
+
151
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Proteasoma: genes and DRIPs
152
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MHC class I-dependent
presentation
2° phase Peptide transport
153
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Alternative for production of adequate peptides
154
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The cellular chaperons The molecular chaperones are a diverse set of protein families requiredfor the correct folding, transport and degradation of other proteins invivo. The chaperonins are large, double-ring oligomeric proteins thatact as containers.
bacterial chaperonin GroEL The eukaryotic chaperoninTCP1 ring complex (TRiC) isstructurally related to GroEL,but has greater similarity tothe chaperonins of archaea(thermosomes). TRiC has tworings of eight differentsubunits, which also haveequatorial ATPase domains andapical substrate-bindingdomains. It takes peptidesfrom proteasome to ER.
155
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MHC class I-dependent
presentation
3° phase Peptide entry in ER
156
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Function of
Transporters associated with antigen
processing (TAP 1 and 2)
157
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TAP 1 and 2: structure and genes
158
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TAP 1 and 2: structure and genes
Up-regulation of TAP transcription
IFN-alfa
159
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Scoperta delle molecole TAP
160
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Scoperta delle molecole TAP
161
![Page 162: Il sistema maggiore di istocompatibilità: struttura e ... · I prodotti dei geni MHC-I sono antigeni direttamente implicati nel fenomeno del rigetto, ... (antigen presenting cell),](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022720/5c65aa4809d3f2966e8d308e/html5/thumbnails/162.jpg)
Scoperta delle molecole TAP
NON PRESENTA
ATP-binding cassette
162
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ABC proteins
Series of membrane transporters(both importers or exporters) whichutilize the energy of ATP hydrolysisto transport various substratesacross cellular membranes. They arepresent both in prokariotic andeukariotic organisms.
They can transport ions, amino acids, peptides, sugars,toxins, drugs, lipids, polysaccharides, nucleotides.
All are constituted by 4 domains (2 hydrophobic transmembrane domains
and 2 ATP-binding domains) 163
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Scoperta delle molecole TAP
PRESENTA
164
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Biology of TAPs
14 3 2
1
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Biology of TAPs
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Biology of TAPs
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4
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Scoperta delle molecole TAP
PRESENTA
Peptides are necessary for correct and stable expression of MHC class I molecules 168
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The reduction in class I MHC expression is due to TAP2 deficiency.
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TAP deficiency
Intracellular FACSstaining of TAP1 and TAP2proteins in two TAP1-deficient patients, theirmother, an unrelatedhealthy control patient,and the TAP competentand incompetent B-lymphoblast lines T0 andT2 respectively. Meanfluorescence intensitiesand the isotype controlbackground staining aredisplayed (y-axis counts).Lymphocyte gated analysis(x-axis FL1-H)
Isotype control
Anti-TAP1
Anti-TAP2170
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TAP deficiency
Congenital HLA class Ideficiency is a rare diseasefrequently resulting inchronic inflammation of therespiratory tract, and/orskin granulomas. A possiblefurther manifestation istoxoplasmicretinochoroiditis (inabsence of HIV infection).
Isotype control
Anti-TAP1
Anti-TAP2171
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TAPs and virus escape
The loading of peptide on MHC by TAPis targeted by several viruses.ICP47 from HHV-1 binds to the peptidebinding site of TAP, with 10-1000 foldhigher affinity than most peptides,thereby blocking the first step of thetranslocation pathway.HCMV US6 instead interacts with TAPfrom the RE luminal side and inhibits ATPbinding and peptide stimulated ATPhydrolysis.UL49.5 proteins have differentstrategies to inhibit TAP including blockof the binding of ATP to TAP.BNLF2a protein from Epstein-Barrvirus prevents the binding of peptidesand ATP to TAP.
172
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Mechanisms of viral escape
BNLF2a proteinfrom Epstein-Barr virusprevents thebinding ofpeptides andATP to TAP
UL49.5 proteinshave differentstrategies toinhibit TAPincluding block ofthe binding ofATP to TAP.
HCMV US6insteadinteracts withTAP from theRE luminal sideand inhibitsATP binding andpeptidestimulated ATPhydrolysis.
ICP47 from HHV-1binds to the peptide binding site of TAP, with 10-1000 fold higher affinity than most peptides, thereby blocking the first step of the translocation pathway.
173
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MHC class I-dependent
presentation
4° phase Association with MHC
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MHC class I assembling
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Correct folding of MHC class I molecules when in presence of presented peptides
1^ fase
176
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Correct folding of MHC class I molecules when in presence of presented peptides
Degen and Williams (1994) first discovered calnexin in association with MHC class I molecules synthesized by lymphoma cell lines.
Anti-Calnexin - ER membrane marker antibody
177
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Correct folding of MHC class I molecules when in presence of presented peptides
Calnexin is a 88 kDa chaperone protein foundin the ER.
a) Newly synthesized MHC class I alphachains bind to calnexin until two βmicroglobulins and possiby a peptide bindto the alpha chain. The heterodimer thendissociates from calnexin and continueson its pathway (Janeway et al, 1999).
b) In addition, calnexin binds with partiallyfolded immunoglobulin proteins and partialcomplexes of T cell receptor and retainsthem in the E.R. until they are completelyfolded (Janeway et al, 1999). 178
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Correct folding of MHC class I molecules when in presence of presented peptides
2^ fase
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Correct folding of MHC class I molecules when in presence of presented peptides
2^ fase
180
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Calreticulin is a luminal protein (chaperonine), travels freely within theER lumen, interacts with its protein-folding intermediates and is vital inseveral cellular functions (cell-cell communication and recognition; immuneresponses and recognition; ion, solute, and metabolite fluxes; intracellularprocessing of metabolites).It binds monoglucosylated carbohydrate which is typically found on newly-synthesized proteins before they leave the ER. The C-terminal region ishighly acidic, binds Ca2+ and is involved in Ca2+ storage. Ca2+ binding tocalreticulin and, consequently, changes in the ER Ca2+ storage capacity,affect the protein’s chaperone function.
Calreticulina ed Epr57
181
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Calreticulin is a luminal protein (chaperonine), travels freely within theER lumen, interacts with its protein-folding intermediates and is vital inseveral cellular functions (cell-cell communication and recognition; immuneresponses and recognition; ion, solute, and metabolite fluxes; intracellularprocessing of metabolites).It binds monoglucosylated carbohydrate which is typically found on newly-synthesized proteins before they leave the ER. The C-terminal region ishighly acidic, binds Ca2+ and is involved in Ca2+ storage. Ca2+ binding tocalreticulin and, consequently, changes in the ER Ca2+ storage capacity,affect the protein’s chaperone function.
Calreticulin deficiency is
embryonic lethal because it causes
lesions during cardiac
development
Calreticulina ed Epr57
182
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Calreticulina ed Epr57ERp57 is a thioloxidereductase, memberof the PDI family ofproteins whichassociates with thesubstrates recognizedby both calreticulin andcalnexin.
ERp57 has been shown to catalyse the formation of nativedisulphide bonds in glycoproteins and to form a stableinteraction with the MHC class I loading complex via aninteraction with tapasin (THE EMBO JOURNAL (2007 ).
183
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Correct folding of MHC class I molecules when in presence of presented peptides
Tapasin serves as a 'bridge'protein for uniting thiscomplex to TAP.Garbi et. al. (2003) haveshown that mice who lacktapasin have a 100-foldreduction in TAP expressionand the final 50 amino acidsof tapasin that lead to astrong bond to TAPupregulates TAP1 and TAP2(Bangia et. al. 1999) 184
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Tapasin-associated immunodeficiency
The loss of tapasin is associated with would seem to lead tosimilar phenotypes as loss of TAP (Yabe et. al. 2002).The disorder known as bare lymphocyte syndrome (BLS)where a reduced MHCI : peptide on the cell surface butcompletely normal TAP are observed.
Results and discussionS.M. was a 54-year-old woman suffering from aprimary chronic glomerulonephritis for 10years. She has been receiving hemodynamicdialysis for 5 years. She had a history ofherpes zoster and polyps of stomach and colon.Because kidney transplantation has beenconsidered, S.M. was subjected to serologicalHLA typing. Her class II antigens could betyped, but class I typing was not successful.
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Several ways for viruses to escape
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Correct folding of MHC class I molecules when in presence of presented peptides
3-4^ fase
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How peptides are generated in proteasome and fit inside the MHC groove
The MHC class I binding groove with antigenic peptide fitted into the pocket.
NEED TO BE
OF ADEQUATE LENGHT !188
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Alternative for production of adequate peptides
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Alternative for production of adequate peptides
ERAAP (the endoplasmic reticulum aminopeptidaseassociated with antigen processing) trims the extraN-terminal residues to generate final peptides ofthe correct length, which are bound by MHC class Imolecules
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Alternative for production of adequate peptides
Article Nature Immunology. 2007. 8, 101 - 108
In the absence of aminopeptidase ERAAP, MHC class Imolecules present many unstable and highly immunogenicpeptidesGianna Elena Hammer, Federico Gonzalez, Edward James, Hector Nolla & Nilabh Shastri
Those peptides are generated by proteolysis,which begins in the cytoplasm and continues inthe endoplasmic reticulum by the uniqueaminopeptidase ERAAP. The overall extent towhich trimming by ERAAP modifies the peptidepool and the immunological consequences ofERAAP deficiency are unknown. Here we showthat the peptide-MHC repertoire of ERAAP-deficient mice was missing many peptides.Furthermore, ERAAP-deficient cells presentedmany unstable and structurally unique peptide-MHC complexes, which elicited potent CD8+ Tcell and B cell responses. Thus, ERAAP is a'quintessential editor' of the peptide-MHCrepertoire and, paradoxically, its absenceenhances immunogenicity.
No CD8Low IFN-gammaAutoimmunity
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Alternative for production of adequate peptides
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Source of cytosolic antigens
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Source of cytosolic antigens
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Proteasoma: genes and DRIPs
A relatively large percentage of nascent proteins never reacha functional state owing to errors in translation or folding.These defective ribosomal products (DRiPs) are rapidlyubiquitylated during translation and are degraded byproteasomes. DRiPs could therefore represent an importantsource of MHC class I peptides.
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