Download - Image J を用いた組織像の定量解析
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Image J を用いた
Oil Red O & Hematoxylin 染色等の
染色像の定量解析
東京理科大学大学院 薬学研究科 薬科学専攻
東京理科大学 総合研究院 戦略的環境次世代健康科学研究基盤センター
小野田 淳人 ([email protected])
0
2000
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10000
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Oil red O Hematoxylin
Area µm2
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組織像の定量解析は、統計的な “違い” を示すためにも
有効な解析手法の一つです
A B
C D
ほんまに? よぅわからへんなぁ
演 者
聴 衆
D 群は、A 群とC 群に比べて
脂質蓄積量(赤)が増加したんやで
※著作権の関係上、画像は適当なものを使用しています
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D 群は、A 群とC 群に比べて
脂質蓄積量(赤)が増加したんやで
ほんまや! よーさん増えとるやんか!
演 者
聴 衆
A B
C D
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
A B C D
Red Areaµm2
組織像の定量解析は、統計的な “違い” を示すためにも
有効な解析手法の一つです
※著作権の関係上、画像は適当なものを使用しています ※著作権の関係上、グラフの数値は適当です
では、どのようにすれば定量化ができるのか、Image Jを例に見ていきましょう。
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染色像の定量化までの流れ
I. Image J の基礎(参考資料)
II. Scale の単位変換
III. 三原色の分離: Split Channels
IV. 赤色の輝度から青色の輝度を引く
V. 測定領域の指定:閾値の決定
VI. 測定領域の定量化
今回は Hematoxylin による核染色を施した Oil Red O 染色を例に
2色ある染色像の定量方法を述べていきます。
また、単染色法や免疫蛍光法などの画像を定量解析する際にも、
同様の手法を適用することができます。
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Image J の基礎:他力本願
http://www.slideshare.net/nmaro/imagej20116
バイオイメージング研究のためのImage J によるデジタル画像解析入門
朽津 夏麿(東京大学大学院)
http://seesaawiki.jp/w/imagej/d/ImageJ%A5%DE%A5%CB%A5
%E5%A5%A2%A5%EB%A1%A7%A5%C1%A5%E5%A1%BC%A5
%C8%A5%EA%A5%A2%A5%EB%A4%C8%BC%C2%CE%E3
Image J マニュアル:チュートリアルと実例
インストールから実例まで、これらの資料を読めば、
たいていのことはできるようになります。
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Image J の基礎:組織解析の注意点
組織切片における定量評価では、
絶対的な定量値にさほどの価値はありません。
大切なのは、対照群との比較解析です。
比較解析では、
染色効率が各切片で同一であることを前提にして成り立ちます。
そのため、
① 組織固定の不十分など、変性による artifact がない切片
② 染色態度を左右する固定時間、切片厚等が同一である切片
③ 基本的に、同一試薬を用いて、同じ操作で、同時に染色した切片
④ 同じ設定の同じ顕微鏡で撮影した画像* *③を満たしている場合に限る
これらの条件を満たしていることが、
染色像の定量解析には必須となります。
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Scale の単位変換
最終的に定量化するときは、基本的に『m』単位を用いますが、
Image J の初期設定では『pixel』になっています。
Image J の初期設定
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Scale の単位変換
1.Image J を起動
起動直後の画面→
2.”File” → “Open” を選択し、解析対象の画像を開く
3.虫眼鏡のマークを選び、
画像を拡大する
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Scale の単位変換
4.Straight line selections
を選択する
5.画像のスケールバーに合わせて、線を引く(黄色)
6.”Analyze” → “Measure” をクリックするとResultsウィンドウが出てくる
7.この場合、50 µmが
293.750 pixelである
ことを示している。
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Scale の単位変換
8.”Analyze” → “Set Scale” をクリックするとSet Scaleウィンドウが出る
9.Distance in pixels に先ほど測定したpixel数を、
Known distance にスケールバーの長さを、
Unit of length にスケールバーの単位を入力する
10.OKをクリックして、
Scaleの単位設定を終了する
※この時の値(○○ pixels/µm など)を
メモしておくと、後で楽になる
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三原色の分離: Split Channels
11.再度、解析対象の同じ画像を開きなおす
12.”Image” → “Color” → “Split Channels” を選択
13.Red, Green, Blue に分かれた3つの画像が表示される
Red Green Blue 初期画像
例えばRedの画像なら、赤の色調(波長)を多く含むところほど輝度が高く、 赤の色調(波長)が少ないところほど輝度が低く示される
低 高
まず、各色の輝度を抽出するために、色の分離を行います。
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赤色の輝度から青色の輝度を引く
14.今回用いた Oil red O & Hematoxylin 染色は、
赤色と青色の色調が強いため、
Redの画像とBlueの画像を残す
15.”Process” → “Image Caluculator” を
クリックして開く
16.Redの画像からBlueの画像が
減算(Subtract)されるように設定する
17.OKをクリックすると 赤の波長の強いところが白色になり、 それ以外は黒色になった画像が入手できる (場合によっては、さらに Green を減算することもある)
Red - Blue
18.”File” → “Save as” で
任意のフォルダに保存する
定量したい色の輝度から不要な色の輝度を減算します。
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赤色の輝度から青色の輝度を引く:簡単な原理
Blue
Red
Red-Blue
初期画像
Split
Subtract
赤(Oil red O)
青(Hematoxylin)
白(血管腔)
赤の波長が強い赤色と白色の輝度が高い
青の波長が強い青色と白色の輝度が高い
赤の輝度大ー青の輝度小= 輝度大(白で示される)
赤の輝度小ー青の輝度大= 輝度は負の値(黒)
赤の輝度大ー青の輝度大= 輝度小(黒)
赤の輝度ー青の輝度= 減算後の輝度
結果的に、減算後の画像では赤色の部分だけが高い輝度(白色)で示される
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測定領域の指定:閾値の設定
19.減算によって得られた画像を開く
20.”Image” → “Adjust” → “Threshold”を
クリックして開く
21.閾値となる値を設定する(次スライド参照)
※比較解析をするためには、この値を定量する全てのFigにおいて
同一にしなければならない。値はもとの画像と比較して熟考する。
22.値を決定した後、
Applyをクリックして適用する。
23. ”File” → “Save as” で
任意のフォルダに保存する
※この画像は
手法を示す際に、もとの画像と比較して
論文に使用されることが多い
数値化する領域を決定するために閾値を定めます。
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測定領域の指定:閾値の決定
21.閾値となる値を設定する
※比較解析をするためには、この値を定量する全てのFigにおいて
同一にしなければならない。値はもとの画像と比較して熟考する。
10 25 40
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測定領域の指定:閾値の決定
21.閾値となる値を設定する
※比較解析をするためには、この値を定量する全てのFigにおいて
同一にしなければならない。値はもとの画像と比較して熟考する。
重ね合わせた結果、25-255の値が実際の Oil Red O 陽性脂肪滴に近いため、この画像をもとに定量することができる。この実験系の全ての画像に対して25-255を適用しなければ、適切な比較解析はできない。
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測定領域の定量化
24.再び、減算後の画像を開く
※ “Threshold” 後の画像を
利用してもよいが、使いにくい
25.再び ”Image” → “Adjust” → “Threshold”を
クリックしてThresholdを開く
26.決定した閾値を入力する
27.指定した部分が赤くなる
28. ”Analyze” → “Set Scale” を開いて
スケールを確認する
※場合によっては、
最初にメモした値を入力し直す
指定した領域を定量化します。
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測定領域の定量化
29. ”Analyze” → “Set Measurement” を
クリックして、測定項目と範囲を選択する
30.まずは、画像全体の面積を測定するため、
“Area” のみにチェックを入れる
31. ”Analyze” → “Measure” をクリックすると
指定した範囲の面積が示される
※この場合は画像全体の面積が示される
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測定領域の定量化
32. ”Analyze” → “Set Measurement” を
クリックして、測定項目と範囲を選択する
33.指定した領域の面積を測定するため、
“Area” と ” Limit to Threshold” に
チェックを入れる
34. ”Analyze” → “Measure” をクリックすると
指定した範囲の面積が示される
※この場合は指定した領域(赤い部分)の
面積が示される
35.研究内容に応じて、定量値をそのまま、
あるいは面積比を算出して用いる。
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ちなみに:各閾値の場合の定量値
10 25 40
22074.669 12056.887 6793.291
同じ画像からでも閾値に応じて異なる結果が得られるので、 細心の注意をはらって閾値を決定する
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測定領域の定量化
36.Resultsのウィンドウを消去する際に保存するか問われるため
“Yes” を選択する
37.保存されるファイルは .xls 形式なのでエクセルとして使用可能
38.得られた数値をもとにFigure、あるいはTableを作成し、
論文に用いる
39.Accept される
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おわりに
今回は Hematoxylin による核染色を施した Oil Red O 染色を例に
2色ある染色像の定量方法を述べましたが、
単染色法や免疫蛍光法などの画像を定量解析する際にも、
同じ手法を適用することができます。
また、
3種以上の色が存在する場合、
黄色や緑、茶色等、原色から遠い色を定量化する場合など、
条件が厳しい画像の際、Image J による定量化の前に
Photoshop を用いて画像編集を施すことで
定量化が可能になる場合があります。
そちらの方は、またの機会にお話しできればと思います。
何か、ご質問等のある方はこちらまで連絡を下さい。