UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ
CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO
PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
ANA ALICE MAIA GONÇALVES
IMUNOBIOINFORMÁTICA APLICADA AO DIAGNÓSTICO DE
Schistosoma mansoni
DIVINÓPOLIS, MG
FEVEREIRO, 2018
ANA ALICE MAIA GONÇALVES
IMUNOBIOINFORMÁTICA APLICADA AO DIAGNÓSTICO DE
Schistosoma mansoni
Dissertação apresentada ao Programa Multicêntrico de Pós-
graduação em Bioquímica e Biologia Molecular da
Universidade Federal de São João Del-Rei, como requisito
parcial para a obtenção do grau de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Alexsandro Sobreira Galdino
Co-Orientador: Prof. Dr. Carlos Chavez Oletégui
DIVINÓPOLIS, MG
FEVEREIRO, 2018
ii
iii
FE
Dedico este trabalho a todos da minha família, que
me apoiaram e estiveram presentes em todos os
momentos, sempre me dando forças para vencer todas as
minhas batalhas!
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por sempre estar comigo, me guiando,
iluminando, protegendo e abençoando. ELE que sempre abriu as portas da minha
vida, me dando forças e sabedoria para enfrentar todos os desafios.
A minha mãe, por ser a pessoa mais batalhadora que conheço. Essa mulher
GIGANTE me ensinou a enfrentar desafios, medos, a ir atrás dos meus sonhos com
todas as garras, porém, sempre mantendo a humildade e os pés no chão. Sempre
sacrificando seus próprios sonhos para me levar até o céu. Um simples “Obrigada
por tudo” está longe de representar minha gratidão.
Aos meus irmãos, Tamires e Wagner, que sempre apoiaram minhas decisões
e me aconselharam nos momentos de indecisões, me dando forças para sempre
batalhar. Muito obrigada! Aos meus familiares, que são a minha base, sempre me
motivando a estudar, entendendo meus momentos de afastamento e vibrando sempre
com cada vitória conquistada.
Ao Prof. Dr. Alexsandro Galdino, por me receber de portas abertas ao LABIOM,
me acolhendo desde o início dessa caminhada. Muito obrigada por todos os
ensinamentos e por todas as palavras de incentivo. Obrigada por ser um orientador
que acompanha todos os nossos passos, que sabe de todas as pontas e vírgulas do
projeto, sempre nos amparando e preocupando com nosso desenvolvimento científico
e, também, com nosso bem-estar.
A Prof.ª Dra. Débora Lopes, pela oportunidade de colaboração e, assim,
realização de parte tão importante deste projeto, contribuindo para meu crescimento
profissional e acadêmico.
A Laís, que me acolheu desde o meu primeiro dia no laboratório. Sempre
disposta a me ajudar, me incentivando, me ajudando e sempre me salvando! Eu não
sei como conseguiria completar esta etapa sem você!! Não tenho palavras para
descrever a minha gratidão a você, obrigada por ser uma amiga dentro e fora do
laboratório.
A Maria Juliana, que foi parte essencial deste trabalho, sempre disposta a me
ensinar, com a maior paciência do mundo, tirando todas as minhas dúvidas e
acrescentando muito em minha vida profissional e pessoal! O meu enorme MUITO
OBRIGADA por fazer esta caminhada ser mais leve e divertida.
v
A Luana, que chegou de mansinho, se tornando parte muito importante desta
jornada! Obrigada pelo seu companheirismo, pela ajuda nas horas do sufoco, pela
ajuda nas horas normais, pelas risadas e tudo mais! Obrigada por tudo!!
Agradeço também a Suliana, Reysla e Juliana por toda a ajuda e
companheirismo, dentro e fora do laboratório, sendo muito importantes para esta
jornada. Muito obrigada por todos os ensinamentos e por toda a ajuda!!
A todos da Equipe LABIOM, pelos momentos de trabalho e descontração
juntos. Vocês são uma família e só tenho que agradecer por poder fazer parte dela!!
Agradeço a todos meus amigos que, de algum modo, fizeram parte desta
jornada, torcendo e me apoiando.
A todos vocês, que fizeram parte desta jornada, muito obrigada!
vi
RESUMO
A esquistossomose, doença causada por trematódeos do gênero Schistosoma, representa um importante problema de saúde pública no mundo. Atinge principalmente países em desenvolvimento, devido às precárias condições de sobrevivência. No Brasil, a infecção por Schistosoma mansoni atinge 19 Estados, destacando-se o de Minas Gerais, onde prevalece em mais da metade de seus municípios. Para o controle e monitoramento eficaz da doença, é primordial a disponibilidade de testes de diagnóstico que sejam sensíveis e específicos. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi a identificação e seleção de novos antígenos, por meio de análises in silico, para a composição de um kit de diagnóstico inovador contra S. mansoni. Com a disponibilidade de informações e propriedades do parasito, contidas em bancos de dados, foi possível triar epítopos com capacidade antigênica, a partir de proteínas hipotéticas do S. mansoni, utilizando ferramentas de bioinformática. A triagem dos epítopos mais promissores, como candidatos a comporem kits de ensaios sorológicos, baseou-se em critérios de seleção, como, a localização celular, afinidade por moléculas HLA de classe II e por BCR, antigenicidade, baixa similaridade com proteínas humanas ou com proteínas de helmintos. Ao final das análises, os cinco melhores epítopos foram selecionados e, a partir deles, foi criada uma proteína multiepitopo recombinante por meio de desenho racional. O gene sintético, que codifica a proteína multiepitopo (denominada rMEBIOSM) foi clonado num vetor pET21a, para posterior inserção em células de Escherichia coli BL21 (λDE3). Entretanto, não foi possível observar a banda correspondente à massa molecular de rMEBIOSM. Isso indica que, mesmo após a modificação de determinadas variáveis do protocolo de expressão, assim como a utilização de cepas diferentes, não houve expressão da proteína. O resultado obtido foi confirmado por meio de purificação de cromatografia de afinidade e Dot-Blot. Tais achados demonstraram que, possivelmente, a E. coli não foi a célula hospedeira adequada para a expressão da proteína, sendo necessária, então, a utilização de outras células hospedeiras para expressar a proteína rMEBIOSM. Palavras Chave: esquistossomose, bioinformática, proteína multiepitopo, diagnóstico.
vii
ABSTRACT
Schistosomiasis, a disease caused by trematodes of the genus Schistosoma, represents a major public health problem in the world. Affects mainly developing countries, due to precarious conditions of survival. In Brazil, Schistosoma mansoni infection affects 19 states, most notably Minas Gerais, where it prevails in more than half of its municipalities. For the control and effective monitoring of the disease, it is essential the availability of diagnostic tests that are sensitive and specific. In this context, the aim of this study was the identification and selection of new antigens, by in silico analysis, for the composition of a novel diagnostic kit against S. mansoni. With the availability of information and properties of the parasite, contained in databases, it was possible to screen antigenic epitopes from hypothetical S. mansoni, proteins using bioinformatics tools. The screening of the most promising epitopes, as candidates to compose serological test kits tests, were based on selection criteria, such as, cellular localization, affinity HLA class II molecules and BCR, antigenicity, low similarity to human or helminth proteins. At the end of the analyzes, the five best epitopes were selected and, from them, a recombinant multiepitope protein was created by rational design. The synthetic gene, encoding the multiepitope protein (termed rMEBIOSM) was cloned into a vector pET21a, for further insertion into Escherichia coli BL21 (λDE3) cells. However, it was not possible to observe the band corresponding to the molecular mass of rMEBIOSM. This indicates that, even after modification of certain variables of the expression protocol, as well as the use of different strains, there was no expression of the protein. The result wasconfirmed by affinity chromatography purification and Dot-Blot. Such findings demonstrated that, possibly, E. coli was not the host cell suitable for protein expression, thus requiring the use of other host cells to express the rMEBIOSM protein.
Key words: schistosomiasis, bioinformatics, multiepitope protein, diagnosis.
viii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 16
1.1 ESQUISTOSSOMOSE .................................................................................... 16
1.2 CICLO BIOLÓGICO DO S. mansoni ............................................................... 18
1.3 IMUNOPATOLOGIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS .................................... 19
1.4 CONTROLE E TRATAMENTO ........................................................................ 22
1.4.1 Vacinas ...................................................................................................... 24
1.5 DIAGNÓSTICO ................................................................................................ 26
1.6 BIOINFORMÁTICA .......................................................................................... 34
2 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 36
3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 38
3.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 38
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 38
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 39
4.1 ANÁLISES IN SILICO ...................................................................................... 42
4.1.1 Predição da localização celular.................................................................. 42
4.1.2 Predição de peptídeo sinal ........................................................................ 42
4.1.3 Predição de hélices transmembrânicas e regiões expostas ...................... 42
4.1.4 Predição de epítopos com afinidade por moléculas de HLA classe II ....... 43
4.1.5 Predição de epítopos lineares com afinidade pelos receptores de
antígenos de células B........................................................................................ 43
4.1.6 Predição de antigenicidade ........................................................................ 44
4.1.7 Análise de homologia ................................................................................. 44
4.1.8 Predição da expressão das proteínas nas diferentes fases de vida do
parasito ............................................................................................................... 44
4.2 DESENHO RACIONAL DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE . 44
4.3 LINHAGEM BACTERIANA .............................................................................. 45
4.4 PLASMÍDEO .................................................................................................... 46
4.5 PREPARAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES E TRANSFORMAÇÃO COM
PLASMÍDEO pET21a::rMEBIOSM ........................................................................ 48
ix
4.6 EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA PROTEÍNA rMEBIOSM ............................. 49
4.7 ANÁLISE EM GEL SDS-PAGE DA PROTEÍNA rMEBIOSM ........................... 50
4.8 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA rMEBIOSM .................................................... 50
4.9 DOT-BLOT ....................................................................................................... 52
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 53
5.1 ANÁLISES IN SILICO ...................................................................................... 53
5.1.1 Obtenção das sequências de proteínas hipotéticas de S. mansoni ........... 53
5.1.2 Predição de localização celular.................................................................. 53
5.1.3 Predição de peptídeo sinal ........................................................................ 55
5.1.4 Predição de hélices transmembrânicas e regiões expostas ...................... 56
5.1.5 Predição de epítopos com afinidade por moléculas do HLA classe II ....... 57
5.1.6 Predição de epítopos lineares com afinidade pelo receptor de antígeno de
célula B ............................................................................................................... 59
5.1.7 Predição de antigenicidade ........................................................................ 61
5.1.8 Análise de homologia ................................................................................. 62
5.1.9 Predição da expressão das proteínas nas diferentes fases de vida do
parasito ............................................................................................................... 64
5.2 DESENHO RACIONAL DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE . 65
5.3 PREPARAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES E TRANSFORMAÇÃO COM
PLASMÍDEO pET21a::rMEBIOSM ........................................................................ 68
5.4 EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA PROTEÍNA rMEBIOSM E ANÁLISE POR
GEL SDS-PAGE .................................................................................................... 70
5.5 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA rMEBIOSM E DOT-BLOT .............................. 78
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 82
7 PERSPECTIVAS .................................................................................................... 83
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 84
APÊNDICE .............................................................................................................. 106
ANEXO ................................................................................................................... 109
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Distribuição global das espécies de Schistosoma.. ................................... 17
Figura 2: Distribuição geográfica de S. mansoni no Brasil. ...................................... 18
Figura 3: Fluxograma das análises in silico das proteínas ....................................... 40
Figura 4: Fluxograma das análises in vitro da produção da proteína multiepitopo ... 41
Figura 5: Mapa físico do vetor pET21a .................................................................... 47
Figura 6: Mapa da região do polylinker do vetor pET21a ......................................... 47
Figura 7: Predição de localização celular da proteína hipotética Smp_144770 pelo
programa Psort II ....................................................................................................... 54
Figura 8: Predição de peptídeo sinal ........................................................................ 56
Figura 9: Análise da orientação da proteína Smp_179660 na membrana plasmática
pelos programas TMHMM, TMpred e SOSUI ............................................................ 57
Figura 10: Predição de epítopos pelo programa Tepitool da proteína Smp_126900.
.................................................................................................................................. 59
Figura 11: Predição de epítopos com afinidade por BCR ........................................ 61
Figura 12: Predição de antigenicidade realizada pelo programa VaxiJen ................ 62
Figura 13: Predição da expressão das proteínas correspondentes aos epítopos
selecionados nas diferentes fases de vida do parasito ............................................. 64
Figura 14: Desenho da proteína multiepitopo recombinante rMEBIOSM ................. 66
Figura 15: Predição da estrutura da proteína multiepitopo recombinante pelo
programa Phyre2 ....................................................................................................... 67
Figura 16: Ponto isoelétrico teórico e massa molecular da rMEBIOSM ................... 68
xi
Figura 17: Análise por SDS-PAGE 12% da cinética de indução das cepas pLysS e
pLysE. ....................................................................................................................... 72
Figura 18: Análise por SDS-PAGE 12% da cinética de indução das cepas pLysS e
pLysE do sobrenandante e pellet. ............................................................................. 75
Figura 19: Análise por SDS-PAGE 12% da purificação da cepa pLysS ................... 79
Figura 20: Teste Dot-Blot ......................................................................................... 80
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Cepas e genótipos de Escherichia coli ..................................................... 46
Tabela 2: Epitopos selecionados para comporem a proteína multiepitopo ............... 63
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
aa Aminoácido
APC Células apresentadores de antígenos, do inglês: Antigen-
presenting cells
APS Persulfato de amônio, do inglês: Ammonium persulfate
BCR Receptor de antígeno de célula B, do inglês: B cell antigen
receptor.
ºC Graus Celsius
CAA Antígeno anódico circulante, do inglês: Circulating anodic antigen
CCA Antígeno catódico circulante, do inglês: Circulating cathodic
antigen
cm Centímetros
COPT Teste de precipitina circunoval, do inglês: Circumoval precipitin
test
DNA Ácido Desoxirribonucléico, do inglês: Deoxyribonucleic acid
E. coli Escherichia coli
ELISA Ensaio de absorção imunoenzimático, do inglês: Enzyme linked
immunosorbent assay
GLA-SE Emulsão estável adjuvante glicopiranosil lipídeo, do inglês:
Glucopyranosyl lipid adjuvant stable emulsion
h Horas
H Histidina
His-tag Resíduos de Histidina
xiv
HLA Antígeno leucocitário humano, do inglês: Human leukocyte
antigen
HRP Peroxidase de rabanete, do inglês: Horseradish peroxidase
IFA Ensaio de imunofluorescência indireta, do inglês: Indirect
immunofluorescence assay
IFN- γ Interferon gama
Ig Imunoglobulina
IHT Teste de hemaglutinação indireta, do inglês: Indirect
hemagglutination test
IL Interleucina
IPTG Isopropil-tio-β-galactosídeo
KK Kato-Katz
M Molar
MDA Administração de medicamentos em massa, do inglês: Mass drug
administration
Meio LB Meio Luria-Bertani
mg Miligrama
min Minuto
mL Mililitro
mm Milímetros
mM Milimolar
mRNA RNA mensageiro
Ni-NTA Coluna de afinidade de níquel
nm Nanômetro
OD Densidade Óptica
xv
OXA Oxaminiquina
PBS Tampão salina fosfato
PBS-T-BSA Tampão salina fosfato contendo albumina e polissorbato
PCR Reação em cadeia da polimerase, do inglês: Polymerase chain
reaction
PZQ Praziquantel
pH Potencial hidrogeniônico
pI Ponto isoelétrico
rpm Rotação por minuto
RNA Ácido ribonucleico, do inglês: Ribonucleic acid
SDS Dodecil sulfato de sódio, do inglês: Sodium dodecyl sulfate
SEA Antígeno solúvel do ovo, do inglês: Soluble egg antigen
SWAP Preparação de antígeno solúvel de verme adulto, do inglês:
Soluble adult worm antigen preparation
TF-Test® Teste de três fezes; do inglês: Three fecal test
TEMED Tetrametilelenodiamônio
Th1 Subpopulação de células T auxiliares do tipo 1, do inglês: T
helper cells type 1
Th2 Subpopulação de células T auxiliares do tipo 2, do inglês: T
helper cells type 2
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
tRNA RNA transportador
Tsp Tetraspanina
µg Micrograma
µl Microlitro
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 ESQUISTOSSOMOSE
A esquistossomose é uma doença causada por trematódeos do gênero
Schistosoma (BASCH, 1991; COLLEY; SECOR, 2014). Tem grande relevância clínica
e socioeconômica (AMARAL et al., 2017; WHO, 2013), sendo considerada
negligenciada tanto pelos órgãos públicos como pela indústria farmacêutica,
especialmente porque os países endêmicos são, na sua maioria, subdesenvolvidos
(GRYSEELS, 2012). Das doenças negligenciadas, é considerada a segunda mais
prevalente, estando atrás somente da malária (CHITSULO et al., 2000;
ELMORSHEDY et al., 2016). Trata-se de uma infecção helmíntica que afeta humanos
com grande impacto social, apresentando altas taxas de morbidade e mortalidade
global, o que a torna um grave problema de saúde pública (OLIVEIRA et al., 2016b;
VAN DER WERF et al., 2003).
A distribuição geográfica das espécies do parasito abrange 78 países,
infectando mais de 240 milhões de pessoas e, aproximadamente, 800 milhões vivem
em áreas de risco (WEERAKOON et al., 2015). Tem prevalência em áreas tropicais e
subtropicais, especialmente em áreas pobres e rurais, onde as condições de
saneamento e qualidade de vida são precárias (DA MARTINS et al., 2015). Em 2016,
pelo menos 206,5 milhões de pessoas necessitaram de tratamento preventivo, dos
quais mais de 88 milhões receberam tratamento (“WHO | Schistosomiasis”, 2017).
Dentre as espécies existentes, seis estão envolvidas na infecção de humanos:
Schistosoma mansoni, S. haematobium, S. japonicum, S. mekongi, S. intercalatum e
S. guineensi (COLLEY et al., 2014). Três destas são consideradas mais importantes:
S. mansoni, S. japonicum e S. haematobium, sendo que S. mansoni tem a maior
distribuição geográfica dentre elas (GRYSEELS et al., 2006; WANG; DA’DARA;
SKELLY, 2017). A distribuição global das espécies está representada na Figura 1.
17
Figura 1: Distribuição global das espécies de Schistosoma.
Fonte: (COLLEY et al., 2014).
O S. mansoni é a única espécie encontrada na América Latina (WEERAKOON
et al., 2015), estando presente também na África, Oriente Médio, Caribe e América
Latina (“WHO | Schistosomiasis”, 2017). No Brasil, as áreas endêmicas e focais
abrangem 19 Unidades Federadas, sendo que as áreas endêmicas compreendem os
Estados de Alagoas, Bahia, Pernambuco, Rio Grande do Norte (faixa litorânea),
Paraíba, Sergipe, Espírito Santo e Minas Gerais (predominantemente no Norte e
Nordeste do Estado). As áreas focais compreendem os Estados do Pará, Maranhão,
Piauí, Ceará, Rio de Janeiro, São Paulo, Santa Catarina, Paraná, Rio Grande do Sul,
Goiás e no Distrito Federal (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). É estimado que,
atualmente, seis milhões de pessoas estão infectadas e 25 milhões vivem em áreas
de risco de contrair a esquistossomose no país (ESPÍRITO-SANTO et al., 2015). O
Estado de Minas Gerais é considerado de grande importância epidemiológica para a
infecção no Brasil, visto que esta doença apresenta prevalência em cerca de 61% dos
seus municípios (DRUMMOND et al., 2010; FERREIRA et al., 2017), com mais de 10
milhões de pessoas vivendo em áreas endêmicas (DE CARVALHO et al., 2012;
DRUMMOND et al., 2010) . A Figura 2 representa a distribuição geográfica de S.
mansoni no Brasil.
18
Figura 2: Distribuição geográfica de S. mansoni no Brasil.
Fonte: (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
1.2 CICLO BIOLÓGICO DO S. mansoni
O S. mansoni tem um ciclo biológico complexo, envolvendo a fase de
reprodução assexuada no hospedeiro intermediário (caramujos do gênero
Biomphalaria) (CRISCIONE et al., 2009) e a fase de reprodução sexuada no
hospedeiro definitivo (homem e pequenos mamíferos) (BOROS, 1989; PEARCE;
MACDONALD, 2002).
O ciclo de vida se inicia quando os ovos eliminados junto às fezes de pessoas
infectadas entram em contato com a água (CARVALHO, 2016; PAN, 1965), eclodindo
e liberando miracídios, que são guiados por estímulos químicos e luminosos para
penetrar no hospedeiro intermediário (GRYSEELS et al., 2006). Uma vez no
hospedeiro intermediário, os miracídios dão origem à esporocistos primários e, após
14 dias de penetração, a esporocistos secundários. Estes sofrem modificações
anatômicas, iniciando a proliferação de células germinativas e, então, a formação de
19
cercárias. A formação completa das cercárias ocorre entre 27 a 30 dias após a
penetração dos miracídios (CARVALHO, 2016; PAN, 1965). As cercárias deixam o
hospedeiro intermediário entre 4 a 6 semanas após a infecção e nadam na água por
até 72h em busca do hospedeiro definitivo. A liberação da cercária é provocada pela
claridade e ocorre principalmente durante o dia (GRYSEELS et al., 2006).
As cercárias penetram na pele ou mucosa do hospedeiro definitivo e dão início
a fase sexuada do ciclo, sendo que a penetração é realizada por atividade mecânica
e por liberação de enzimas proteolíticas cercarianas (JAMIESON, 2016). A penetração
das cercárias leva a alterações morfofisiológicas, causadas pelas mudanças de
osmolaridade e temperatura, transformando-as em esquistossômulos (CARVALHO,
2016; STIREWALT, 1974). Estes saem da derme e vão para os pulmões através da
corrente sanguínea, onde sofrem a fase de alongamento. Após esta fase, eles caem
novamente na corrente sanguínea e chegam até as veias do sistema porta-hepático,
onde ocorre a maturação e acasalamento (CRABTREE; WILSON, 1986; KRAUTZ-
PETERSON et al., 2009; WILSON et al., 1978).
Os vermes adultos medem entre 1 a 2 centímetros (cm) de comprimento e 0,3
a 0,6 mm de largura (LAMBERTUCCI, 2010; VALE et al., 2012); são dióicos com corpo
cilíndrico, apresentando duas ventosas, tegumento complexo, trato digestivo cego e
órgãos de reprodução (JAMIESON, 2016). O macho possui um canal ginecóforo, no
qual a fêmea se aloja (LAMBERTUCCI, 2010; VALE et al., 2012) e, quando
acasalados, migram pela corrente sanguínea até as veias mesentéricas, onde as
fêmeas iniciam a oviposição (KRAUTZ-PETERSON et al., 2009).
A produção de ovos se inicia no período entre 5 a 7 semanas após a infecção,
onde são eliminados juntos às fezes, dando continuidade ao ciclo (COLLEY et al.,
2014). Porém, pode acontecer de alguns ovos serem transportados pela circulação
sanguínea para outros órgãos, e provocarem uma reação inflamatória granulomatosa
em torno da região onde ficam retidos (CARVALHO, 2016).
1.3 IMUNOPATOLOGIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
A esquistossomose pode levar a diferentes manifestações, tendo como fatores
importantes para o seu desenvolvimento clínico a localização do parasito, a carga
20
parasitária e a resposta imune do hospedeiro frente aos antígenos do S. mansoni
(BOROS, 1989; CARVALHO, 2016; TORRES, 1976). Pode ser classificada como
aguda, tendo característica assintomática em indivíduos localizados em áreas
endêmicas e sintomáticas para indivíduos de áreas não endêmicas, ou crônica (ROSS
et al., 2013; WEERAKOON et al., 2015).
A fase aguda representa a fase inicial da doença, caracterizada pela resposta
imune do hospedeiro frente à penetração da cercária, aos esquistossômulos, vermes
adultos, produção e liberação de ovos (ROSS et al., 2007; WEERAKOON et al., 2015).
A primeira manifestação clínica frente à infecção é a dermatite cercariana, mediada
pela resposta imunológica com produção de Imunoglobulinas E (IgE) (BURKE et al.,
2009; CALDAS et al., 2008; GRYSEELS et al., 2006; ROSS et al., 2007, 2002). A
dermatite é causada pela penetração percutânea das cercárias, provocando urticárias
temporárias que podem persistir por dias, como lesões pápulas pruriginosas,
ocorrendo principalmente após infecções primárias (BOTTIEAU et al., 2006;
GRYSEELS et al., 2006). A resposta inicial à doença é desenvolvida pelo sistema
imune inato, seguida em poucos dias por uma resposta imune adaptativa CD4+ T-
helper tipo 1 (Th1) (BARSOUM; ESMAT; EL-BAZ, 2013; ROSS et al., 2007). Este tipo
de resposta é mediada pela produção de citocinas pro-inflamatórias, como
interleucina-2 (IL-2), interferon-γ (IFN-γ), fator de necrose tumoral- α (TNF-α)
(CHIARAMONTE et al., 1999; LAMBERTUCCI, 2010), IL-1 e IL-6 (BARTLEY et al.,
2006; BURKE et al., 2009; OSWALD et al., 2001; PEARCE; MACDONALD, 2002;
WILSON et al., 2007; WYNN et al., 2004).
As manifestações clínicas na fase aguda podem incluir febre, fadiga, mialgia,
mal-estar, eosinofilia e infiltrados irregulares no peito visualizados por radiografia
(GRYSEELS et al., 2006). Além disso, pode levar a complicações mais graves,
comprometendo funções respiratórias e causando tosse, dispneia e dor torácica;
comprometimento com funções digestivas, levando a dor abdominal, diarreia, perda
de peso e hepatoesplenomegalia pode ser observado em situações mais graves
(JAURÉGUIBERRY; PARIS; CAUMES, 2010).
A infecção crônica é causada pela retenção dos ovos durante a migração pela
corrente sanguínea. Uma vez na circulação, os ovos não eliminados pelas fezes
podem atingir e se alocarem em certos órgãos e tecidos como baço, fígado, pulmão e
sistema cerebrospinal (CHEEVER; HOFFMANN; WYNN, 2000; GRYSEELS et al.,
2006). Nesta fase, a resposta é mediada por células do tipo Th2, havendo, então, uma
21
mudança de perfil imunológico frente à infecção. As células inflamatórias são
progressivamente eliminadas, sendo substituídas por fibroblastos (BARSOUM;
ESMAT; EL-BAZ, 2013). A resposta do tipo Th2 suprime a resposta pró-inflamatória
Th1 e surge com a deposição de ovos, produzindo várias citocinas, como IL-4, IL-5,
IL-10 e IL-13 (CHIARAMONTE et al., 1999; LAMBERTUCCI, 2010). Em decorrência
disso, pode-se observar uma reação inflamatória eosinofílica e granulomatosa, sendo
substituídas progressivamente por depósitos fibrosos, em resposta a enzimas
proteolíticas secretadas pelos ovos retidos (CHEEVER; HOFFMANN; WYNN, 2000;
GRYSEELS et al., 2006). A inabilidade do hospedeiro de produzir uma resposta imune
do tipo Th2 para regular a resposta pró-inflamatória inicial pode ser fatal
(CHIARAMONTE et al., 1999; LAMBERTUCCI, 2010).
Apesar dos granulomas protegerem os tecidos do hospedeiro ao isolar as
toxinas secretadas pelos ovos, eles são os responsáveis pela patogênese da doença,
causando inflamação grave, eosonofilia, deposição de colágeno, fibrose e hipertensão
portal (AMARAL et al., 2017; HAMS; AVIELLO; FALLON, 2013; WILSON et al., 2007).
No fígado, como consequência, os granulomas podem levar à fibrose grave,
interrompendo o fluxo sanguíneo e causando hipertensão portal (AMARAL et al.,
2017; GRYSEELS et al., 2006; ROSS et al., 2002), esplenomegalia, circulação venosa
coleteral, desvio portacaval e varizes gastrointestinais (CHEEVER, 1968; GRYSEELS
et al., 2006; GRYSEELS; POLDERMAN, 1987; KARDORFF et al., 1996). O
sangramento de varizes gastroesofágicas é a complicação mais grave e
frequentemente fatal da fibrose hepática causada por S. mansoni (GRYSEELS et al.,
2006).
Da mesma forma, no intestino, os granulomas podem causar hiperplasia da
mucosa, polipose, ulceração e formação de abscessos (GRYSEELS et al., 2006;
MOHAMED; AL KARAWI; YASAWY, 1990), sendo que a maior parte das lesões estão
situadas, principalmente, no intestino grosso e reto (GRYSEELS et al., 2006).
Adicionalmente, a deposição de ovos pode acontecer em órgãos atípicos.
A esquistossomose pulmonar é devido a deposição de ovos nos capilares
perialveolares pulmonares, originando sintomas brônquicos e posteriormente,
hipertensão pulmonar, causada por complicação devido à fibrose (GRYSEELS et al.,
2006).
A neuroesquistossomose é devido à deposição de ovos no sistema nervoso
central, sendo que S. mansoni afeta principalmente a medula espinhal (PITTELLA;
22
LANA-PEIXOTO, 1981; VALE et al., 2012). É a síndrome clínica mais grave, tendo
como sintomas dor lombar, dor radicular dos membros inferiores, fraqueza muscular,
perda sensorial e disfunção da bexiga (BARSOUM; ESMAT; EL-BAZ, 2013).
A resposta imune contra antígenos liberados pelo ovo tem intensidade máxima
no início da infecção, declinando durante o tempo da infecção. A resposta inflamatória
granulomatosa tem pico 8 a 10 semanas após a infecção, ocorrendo uma modulação
negativa por volta da 12ª semana após a exposição ao parasito, com declínio também
das citocinas. Porém, a fibrose é acumulativa e, na maioria das vezes, irreversível
(BOROS, 1989; NASCIMENTO-CARVALHO; MORENO-CARVALHO, 2005).
1.4 CONTROLE E TRATAMENTO
As medidas preventivas para o controle da doença, atualmente, envolvem
melhoria do saneamento, modificações ambientais para reduzir a exposição ao
hospedeiro intermediário e liberação de cercarias e educação para reduzir o contato
de água não-tratada. Além disso, a transmissão da esquistossomose pode ser contida
pela administração de medicamentos em massa (MDA, do inglês: Mass Drug
Administration) para quimioterapia em grupos de risco e de indivíduos infectados
(ELBAZ; ESMAT, 2013; MCCARTHY et al., 2012). Dessa forma, torna-se possível
conduzir a redução da prevalência, mortalidade e morbidade (CARVALHO, 2016).
Apesar das medidas de controle existentes, o controle da doença em países
endêmicos é um dos maiores problemas enfrentado pela saúde pública. Alguns
fatores são responsáveis por dificultarem a erradicação da esquistossomose, nestas
áreas, como a ampla disseminação dos hospedeiros intermediários e a capacidade
de conseguir escapar de pesticidas usados no controle de moluscos, o alto custo com
implementação de condições sanitárias ideais e suprimento de água potável, o contato
constante da população rural com água não tratada, o longo prazo que é preciso para
a educação sanitária e o tempo necessário para a população aderir aos programas de
controle. Além disso, o tratamento individual ou em massa tem sido eficiente para
controlar a morbidade, porém não consegue reduzir a prevalência devido às
constantes reinfecções, além de não haver vacinas disponíveis para prevenir a
doença (COURA; AMARAL, 2004).
23
Na década de 70, surgiram duas drogas para o tratamento da doença:
oxaminiquina (OXA) e praziquantel (PZQ). Ambas mostraram alta taxa de cura e baixa
toxicidade. Estas drogas se mostraram efetivas em controlar a morbidade ao reduzir
a carga parasitária, e a taxa de reinfecção, quando usadas repetidamente em áreas
endêmicas (BINA; PRATA, 1980; COURA et al., 1992; COURA; AMARAL, 2004;
COURA; COURA, 1980; KATZ; ROCHA; PEREIRA, 1980; PRATA et al., 1980).
Porém, somente a terapia não é capaz de impedir a transmissão, uma vez que
interrupção do tratamento leva à reversão da susceptibilidade ao parasito (COURA;
AMARAL, 2004; COURA; MENDONÇA; MADRUGA, 1987).
O PZQ atualmente é o fármaco utilizado para o tratamento da
esquistossomose, conferindo uma taxa de cura entre 60 a 90% (CIOLI et al., 2012;
ELBAZ; ESMAT, 2013). Apresenta algumas vantagens em relação à OXA,
apresentando baixo custo, baixa toxicidade, boa estabilidade e é eficaz contra todas
as espécies de Schistosoma (DOENHOFF; CIOLI; UTZINGER, 2008). A importância
da última característica é percebida principalmente em áreas em que há prevalência
de mais de uma espécie de Schistosoma, como na África. Mesmo quando o fármaco
não consegue curar totalmente, há drástica redução no número de ovos eliminados,
diminuindo assim os sintomas da fase crônica da doença (CIOLI et al., 2012; ELBAZ;
ESMAT, 2013).
Apesar das vantagens, há pontos negativos em relação ao fármaco. O PZQ
não tem eficácia contra formas imaturas do parasito, sendo aparentemente eficaz nos
primeiros dias da infecção, com subsequente queda da eficácia por volta da quarta
semana, reestabelecendo sua eficiência terapêutica após a sétima semana da
infecção (ELBAZ; ESMAT, 2013; PAVLIN; KOZARSKY; CETRON, 2012; PÉREZ DEL
VILLAR et al., 2012). Além disso, o PZQ tem sua eficácia reduzida em indivíduos de
áreas endêmicas devido às constantes reinfecções, sendo causadas pelo
aparecimento de variantes genéticas de S. mansoni tolerantes ao fármaco
(BOURGUINAT et al., 2007; CRELLEN et al., 2016; NORTON et al., 2010; WEBSTER
et al., 2014; WOLSTENHOLME et al., 2004).
Na Assembléia Geral das Nações Unidas realizada em 2015, foi proposto um
plano de ação que tem como meta mundial erradicar as doenças tropicais
negligenciadas até 2030, dentre estas, está incluída a esquistossomose mansônica.
Sendo assim, um diagnóstico eficaz, de alta sensibilidade e especificidade, faz-se
necessário para possibilitar a detecção da doença na fase inicial e também para
24
avaliar a cura após o tratamento, tornando-se de extrema importância para o controle
da doença (BERHE et al., 2004; CARVALHO, 2016).
1.4.1 Vacinas
Uma das alternativas mais eficazes de controle para várias doenças, incluindo
a esquistossomose, é por meio da utilização de vacinas. A vacina ideal é capaz de
induzir uma resposta imune igual ou melhor do que a produzida pela infecção natural.
Como resultado, o indivíduo pode obter uma imunidade a longo prazo contra o
patógeno, evitando a trasmissão da doença e contribuindo para o controle e
erradicação da doença (COZZI; SCARSELLI; FERLENGHI, 2013; LILJEROOS et al.,
2015).
Apesar da terapia com o PZQ estar desempenhando um papel importante no
controle e prevenção da esquistossomose, a não prevenção de reinfecção e o
surgimento de parasitos resistentes à droga dificultam a contenção da doença (CIOLI
et al., 2014; TEBEJE et al., 2016). Neste contexto, uma vacina seria o componente
chave na abordagem de controle e eliminação da esquistossomose (TEBEJE et al.,
2016). Um estado imune contra S. mansoni pode ser alcançado pela integração de
mecanismos humorais e celulares, baseado na produção de mediadores celulares do
tipo Th1 e Th2 específicos contra o antígeno, de forma a alcançar uma relação
favorável entre os níveis de IgE e IgG4 (BARSOUM; ESMAT; EL-BAZ, 2013;
MCMANUS; LOUKAS, 2008).
O S. mansoni possui ciclo de vida complexo e evoluiu para viver durante
décadas no hospedeiro (FONSECA; OLIVEIRA; ALVES, 2015; GRYSEELS, 2012),
possuindo estratégias intrigantes para evadir o sistema imunológico do indivíduo
infectado (FONSECA; OLIVEIRA; ALVES, 2015; JENKINS et al., 2005). Considerando
isto, torna-se uma tarefa difícil desenvolver uma vacina efetiva contra este parasito.
Porém, acredita-se que uma redução parcial da carga parasitária pode ter impacto no
controle e erradicação da doença (FONSECA; OLIVEIRA; ALVES, 2015), tendo
redução na quantidade de ovos que são depositados em tecidos e que são
excretados, diminuindo assim a patogenicidade e transmissão da doença
(MERRIFIELD et al., 2016).
As vacinas tradicionais são elaboradas isolando e purificando partes
antigênicas de um patógeno, que normalmente é morto por calor ou quimicamente
25
inativado (OLIVEIRA et al., 2016a; SOUZA et al.,1987). A vacina contendo cercária
de S. mansoni irradiada demonstrou proteção em vários mamíferos (FUKUSHIGE et
al., 2015; MCMANUS; LOUKAS, 2008; TEBEJE et al., 2016), com potencial de atingir
proteção de 78% em uma única dose de vacinação (FUKUSHIGE et al., 2015;
TEBEJE et al., 2016), porém apresenta um alto risco de infecção durante a imunização
nos indivíduos imunizados (OLIVEIRA et al., 2016a; SOUZA et al.,1987).
Há três antígenos vacinais em fase de testes clínicos humanos: Sm14 (
proteína ligadora de ácido graxo de S. mansoni), Sm-TSP-2 (tetraspanina 2 de S.
mansoni) e Sh28GST (glutationa S-transferase de S. haematobium). A Sm-p80,
também está sendo estudada contra a esquistossomose, em fase pré-clínica
(MERRIFIELD et al., 2016; TEBEJE et al., 2016).
Os parasitos usam proteínas ligadoras de ácidos graxo para absorver,
transportar e compartimentar ácidos graxos do hospedeiro, pois eles não possuem
uma vida dependente de oxigênio para a síntese de esteróis e ácidos graxos. Devido
ao seu papel biológico crítico, a Sm14 tem sido considerada uma potencial candidata
para vacina (TEBEJE et al., 2016; TENDLER; SIMPSON, 2008). Quando testada na
forma recombinante sem uso de adjuvante apresentou 67% de proteção em termos
contra S. mansoni em modelo murino (TEBEJE et al., 2016; TENDLER et al., 1996).
Quando testada em preparação concomitante ao adjuvante glicopiranosil lipídeo
(GLA-SE, do inglês: glucopyranosyl lipid adjuvant stable emulsion) concluiu com
sucesso a fase clínica 1, em voluntários saudáveis no Brasil, sendo confirmada como
segura e imunogênica (SANTINI-OLIVEIRA et al., 2016). A fase clínica 2 está em
andamento, sendo realizados testes com a Sm14 em áreas endêmicas do Brasil e
África (TEBEJE et al., 2016; TENDLER; ALMEIDA; SIMPSON, 2015).
As Tetraspaninas (Tsp) são um grupo de proteínas imensamente expressas no
tegumento do esquistossoma, o que sugere maior vulnerabilidade ao sistema
imunológico do hospedeiro (BRASCHI; BORGES; WILSON, 2006; TEBEJE et al.,
2016). A importância das tetraspaninas para a sobrevivência do parasito foi
recentemente demonstrada. O silenciamento da transcrição de Tsp-1 e Tsp-2 (as duas
principais tetraspaninas) resultou em redução significativa no número de vermes que
conseguem atingir a maturidade no hospedeiro definitivo (FONSECA; OLIVEIRA;
ALVES, 2015; TRAN et al., 2010). Estudos pré-clínicos em modelo murino da vacina
com Tsp-2 mostraram uma grande redução da carga parasitária e está atualmente em
fase clínica 1 (CHENG et al., 2013; CURTI et al., 2013; MERRIFIELD et al., 2016).
26
A Sh28GST é uma enzima envolvida no metabolismo de ácidos graxos e
síntese de prostaglandina D2 (TEBEJE et al., 2016), e na proteção do parasito contra
compostos tóxicos, ajudando o parasito a escapar do sistema imune do hospedeiro
(MIELE et al., 2004). A vacina recombinante de Sh28GST foi a primeira vacina contra
esquistossomose a entrar em fase clínica (RICCIARDI; NDAO, 2015), sendo que as
fases clínicas 1 e 2 foram seguras para a saúde de adultos e crianças (MO et al.,
2014;TEBEJE et al.,2016). A fase clínica 3 foi realizada em 2012, sendo avaliada se
a coadministração da vacina em questão e o PZQ poderiam atrasar o reaparecimento
da doença de S. haematobium em crianças infectadas, porém os resultados ainda não
foram divulgados (MERRIFIELD et al., 2016; TEBEJE et al., 2016).
A Calpaína é uma protease de cisteína neutra ativada com cálcio (MCMANUS;
LOUKAS, 2008; TEBEJE et al., 2016) e tem um papel importante na evasão imune,
estando envolvida na reciclagem/renovação de proteínas de superfície do parasito,
um signifcativo mecanismo de escape imunológico como proteção do parasito contra
as defesas do hospedeiro (FONSECA; OLIVEIRA; ALVES, 2015; SILVA; CLARKE;
PODESTA, 1993). A vacina com Sm-p80, a subunidade grande da calpaína de S.
mansoni, apresentou 49% de redução da carga parasitária junto com o ajduvante
resiquimod, em modelo murino (AHMAD et al., 2010; TEBEJE et al., 2016). Utilizando
o adjuvante oligodesoxinucleotídeo, foi possível atingir 70% de redução da carga
parasitária e 75% da redução de ovos, in vivo (AHMAD et al., 2009b; TEBEJE et al.,
2016). Quando testada como vacina de DNA, em modelo animal, a Sm-p80 alcançou
59% de redução da carga parasitária e 84% da redução de ovos (AHMAD et al.,
2009a; TEBEJE et al., 2016).
1.5 DIAGNÓSTICO
Métodos que possibilitem o diagnóstico preciso de infecções são um pré-
requisito para o controle eficiente da doença. Além disso, com o grande número de
pessoas infectadas mundialmente por esquistossomose, é imprescindível o uso de
um diagnóstico eficaz para a detecção da doença, o que permite o acesso rápido de
tratamento ideal e preciso, além de ajudar a reduzir as taxas de transmissão do
parasito (HAMILTON; KLINKERT; DOENHOFF, 1998).
27
Atualmente, os métodos de diagnóstico podem ser divididos em diretos ou
indiretos, e também, qualitativos ou quantitativos. Os métodos diretos permitem a
detecção do parasito propriamente dito ou fases detectáveis, como ovos, substâncias
antigênicas ou vestígios moleculares. Os métodos indiretos propiciam a detecção de
antígenos do parasito ou a detecção de anticorpos específicos no soro do hospedeiro
(CARVALHO, 2016; RABELLO, 1990). Os métodos qualitativos possibilitam somente
a detecção da existência do parasito, enquanto que os métodos quantitativos
permitem a detecção da carga parasitária e/ou resposta imunológica do indivíduo
infectado, permitindo estabelecer indicadores epidemiológicos para programas de
controle (CARVALHO, 2016).
A detecção de ovos nas fezes é o método tradicional para o diagóstico direto
de esquistossomose, tendo como característica principal a sua especificidade
(HAMILTON; KLINKERT; DOENHOFF, 1998). Os principais testes parasitológicos
utilizados atualmente são o de sedimentação espontânea (CARVALHO, 2016;
HOFFMAN; PONS; JANER, 1934), a técnica de centrifugação com formol e acetato
de etila (TF-Test®- Teste de três fezes; do inglês: Three fecal test) (CARVALHO, 2016;
GOMES et al., 2004) e a técnica de Kato-Katz (KK) (CARVALHO, 2016; KATZ;
CHAVES; PELLEGRINO, 1972).
A técnica de sedimentação espontânea possibilita a identifcação dos ovos e a
diferenciação em ovos viáveis ou não. É um ótimo método qualitativo, porém não
permite a quantificação da intensidade da infecção medida pela contagem de ovos
encontrados na amostra analisada (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). A técnica de
TF-Test® é composta por três amostras fecais coletadas em dias alternados e unidas
por meio de concentração do sedimento por centrifugação rápida. As amostras são
duplamente filtradas, transferidas para uma solução conservadora (formalina 10%) e
seguidamente examinadas por microscopia óptica (CARVALHO, 2016).
O método parasitológico recomendado pela Organização Mundial de Saúde é
a técnica KK (WHO, 1993). A técnica utiliza um cartão com orifício central de 6 mm,
para medir a quantidade de fezes a ser examinada (≅43,7 mg). As fezes obtidas são
transferidas para uma lâmina de vidro e cobertas por lamínula de celofane, sendo
possível a visualização dos ovos pelo exame microscópico (KATZ; CHAVES;
PELLEGRINO, 1972). O método apresenta um alto nível de especificidade, é simples,
menos laborioso do que muitas outras metodologias, tem baixo custo e pode ser
facilmente utilizado em campo (WEERAKOON et al., 2015). Este método
28
parasitológico providencia uma sensibilidade tolerável para pacientes de áreas
endêmicas (GOMES; ENK; RABELLO, 2014; HINZ et al., 2017). Em contrapartida, a
sensibilidade é baixa para indivíduos infectados que vivem em áreas não endêmicas,
assim como para indivíduos em fase aguda ou com baixo nível de infecção (COLLEY
et al., 2014; HINZ et al., 2017; WAMI et al., 2014), como, por exemplo, turistas que
retornam de áreas endêmicas (GRENFELL et al., 2013c; HINZ et al., 2017; VAN
MEENSEL et al., 2014). As desvantagens deste método estão relacionadas ao
número de ovos presentes nas fezes de indíviduos com baixa carga parasitária,
variações diárias de oviposição e apenas uma pequena quantidade da amostra de
fezes é examinada em uma única lâmina de KK (KONGS et al., 2001; SIQUEIRA et
al., 2015). Tais questões subestimam a real prevalência da doença, principalmente
em áreas de baixa transmissão (ENK et al., 2008; SIQUEIRA et al., 2015). A presença
de ovos nas fezes tem maior variação em diferentes dias do que em diferentes lâminas
da mesma amostra, indicando que um maior número de exame de diferentes amostras
seria o ideal para avaliar com maior precisão a prevalência da doença (SIQUEIRA et
al., 2015; UTZINGER et al., 2001). A sensibilidade do método pode ser melhorada
utilizando várias amostras durante vários dias consecutivos, porém esta abordagem
pode comprometer a simplicidade e custo-efetividade do teste, além de induzir à
relutância dos indivíduos para fornecerem mais de uma amostra de fezes, o que
limitaria o trabalho dos profissionais de saúde (ENGELS; SINZINKAYO; GRYSEELS,
1996; WEERAKOON et al., 2015).
Há outros métodos diretos de detecção, como a técnica de eclosão de
miracídios, biópsia retal e biópsia hepática. A técnica de eclosão de miracídios é
baseada em colocar a amostra de fezes em recipiente próprio transparente, contendo
água morna e expor este recipiente à luz solar ou artificial. Depois de algum tempo, é
possível visualizar a olho nu ou com uma lupa os miracídios que sairam dos ovos,
caso haja. A biópsia retal fundamenta-se na retirada e examinação de fragmentos da
mucosa retal, permitindo a detecção de ovos em seus diferentes estágios evolutivos.
A biópsia hepática consiste na realização de exame de fragmento do fígado, obtido
cirurgicamente ou por meio de punção. A confirmação da infecção é realizada pela
presença de ovos ou granulomas. Esta biópsia só é realizada quando a doença se
apresenta clinicamente grave ou quando não foi possível confirmar a infecção por
outros métodos de diagnóstico e, também, para diferenciar de outras hepatopatias
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
29
Embora as técnicas apresentadas mostrem-se bastante eficientes e simples,
geralmente são inadequadas para o diagnóstico da infecção recente, quando ainda
não há produção de ovos, e também quando a oviposição é limitada (ABDEL-
HAFEEZ et al., 2015; PONTES; DIAS-NETO; RABELLO, 2002). Métodos moleculares
(ABDEL-HAFEEZ et al., 2015) e sorológicos (HINZ et al., 2017) são alternativas
promissoras para o diagnóstico da infecção.
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, do inglês: Polymerase chain
reaction) é um método molecular útil para a detecção de baixa carga parasitária e é
altamente sensível para o diagnóstico de doenças infecciosas (SIQUEIRA et al.,
2015). A PCR convencional amplifica um segmento específico de gene e trata-se de
uma técnica que permite detectar ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês:
Deoxyribonucleic acid) do parasito em fezes (GORDON et al., 2012; PONTES et al.,
2003; WEERAKOON et al., 2015). Baseado no princípio molecular do método de
detecção, a amplificação do DNA ou do ácido ribonucléico (RNA, do inglês:
Ribonucleic acid) do parasito por PCR é um complemento promissor para o
diagnóstico preciso da esquistossomose. Além disso, avanços recentes incluem
detecção de DNA de ovo, DNA circulante sem parasito celular (provenientes de
esquistossômulos mortos, perda de tegumentos dos vermes ou desintegração de ovos
inativos) e microRNAs circulantes (WEERAKOON et al., 2015).
A PCR-ELISA é uma alternativa de diagnóstico que permite a detecção de DNA
de S. mansoni em fezes de indivíduos com baixa infecção, permitindo a detecção de
DNA amplificado por PCR utilizando uma plataforma de Ensaio de absorção
imunoenzimático (ELISA, do inglês: Enzyme linked immunosorbent assay) (GOMES
et al., 2010; SIQUEIRA et al., 2015).
Apesar dos métodos moleculares apresentarem alta sensibilidade e
especificidade, possuem alto custo e requerem equipamentos caros para sua
realização (HUSSEIN et al., 2012), além de ser necessário um alto conhecimento para
a realização da técnica, fatos que podem dificultar o acesso a este tipo de diagnóstico
(WEERAKOON et al., 2015).
Testes sorológicos são especialmente úteis para a vigilância da doença e
triagem preliminar em áreas não endêmicas (DOENHOFF; CHIODINI; HAMILTON,
2004; WANG; UTZINGER; ZHOU, 2008; WEERAKOON et al., 2015; WU; HALIM,
2000), onde a baixa sensibilidade dos testes parasitológicos possa levar a resultados
falso-negativos de indivíduos infectados (ALARCÓN DE NOYA et al., 2007;
30
WEERAKOON et al., 2015). Testes para detecção de antígenos e anticorpos, como
teste de precipitina circunoval (COPT, do inglês: Circumoval precipitin test), teste de
hemaglutinação indireta (IHT, do inglês: Indirect hemagglutination test), ensaio de
imunofluorescência indireta (IFA, do inglês: Indirect immunofluorescence assay) e
ELISA são exemplos de testes aplicados para diagnóstico de S. mansoni
(WEERAKOON et al., 2015).
O método COPT é baseado na precipitação do soro do indivíduo após o contato
com ovos liofilizados ou fecundados (GOMES; ENK; RABELLO, 2014), apresentando
sensibilidade entre 92 a 100% e especificidade entre 96 a 100% (ALARCÓN DE NOYA
et al., 2007; GOMES; ENK; RABELLO, 2014). Possui algumas limitações relacionadas
ao tempo de execução e período variável de seroconversão após o tratamento
(GOMES; ENK; RABELLO, 2014).
O IHT é um teste indireto que utiliza glóbulos vermelhos liofilizados cobertos
com antígenos, sendo que antígeno solúvel do ovo (SEA, do inglês: Soluble egg
antigen) é o mais utilizado, para a detecção de anticorpos no soro de indivíduo
infectado por meio de aglutinação. A técnica é simples, requer somente equipamento
básico de laboratório para a sua execução e devido a isto, pode ser empregada em
campo (GOMES; ENK; RABELLO, 2014). Apesar de apresentar uma alta
sensibilidade, entre 71 a 97% (GOMES; ENK; RABELLO, 2014; YU et al., 2007), o
método apresenta algumas desvantagens, como baixa especificidade devido a
reações cruzadas com outros helmintos (GOMES; ENK; RABELLO, 2014; ZHOU et
al., 2007, 2008) e reações positivas mesmo após o tratamento (GOMES; ENK;
RABELLO, 2014; ZHOU et al., 2008).
A técnica IFA baseia-se na reação entre antígenos do parasito e anticorpos
antiesquistossoma produzidos por indivíduos infectados (AZAB; SAFER; GHAFFAR,
1984; KAMIYA et al., 1982; KOLÁROVÁ; SÝKORA; BAH, 1994; WEERAKOON et al.,
2015). É um método sensível de diagnóstico, especialmente útil para áreas de baixa
endemia, capaz de detectar IgM e IgG na fase aguda ou crônica da doença
(BURLANDY-SOARES et al., 2003; KANAMURA et al., 1979, 1998; WEERAKOON et
al., 2015). O uso da técnica é limitado devido à necessidade de microscópio caro e
complexo, reagentes caros e pessoas qualificadas para sua realização (GOMES;
ENK; RABELLO, 2014).
Atualmente, o método sorológico de diagnóstico mais utilizado para detecção
da infecção é o ELISA (GOMES; ENK; RABELLO, 2014; HAMILTON; KLINKERT;
31
DOENHOFF, 1998). A técnica permite detectar várias classes de anticorpos com base
no reconhecimento por diferentes antígenos do parasito, expressos em qualquer uma
das suas fases (GOMES; ENK; RABELLO, 2014). É altamente sensível e útil para
levantamentos epidemiológicos da esquistossomose (ALARCÓN DE NOYA et al.,
2007; BOTELHO et al., 2009; DA SILVA et al., 1998; ISHIDA et al., 2003; SORGHO
et al., 2005; TURNER et al., 2004). O ensaio de ELISA pode ser utilizado para a
detecção de anticorpos do indivíduo ou de antígenos do agente causador da infecção
(CROWTHER, 2009).
A reatividade entre anticorpos do soro do indivíduo infectado e antígenos
extraídos de diferentes estágios do parasito tem sido testada efetivamente nesta
técnica (LUNDE; OTTESEN, 1980; MCLAREN et al., 1978; SARHAN et al., 2014;
SMITH et al., 2012; WEERAKOON et al., 2015). Dois antígenos circulantes do
parasito, o antígeno catódico circulante (CCA, do inglês: circulating cathodic antigen)
e o antígeno anódico circulante (CAA, do inglês: circulating anodic antigen), são
proteoglicanos derivados do epitélio intestinal do parasito, que têm sido testados em
protocolos de diagnósticos sorológicos, porque são descritos como importantes alvos
para detectar infecção ativa e também a resposta terapêutica (AGNEW et al., 1995;
BARSOUM; COLLEY; KAMAL, 1990; LAMBERTON et al., 2014; STOTHARD, 2009;
VAN LIESHOUT; POLDERMAN; DEELDER, 2000; WEERAKOON et al., 2015).
Ambos são encontrados no sangue 3 semanas após a infecção (BARSOUM;
COLLEY; KAMAL, 1990; VAN DAM et al., 1996; WEERAKOON et al., 2015) e podem
ser detectados na urina ou soro de indivíduos (DE JONGE et al., 1990; VAN ETTEN
et al., 1994; WEERAKOON et al., 2015). O uso destes antígenos para diagnóstico
apresenta vantagens como alta especificidade, correlação positiva com a carga
parasitária e estimativa da intensidade da infecção (GOMES; ENK; RABELLO, 2014;
POLMAN et al., 1995; VAN LIESHOUT et al., 1995a, 1995b), além de desaparecem
rapidamente após o tratamento, podendo ser utilizados como avaliação da cura (EL-
MORSHEDY et al., 1996; GOMES; ENK; RABELLO, 2014). Entretanto, apresenta
baixa sensibilidade em áreas não endêmicas ou indivíduos com infecção leve
(WEERAKOON et al., 2015).
Outra alternativa de diagnóstico foi desenvolvida utilizando o antígeno CCA,
pelo teste imunocromatográfico POC-CCA® (point-of-care circulating cathodic
antigen). Trata-se de um ensaio de fluxo lateral, disponível comercialmente, utilizado
para detectar CCA (COLLEY et al., 2013; LEGESSE; ERKO, 2007; STOTHARD et al.,
32
2006; VAN DAM et al., 2004; VAN LIESHOUT; POLDERMAN; DEELDER, 2000) na
urina do indivíduo infectado. Este método é considerado bastante eficaz e confiável,
principalmente em áreas endêmicas e em indivíduos com alta intensidade de infecção
(COLLEY et al., 2013; COULIBALY et al., 2011; SHANE et al., 2011; TCHUEM
TCHUENTÉ et al., 2012). Por outro lado, mais estudos são necessários para avaliar
a performance do teste em áreas não endêmicas e em indivíduos com baixa carga
parasitária (SIQUEIRA et al., 2016).
Os métodos sorológicos de diagnóstico comumente utilizados apresentam
algumas limitações, como: variação dos títulos de anticorpos, que podem permanecer
ou aumentar após o tratamento (HINZ et al., 2017; SOENTJENS et al., 2014b); a
inabilidade em distinguir entre infecção passada, aguda ou reinfecção (ELBAZ;
ESMAT, 2013; GRENFELL et al., 2014; HINZ et al., 2017; WILKINS; KEYSTONE,
2013); a baixa produção de anticorpos, seroconversão tardia ou ausente (HINZ et al.,
2017; SOENTJENS et al., 2014a; XIE et al., 2014) ou uma resposta decrescente de
anticorpos em indivíduos de áreas endêmicas, devido às constantes exposições ao
parasito (DUVALL et al., 2014; HINZ et al., 2017). Tais limitações podem levar a
resultados de baixa confiabilidade (HINZ et al., 2017).
A busca por um método confiável para o monitoramento e controle da
esquistossomose tem levado à investigação de vários antígenos (CAVALCANTI et al.,
2013). A triagem dos antígenos adequados representa uma das maiores dificuldades
no desenvolvimento de testes de diagnóstico. Diante disso, sabe-se que existem
alguns fatores que podem influenciar na seleção de um antígeno apropriado, tais
como: simplicidade de obtenção e produtividade, alta estabilidade em condições
simples de estocagem e elevada antigenicidade e imunogenicidade (RABELLO et al.,
2008).
Os antígenos utilizados atualmente em ensaios sorológicos podem ser obtidos
de diferentes estágios evolutivos do parasito (HINZ et al., 2017). Geralmente são
empregados como um mix de proteínas expressas em diferentes fases do parasito ou
como proteínas específicas, isoladas por métodos de purificação de alta eficiência. A
preparação de antígeno solúvel de verme adulto (SWAP, do inglês: soluble adult worm
antigen preparation) é considerada a fonte mais fácil e abundante de material
antigênico (DOENHOFF; CHIODINI; HAMILTON, 2004). Antígenos de cercárias são
menos utilizados em consequência de sua baixa sensibilidade e especificidade
(LUNDE; OTTESEN, 1980). Proteínas de esquistossômulos são apontadas com maior
33
sensibilidade quando comparadas à SEA (HINZ et al., 2017; SMITH et al., 2012),
sendo mais eficazes para diagnosticar indivíduos de áreas endêmicas, mas com
considerável potencial para serem utilizadas no diagnóstico de indivíduos de áreas
não endêmicas (GRENFELL et al., 2013a, 2013b; HINZ et al., 2017). Os SEA são
utilizados normalmente em preparações brutas ou purificados, apresentando melhor
performance nas preparações purificadas (HINZ et al., 2017; LONG et al., 1982).
Estes antígenos apresentam sensibilidade que pode variar de moderada a alta em
teste de ELISA, porém podem apresentar baixa especificidade (DAWSON et al.,
2013; DOENHOFF et al., 1993; HINZ et al., 2017; SORGHO et al., 2005), em
consequência de possíveis reações cruzadas com antígenos de outros helmintos
(GRENFELL et al., 2013c; HINZ et al., 2017).
Além dos métodos de diagnóstico citados acima, há também o diagnóstico por
imagem, como: ultrassonografia de abdômen, utilizado para o diagnóstico da forma
hepatoesplênica da esquistossomose; radiografia do tórax em PA e perfil, utilizado
para diagnosticar a hipertensão arterial pulmonar consequente da artrite pulmonar
causada pela esquistossomose; endoscopia digestiva alta, utilizada para o diagnóstico
e tratamento das varizes gastroesofágicas resultantes da hipertensão portal na
esquistossomose hepatoesplênica; ressonância magnética, utilizado para
diagnosticar a mielopatia esquistossomótica e eco-doppler-cardiografia, exame
alternativo para diagnosticar a hipertensão pulmonar esquistossomótica
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
Um dos maiores entraves da pesquisa por testes de diagnóstico baseados no
reconhecimento por anticorpos é a ocorrência de reações cruzadas. Isso é
particularmente verificado quando se emprega antígeno bruto, sem purificação, por
possuírem frações antigênicas compartilhadas por muitos parasitos, protozoários e
até mesmo bactérias (RABELLO et al., 2008). Antígenos recombinantes têm sido
utilizados como alternativa aos SEA e antígenos solúveis de SWAP para o diagnóstico
da esquistossomose. Esta abordagem tem sido bastante utilizada com o intuito de
aumentar a especificidade do teste e minimizar as reações cruzadas, visto que é uma
forma de manipulação que não exige a manipulação do parasito e permite a seleção
do alvo antigênico antes da construção e expressão do antígeno (CAVALCANTI et al.,
2013; GOMES; ENK; RABELLO, 2014). Além disso, a metodologia permite produção
em larga escala, viabilizando o processo de desenvolvimento e comercialização do
teste de diagnóstico. Portanto, é imprescindível a busca por antígenos adequados
34
para uma abordagem soroepidemiológica, a fim de diagnosticar com maior
especificidade, sensibilidade e eficácia a infecção por S. mansoni.
1.6 BIOINFORMÁTICA
Segundo a American Medical Informatics Association, a bioinformática é “o
desenvolvimento de armazenamento, analítica e métodos interpretativos para otimizar
a transformação de dados biomédicos e dados genômicos cada vez mais volumosos,
em saúde pró-ativa, preditiva, preventiva e participativa”. A bioinformática é a ciência
interdisciplinar sobre armazenamento, recuperação e análises de informações
biológicas. A aplicação da bioinformática é um componente essencial para a
genômica, proteômica, predição funcional de proteínas e investigação de diferentes
expressões de genes em tecidos sadios e doentes (LYNN; LLOYD; FARRELLY,
2003).
Com o acúmulo de dados genômicos em bancos de dados públicos, surgiu no
século 21 uma abordagem multidisciplinar para identificar alvos para o diagnóstico e
vacinas, chamada de Imunobioinformática (CARVALHO et al., 2017). A
imunobioinformática lida com a aplicação de métodos computacionais para problemas
imunológicos e é considerado uma parte da bioinformática (BACKERT;
KOHLBACHER, 2015). O campo da imunobioinformática aprimorou nas últimas
décadas e os métodos para predição de epítopos (porção da proteína que tem
capacidade de ser reconhecida pelo sistema imune) têm sido amplamente utilizados
e aplicados com sucesso em várias áreas (BOISGUÉRIN et al., 2014; SCHUBERT et
al., 2016; SHUKLA et al., 2015).
Métodos in silico capazes de fazer a predição de epitopos imunológicos para
reconhecimento de células T e B auxiliam na determinação e rastreio de epítopos com
a maior chance de induzir respostas imunes protetoras (BERGMANN-LEITNER et al.,
2013). Como exemplo, a vacinologia reversa é o método de bioinformática que permite
a identificação de antígenos de um patógeno utilizando análises computacionais do
seu genoma, sem a necessidade de manipulação do microrganismo, para o
desenvolvimento de vacinas (DOYTCHINOVA; FLOWER, 2008). Seguindo o mesmo
princípio da vacinologia reversa, é possível identificar e selecionar antígenos com
potencial para comporem kits de diagnóstico, utilizando análises in silico (CARVALHO
35
et al., 2011). Alguns autores utilizaram as ferramentas de bioinformática para
selecionarem candidatos para o diagnóstico de várias doenças, obtendo resultados
promissores (CALERO et al., 2013; CARVALHO et al., 2017; DE SOUZA et al., 2018;
GUO et al., 2012; LOPES et al., 2017; MUSTAFA, 2013; ZHANG et al., 2007).
O resultado do sequenciamento do genoma de S. mansoni (BERRIMAN et al.,
2009), em conjunto com a disponibilidade de ferramentas de bioinformática cada vez
mais sofisticadas, tem fornecido recursos valiosos para a investigação de epítopos do
parasito para triagem de antígenos promissores para comporem kits de diagnóstico
(MCCARTHY et al., 2012; SILVA-MORAES et al., 2014).
Pode-se concluir, então, que os métodos computacionais são fortes aliados
para a pesquisa, proporcionando um direcionamento para a seleção de pequenas
porções de proteínas que são capazes de serem reconhecidas pelo sistema imune,
permitindo o desenvolvimento de estratégias mais sensíveis e eficazes que possam
ajudar no controle da esquistossomose, com redução de custos da pesquisa e do
tempo de bancada.
36
2 JUSTIFICATIVA
A esquistossomose representa um importante problema de saúde pública, com
grande relevância clínica e socioeconômica (AMARAL et al., 2017; WHO, 2013),
sendo uma das doenças negligenciadas que mais afeta pessoas no mundo,
principalmente em países subdesenvolvidos (COURA; AMARAL, 2004). A falta de
saneamento básico e água potável, assim como condições precárias que refletem na
qualidade de vida de indivíduos, principalmente aqueles que vivem em áreas
endêmicas, são fatores que contribuem para a disseminação da doença (DA
MARTINS et al., 2015).
A doença se encontra em situação alarmante, uma vez que o controle da
transmissão da esquistossomose, especialmente em países endêmicos, enfrenta
várias dificuldades, tornando-se insuficientes e ineficazes (COURA; AMARAL, 2004).
Frente às limitações, faz-se necessário o desenvolvimento de um diagnóstico de alta
sensibilidade e especificidade, para a fase aguda e crônica da doença. Além disso,
torna-se imprescindível estabelecer testes capazes de detectar a doença em
indivíduos com alta ou baixa carga parasitária e avaliar a cura, indicando a real
prevalência da esquistossomose, contribuindo para o tratamento precoce, e auxiliar
na erradicação da doença.
A investigação por métodos de vigilância e controle da esquistossomose tem
estimulado a busca de vários alvos antigênicos contra a esquistossomose
(CAVALCANTI et al., 2013). Antígenos recombinantes têm sido utilizados para a
busca de novos candidatos para diagnóstico e terapia para doenças (CAVALCANTI
et al., 2013; GOMES; ENK; RABELLO, 2014). Embora a identificação de epítopos sem
a manipulação do parasito esteja contribuindo fortemente para o avanço das
pesquisas, a escolha dos antígenos apropriados é de crucial importância para o
desenvolvimento dos testes sorológicos, uma vez que a ocorrência de reações
cruzadas representa uma das maiores dificuldades em ensaios baseados na detecção
de anticorpos (RABELLO et al., 2008).
Os avanços biotecnológicos têm permitido a identificação racional de epítopos
como alvos contra a esquistossomose, podendo ter como finalidade a contrução de
proteínas recombinantes como uma estratégia para o reconhecimento por anticorpos
em kits de diagnóstico. Este método tem se mostrado eficiente, permitindo o aumento
37
da sensibilidade do teste (DE SOUZA et al., 2013), possibilitando a redução da
complexidade e custo final dos kits de diagnóstico (DIPTI; JAIN; NAVIN, 2006).
Diante do exposto, este trabalho foi desenvolvido frente à necessidade do
desenvolvimento de um kit de diagnóstico inovador para S. mansoni, sendo composto
por antígenos que possam proporcionar alta sensibilidade e especificidade. Diante do
progresso na área computacional e da disponibilidade de ferramentas de
bioinformática cada vez mais sofisticadas, concomitante à informação genômica do
parasito (BERRIMAN et al., 2009). A proposta foi selecionar, por meio de análises in
silico, novos antígenos de S. mansoni para comporem uma proteína multiepitopo
recombinante, com objetivo de avaliar sua antigenicidade em testes sorológicos.
38
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Construir uma proteína multiepitopo recombinante a partir de epítopos
selecionados por análises in silico para a composição de um kit de diagnóstico
inovador para o S. mansoni.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Identificar, por análises in silico, epítopos provenientes da membrana do parasito S.
mansoni;
- Caracterizar e selecionar os epítopos mais antigênicos;
- Desenhar racionalmente a proteína multiepitopo recombinante;
- Expressar a proteína multiepitopo recombinante em Escherichia coli (E. coli);
- Purificar a proteína multiepitopo recombinante em coluna de afinidade de níquel (Ni-
NTA);
- Detectar a proteína por meio da metodologia de Dot-Blot.
39
4 MATERIAL E MÉTODOS
A metodologia utilizada foi realizada em duas etapas: análises in silico, a partir
de sequências proteicas obtidas em um banco de dados que contêm informações
genômicas do parasito para a predição e seleção de epítopos antigênicos (Figura 3);
e metodologia in vitro, na qual corresponde à expressão do gene correspondente à
proteína multiepitopo, desenhada a partir de epítopos selecionados in silico (Figura 4).
40
Figura 3. Fluxograma das análises in silico das proteínas.
Obtenção das sequências
↓
Predição da localização celular
↓
Predição de peptídeo sinal e clivagem
da sequência correspondente
↓
Predição de hélices transmembrânicas
↓
Predição de epítopos com afinidade
por moléculas de HLA classe II
↓
Predição de epítopos lineares com
afinidade por BCR
↓
Predição de antigenicidade
↓
Análise de homologia com proteínas
humanas e proteínas de helmintos
↓
Predição da expressão das proteínas
nas diferentes fases do parasito
↓
Desenho racional da proteína
multiepitopo recombinante
↓
Análises in silico da proteína
multiepitopo recombinante
41
Figura 4. Fluxograma das análises in vitro da produção da proteína multiepitopo.
Preparação de células competentes
↓
Transformação com plasmídeo
pET21a::rMEBIOSM
↓
Expressão heteróloga da proteína rMEBIOSM
↓
Análise em gel SDS-PAGE
↓
Purificação
↓
Análise em gel SDS-PAGE
↓
Dot-Blot
42
4.1 ANÁLISES IN SILICO
As sequências proteicas foram obtidas no banco de dados do GeneDB
(http://www.genedb.org/Homepage/Smansoni) (LOGAN-KLUMPLER et al., 2012),
onde foram selecionadas apenas proteínas hipotéticas de S. mansoni.
4.1.1 Predição da localização celular
As sequências das proteínas hipotéticas obtidas a partir do banco de dados
foram inicialmente analisadas utilizando o programa PSORT II
(http://psort.hgc.jp/form2.html) (NAKAI; HORTON, 1999). Foram selecionadas as
proteínas que apresentaram maior probabilidade de estarem localizadas na
membrana plasmática.
4.1.2 Predição de peptídeo sinal
As proteínas selecionadas anteriormente foram analisadas pelo programa
SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (EMANUELSSON et al., 2007)
para a predição da presença de peptídeo sinal. Aquelas proteínas que apresentaram
peptídeo sinal tiveram a sequência correspondente retirada da sequência proteica
total para a realização das próximas análises.
4.1.3 Predição de hélices transmembrânicas e regiões expostas
As proteínas selecionadas anteriormente foram analisadas para a predição de
hélices transmembrânicas e seleção das regiões expostas. Para esta análise, foram
utilizados três programas: TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)
(SONNHAMMER; VON HEIJNE; KROGH, 1998), TMpred
(http://www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html) (HOFMANN; STOFFEL,
1993) e SOSUI 1.11 (http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)
(HIROKAWA; BOON-CHIENG; MITAKU, 1998). Estes programas fazem a predição
da conformação da proteína na membrana do parasito, mostrando quais aminoácidos
43
compõem a região interna, hélice transmembrânica e região exposta. Os resultados
dos três programas foram comparados, sendo selecionados somente as partes
expostas das proteínas que eram em comum nos três programas, com tamanho de
no mínimo 35 aminoácidos.
4.1.4 Predição de epítopos com afinidade por moléculas de HLA classe II
Após a seleção de regiões expostas, avaliou-se a afinidade de ligação entre
pequenas porções de 15 aminoácidos da sequência exposta por diferentes moléculas
de Antígeno leucocitário humano (HLA, do inglês: Human leukocyte antigen) de
Classe II. O programa Tepitool (http://tools.iedb.org/tepitool/) (PAUL et al., 2016) foi
utilizado para a predição de epítopos com afinidade por sete moléculas de HLA (DRB1
0101, DRB1 0301, DRB1 0401, DRB1 0701, DRB1 1101, DRB1 1301 e DRB1 1501).
Estes alelos foram selecionados por serem amplamente encontrados nas superfícies
das células apresentadoras de antígenos (APC, do inglês: antigen-presenting cells)
(TEXIER et al., 2000). O programa foi ajustado para fazer a predição de epítopos que
tivessem 100% de afinidade por todas as moléculas de HLA selecionadas.
4.1.5 Predição de epítopos lineares com afinidade pelos receptores de antígenos de
células B
As regiões expostas selecionadas anteriormente foram também analisadas
pelo programa ABCpred (http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/) (SAHA;
RAGHAVA, 2006) para a predição de antígenos com afinidade pelo receptor de
antígeno de célula B (BCR, do inglês: B cell antigen receptor). O programa faz a
predição de epítopos contendo 10,12,14,16,18 e 20 aminoácidos com um threshold
de 0.51 e acurácia de 65,93%. Para a triagem em questão, foi ajustado o parâmetro
de busca para epítopos contendo 16 aminoácidos e todos acima do threshold foram
considerados.
Os epítopos preditos com afinidade tanto pelas moléculas de HLA quanto por
BCR foram, então, comparados. Aqueles que fossem reconhecidos por ambos
receptores do sistema imune foram selecionados.
44
4.1.6 Predição de antigenicidade
O programa VaxiJen v2.0 (http://ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/Vaxi
Jen.html) (DOYTCHINOVA; FLOWER, 2008) foi utilizado para determinar a
antigenicidade dos epítopos selecionados na última etapa. O programa faz a análise
baseado com valor de corte de 0.5 e acurácia de 78%. Somente epítopos preditos
como antigênicos foram considerados.
4.1.7 Análise de homologia
Após a seleção dos epítopos, utilizou-se o programa NCBI Blast+
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/ncbiblast/) (CAMACHO et al., 2009) para conferir,
hipoteticamente, se os epítopos selecionados apresentavam homologia com
proteínas humanas ou com proteínas de outros helmintos (filo Nematoda), que
geralmente possam acarretar em resultados falso-negativos e reações cruzadas,
respectivamente. Foram desconsiderados os epítopos que apresentaram homologia
acima de 60% (CARVALHO et al., 2011).
4.1.8 Predição da expressão das proteínas nas diferentes fases de vida do parasito
Após a seleção final de epítopos, foi analisada a predição da expressão das
proteínas que correspondem aos epítopos selecionados, nas diferentes fases de vida:
cercária, esquistossômulo e verme adulto do parasito. Esta informação está disponível
no banco de dados GeneDB.
4.2 DESENHO RACIONAL DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE
O desenho racional da proteína foi baseado em tecnologias já desenvolvidas
pelo grupo de Biotecnologia de Microrganismos como as utilizadas para o
desenvolvimento de kits de diagnóstico de Rubéola, Hepatite C, Hepatite B,
Leishmaniose visceral canina e Esquistossomose (BR1020120024691,
BR1020120024705, BR1020120024683, BR 1020140313311 e BR1020160052025).
45
Para compor a proteína multiepitopo, foram selecionados os melhores epítopos
triados pela bioinformática. Eles foram alternados entre si até formar a melhor
sequência, de acordo com análises de predição de antigenicidade, ponto isoelétrico
(pI), massa molecular e estrutura tridimensional. A proteína multiepitopo originada foi
nomeada como rMEBIOSM.
Análises in silico eram realizadas ao final de cada tentativa de alternar as
sequências dos epítopos para formar a proteína multiepitopo com o propósito de
selecionar a melhor sequência.
O programa Compute pI/Mw (http://web.expasy.org/compute_pi/)
(GASTEIGER et al., 2005) foi usado para conferir o ponto isoelétrico (pI) hipotético e
a massa molecular da proteína. Com o programa VaxiJen v2.0, avaliou-se a predição
de antigenicidade e empregando o programa Phyre2 (http://www
.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index) (KELLEY et al., 2015), foi possível
prever a estrutura tridimensional hipotética da proteína.
A sequência de aminoácidos da proteína multiepitopo selecionada foi enviada
para a empresa Epoch Biolabs (Fort Bend Country), onde o gene foi sintetizado e
clonado no vetor de expressão em E. coli pET21a, originando o plasmídeo nomeado
como pET21a::rMEBIOSM. A empresa realiza o desenho do gene considerando os
seguintes critérios: otimização do gene utilizando códons preferenciais (códon usage)
para E.coli BL21(λ DE3) e adição de sítios de restrição apropriados na extremidade
do gene para facilitar a clonagem.
4.3 LINHAGEM BACTERIANA
As cepas de E. coli utilizadas neste trabalho estão representadas juntamente
com seus genótipos na Tabela 1. Estas cepas foram escolhidas por serem células
manipuladas por engenharia genética a fim de proporcionar a indução da expressão
de genes em plasmídeos pelo indutor isopropil-tio-β-galactosídeo (IPTG), através do
promotor T7.
As cepas pLysS e pLysE foram selecionadas por possuírem o plasmídeo que
produz a lisozima T7 (MIERENDORF; YEAGER; NOVY, 1994), a qual controla a
expressão de proteínas recombinantes, evitando a produção da proteína
recombinante sem a presença do indutor (ROSANO; CECCARELLI, 2014). A cepa
46
C41 (DE3) foi selecionada por sua capacidade de expressar proteínas tóxicas
(MIROUX; WALKER, 1996) e de difícil expressão (PAPANEOPHYTOU;
KONTOPIDIS, 2014). A cepa Arctic Express (DE3) foi selecionada por sua capacidade
de expressar proteínas em formas mais solúveis (HONG; RASHID; SANTIAGO-
VÁSQUEZ, 2013).
Tabela 1: Cepas e genótipos de Escherichia coli.
CEPAS GENÓTIPOS
BL21(λ DE3) pLysS F- ompT gal dcm lon hsdSB (rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR)
BL21 (λ DE3) pLysE F- ompT gal dcm lon hsdSB (rB- mB-) λ(DE3) pLysE(cmR)
C41 (DE3) F - ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm λ (DE3)
ARCTIC EXPRESS (DE3) F– ompT hsdS (rB – mB –) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte [cpn10 cpn60 Gentr]
4.4 PLASMÍDEO
O plasmídeo utilizado para clonagem e expressão da rMEBIOSM foi o pET21a
(Novagen, Windsor, Reino Unido), cujo mapa físico é representado na Figura 5 e a
região do polylinker é representado na Figura 6.
47
Figura 5. Mapa físico do vetor pET21a.
Fonte: NOVAGEN
Figura 6. Mapa da região do polylinker do vetor pET21a. O gene sintético rMEBIOSM foi clonado entre os sítios de Nde I e Xho I do vetor pET21a, com a sequência da cauda de histidina na extremidade C-terminal.
Fonte: NOVAGEN
48
4.5 PREPARAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES E TRANSFORMAÇÃO COM
PLASMÍDEO pET21a::rMEBIOSM
A preparação de células competentes inicia-se realizando pré-inóculo da cepa
a ser transformada, onde é inoculado uma colônia da cepa em 5 mililitros (mL) de meio
Luria-Bertani (LB).
O pré-inóculo é incubado a 37 graus Celsius (ºC), sob agitação 180-200 rotação
por minuto (rpm), durante 16 horas (h). Posteriormente, 1,25 mL do pré-inóculo foram
inoculados em 30 mL de meio LB. Em seguida, foram incubados a 37ºC, sob agitação
(180-200 rpm), até atingir uma Densidade Óptica (OD) 600 nanômetro (nm) de 0,3.
Após atingir a OD600nm de 0,3, foi centrifugado (35000xg/10min/4ºC) 1 mL do
conteúdo do inóculo.
Após a centrifugação, a amostra foi levada para a capela de fluxo laminar em
um recipiente contendo gelo. O sobrenadante foi descartado e adicionado 1mL de
CaCl2 0,1 Molar (M) ao pellet.
A amostra foi homogeneizada suavemente e centrifugada
(35000xg/10min/4ºC). O sobrenadante foi descartado, adicionado 100 microlitros (μL)
de CaCl2 + glicerol 15% ao pellet e homogeneizado suavemente.
A transformação das células hospedeiras, E. coli BL21 (λDE3) pLysS e pLysE,
C41 (DE3) e ArcticExpress (DE3) foi realizada através da técnica de choque térmico,
possibilitando a inserção do vetor de expressão (SAMBROOK et al., 1989).
Uma alíquota de 100 μL de células competentes de cada cepa foi utilizada para
a transformação, com o acréscimo de no máximo 1/10 do volume de amostra contendo
o pET21a::rMEBIOSM e incubada no gelo por 30 minutos (min). Decorrido este tempo,
a amostra foi incubada no banho-maria a 42ºC por 90 segundos, a fim de realizar um
choque térmico nas células. Em seguida, foi incubada novamente no gelo por 10 min
e logo após, adicionou-se 1 mL de meio LB líquido, sendo incubada em banho-maria
a 37ºC por 1 h.
A amostra foi centrifugada (17000xg/10 min a 4°C), o sobrenadante descartado
até sobrar 200 μL do mesmo e o pellet homogeneizado ao sobrenadante. Por fim,
utilizando pérolas de vidro, realizou-se o plaqueamento de 50 e 150 μL de células
transformadas com o plasmídeo pET21a::rMEBIOSM em cada placa de Petri com
meio LB ágar contendo ampicilina na concentração de 100 μg/mL. As placas foram
incubadas em estufa a 37°C por 16-18 h.
49
4.6 EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA PROTEÍNA rMEBIOSM
A indução da expressão gênica foi realizada com o objetivo de verificar a
capacidade das cepas de E. coli utilizadas expressarem a proteína multiepitopo
recombinante. Para esta finalidade, foram retirados da placa de Petri de um a três
clones contendo a construção plasmidial pET21a::rMEBIOSM e inoculados num
falcon com 5 mL de meio LB líquido contendo ampicilina (100 μg/mL) e incubados a
37ºC, sob agitação 180-200 rpm, durante 16h. Posteriormente, inoculou-se 1,25 mL
do pré-inóculo em 25 mL de meio LB contendo ampicilina na concentração de 100
μg/mL, incubado a 37ºC, sob agitação (180-200 rpm), até atingir uma OD600nm de
0,6.
Após atingir a OD600nm de 0,6, foi coletado 2mL da cultura, denominado de
tempo de indução = 0h e se iniciou a processo de indução. Foram testados diferentes
tipos de indutores e diferentes temperaturas pós-indução. Para as cepas pLysS e
pLysE, o protocolo utilizado por Galdino e colaboradores (2016) foi o escolhido para a
indução da expressão, o qual se mostrou eficiente para expressão da proteína
recombinante utilizada por estes autores. Além de utilizar o protocolo original, como
alternativa, ele foi modificado para se alcançar a expressão da proteína. Na primeira
modificação, alterou-se a concentração final de IPTG e temperatura pós-indução,
diminuindo para 0,03 mM e 25ºC, respectivamente. Na segunda modificação, o tipo
de indutor utilizado foi modificado do protocolo original, utilizando-se lactose na
concentração final de 1 mM.
Para as cepas C41 (DE3) e Arctic Express (DE3), o protocolo da indução da
expressão também foi o mesmo utilizado por Galdino e colaboradores (2016). Porém,
para a cepa Arctic Express (DE3), a temperatura pós-indução foi modificada para
12ºC, estando dentro da faixa de temperatura para indução indicada pelo fabricante.
Foram coletadas alíquotas de 1 mL no tempo de indução de 30 min, 1h30 min e
2h30min. Após serem centrifugadas (17000xg/5min), descartou-se o sobrenadante e
o pellet foi ressuspendido em 50 μL de tampão de amostra com β-mercaptoetanol.
50
4.7 ANÁLISE EM GEL SDS-PAGE DA PROTEÍNA rMEBIOSM
A análise da indução da expressão da proteína foi verificada em gel de
poliacrilamida contendo Dodecil Sulfato de Sódio (SDS, do inglês: Sodium Dodecyl
Sulfate), de acordo com a metodologia de Harlow e Lane (1988).
No preparo das amostras das proteínas, foi adicionado tampão de amostra com
β-mercaptoetanol, sendo um tampão desnaturante. Depois, foram fervidas por cinco
minutos, centrifugadas (17000xg/5 min) e então aplicado 20 μL do sobrenadante de
cada amostra nas canaletas do gel. Em uma das canaletas, foi aplicado o marcador
de massa molecular (PierceTM Unstained Protein MW Marker 26610, Thermo Fisher
Scientific.). O pellet resultante da centrifugação também foi aplicado juntamente com
tampão de amostra, como tentativa para verificar se a proteína recombinante se
encontrava na parte insolúvel da amostra (pellet).
Em seguida à aplicação das amostras, o gel foi submetido à eletroforese a 60V
até a entrada no gel separador e de 80V até o final da corrida eletroforética, em
tampão de corrida Tris-glicina no potencial Hidrogeniônico (pH) 8.7 com SDS.
Posteriormente, o gel foi corado com Coomassie brilliante blue R-250 até 16 horas,
subsequentemente descorado com solução de metanol e ácido acético até a
visualização das bandas proteicas.
4.8 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA rMEBIOSM
Para o processo de purificação da proteína rMEBIOSM, foi realizada a indução
seguindo protocolo descrito no item 4.6. A amostra final da indução foi centrifugada
(17000xg/5 min), sendo o sobrenadante descartado e o pellet ressuspendido em 1 mL
de tampão de lise para ser utilizado no processo de purificação. A amostra foi
incubada à 4°C por 16 h. Após, a amostra foi sonicada (6 pulsos de 5 segundos a
40mA, com intervalo de 10 segundos entre cada pulso) e reservada em um béquer
contendo gelo.
A resina de cromatografia de afinidade Níquel-NTA (HIS-Select ® Nickel Affinity
Gel P6611, Sigma Aldrich) é armazenada num microtubo contendo álcool 30%. Para
separar a resina do álcool, realizou-se uma centrifugação (1600xg/3 min/25ºC) do
51
microtubo para permitir o descarte do álcool. A preparação da resina para a purificação
se inicia com a lavagem da mesma com 1mL de água destilada, sendo, logo depois,
o microtubo centrifugado (1600xg/3min/25ºC) e o sobrenadante descartado,
realizando esse processo cinco vezes. Em seguida, a resina foi pré-equilibrada com a
adição de 1mL de tampão de lise, pois a amostra encontrava-se ressuspendida em
tampão de lise. O microtubo foi centrifugado (1600xg/3min/25ºC), o sobrenadante
descartado e o procedimento repetido por cinco vezes vezes.
A amostra já sonicada foi centrifugada e todo o sobrenadante transferido para
a resina previamente equilibrada com tampão de lise. O protocolo de purificação
utilizado por De Souza e colaboradores (2013) foi o escolhido inicialmente para a
purificação. Porém, além de utilizar o protocolo original, este foi modificado duas
vezes, a fim de se alcançar a purificação da proteína recombinante. No protocolo
original, centrifugou-se a amostra sonicada a 17000xg/15min/4ºC e o sobrenadante
originado foi adicionado à resina. Na primeira modificação, alterou-se apenas o tempo
de centrifugação do protocolo, utilizando 2 min ao invés de 15 min. Já na segunda
modificação, a amostra sonicada foi adicionada à resina sem ser centrifugada. O
microtubo contendo a amostra e a resina foi homogeneizado por inversão e colocado
num aparato de homogeneização, onde permaneceu sob agitação por 1h a 4º C.
Após 1h em agitação, realizou-se uma nova centrifugação (1600xg/3min/25ºC)
e o sobrenadante foi coletado (flow-through). Foram realizadas cinco lavagens
adicionando 1 mL de tampão de lavagem à resina. Em cada lavagem, o microtubo foi
centrifugado (1600xg/3min/25ºC) e homogeneizado por inversão e o sobrenadante
transferido para um novo microtubo devidamente identificado. Para constatar qual a
concentração de imidazol do tampão de eluição é capaz de eluir a proteína
rMEBIOSM, foram testados quatro tampões de eluição com diferentes concentrações
de imidazol: 50mM, 100mM, 200mM e 500mM. Portanto, após o término da lavagem,
foi adicionado 500 μL de tampão de eluição, o microtubo foi homogeneizado por
inversão e centrifugado (1600xg/3min/25ºC). Este procedimento foi realizado duas
vezes para cada tampão de eluição com concentração diferente de imidazol e o
sobrenadante originado de cada centrifugação foi transferido para um novo microtubo
devidamente identificado. Os sobrenadantes coletados nas lavagens e nas eluições
foram armazenados à - 20ºC para posterior análise em gel SDS-PAGE.
52
4.9 DOT-BLOT
Para o Dot-Blot, a membrana de Difluoreto de Polivinilideno (PVDF) (Westran®
General Electric – GE, Estado Unidos) foi imersa em metanol (Sigma®- Alemanha) e
com auxílio de uma pipeta aplicou-se 2 μL da proteína rMEBIOSM em dois pontos da
membrana (os sobrenadantes originados das lavagens e eluições da purificação
foram juntados num microtubo e a amostra originada foi utilizada para o teste). A
membrana foi secada por 1h em estufa à 37ºC e acondicionada em uma placa de
Petri. Em seguida, os sítios inespecíficos foram bloqueados pela imersão da
membrana em 5 mL de solução tampão salina fosfato contendo 5% de albumina e
polissorbato (Tween-20 Sigma®- Alemanha) 0,05% (PBS-T-BSA) por 1h em
temperatura ambiente sob uma leve agitação mecânica. Logo depois, a membrana foi
lavada com PBS-Tween-20 a 0,05% (Sigma®- Alemanha), mantendo a solução por 5
minutos sob leve agitação mecânica. Este procedimento foi repetido 3 vezes. O
anticorpo monoclonal anti poli-histidina (anti-His) conjugado com peroxidase de
rabanete (HRP, do inglês: horseradish peroxidase) (Sigma®- Alemanha) foi diluído na
proporção de 1:1000 em solução PBS-T-BSA e aplicado sobre a membrana e mantido
por uma hora em temperatura ambiente, sob leve agitação mecânica. A membrana foi
lavada novamente 3 vezes com PBS-Tween-20 a 0,05% (Sigma®- Alemanha), por
cinco minutos sob agitação leve.
O reagente para revelação do teste foi preparado com 3,3’-Diaminobenzidina
(DAB - Sigma®- Alemanha) com adição de 40 μL de peróxido de hidrogênio (H2O2) a
10% no volume final de 15 mL de solução Tris- NaCl pH 7,6 em seguida, foi aplicado
sobre a membrana para o aparecimento de cor na área onde foi aplicada a amostra.
Com a finalidade de parar a reação de revelação, utilizou-se a água.
53
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ANÁLISES IN SILICO
5.1.1 Obtenção das sequências de proteínas hipotéticas de S. mansoni
Diante da situação alarmante da doença, tem-se a necessidade de buscar
novas estratégias de controle e, para isto, as ferramentas de bioinformática estão se
tornando grandes aliadas às pesquisas. O sequenciamento genômico do parasito,
assim como a disponibilidade de programas que predizem particularidades do
Schistosoma estão sendo amplamente utilizados, o que cada vez mais facilita a busca
por técnicas de diagnósticos baseadas em antígenos (CARVALHO et al., 2011).
Apesar da complexidade do S. mansoni, avanços na biologia molecular têm permitido
a investigação de peculiaridades do genoma, o que vêm facilitando a pesquisa por
pequenas regiões proteicas antigênicas do parasito (LOPES et al., 2017).
Utilizando o banco de dados de domínio público GeneDB, verificou-se que o
genoma do parasito contém 3.080 proteínas hipotéticas, cuja função e localização são
desconhecidas. Para este trabalho, foram selecionadas 390 sequências de proteínas
hipotéticas de S. mansoni para as análises in silico. Aproximadamente 40% do
genoma do parasito é composto por proteínas hipotéticas e estas são alvos muito
promissores a serem caracterizados e testados (FONSECA et al., 2012).
5.1.2 Predição de localização celular
O parasito possui um tegumento composto por uma membrana plasmática
dupla incomum, responsável pela absorção de nutrientes, crescimento e
desenvolvimento e auxilia na proteção contra o sistema imune do hospedeiro, tendo
um papel importante na interação parasito-hospedeiro (HAN et al., 2009; MCLAREN;
HOCKLEY, 1977). O tegumento sofre várias mudanças durante as fases de vida do
parasito, e estas mudanças são importantes para a sua sobrevivência e resistência à
imunidade do hospedeiro, sendo, então, uma fonte relevante de antígenos (ABATH;
54
WERKHAUSER, 1996). Os antígenos encontrados na superfície do tegumento
tendem a ter uma boa imunogenicidade, pois estão expostos diretamente ao sistema
imunológico (DA’DARA et al., 2003; DE OLIVEIRA LOPES et al., 2013; TRAN et al.,
2006). Estudos realizados por Carvalho e colaboradores (2011) corroboram com estas
informações, sendo selecionados epítopos da superfície do parasito, por meio de
análises in silico, e estes se mostraram possíveis candidatos para o diagnóstico de
S. mansoni.
Diante destas considerações, o estudo teve como um dos critérios de seleção
das proteínas a localização celular. Somente aquelas que tinham probabilidade de
serem expressas na membrana plasmática do parasito foram selecionadas. Apesar
de não ser possível analisar por meio de programas de bioinformática se a proteína
está presente na membrana interna ou externa do tegumento, este critério foi utilizado
devido a hipótese de que as proteínas do tegumento sejam mais susceptíveis ao
sistema imunológico, com maior probabilidade de reconhecimento por anticorpos.
Utilizando o programa Psort II, foi possível fazer a predição da localização
celular e selecionar somente aquelas proteínas que tinham maior probabilidade de
serem de membrana plasmática. De 390 proteínas, 172 foram preditas como
transmembrânicas e selecionadas para as análises posteriores. A Figura 7 representa
a predição de localização celular da Smp_144770, formada por uma sequência de 928
aminoácidos, que apresentou 73.9 % de probabilidade de estar localizada na
membrana.
Figura 7. Predição de localização celular da proteína hipotética Smp_144770 pelo programa Psort II. Onde X indica a probabilidade de 73.9% de ser uma proteína de membrana plasmática.
X
55
5.1.3 Predição de peptídeo sinal
Muitas das proteínas que são sintetizadas em compartimentos celulares não
desempenham seus papéis biológicos nos locais onde são geradas, sendo exportadas
para o seu local de função. O peptídeo sinal é uma sequência pequena composta por
15 a 60 aminoácidos, localizada normalmente na porção N-terminal da proteína (DE
OLIVEIRA LOPES et al., 2013), e atua no direcionamento das proteínas, não estando
presente na proteína madura (AUCLAIR; BHANU; KENDALL, 2012).
De Oliveira e colaboradores (2013) enfatizaram a importância da análise da
presença de peptídeo sinal, pois, para manter a confiabilidade, a sequência de
peptídeo sinal deve ser retirada, caso esteja presente na proteína. De contrário, pode
gerar resultados errôneos, uma vez que a sequência da proteína pode ser alterada e
estabelecer uma conformação distorcida na membrana plasmática. Esta análise é de
grande importância, uma vez que consegue mimetizar o que acontece naturalmente
no organismo e, caso a sequência correspondente não seja retirada, a topologia da
proteína na membrana pode ser predita de forma errada. Estudos realizados por
Zhang e colaboradores (2014) também ressaltaram a importância de se predizer a
presença do peptídeo sinal nas análises para a triagem de epítopos. Para este estudo,
esta etapa não foi de critério de exclusão, pois as proteínas que não apresentaram o
peptídeo sinal também foram mantidas para as análises, devido ao fato de serem
direcionadas para a membrana plasmática ou secretadas por mecanismos não-
canônicos (LOPES et al., 2017; MAMBULA et al., 2007; ZHANG et al., 2012).
As proteínas transmembranas selecionadas anteriormente foram analisadas
pelo programa SignalP 4.1, o qual faz a predição da presença de peptídeo sinal e do
seu local de clivagem, simulando assim o que ocorre no organismo. De 172 proteínas
selecionadas, 21 apresentaram a presença de peptídeo sinal e a sequência
correspondente ao peptídeo sinal foi retirada para as análises seguintes. As proteínas
que não apresentaram peptídeo sinal também foram mantidas para as próximas
análises. A Figura 8A representa a proteína Smp_170620, que possui o peptídeo sinal,
bem como o seu sítio de clivagem e a Figura 8B representa a proteína Smp_145040,
que não possui o peptídeo sinal.
56
Figura 8. Predição de peptídeo sinal. A- Presença de peptídeo sinal na proteína Smp_170620, onde X corresponde a sequência de peptídeo sinal e Y corresponde ao sítio de clivagem. B- Ausência de peptídeo sinal na proteína Smp_145040, não havendo pico acima do limiar.
5.1.4 Predição de hélices transmembrânicas e regiões expostas
Como critério de seleção para este estudo, somente as partes expostas das
proteínas foram selecionadas para análises posteriores, pois supostamente estão
mais susceptíveis ao sistema imune do hospedeiro (DE OLIVEIRA LOPES et al.,
2013). Seguindo este critério, Lopes e colaboradores (2017) selecionaram epítopos
de partes expostas de proteínas, por meio de análises in silico, que foram capazes
tanto de estimular linfócitos T CD4 quanto de serem reconhecidos por soro de
indivíduos infectados.
Para esta seleção, foram utilizados os programas TMHMM, TMpred e SOSUI
1.11, com intuito de realizar a predição da orientação das proteínas na membrana
plasmática. De 172 proteínas analisadas, 48 proteínas apresentaram regiões
expostas acima de 35 aminoácidos, sendo selecionadas para as próximas análises,
totalizando em 56 regiões expostas (algumas proteínas apresentaram mais de uma
região exposta com, no mínimo, 35 aminoácidos). As regiões intracelulares e hélices
transmembrânicas foram descartadas. O critério de selecionar somente regiões
X
Y
A B
57
expostas contendo ao menos 35 aminoácidos foi utilizado com o objetivo de se obter
uma cadeia peptídica que irá gerar um número satisfatório de epítopos com afinidade
por moléculas de HLA de classe II e por BCR.
A Figura 9 representa a predição da proteína Smp_179660 pelos programas
TMHMM, TMpred e SOSUI 1.11, na qual se nota que todos os programas fazem a
predição de quais aminoácidos compõem a região exposta, hélices transmembrânicas
e região intracelular da proteína.
Figura 9. Análise da orientação da proteína Smp_179660 na membrana plasmática pelos programas TMHMM, TMpred e SOSUI. A- TMHMM: prediz que as regiões expostas são entre os aminoácidos 1 a 61, 161 a 443 e 509 a 836; B-TMpred: prediz que as regiões expostas são entre os aminoácidos 1 a 60,163 a 448 e 510 a 838 e, C- SOSUI: prediz que as regiões expostas são entre os aminoácidos 1 a 61, 163 a 443 e 511 a 832. Nota-se que há três regiões expostas em comum nos três programas, sendo selecionadas para as próximas análises.
5.1.5 Predição de epítopos com afinidade por moléculas do HLA classe II
As moléculas HLA de classe II são expressas na superfície de células do
sistema imune, como células B, células dentríticas e macrófagos, e atuam na
apresentação de fragmentos de proteínas exógenas para o sistema imune (ROCHA
et al., 2008). As APC reconhecem os antígenos por meio de receptores de superfície
celular, com subsequente degradação a peptídeos menores. As moléculas de HLA de
A B
C
58
classe II são sintetizadas no retículo endoplasmático e transportadas em fagosomas
ou endosomas, onde se ligam ao peptídeo. O complexo HLA II ligado ao peptídeo é,
então, transportado para a superfície da célula, sendo responsável pela apresentação
do antígeno para as células T CD4+ (ROBINSON; DELVIG, 2002). As células T CD4+
ativadas se diferenciam em subtipos e possuem diversas funções importantes
(LUCKHEERAM et al., 2012), como a ativação de células B.
Os genes HLA constituem um dos sistemas genético humano mais polimórfico
conhecido atualmente (PETZL-ERLER; LUZ; SOTOMAIOR, 1993; TROWSDALE;
KNIGHT, 2013), e para as HLA de classe II, as moléculas HLA-DRB1 são as mais
abundantes na superfície das células apresentadores de antígenos, sendo que mais
de 200 alelos já foram descritos para este locus. Os sete alelos das HLA de classe II
(DRB1 0101, DRB1 0301, DRB1 0401, DRB1 0701, DRB1 1101, DRB1 1301 e DRB1
1501) analisados foram selecionados por serem amplamente encontradas em
diferentes populações pelo mundo, principalmente na população caucasiana (TEXIER
et al., 2000).
Uma forma de se selecionar peptídeos como alvos antigênicos é por intermédio
de análise de afinidade entre determinadas sequências proteicas e moléculas de HLA.
Alguns antígenos são chamados de promíscuos, pois podem ser reconhecidos por
diversas moléculas de HLA. Uma vez utilizando estes antígenos, seria possível
amplificar a gama de indivíduos que poderiam reconhecê-los, aumentando assim a
probabilidade de estimular o sistema imune, já que o perfil de HLA de cada pessoas
pode modificar bastante devido ao polimorfismo (WIENS et al., 2013). Sendo assim,
para este estudo, priorizou-se a seleção de epítopos que eram reconhecidos ao
mesmo tempo por todas as sete moléculas de HLA citadas acima. De fato, Oliveira e
colaboradores (2016a), obtiveram, por meio de tais análises, epítopos capazes de
estimular a proliferação de linfócitos T CD4, se mostrando candidatos promissores
para a composição de vacinas. Ainda, Carvalho e colaboradores (2017), também
obtiveram resultados promissores para o diagnóstico de S. mansoni utilizando este
critério.
Portanto, as regiões expostas selecionadas anteriormente foram analisadas
pelo programa Tepitool, para predição de epítopos, que tenham afinidade de ligação
por sete moléculas de HLA classe II: DRB1 0101, DRB1 0301, DRB1 0401, DRB1
0701, DRB1 1101, DRB1 1301 e DRB1 1501. Os epítopos foram selecionados pelo
critério de afinidade, quando apresentassem capacidade hipotética de interação com
59
100% dos alelos, baseado na hipótese de que a comunicação epítopo-HLA consiga
estimular a resposta imune do hospedeiro, de acordo com as predições. A Figura 10
representa a relação dos epítopos preditos para a proteína Smp_126900. Foram
gerados 12 epítopos com afinidade pelas sete moléculas de HLA selecionadas.
Figura 10. Predição de epítopos pelo programa Tepitool da proteína Smp_126900.Todos os epítopos presentes na figura foram selecionados, pois todos eles têm 100% de afinidade pelos sete HLAs escolhidos.
5.1.6 Predição de epítopos lineares com afinidade pelo receptor de antígeno de
célula B
A resposta imune contra o parasito envolve a resposta celular e humoral
(CALDAS et al., 2008). A resposta humoral à antígenos proteicos é dependente do
reconhecimento por linfócitos T auxiliares. Estas células interagem com os linfócitos
B, estimulando a expansão clonal, mudança de classe, maturação de afinidade e
diferenciação em linfócitos B de memória (MESQUITA JÚNIOR et al., 2010). Este é
um evento inicial crucial para a produção da resposta humoral contra parasitos
extracelulares, levando à produção de anticorpos com alta capacidade de
reconhecimento do antígeno (HARDTKE; OHL; FÖRSTER, 2005).
O complexo BCR, responsável pelo reconhecimento de antígenos pelas células
B, é composto por molécula de anticorpo transmembrana associada a duas cadeias
de sinalização. As imunoglobulinas das classes M e D são os anticorpos de membrana
receptores de antígenos de células B virgens e, juntamente com Igα e Igβ, que são
60
cadeias proteicas ligadas não covalentemente à imunoglobulina receptora,
transduzem o sinal gerado após o reconhecimento do antígeno. Os antígenos
proteicos são internalizados, processados e apresentados. A ativação de células B
por antígenos tem como efeito o aumento da expressão de moléculas de HLA de
classe II em sua superfície, que apresentam o antígeno às células T auxiliares
previamente ativadas, que são fortes estimuladoras da proliferação e diferenciação de
células B (ABBA; LICHTMAN; PILLAI, 2012).
Para compor uma proteína multiepitopo recombinante, é necessário trabalhar
com epítopos lineares, uma vez que epítopos conformacionais têm uma grande
probabilidade de não manterem a sua imunorreatividade, sendo que provavelmente a
sua integridade conformacional não seria mantida quando incorporados à proteína
recombinante (DIPTI; JAIN; NAVIN, 2006). Estudos realizados por De Souza e
colaboradores (2018) selecionaram um epítopo linear, capaz de ser reconhecido por
IgG em soro de indivíduos infectados, sendo candidato promissor para o diagnóstico
de S. mansoni.
Para a predição de epítopos lineares com afinidade por BCR, as partes
expostas das proteínas que geraram antígenos com afinidade por moléculas de HLA
de classe II, foram submetidas ao programa ABCpred. Foram preditos epítopos com
sequência de 16 aminoácidos e aqueles que apresentassem threshold acima de 0.51
foram considerados. A Figura 11 representa parte do resultado gerado pela análise
da proteína Smp_179660.
Com objetivo de selecionar epítopos para cada região exposta, as sequências
de aminoácidos dos epítopos preditos com afinidade por moléculas de HLA de classe
II e BCR foram então comparadas. Aqueles reconhecidos, ao mesmo tempo com o
mínimo de doze aminoácidos em comum, por estas duas moléculas do sistema imune
foram selecionados. Este critério de seleção foi estabelecido com objetivo de
mimetizar o que acontece no organismo, visto que a ativação de linfócitos B por
antígenos proteicos é dependente de células T CD4.
Embora algumas sequências de cada epítopo não tenham tido 100% de
compatibilidade entre BCR e HLAs, a literatura afirma que os anticorpos reconhecem
determinantes lineares formados por cerca de seis aminoácidos (ABBA; LICHTMAN;
PILLAI, 2012). Baseado nisto, acredita-se que, apesar das células B não
reconhecerem a sequência total de certos epítopos selecionados para HLA, eles
podem ser potenciais alvos antigênicos, uma vez que podem ser reconhecidos por
61
anticorpos em soros de pacientes infectados e serem utilizados como uma alternativa
para diagnóstico. Carvalho e colaboradores (2017) obtiveram, por meio de tais
análises, epítopos de proteínas hipotéticas e também de proteínas já descritas e que
foram reconhecidos por ambas as moléculas do sistema imune, apresentando alta
sensibilidade e especificidade, sendo ótimos candidatos para diagnosticar a infecção
por S. mansoni.
Figura 11. Predição de epítopos lineares com afinidade por BCR. Todos os epítopos presentes na figura têm threshold acima de 0.51 e foram considerados para a próxima etapa.
5.1.7 Predição de antigenicidade
A antigenicidade de um epítopo refere-se à capacidade de interação com o
sítio de ligação (paratopo) do anticorpo (VAN REGENMORTEL, 2001). Uma proteína
considerada antigênica é capaz de ser reconhecida com alta sensibilidade e
especificidade por soro de pacientes infectados (DIAS et al., 2017). Estudos
realizados por Mohammad e colaboradores (2016), utilizando o preditor de
antigenicidade VaxiJen, selecionaram-se epítopos ditos como antigênicos, sendo
candidatos promissores para a composição de vacinas e kits de diagnóstico. Dito isso,
62
é de extrema importância o uso de uma ferramenta de bioinformática capaz de
predizer a probabilidade antigênica de um epítopo, proporcionando um
direcionamento na triagem de alvos, o que visa a elaboração de um kit de diagnóstico
com alta sensibilidade e especificidade.
Sendo assim, os epítopos selecionados pelas análises anteriores foram
submetidos ao VaxiJen. A ferramenta faz a predição de antigenicidade de acordo com
cada tipo de organismo. Para parasito, o threshold é 0.5, sendo considerados
antigênicos os epítopos que alcançassem este valor, segundo a predição. Após a
análise, somente os epítopos preditos como antigênicos foram considerados para a
montagem da proteína multiepitopo. A Figura 12 representa o resultado da predição
de antigenicidade dos epítopos Smp_145040.
Figura 12. Predição de antigenicidade realizada pelo programa VaxiJen. Este epítopo foi considerado antigênico, tendo valor de antigenicidade de 1.2021.
5.1.8 Análise de homologia
A análise de homologia entre os epítopos e proteínas humanas ou proteínas de
outros helmintos é importante para a triagem de candidatos para kits de diagnóstico.
O sistema imune elimina ou regula autoantígenos reativos, sendo assim, os epítopos
que apresentam homologia significativa com proteínas humanas são considerados de
63
baixa imunogenicidade (CARVALHO et al., 2011). Além disso, as reações cruzadas
entre helmintos podem dificultar o diagnóstico preciso de uma determinada doença,
devido à presença de epítopos antigênicos comuns, em diferentes espécies de
parasitas (ISHIDA et al., 2003). Esta análise foi utilizada em diversos estudos,
destacando a sua importância (CARVALHO et al., 2011; CARVALHO et al., 2017; DE
SOUZA et al., 2018; LOPES et al., 2017).
Todos os epítopos selecionados pela última análise foram submetidos à análise
de homologia pelo programa NCBI Blast+. Foi possível excluir aqueles epítopos
preditos com homologia significativa com proteínas de outras espécies
filogeneticamente relacionadas ou não, evitando assim resultados falso-negativos ou
falso-positivos em testes. Não foi observada homologia com outros helmintos, e
aqueles epítopos que apresentaram homologia acima de 60% com proteínas
humanas foram descartados, seguindo o critério utilizado por Carvalho e
colaboradores (2011).
Após esta última análise, todos os epítopos selecionados possuem todos os
critérios de seleção das análises in silico, sendo possível selecionar os melhores
epítopos para comporem a proteína multiepitopo. Para isto, optou-se por selecionar
cinco epítopos, com sequência de 15 aminoácidos cada. A seleção final foi baseada
nos maiores valores de antigenicidade, sendo possível selecionar 5 melhores epítopos
dentro dos critérios estabelecidos. A Tabela 2 representa os epítopos selecionados,
bem como suas proteínas de origem, seu valor de antigenicidade e o número de
aminoácidos (aa) que as moléculas HLA classe II e BCR reconhecem.
Tabela 2: Epítopos selecionados para comporem a proteína rmultiepitopo.
Proteína Epítopo Valor de
antigenicidade
Reconhecimento
por HLA classe II
Reconhecimento
por BCR
Smp_159780 Ep1 1.4179 15 aa 12 aa
Smp_179660 Ep2 1.3869 15 aa 15 aa
Smp_126900 Ep3 1.2524 15 aa 15 aa
Smp_145040 Ep4 1.2021 15 aa 12 aa
Smp_159780 Ep5 1.1744 15 aa 14 aa
64
5.1.9 Predição da expressão das proteínas nas diferentes fases de vida do parasito
O banco de dados GeneDB dispõe de informações sobre o transcriptoma das
proteínas de S. mansoni, onde se pode verificar a probabilidade de expressão da
proteína nas diferentes fases de vida do parasito. Esta informação foi analisada para
as proteínas correspondentes aos epítopos selecionados.
Neste contexto, mediante o estudo desta informação, verificou-se que todas as
proteínas são expressas em todas as fases do parasito, com diferença de níveis de
expressão nas diferentes fases de vida. Porém, todas apresentaram maior nível de
expressão em esquistossômulos. A Figura 13 representa a predição das proteínas
correspondentes aos epítopos selecionados para comporem a proteína multiepitopo
recombinante.
Figura 13. Predição da expressão das proteínas correspondentes aos epítopos
selecionados nas diferentes fases de vida do parasito. C: cercária; 3S:
esquistossômulo de 3h; 24S: esquistossômulo de 24h; A: verme adulto. A: predição
da proteína Smp_159780. B: predição da proteína Smp_179660. C: predição da
proteína Smp_126900. D: predição da proteína Smp_145040. Nota-se que as
proteínas são expressas em todas as fases de vida do parasito, tendo maior
expressão na fase esquistossômulo de 24h.
A B
C D
65
Diante das análises apresentadas, sugere-se que a utilização dos epítopos
selecionados a partir destas proteínas proporcionará um diagnóstico da doença na
fase aguda e crônica. A possibilidade de diagnosticar a doença na fase aguda, uma
vez que que as proteínas possuem maior nível de expressão nas fases iniciais de vida
do parasito (cercária e esquistossômulo), tem relevância na importância clínica. Isso
acontece porque um método de diagnóstico que possibilite a detecção da doença na
fase aguda é crucial para evitar as reações patológicas irreversíveis causadas pelo
depósito de ovos em tecidos e órgãos (HUSSEIN et al., 2012), permitindo o tratamento
precoce da doença (BAHGAT et al., 2011). Como consequência, pode ser observada,
junto às medidas adequadas de controle, a diminuição da transmissão e maior
controle sobre a prevalência da doença.
5.2 DESENHO RACIONAL DA PROTEÍNA MULTIEPITOPO RECOMBINANTE
A necessidade de mais de um epítopo e ou proteína recombinante para garantir
um diagnóstico sensível e específico pode resultar em um aumento no custo final
deste kit. Em contraste, a estratégia promissora de uma proteína multiepítopo pode
reduzir a complexidade do procedimento e minimizar o custo final dos kits de
diagnóstico (DIPTI; JAIN; NAVIN, 2006).
A construção de proteínas multiepitopo recombinantes contendo uma alta
densidade de epítopos racionalmente selecionados tem sido uma alternativa para a
detecção de anticorpos no diagnóstico. Estudos realizados por Chao e colaboradores
(2016) para S. japonicum, demonstraram que a proteína multiepitopo recombinante
tem maior potencial de ser reconhecida por soro de indivíduos infectados do que por
antígenos separados. Além disso, diversos trabalhos publicados já relataram que
essas proteínas exibem uma ampla habilidade para expor os epítopos constituintes
com grande eficiência, resultando em maior sensibilidade e especificidade do teste e
abrangendo diagnóstico para várias doenças (ANANDARAO et al., 2005, 2006;
CAMUSSONE et al., 2009; CHENG et al., 2011; DAI et al., 2012; DE SOUZA et al.,
2013; DIPTI; JAIN; NAVIN, 2006; DUTHIE et al., 2010; FARIA et al., 2015; GALDINO
et al., 2016; HOUGHTON et al., 2000; LIN; CHEN; YAN, 2008; TRIPATHI et al., 2007).
Para o desenho racional da quimera, todos os cinco epítopos selecionados
pelas análises in silico foram utilizados para a construção da mesma, no qual foram
66
inseridos linkers flexíveis entre os epítopos. Ao final da sequência, na porção C-
terminal, foram inseridos seis resíduos de histidina (H) para permitir a detecção e
purificação da proteína recombinante.
A proteína recombinante gerada possui 304 aminoácidos, sendo a sequência
dos epítopos repetida três vezes para atingir a massa molecular desejada. Todas as
possibilidades de posições dos epítopos foram testadas, alterando-se a ordem de
cada um. A antigenicidade de cada tentativa de proteína multiepitopo recombinante
foi conferida pelo programa VaxiJen e a selecionada possui antigenicidade no valor
de 1.0738.
A Figura 14 representa a disposição dos epítopos para a formação da proteína
rMEBIOSM.
Figura 14. Desenho da proteína multiepitopo recombinante rMEBIOSM. Os epítopos de cada proteína foram dispostos de forma sequencial, tendo como início o Ep2 (proteína de origem Smp_179660), seguido por Ep3 (proteína de origem Smp_126900), Ep4 (proteína de origem Smp_145040), Ep5 (proteína de origem Smp_159780) e Ep1 (proteína de origem Smp_159780). Entre cada epitopo está presente o linker flexível. A cadeia proteica termina com uma cauda de seis histidinas (H).
Também como critério de seleção, a estrutura terciária de cada possível
proteína multiepitopo foi predita pelo programa Phyre2. A Figura 15 representa a
estrutura da proteína multiepitopo rMEBIOSM predita pelo Phyre2.
A predição da estrutura é baseada em modelos já existentes em banco de
dados. Aquelas sequências de proteína que tiveram a estrutura preditas a serem muito
enoveladas foram descartadas, pois este enovelamento poderia ser um impedimento
para o reconhecimento de anticorpos. Dipti e colaboradores (2006) obtiveram uma
predição de estrutura similar para a proteína recombinante do estudo em questão,
sendo justificado o uso desta pela exposição dos epítopos, no qual eles estariam
provavelmente mais acessíveis para as interações com anticorpos, aumentando a
sensibilidade e especificidade na reatividade com os anticorpos. A reatividade entre
os epítopos e anticorpos foi confirmada experimentalmente, afirmando a teoria de
maior acessibilidade dos epítopos.
Ep2 Ep3 Ep4 Ep5 Ep1 HHHHHH
67
Figura 15. Predição da estrutura da proteína multiepitopo recombinante pelo programa Phyre2.
A predição da estrutura da proteína recombinante selecionada apresentou
baixa confiança e teve 89% da sua sequência predita como desordenada. Regiões
desordenadas não apresentam uma estrutura terciária bem definida
(SCHLESSINGER et al., 2011; VICEDO et al., 2015) e proporcionam um
reconhecimento molecular promíscuo, com ligação transitória para vários alvos e por
isso, ajudam a aumentar a complexidade das interações proteicas (GU; HILSER,
2009; TOMPA; SZÁSZ; BUDAY, 2005). A baixa similaridade e nível de confiança da
predição podem ser justificada por se tratar de uma proteína multiepitopo
recombinante inexistente na natureza.
O valor do pI teórico e da massa molecular da proteína selecionada foram
conferidos utilizando o programa Compute pI/mW. O pI é o valor no qual o potencial
Hidrogeniônico (pH) de uma molécula se encontra com a carga líquida igual a zero
(BROOKS; FELL; FREI 1986) e este valor é importante para a etapa de diálise da
proteína, uma vez que durante o processo, o pH deve manter uma determinada
distância do pI, caso contrário haverá a precipitação da proteína. A massa molecular
predita da proteína auxiliou na identificação ao se comparar a massa em relação a um
68
marcador de peso molecular padrão na eletroforese do tipo SDS-PAGE. A Figura 16
representa o resultado para massa molecular e pI de rMEBIOSM.
Figura 16. Ponto isoelétrico teórico e massa molecular da rMEBIOSM. O ponto isoelétrico teórico e massa molecular são de 8.78 e 30.8 kDa, respectivamente.
A sequência proteica foi enviada para a empresa Epoch Biolabs (Fort Bend
County, Texas, EUA), que realizou a síntese do gene contendo códons preferenciais
para E. coli e a clonagem deste no vetor de expressão pET21a.
5.3 PREPARAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES E TRANSFORMAÇÃO COM
PLASMÍDEO pET21a::rMEBIOSM
A E. coli é um dos possíveis organismos de escolha para expressão de
proteínas recombinantes e se tornou a plataforma de expressão mais popular
(ROSANO; CECCARELLI, 2014). A escolha da E. coli para a expressão da proteína
rMEBIOSM se deve às várias vantagens apresentadas pela mesma, como, a
simplicidade relativa, cultivo barato e rápido, genética já caracterizada e existência de
69
várias ferramentas compatíveis para a biotecnologia (SORENSEN; MORTENSEN,
2005).
Vários autores utilizaram a E. coli para expressão de proteínas recombinantes,
devido às vantagens apresentadas por este microrganismo, tendo a expressão
realizada com sucesso (ARORA; KHANNA, 1996; BRIAND et al., 2016; DE SOUZA et
al., 2013; DIPTI; JAIN; NAVIN, 2006; FREIHERR VON ROMAN et al., 2014; GALDINO
et al., 2016; MCKINSTRY et al., 2014; VOULGARIDOU et al., 2013).
A preparação de células competentes é realizada para capacitar a célula a
receber a construção plasmidial. Logo após as células se tornarem competentes,
inicia-se o protocolo de transformação. A transformação bacteriana teve como objetivo
inserir o plasmídeo pET::rMEBIOSM em células E.coli BL21 pLysS, pLysE, C41 (DE3)
e Arctic Express (DE3).
A transformação é confirmada como bem sucedida quando é possível visualizar
a presença de colônias em placas de Petri com meio LB sólido, contendo ampicilina
na concentração final de 100μg/mL, sendo esta utilizada como marca de seleção dos
clones recombinantes.
Marcas de seleção são utilizadas para conferir resistência a várias substâncias
(VICKERS et al., 2013). As mais utilizadas para a seleção de bactérias são os
antibióticos ampicilina e kanamicina (HERSHFIELD et al., 1974; JANG; MAGNUSON,
2013; SUTCLIFFE, 1978), a qual permite a seleção das células transformantes que
receberam o plasmídeo, ao adicionar o antibiótico relacionado a marca de seleção no
meio de cultura (MANNA et al., 2013; PRESTON, 2003; SAMBROOK; RUSSELL,
2001). No caso do plasmídeo pET21a::rMEBIOSM, a marca de seleção utilizada foi o
gene que confere resistência a ampicilina, que codifica a enzima β-lactamase, a qual
hidrolisa o anel β-lactâmico presente na ampicilina (BRIÑAS et al., 2002;
LIVERMORE, 1995).
Portanto, somente as células que receberam o plasmídeo são capazes de
crescer em meio contendo ampicilina. As transformações com as cepas pLysS, pLysE,
C41(DE3) e Arctic Express (DE3) foram bem sucedidas.
70
5.4 EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA PROTEÍNA rMEBIOSM E ANÁLISE POR GEL
SDS-PAGE
O promotor é o componente-chave de um sistema de expressão, pois ele
controla a iniciação da transcrição de genes associados (KAUR; KUMAR; KAUR,
2018). O sistema de expressão mais utilizado para E. coli é o pET, contendo o
promotor T7 (GRÄSLUND et al., 2008; JIA; JEON, 2016), sendo o sistema de
expressão de escolha para este estudo.
A expressão com o sistema pET requer uma célula hospedeira engenheirada
com a região DE3 do bacteriófago λ, gene que codifica a T7 RNA polimerase
(MIERENDORF; YEAGER; NOVY, 1994). A atividade do promotor T7 é forte e a
produção da proteína recombinante pode totalizar até 50% das proteínas celulares
(JIA; JEON, 2016; STUDIER; MOFFATT, 1986). O gene da T7 RNA polimerase está
sob o controle do promotor lacUV5, que é ativado na presença de IPTG (JIA; JEON,
2016; PAN; MALCOLM, 2000). Além disso, o genoma da E. coli e o plasmídeo pET
contém o gene LacI, o qual codifica o repressor do promotor lacUV5. Assim, a
transcrição da T7 RNA polimerase se inicia com a presença de IPTG, que se liga e
desencadeia a liberação do repressor do operador lac, iniciando a transcrição do gene
de interesse (SORENSEN; MORTENSEN, 2005). Por outro lado, a expressão de
proteínas recombinantes podem ser controladas por meio da coexpressão da lisozima
T7, a qual se liga à T7 RNA polimerase e inibe a transcrição do gene de interesse
(JIA; JEON, 2016; STANO; PATEL, 2004).
A cepa BL21 de E. coli e seus derivados são os hospedeiros mais utilizados
para a produção de proteínas recombinantes, sendo que estas cepas são deficientes
das proteases lon e ompT, que podem aumentar a instabilidade da proteína (JIA;
JEON, 2016).
Diante disso, as células hospedeiras escolhidas inicialmente para a expressão
heteróloga foram as cepas BL21 (λ DE3) pLysS e pLysE, denominadas assim pelo
plasmídeo que possuem, o qual produz a lisozima T7 (MIERENDORF; YEAGER;
NOVY, 1994). As células hospedeiras contendo o plasmídeo pLysS produzem baixas
quantidades de lisozima T7, enquanto que células contendo o plasmídeo pLysE
produzem uma grande quantidade da enzima, sendo então a cepa com maior controle
rigoroso para a produção de proteínas recombinantes nas cepas λDE3
(MIERENDORF; YEAGER; NOVY, 1994; STUDIER, 1991). Como alternativa, as
71
cepas C41 (DE3) e Arctic Express (DE3) foram utilizadas para tentar expressar a
proteína multiepitopo.
A cepa C41 (DE3) é uma mutante de BL21 (DE3) e é superior a esta na
expressão de várias proteínas heterólogas (DUMON-SEIGNOVERT; CARIOT;
VUILLARD, 2004). Estudos realizados por Miroux e Walker (1996) demonstraram que
C41 (DE3) foi mais eficaz do que BL21 (DE3) para a expressão de proteínas
globulares e de membranas que possam ter efeito tóxico. Além disso, com a utilização
da cepa, foi possível a expressão de altos níveis de proteínas que foram incapazes
de serem expressas em grandes quantidades em BL21 (DE3) (PAPANEOPHYTOU;
KONTOPIDIS, 2014), com trabalhos já publicados sobre a utilização de C41 (DE3)
para a expressão de proteínas difíceis de serem expressas (ARECHAGA et al., 2003;
PAPANEOPHYTOU; KONTOPIDIS, 2014; SMITH; WALKER, 2003; SORENSEN;
SPERLING-PETERSEN; MORTENSEN, 2003).
A cepa Arctic Express (DE3) é uma mutante de BL21 (DE3) que auxilia na
expressão de proteínas em formas mais solúveis (HONG; RASHID; SANTIAGO-
VAZQUEZ, 2013). Esta cepa possui, respectivamente, a chaperonina e co-
chaperonina adaptadas ao frio Cpn60 e Cpn10, retiradas da bactéria psicrofílica
Oleispira antarctica (FERRER et al., 2004; ROSANO; CECCARELLI, 2014). Estas
conferem processamento melhorado de proteínas a temperaturas mais baixas,
aumentando potencialmente o rendimento da proteína recombinante ativa e solúvel.
Estudos realizados por Hartinger e colaboradores (2010) concluíram que, a cepa
Arctic Express (DE3), quando comparada à outras cepas, proporcionou uma
expressão mais eficiente de uma enzima que geralmente é produzida na forma de
corpos de inclusão, gerando uma quantidade satisfatória da enzima ativa e na forma
solúvel.
Posteriormente a etapa de transformação com o plasmídeo, iniciou-se a
indução da expressão da proteína de interesse, no intuito de verificar a capacidade
das cepas expressarem a proteína rMEBIOSM, sendo avaliada por meio de um gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE). Com objetivo de realizar a expressão da proteína
multiepitopo, foram testadas diferentes condições da indução.
O protocolo utilizado por Galdino e colaboradores (2016) foi o escolhido
inicialmente para a expressão da proteína recombinante com as cepas pLysS e
pLysE. O protocolo de indução utilizado por estes autores tem como temperatura pré
e pós-indução de 37ºC e IPTG como indutor, com concentração final de 1mM.
72
Porém, aparentemente, não houve expressão da proteína recombinante
utilizando este protocolo. A Figura 17 traz o resultado de indução de pLysS e pLysE,
onde foram aplicados no gel SDS-PAGE o sobrenadante da indução.
Uma vez que não houve o aparecimento de uma banda mais evidente na altura
correspondente a massa molecular teórica da proteína rMEBIOSM (Figura 17), foram
modificadas três variáveis na indução como tentativa para expressar a proteína
recombinante: temperatura pós-indução; indutor e concentração do indutor IPTG,
sendo descritas por maximizar a solubilidade de proteínas recombinantes
(HATAYAMA et al., 2012; SINGHA et al., 2017; SONG et al., 2012; WINGFIELD,
2005).
Figura 17. Análise por SDS-PAGE 12% da cinética de indução das cepas pLysS e pLysE. M- marcador de massa molecular. MW - massa molecular. 0, 0.5, 1.5 e 2.5 correspondem ao tempo de indução em horas das amostras coletadas. Da esquerda para a direita estão as amostras de indução de pLysS, logo em seguida está o marcador, e nas últimas canaletas estão as amostras de indução de pLysE (neste gel foram aplicados somente o sobrenadante das amostras). Nota-se que não houve expressão da proteína rMEBIOSM, que tem massa molecular de aproximadamente 30kDa.
A expressão de proteínas heterólogas em E. coli apresenta limitações, como,
agregação e mal dobramento da proteína recombinante, resultando em depósito de
corpos de inclusão biologicamente inativos no citoplasma. Estes corpos de inclusão
são formados, geralmente, como resultado da inabilidade da proteína se dobrar
73
rapidamente, levando ao acúmulo de intermediários ou pela falta de interação da
proteína com moduladores apropriados (SINGHA et al., 2017).
Sendo assim, diminuir as taxas de produção da proteína recombinante pode
beneficiar a sua solubilidade, pois ela terá mais tempo para se dobrar devidamente
(ROSANO; CECCARELLI, 2014). O método mais utilizado para diminuir a síntese de
proteína é reduzir a temperatura de indução (ROSANO; CECCARELLI, 2014;
SCHEIN; NOTEBORN, 1988; VASINA; BANEYX, 1997; VERA et al., 2007). Dessa
forma, uma temperatura mais baixa irá diminuir a agregação proteica, que é
favorecida a altas temperaturas, uma vez que as interações hidrofóbicas são
dependentes da temperatura (BALDWIN, 1986; MAKHATADZE; PRIVALOV, 1995;
ROSANO; CECCARELLI, 2014; SCHELLMAN, 1997). Corroborando com estes
dados, estudos realizados por Voulgaridou e colaboradores (2013), demonstraram
que a solubilidade da proteína ALDH3A1 aumentou de 2.5% para 35.5%, quando a
temperatura foi reduzida de 37°C para 25°C.
Além disso, o efeito de indutores na formação de corpos de inclusão acontece
mais comumente em sistemas com promotores fortes (KAUR; KUMAR; KAUR, 2018).
Baixos níveis de indutor podem resultar em uma indução ineficiente, porém, a
concentração de indutor em excesso pode levar a efeitos tóxicos, como diminuição do
crescimento das células e, também, redução da produção da proteína recombinante.
Estudos realizados por Mühlmann e colaboradores (2017), otimizaram a concentração
de IPTG para a indução da proteína recombinante do estudo. Os melhores resultados
obtidos foram com a concentração de IPTG entre 0.05 a 0.1mM, sendo que estes
valores se encontram longe da concentração recomendada de 1mM. Em alternativa,
a lactose pode ser utilizada como indutor, diminuindo os custos da expressão e a
toxicidade causada pelo IPTG, sendo capaz de induzir a expressão com a mesma
eficiência do IPTG (NEUBAUER et al., 1992).
Diante do exposto, o segundo protocolo de indução testado teve como
mudança a temperatura pós-indução, sendo diminuída para 25ºC, e a concentração
do indutor, utilizando IPTG na concentração final de 0,3mM. O terceiro protocolo
testado teve como mudança o indutor utilizado, sendo a lactose usada para induzir a
expressão da proteína, com temperatura pós-indução de 37ºC e em uma
concentração final de 1mM. Porém, mesmo modificando estas variáveis na indução,
aparentemente não houve expressão da proteína rMEBIOSM.
74
Como alternativa de expressão, foram utilizadas as cepas C41 (DE3) e Arctic
Express (DE3). Em ambos os protocolos de indução, a concentração final de IPTG foi
de 1mM. Porém, para a cepa C41, utilizou-se a temperatura pós-indução de 37°C e,
para a cepa Arctic Express, temperatura pós indução de 12ºC. Segundo instruções
do fabricante, Agilent Technologies, a expressão utilizando Arctic Express (DE3) deve
ser realizada entre 10ºC a 13ºC, corroborando com a expressão de proteínas
recombinantes nessa faixa de temperatura, por alguns autores (HARTINGER et al.,
2010; MUDAPAKA; TAYLOR, 2015; POROWIŃSKA; CZARNECKA; KOMOSZYŃSKI,
2014; SHAH; WALLING, 2017). Por não se saber o motivo da proteína recombinante
não estar sendo expressa, as cepas C41 e Arctic Express foram escolhidas por suas
capacidades, respectivamente, de expressar proteínas tóxicas e de difícil expressão
e por aumentar a solubilidade da proteína recombinante, sendo estes problemas
comuns encontrados na expressão de proteínas heterólogas. No entanto, estas cepas
também não foram capazes de expressarem a proteína recombinante rMEBIOSM.
Na eletroforese em gel de SDS-PAGE, a fração solúvel (sobrenadante) e
insolúvel (pellet), resultante da indução de todas as cepas, foram verificadas para se
certificar que a proteína não estava presente em forma de corpos de inclusão.
Entretanto, não foi possível visualizar a banda proteica correspondente à massa
molecular teórica da rMEBIOSM no gel SDS-PAGE, independente do protocolo de
indução realizado, podendo-se sugerir que nenhuma das cepas foi capaz de
expressar a proteína recombinante, sendo confirmado posteriormente pela purificação
e Dot-Blot. A Figura 18 traz o resultado de indução de pLysS e pLysE, onde foram
aplicados no gel SDS-PAGE o sobrenadante e o pellet resultante da indução.
Alguns fatores têm impacto na expressão de proteínas recombinantes,
resultando em uma expressão de baixo nível ou nenhuma expressão, como: códon
do gene, estabilidade do RNA mensageiro (mRNA), degradação (SINGHA et al.,
2017), toxicidade e insolubilidade da proteína recombinante (ROSANO;
CECCARELLI, 2014).
O código genético do mRNA é redundante, com 61 códons sendo traduzidos
em 20 aminoácidos diferentes, sendo que cada aminoácido pode ser codificado por
até 6 códons diferentes. Porém, alguns códons são usados com mais frequência do
que outros, sendo este fenômeno chamado de codon usage bias (BRANDIS;
HUGHES, 2016). Portanto, cada organismo tem uma tendência para códons
preferenciais e isto reflete na eficiência com que moléculas de RNA transportador
75
(tRNA) são capazes de reconhecer códons diferentes (GOMES et al., 2016). Dito
isso, se o gene clonado contém códons incomuns ao do hospedeiro, no momento da
síntese, ocorre a depleção de tRNA de baixa abundância. Isto pode acarretar em uma
má incorporação de aminoácidos, afetando os níveis da expressão da proteína
recombinante e sua atividade (GUSTAFSSON; GOVINDARAJAN; MINSHULL, 2004;
ROSANO; CECCARELLI, 2014). Porém, a empresa Epoch Biolabs, responsável pela
síntese do gene e clonagem no plasmídeo pET21a, otimiza a sequência de
nucleotídeos para a expressão em E. coli, o qual também foi conferido pelo programa
da GenScript (https://www.genscript.com/tools/rare-codon-analysis), podendo
descartar que este seja o problema da expressão da proteína recombinante.
Figura 18. Análise por SDS-PAGE 12% da cinética de indução das cepas pLysS e pLysE do sobrenandante e pellet. M- marcador de massa molecular. MW - massa molecular. 0.0P e 2.5P correspondem ao pellet do tempo de 0h e 2.5h, respectivamente. 0.0S e 2.5S correspondem ao sobrenadante do tempo de 0h e 2.5, respectivamente. Da esquerda para a direita estão as amostras de indução de pLysS, logo em seguida está o marcador, e nas últimas canaletas estão as amostras de indução de pLysE. Nota-se que não houve expressão da proteína rMEBIOSM, que tem massa molecular de aproximadamente 30kDa.
76
Para verificar se a proteína recombinante estava sendo tóxica para a célula
hospedeira ou se ela estava sendo produzida em forma de corpos de inclusão,
diferentes cepas e protocolos de expressão foram testados. Na expressão em E. coli,
o vazamento da expressão é um grande problema encontrado (KAUR; KUMAR;
KAUR, 2018), causada por um pequeno vazamento da produção da T7 RNA
polimerase, levando a produção da proteína recombinante sem a presença do indutor.
Sendo assim, se a proteína for tóxica ao hospedeiro, este vazamento pode inibir o
crescimento celular e reduzir o rendimento total da proteína (GUAN et al., 2013;
SINGHA et al., 2017). Entretanto, as cepas pLysS e pLysE podem evitar a toxicidade
causada pela produção da proteína antes da indução, devido a produção da lisozima
T7 (ROSANO; CECCARELLI, 2014). Estas cepas, juntamente com a C41 (DE3), não
foram capazes de expressar a proteína recombinante, descartando a possibilidade da
toxicidade da proteína. Além disso, a insolubilidade da proteína também foi
descartada, uma vez que foram testados diferentes protocolos com cepas diferentes,
descritos por aumentar a solubilidade da proteína recombinante.
Em E. coli, a meia-vida do mRNA varia de alguns segundos até 20 minutos
(SINGHA et al., 2017), tempo muito mais curto do que em eucariotos, podendo
representar um passo restringente na tradução e expressão de proteínas
recombinantes (MAKINO; SKRETAS; GEORGIOU, 2011). Deste modo, alguns fatores
estão envolvidos na degradação do transcrito, como, exonucleases, endonucleases,
estrutura secundária e sítio de ligação para o ribossomo (SCHUMANN; FERREIRA,
2004). Os mRNAs são degradados principalmente pela enzima exonuclease 3’→ 5’
e endonuclease RNase E (SINGHA et al., 2017), impossibilitando a tradução da
proteína. Ainda, a sequência denominada Shine-Dalgardo foi descoberta na
extremidade 5’ do mRNA de bacteriófago, a qual interage com a extremidade
complementar 3’ do ribossomo 16S durante a iniciação da tradução (SCHUMANN;
FERREIRA, 2004; SHINE; DALGARNO, 1974). Esta sequência aumenta de 3 a 6
vezes a produção de proteínas (RINGQUIST et al., 1992; SCHUMANN; FERREIRA,
2004). Além disso, o espaçamento entre a sequência e o códon de iniciação também
influencia na eficácia da tradução, podendo variar de 5 a 13 aminoácidos (GOLD,
1988; SCHUMANN; FERREIRA, 2004), com espaçamento mínimo requerido de 3 a 4
aminoácidos (SINGHA et al., 2017). Logo, a presença de estrutura secundária do
mRNA na extremidade 5’, sequestrando a sequência Shine-Dalgarno, reduz
significativamente a tradução do transcrito (SCHUMANN; FERREIRA, 2004). Sendo
77
assim, a afinidade desta sequência com o ribossomo é um fator crítico, influenciando
a eficácia da expressão de proteínas (JOSEPH; PICHAIMUTHU; SRIMEENAKSHI,
2015; KOMAROVA et al., 2005; VIMBERG et al., 2007). Dito isso, estes podem ser
possíveis fatores pelo qual a proteína rMEBIOSM não foi expressa, visto que as cepas
utilizadas não são mutantes que não produzem endonucleases e exonucleases, que
poderia causar a degradação do mRNA. Além disso, a sequência Shine-Dalgarno não
foi inserida no gene para a proteína rMEBIOSM, podendo ser fator limitante para a
tradução do mRNA, visto a sua importância para este processo.
Um outro grande problema encontrado na produção de proteínas
recombinantes em E. coli é a degradação proteica, afetando a qualidade e quantidade
da produção de proteína (SINGHA et al., 2017). A instabilidade da proteína dentro do
hospedeiro procarionte é uma limitação na produção de proteínas de eucariotos
(FAKRUDDIN et al., 2013). Sendo assim, a proteína pode ser degradada por
proteases antes da detecção da expressão por testes (DUONG-LY; GABELLI, 2014).
Vários aspectos podem afetar a instabilidade da proteína, como, a sequência de
aminoácidos, a construção da proteína, a célula hospedeira, condições de expressão
e purificação (JOSEPH; PICHAIMUTHU; SRIMEENAKSHI, 2015).
A adição de inibidores de proteases no meio, como leupeptina e aprotinina,
podem ajudar a prevenir a degradação da proteína recombinante (DUONG-LY;
GABELLI, 2014). Além disso, muitas proteínas recombinantes são expressas com
tags ou sequências fusionadas para prevenir a degradação proteolítica e aumentar a
estabilidade. Ainda, a estabilidade da proteína recombinante pode ser melhorada e
aumentada com a adição de meios customizados para a produção, contendo traços
de metais, vitaminas e minerais, podendo servir como cofatores, grupos prostéticos
ou ligantes para proteína recombinante (JOSEPH; PICHAIMUTHU; SRIMEENAKSHI,
2015). Também, a secreção da proteína recombinante para o meio periplasmático
permite maior nível de expressão do que a secreção para o citoplasma, onde a
proteína pode ser degradada por proteases (FAKRUDDIN et al., 2013; HOFFMAN;
WRIGHT, 1985).
A susceptibilidade da proteína por proteases pode ser aumentada pela
presença de certos aminoácidos no N e C-terminal da proteína recombinante
(FAKRUDDIN et al., 2013). A presença de aminoácidos no N-terminal como arginina,
lisina, leucina, fenilananina, triptofano ou tirosina diminuem a meia-vida da proteína.
Estudos realizados por Tobias e colaboradores (1991), demonstraram que, proteínas
78
contendo estes aminoácidos no N-terminal tiveram meia-vida de 2 minutos, em
comparação a proteínas contendo outros aminoácidos, que têm meia-vida de mais de
10 horas. Além disso, O C-terminal de proteínas contendo aminoácidos não-polares
podem levar a rápida degradação, em contraste com proteínas contendo aminoácidos
polares ou com carga, que não são degradados (FAKRUDDIN et al., 2013;
GOTTESMAN; WICKNER; MAURIZI, 1997). O N-terminal da sequência da proteína
rMEBIOSM contém arginina, leucina, fenilananina e tirosina e o C-terminal é composto
praticamente por aminoácidos não-polares, podendo contribuir grandemente para a
instabilidade e degradação da proteína recombinante. Mesmo após várias tentativas
de expressar a proteína, o motivo da não expressão ou detecção permanece
desconhecido. Dessa forma, uma possível explicação seria a instabilidade da
rMEBIOSM, a qual pode estar sofrendo degradação por proteases, sendo tal processo
fortemente influenciado pela composição de aminoácidos no N e C-terminal,
justificando a não detecção da proteína rMEBIOSM pelos testes realizados.
5.5 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA rMEBIOSM E DOT-BLOT
Em expressão de proteínas recombinante, algumas podem estar mascaradas por
proteínas de peso molecular aproximado do hospedeiro no gel SDS-PAGE
(BIOSCIENCES, 2001) e neste caso, técnicas mais sensíveis são necessárias para
detectar a proteína recombinante. Objetivando confirmar se realmente a proteína
rMEBIOSM não foi expressa, foram realizados testes de purificação e Dot-Blot.
A purificação por meio de cromatografia de afinidade é um método eficiente que
utiliza tags com afinidade peptídica, as quais são fusionadas à proteína de interesse,
permitindo a sua purificação (BORNHORST; FALKE, 2000; JARVIK; TELMER, 1998;
NILSSON et al., 1997), sendo empregado para purificar proteínas recombinante
contendo tags de afinidade. Este método baseia-se na interação entre íon de metal
de transição (como o níquel) imobilizado em uma matriz e cadeias laterais de
aminoácidos específicos. Assim, a histidina é o aminoácido que tem a interação mais
forte com matrizes de íon metálicos imobilizados, logo, peptídeos contendo sequência
de resíduos consecutivos deste são retidos eficientemente na matriz, podendo ser
facilmente eluídos com imidazol (BORNHORST; FALKE, 2000; PORATH, 1992).
79
Portanto, realizou-se a purificação das amostras de indução da expressão, para
verificar a presença da proteína recombinante. Durante o processo, foram utilizadas
diferentes concentrações de imidazol, para avaliar qual concentração seria capaz de
eluir melhor a proteína. Somente as amostras de indução de pLysS e pLysE foram
purificadas, visto que as cepas C41 e Arctic Express obtiveram o mesmo resultado
em gel SDS-PAGE da indução, ou seja, não apresentaram expressão da proteína. As
amostras de pLysE e pLysS foram unidas e purificadas juntas.
O processo da purificação foi verificado por gel de eletroforese SDS-PAGE
12%. Para a análise em gel SDS-PAGE, não foram aplicadas todas as amostras
derivadas da purificação, sendo aplicadas aquelas que eram mais relevantes para
avaliar o resultado. A Figura 19 apresenta o resultado da purificação cujo as amostras
foram centrifugadas a 17000xg/15min/4ºC, não sendo possível visualizar a banda
correspondente à massa molecular da proteína rMEBIOSM em nenhum dos
protocolos de purificação realizados.
Figura 19. Análise por SDS-PAGE 12% da purificação da cepa pLysS. M- marcador de massa molecular. MW- massa molecular. FT- flow-through; L1- lavagem 1; L2- lavagem 2; E1 e E2- eluições 1 e 2 com 50mM de imidazol; E3 e E4- eluições 3 e 4 com 100mM de imidazol; E5 e E6- eluições 5 e 6 com 200mM de imidazol; E7 e E8- eluições 7 e 8 com 500mM de imidazol. Nota-se a ausência da banda de peso molecular aproximado à da proteína rMEBIOSM (30kDa).
80
O Dot-Blot é uma técnica bastante similar a técnica Werstern-Blot que permite
a detecção de proteínas (FALCONAR; ROMERO-VIVAS, 2013; GROEN et al., 2000;
IGLESIAS-FIGUEROA et al., 2016; WANG et al., 2008; ZHU et al., 2010), podendo
ser utilizado como alternativa ao ELISA, se mostrando uma técnica imunológica útil
que pode ser usada rotineiramente (GUILLEMIN et al., 2009).
Esta técnica foi utilizada como teste final para confirmação da não expressão
da proteína da rMEBIOSM. As alíquotas das amostras purificadas (lavagens e
eluições), resultantes da junção das amostras de pLysS e pLysE, foram utilizadas para
realizar o teste. Quando há a presença da proteína recombinante com cauda de
histidina na amostra, há reação de cor marrom ao adicionar o anticorpo anti-His
conjugado com HRP nos pontos da membrana onde a amostra foi aplicada. A Figura
20 representa o resultado do teste, onde não houve reação de cor entre a amostra e
o anticorpo anti-His.
Figura 20. Teste Dot-Blot. Pode-se concluir, pela ausência de cor na membrana Difluoreto de Polivinilideno utilizada, que não houve expressão da proteína recombinante rMEBIOSM.
A princípio, a seleção de hospedeiro para expressão baseava-se na
capacidade de realização da transcrição do gene, sendo garantia que o produto seria
expresso. Hoje, sabe-se que a compatibilidade do ambiente bioquímico do
hospedeiro, juntamente à sua capacidade de processar e traduzir a transcrição do
RNA, além da capacidade de modificar e sustentar a proteína no seu estado intacto e
funcional, são tão importantes quanto a capacidade de transcrição do gene (GREENE,
2004).
A E. coli foi o hospedeiro escolhido para a expressão da proteína recombinante
rMEBIOSM devido às suas vantagens para esta tecnologia, já descritas acima. Porém,
depois de vários testes realizados, conclui-se que este não é o hospedeiro adequado
81
para a expressão da proteína em questão, uma vez que não foi possível detectar a
presença proteína recombinante, mesmo após a utilização de diferentes protocolos e
diferentes cepas. Para tentar contornar o problema da expressão, células eucarióticas
podem ser utilizadas como sistemas de expressão alternativos ao sistema procarioto,
compreendendo sistemas de células de mamíferos, insetos, fungos e leveduras
(GOMES et al., 2016).
82
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A partir de proteínas transmembranas hipotéticas do parasito, foi possível
identificar e selecionar, por meio de análises in silico, epítopos antigênicos, que
apresentaram afinidade de ligação por moléculas de HLA de classe II e de BCR.
Realizou-se o desenho racional de uma proteína multiepitopo recombinante a
partir dos epítopos selecionados, para avaliação da capacidade de reconhecimento
por anticorpos contra o Schistosoma mansoni em ensaios sorológicos, in vitro.
A expressão da proteína multiepitopo recombinante não foi alcançada, não
sendo possível a sua detecção pelos testes realizados.
Mais testes são necessários para avaliar a capacidade antigênica da proteína
multiepitopo recombinante.
83
7 PERSPECTIVAS
Avaliar a capacidade de reconhecimento por anticorpos presentes no soro de
indivíduos infectados dos dois melhores epítopos selecionados, segundo a predição
de antigenicidade, os quais serão obtidos por síntese química.
Expressar a proteína multiepitopo em hospedeiro diferente, para posterior
purificação e avaliação do reconhecimento do soro de indivíduos infectados frente à
proteína, por anticorpos presentes no soro de indivíduos infectados.
84
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106
APÊNDICE
MEIO DE CULTURA E SOLUÇÕES
MEIO LB LÍQUIDO
Peptona de caseína 1,0 % (p/v)
Extrato de levedura 0,5 % (p/v)
NaCl 1,0 % (p/v)
O pH foi ajustado para 7,2.
MEIO LB SÓLIDO
Peptona de caseína 1,0 % (p/v)
Extrato de levedura 0,5 % (p/v)
NaCl 1,0 % (p/v)
Ágar 1,5 % (p/v)
O pH foi ajustado para 7,2.
SDS-PAGE
Tampão de corrida 5X Tris-Glicina pH 8.7
Tris base - 15,14 g
Glicina - 72,0 g
SDS - 5.0 g
Tampão de amostra SDS PAGE com β-mercaptoetanol
Tris-HCl - 50mM pH 6, 8
SDS - 2%
Azul de bromofenol - 0, 1%
Glicerol - 10%
β-mercaptoetanol - 10%
107
Gel de Concentração SDS-PAGE (5%)
H2O
Solução Bis-acrilamida - 30%
Tris-HCl - 1,0M pH 6, 8
SDS -10%
APS (Persulfato de amônio, do inglês: Ammonium persulfate) - 10%
TEMED (tetrametilelenodiamônio)
Gel de separação SDS-PAGE (12%)
H2O
Solução Bis-acrilamida - 30%
Tris-HCl - 1, 5 M pH 8, 8
SDS - 10%
APS - 10%
TEMED
Solução corante SDS-PAGE
Coomassie Blue R-250 - 0,25% (P/V)
Metanol - 40% (v/v)
Ácido Acético - 10% (v/v)
Solução Descorante SDS - PAGE
Metanol - 40% (v/v)
Ácido acético - 10% (v/v)
Purificação da proteína rMEBIOSM
Tampão de lise pH 8,0
NaH2PO4 1M - 50 mM
NaCl 5M - 300 mM
Imidazol 2M -10 mM
Ureia 8M - 9,6 g
108
Tampão de lavagem pH 8,0
NaH2PO4 1M - 50 mM
NaCl 5M - 300 mM
Imidazol 2M - 20 mM
Uréia 8M - 9,6g
Tampão de eluição pH 8,0
NaH2PO4 1M - 50 mM
NaCl 5M - 300 mM
Imidazol 2M – 50 mM (0,5mL); 100 mM (1 mL); 200 mM (2mL); 500 mM (5mL)
Uréia 8M - 9,6g
Dot-Blot
Tris-NaCl pH 7, 6
Tris - 50 mM
NaCl - 150 mM
Tampão PBST 1X
Tampão PBS 1 X
Tween-20 - 0,05% (v/v)
Tampão PBS-T-BSA
Tampão PBS 1 X
Tween- 20 - 0,05% (v/v)
Albumina 5%
Anticorpo monoclonal anti poli-histidina conjugado com peroxidase de rabanete (anti-
His-HRP, Sigma) na diluição de 1:1000 em solução de PBS-T-BSA
109
ANEXO
PRODUÇÃO CIENTÍFICA DURANTE O MESTRADO
110
111
112
113
114