1
INDICE
INDICE………………..…………………………………………………………04
RESUMEN……………………………...………………………………………08
ABSTRACT…………………………….……………………………………….09
INTRODUCCION………………………………………………………………10
ANTECEDENTES……………………………………………………………...13
MATERIALES Y METODOS………………………………………………….22
I. Obtención de la Muestra Microalgal y su
Aislamiento…..………………………………………………....22
1. Origen de la cepa…………………..………………………22
2. Clasificación taxonómica………………………………….22
3. Técnicas de colección algal……………….………………22
4. Manipulación de la muestra en laboratorio………..…….23
4.1 Tratamiento del agua de mar…………………………23
4.2 Limpieza y esterilización de material…..……………24
4.3 Medio de cultivo……………………….……………….25
4.4 Adaptación de la especie……………………..………25
5. Aislamiento…………………………………………………..26
2
5.1 Conteo………………………………………...………..26
5.2 Técnica de dilución ……………………………..…….26
5.3 Técnica de lavado de células…………….………….27
II. Flujo de Cultivo……………………………..…..………………28
1. Cultivo inicial……………………………….……………….29
2. Cultivo intermedio………………………………………..29
3. Cultivo masivo…………………………………………….30
III. Instalación de Acuarios....………………….…..……………..30
1. Lugar de ejecución……………………..………………….31
2. Limpieza…………………………………………………….31
3. Especie elegida Cheiodactylus variegatus…………….. 31
4. Instalación…………………………………………………..31
5. Acondicionamiento y adaptación de Cheiodactylus
variegatus…………………………...………………………32
5.1 Acondicionamiento…………………………………….32
5.2 Adaptación………………………………..…………….33
IV. Realización de las Pruebas Mediante la Técnica de Agua
Verde………………………………………..……………..……34
1. Acuarios de tratamiento………………….………………..34
2. Acuario control…………………..………………………….35
3. Parámetros físico-químicos……………………………….35
3.1 Oxígeno………………….……………………………..35
3.2 pH………………………………………………………..35
3.3 Amonio y nitritos………………...……………………..36
3.4 Temperatura……………………………………………36
4. Procedimiento/Registros por día………………………….36
3
4.1 Día 1……………………………….……………………36
4.2 Del día 2 al día 4……………………..………………..37
4.3 Día 5……………………………….……………………37
V. Análisis Microbiológicos………...…………………….……….38
1. Colimetría………………………..………………………….38
1.1 Preparación del Medio de cultivo y batería de
tubos…………………………………………………...….38
1.2 Dilución de las muestras………..…………………….39
1.3 Siembra…………………………...…………………….39
2. Conteo de colonias………………….……………………..40
2.1 Incubación 37ºC………………....…………………….40
2.2 Incubación 20ºC………………….……………………40
3. Aislamiento de Vibrio……………………………………..41
3.1 Primera siembra. Caldo APA…………..……………..41
3.2 Segunda siembra. Agar TCBS………………………..42
3.3 Citocromo oxidasa……………………..………………42
3.4 Aislamiento. Agar TSA…………………………..…….43
4. Pruebas bioquímicas………………………………………43
VI. Mediciones Morfométricas…………………………………….44
VII. Estadística…………………………...…………………..……..44
RESULTADOS………………………………………………..………………..46
1. Adaptación y aislamiento………………………………….46
2. Flujo de cultivo……………………………………….……..47
2.1 Cultivo inicial……………………………………………47
2.2 Cultivo intermedio………………………………….…..47
4
2.3 Cultivo masivo………………………………………….47
3. Factores físico-químicos…………………………………..47
3.1 Oxígeno………………………….……………………..47
3.2 pH…………………………………………….………….48
3.3 Amonio……………………………………………….....48
3.4 Nitrito………………………………………………..…..49
3.5 Temperatura………………………………………..…..49
4. Análisis microbiológicos………………………...…………49
4.1 Colimetría ………………………………………………49
4.2 Conteo de colonias……………………………..……..50
4.3 Identificación de Vibrio………………………………..50
4.4 Crecimiento y sobrevivencia………………………....51
DISCUSION…………………………………………………………………….53 CONCLUSIONES……………………………………………...………………60 REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA…..…………………………………………61 ANEXOS………………………………………………………………………..67
5
RESUMEN
Las microalgas han sido descritas como microorganismos con
capacidad purificadora y en algunos casos actividad antimicrobiana. El
género Tetraselmis es conocido por poseer dicha actividad, la cual se
puso a prueba en este trabajo mediante la técnica de agua verde, que
consiste en agregar cultivos microalgales a elevadas densidades
celulares en cultivos de diferentes organismos acuáticos, en este caso
fueron juveniles de Cheilodactylus variegatus “pintadilla”, y la especie
microalgal fue Tetraselmis contracta. El experimento contó con cuatro
acuarios de diez individuos cada uno, donde tres acuarios fueron réplicas
del tratamiento con microalgas y uno sirvió de control sin microalgas. Se
realizaron siete pruebas consecutivas en las cuales se midieron los
parámetros físico-químicos (oxígeno, pH, amonio, nitritos, temperatura) en
todas de ellas, y análisis microbiológicos en las últimas cuatro. Los
resultados mostraron poco aumento de los niveles de amonio de los
tratamientos con diferencia significativa (p<0.001) en relación al control, y
la carga bacteriana se vio reducida en mas del 50% para los valores del
tratamiento, lo cual demuestra la capacidad de esta especie microalgal de
actuar como biocontrolador de la calidad de agua en acuicultura.
6
ABSTRACT
Microalgae have been described as microorganism with purifying
and sometimes antimicrobial activity. Genus Tetraselmis is well known for
possessing such activity against bacteria, which was proved in this work
using the green water technique, this consists in adding microalgae
cultures at high cell densities on other culturing aquatic organisms, that in
this case were Cheilodactylus variegatus juveniles “pintadilla”, and the
microalgae specie was Tetraselmis contracta. The experiment had four
tanks containing ten fishes each; three of these tanks were repeated
treatments using microalgae and one were used as control without
microalgae. Seven continuous assays were made measuring physical
chemical factors (oxygen, pH, ammonium, nitrite, temperature), and
microbiological analysis were made in the last four. Results showed a
slight increase in the treatment ammonium levels with a significant
difference (p<0.001) in comparison to control, and bacteria load was
reduced in more than 50% for the treatment; this proves that this
microalgae Tetraselmis contracta is able to act as a biocontroller in water
quality.
7
INTRODUCCIÓN
Las microalgas, constituyen un grupo fotosintético heterogéneo de
distribución cosmopolita, caracterizados por habitar ambientes tanto
acuáticos como terrestres, incluyen ambientes de condiciones extremas, y
de naturaleza salobre, marina o dulceacuícola. Pueden ser procariotas
como las cianobacterias (algas verdes azules) o eucariotas (como la gran
mayoría), y su morfología varía desde organismos unicelulares con o sin
flagelo hasta las formas coloniales o filamentosas, capaces de formar a
partir de elementos simples, sustancias orgánicas complejas.
El género Tetraselmis contiene aproximadamente más de 50
especies, y sus características pueden variar según su hábitat. En su
ambiente natural pueden encontrárseles en forma solitaria de nado libre,
coloniales, aflageladas y sésiles. También pueden presentarse es estadío
de quiste, según sean las condiciones medioambientales, éstos son
esféricos y presentan una pared celular bastante gruesa de naturaleza
orgánica, que en algunos casos puede presentar ornamentaciones.
El cultivo de microalgas tuvo gran importancia para acuicultores,
biotecnólogos, ecólogos, etc. por años y durante la década de los
noventa, produciéndose cultivos en forma masiva con la finalidad de
utilizar el producto como suplemento en la dieta alimenticia para animales
(larvas de crustáceos, moluscos, peces), como fertilizantes de tierras de
cultivo o materia prima en la obtención de productos químicos (pigmentos,
lípidos, glicerol). Actualmente, la aplicabilidad de las microalgas y sus
productos ha ido en aumento, dados los avances generados por estudios
8
bioquímicos y el desarrollo de nuevos sistemas de cultivo tendientes a la
obtención de mayor producción y aprovechamiento de su biomasa, la cual
ha sido utilizada en muchos aspectos para beneficio del ser humano,
dada su riqueza en cuanto a sus constituyentes, entre los que destacan
los proteínicos y lipídicos.
El despliegue actual de la biotecnología y el desarrollo de nuevas
técnicas, se encuentra constantemente tras la búsqueda y mejoramiento
de organismos capaces de reemplazar procesos industriales sin generar
contaminación alguna. Dentro de este contexto, las microalgas, se
presentan como un grupo de organismos que, mediante un proceso
biológico, son capaces de transformar una sustancia en otra, propiedad
más conocida como biotransformación y cuyo fundamento es
precisamente la producción de ciertos compuestos mediante el empleo de
un organismo o procesos derivados a partir de éste y cuya ventaja es la
de ser menos contaminantes que los procesos químicos.
Una de las tecnologías más recientes, aplicable al cultivo de
microalgas, es la técnica del “agua verde”, empleada en cultivo de
diferentes organismos acuáticos, sobretodo en cultivos larvales, por
considerárseles la época más crítica en los cultivos acuícolas, y consiste
en la adición de cultivos microalgales de alta densidad celular a los
tanques de cultivo. Los efectos de estos microorganismos fitoplanctónicos
varían desde la estabilización de la calidad del agua en sistemas
estáticos, remoción de compuestos metabólicos, producción de oxígeno, y
control de carga bacteriana patógena. Asimismo, también se les reconoce
el efecto de estimular de manera directa el sistema inmune no específico
de la larva, debido a la presencia de polisacáridos en su pared celular;
mientras que, de manera indirecta, sirve como fuente de nutrientes a
través de las presas vivas, cuyo valor nutricional se mantiene gracias a
las microalgas, ya que por su tamaño reducido son fácilmente capturables
y digeridas por multitud de larvas y estadíos juveniles de moluscos,
crustáceos y peces.
9
El presente trabajo se basa en las propiedades anteriormente
explicadas sobre la importancia del aislamiento y cultivo microalgal,
demostrando de esta manera la capacidad de la microalga Tetraselmis
contracta como agente biocontrolador microbiano de la calidad de agua
mediante la técnica de agua verde y su rol en el campo de la acuicultura,
lo que permitiría valorar la naturaleza de esta especie nativa.
10
ANTECEDENTES
La industria acuícola viene creciendo enormemente a escala
comercial durante las dos últimas décadas y sufriendo varios cambios,
sobretodo la acuicultura de sistemas intensivos debido a su gran
relevancia. Sin embargo, los factores limitantes son principalmente la
calidad de agua, la parte económica y la disponibilidad de terreno en el
caso de sistemas extensivos. En la actualidad, adicionalmente, los
productores se ven obligados a adoptar tecnologías ambientalmente cada
vez más adecuadas, reduciendo el impacto ambiental, la descarga de
aguas y enfermedades; de esta forma, esta industria ha desarrollado
prácticas cada vez más intensivas, dentro de las cuales predominan los
sistemas de recirculación y el empleo de biofiltros que tratan de manera
interna el agua contaminada reduciendo de esta forma el recambio de
agua y la descarga (Avnimelech, 2006; Gutierrez-Wing y Malone, 2006).
Neori et al. (2007) describieron un sistema de biofiltro donde
emplean las aguas de desecho orgánico de peces como fuente de
carbono y energía para la reducción de nitratos (por procesos
microbianos), lo que resulta en una descarga casi nula y una
contaminación mínima y es capaz de ser operada por largos periodos de
tiempo manteniendo los valores dentro del rango aceptable para cultivo
intensivo. Otra alternativa es la liberación del agua con nutrientes a otro
compartimento conteniendo algas que van a asimilarlos y a su vez
suministrar materia orgánica a los peces (tilapias) que se encuentran en
ese mismo compartimento (Avnimelech, 2006). En camaroneras, se utiliza
otro método mediante el uso de un batch reactor de secuencia para tratar
las aguas de desecho, cuyo modo de operación es
aeróbico/anóxico/aeróbico logrando la nitrificación y denitrificación
11
(microorganismos Nitrosomonas, Nitrobacter, Pseudomonas) y la
remoción de carbono (Boopathy et.al., 2007).
La remoción de nutrientes, nitrógeno y fósforo, que se encuentran
en elevadas concentraciones en aguas residuales, consiste en emplear
tratamientos capaces de disminuir, a su mínima expresión, estas
concentraciones tóxicas, de modo tal, que los efluentes sean
ambientalmente inofensivos y no se alteren los ciclos bioquímicos. En
relación a ello, el uso de microalgas en tratamientos de biorremediación
de aguas residuales (de cualquier actividad humana) ha sido investigado
por décadas, quedando demostrado, por numerosos estudios, su alto
potencial y efectividad en la remoción de éstos compuestos, guardando
armonía dentro del ecosistema al no tratarse de ningún proceso químico
(Jiménez-Pérez et al. 2004; Aslan y Kapdan, 2006; Fierro et al. 2007).
Las ventajas del empleo de algas para tal propósito son; el bajo
costo operacional, la posibilidad de reciclar el nitrógeno y fósforo
asimilados en la biomasa algal como fertilizante evitando el problema de
la producción de lodo, y la descarga de efluentes oxigenados dentro de
los cuerpos de agua (Voltolina et al. 2005; Aslan y Kapdan, 2006); sin
embargo, existen también quienes opinan que la principal desventaja o
dificultad de este sistema es el elevado costo que tomaría la cosecha de
los cultivos así como la disponibilidad de un área adecuada para llevarlos
a cabo (Jiménez-Pérez et al. 2004; Fierro et al. 2007). Ante tal disyuntiva
surge el empleo de técnicas de inmovilización de microalgas en matrices
de naturaleza polimérica, que facilita la recuperación de la biomasa y
provee una mayor flexibilidad operacional (Mallick y Rai, 1993 en Fierro et
al. 2007). En tal sentido, el empleo de cuentas de alginato obtenidas de
Macrocystis pyrifera con Scenedesmus intermedius y Nannochloris sp,,
fueron mas efectivas que el empleo de cultivos de células libres
suspendidas (Jiménez-Pérez et al. 2004). Fierro et al. (2007) pusieron a
prueba la inmovilización de la microalga Scenedesmus sp con el derivado
de un biopolímero de quitina denominado quitosan, obtenido del
12
exoesqueleto de crustáceos, obteniendo resultados positivos tanto para la
inmovilización como para la remoción de nutrientes.
Estudios con ciertas macroalgas de la India han reportado gran
capacidad de remoción de amonio, como: Ulva lactuca (Chlorophyta),
Soliera robusta (Rodophyta) y Dyctiota dichotoma (Phaeophyta) (Raikar y
Wafar, 2006).
Por otro lado, las aguas residuales de origen industrial o doméstico
se ven también contaminadas por metales pesados que alteran los
ecosistemas acuáticos, constituyendo una problemática mundial por
desencadenar pérdidas en la diversidad biológica y un incremento de
compuestos tóxicos dentro de la cadena alimenticia. Diferentes técnicas
se han desarrollado para remover éstos metales tóxicos del ambiente
acuático como filtración, ósmosis inversa, precipitación química,
intercambio iónico, remoción electroquímica, entre otras. Sin embargo,
existen ciertas limitaciones al momento de ponerlas en práctica, por
ejemplo, una pobre selectividad, producción de sólidos residuales (10
veces más pesados que el propio metal), desagüe de metales iónicos
peligrosos, compuestos orgánicos que inhiban el proceso, y una baja
eficiencia para remover los metales. La biotecnología, basada en la
acción de crecimiento activo de células algales puede resolver algunas de
estas dificultades mediante la adsorción y la absorción. La biosorción de
metales pesados es una técnica relativamente nueva y es una propiedad
de cierto tipo de biomasas para enlazar y concentrar metales inclusive
estando en soluciones bastante diluídas. Este fenómeno es provocado
por la estructura de la pared celular de ciertas bacterias, hongos, y algas,
siendo estas últimas las que poseen una mayor capacidad de enlace.
Otra de las principales ventajas de la biosorción es su fácil aplicabilidad y
bajo costo (Kalyani et al. 2004; Peña-Castro et al. 2004; Alpat et al. 2007).
Kalyani et al. (2004) investigaron la adsorción de Ni (II) en el alga
parda Sargassum sp (Phaeophyta) bajo forma natural y en tratamiento
13
ácido. Los resultados mostraron una remoción del 95% para el
tratamiento natural y del 99% para el tratamiento ácido. Mientras que,
Peña-Castro et al. (2004) trabajaron con cultivos de Scenedesmus
incrassatulus sometidos a diferentes concentraciones de Cr (VI), Cd (II) y
Cu (II), individuales y en mezclas de dos o tres metales. La interacción de
Cr (VI) y Cd (II) fue positiva incrementando la remoción de ambos
metales, mas no sucedió lo mismo con el Cu (II), este metal no tuvo
ningún tipo de interacción que promueva su remoción.
Basado en las propiedades de la biosorción, Alpat et al. (2007)
desarrollaron un biosensor para mediciones voltamétricas de Cu (II)
empleando como materia prima la microalga Tetraselmis chuii. Su
excelente rendimiento representa una buena alternativa para el desarrollo
de otros biosensores.
Los pesticidas son otras sustancias tóxicas que se encuentran
también en los canales naturales de agua, como la triazina. Dentro de
este herbicida está la atrazina y la terbutrina (herbicida acuático) que
fueron sometidos a pruebas con dos microalgas de agua dulce, la
cianobacteria Synechococcus elongatus y la clorofita Chlorella vulgaris
(Gonzáles-Barreiro et al. 2006). El estudio comprobó que C. vulgaris tuvo
una capacidad de bioconcentración más alta para los dos herbicidas de
triazina que S. elongatus, especialmente con respecto a la terbutrina.
Las propiedades de las algas van mas allá de controlar índices
abióticos, como los factores físico-químicos del agua, compuestos
contaminantes de naturaleza biogeoquímica, o metales pesados; también
actúan sobre el factor biótico, debido a que presentan actividad
antimicrobiana.
La actividad antibacteriana en un organismo algal se ha reportado
desde la década del sesenta, a partir de entonces se han ailsado
14
sustancias bioactivas y farmacologicamente activas. En las microalgas,
dicha actividad se manifiesta debido a la presencia de ácidos grasos, la
producción de metabolitos intra y extracelulares y otros compuestos
bioactivos de potencial medicinal (Kellam y Walter, 1989). En las
macroalgas, esta actividad se manifiesta al someter los extractos crudos a
tratamientos con solventes. En el año 2005, trabajos realizados con
extractos de algas africanas determinó una mayor eficacia en las especies
de la división Phaeophyta (algas pardas), (Choudhury et al. 2005),
mientras que, en muestras colectadas de la costa atlántica europea, se
reportó mayor actividad antibacteriana en las algas pertenecientes a la
división Rodophyta (algas rojas) (Bansemir et al. 2005). Esta variación
puede deberse a diferentes factores, como el método de extracción, el
solvente empleado en la extracción y la temporada en la cual se
colectaron las muestras (Hornsey y Hide, 1974 en Kandhasamy, 2008)
Das et al. (2005) examinaron la producción de compuestos
bioactivos/antimicrobianos a partir de Euglenoides de agua dulce
empleando ensayos microbiológicos, y se investigaron los efectos de los
extractos orgánicos de Euglena viridis contra cepas de diferentes
patógenos de peces y bivalvos, como por ejemplo, Aeromonas hydrophila,
Pseudomonas putida, P. aeruginosa, P. fluorescens, Edwardsiella tarda,
Vibrio alginolyticus, V. anguillarum, V. harveyi, V. fluvialis, and V.
parahaemolyticus y Escherichia coli.
Kellam y Walter (1989) sometieron 132 especies de microalgas a
ensayos microbiológicos para demostrar su actividad antibacteriana,
incluyeron 9 cepas del género Tetraselmis abarcando 8 especies: T. chui,
T. marina, T. striata, T. suecica, T. impelagicus, T. hazeni, T. tetrathele y
Tetraselmis sp., quedando demostrado de esta manera la importancia de
la clase Prasinophyceae en este tipo de estudios, ya que fueron las mas
predominantes, junto a las Bacillarophyceae, en contrarrestar el
15
crecimiento bacteriano, especialmente de Staphylococcus aureus y
Bacillus subtilis.
Dicha actividad antibiótica ha sido reportada, asimismo, en
Chlorella vulgaris y diatomeas, debido a derivados metabólicos bioactivos.
En cultivos de C. vulgaris la producción de metabolitos secundarios tiene
un gran efecto sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. En las
diatomeas dicha actividad se manifiesta a partir de derivados de los
ácidos grasos. Diferentes especies de diatomeas de naturaleza
limnológca y marina han sido investigadas y reportadas como fuentes de
sustancias lipofílicas portadoras de la actividad antimicrobiana (Skulberg,
2004).
En acuicultura, gran parte de las enfermedades que afectan a
peces, bivalvos, crustáceos, y demás organismos marinos cultivables son
provocadas por bacterias patógenas, y dentro de ellas, las mas peligrosas
y dañinas son del género Vibrio, causantes de graves infecciones y
elevadas mortalidades (Pang, 2008), cuyo principal reservorio es el medio
acuático natural (Kahla-Nakbi, 2007). De este modo, bacterias como
Vibrio alginolitycus, desarrollaron estrategias de superviviencia. En el mar
bajo condiciones de estrés, principalmente en ausencia de nutrientes y
baja temperatura, la bacteria entra en un estado conocido como Viable
pero No Cultivable, lo cual significa que puede recuperarse una vez que
las condiciones óptimas se restauren, pero incluso en aquel estado
mantiene su potencial patogénico pudiendo causar infecciones en el
organismo donde se aloje (Kahla-Nakbi, 2007).
En el 2005, una mortalidad masiva atacó varios criaderos de peces
planos en Korea. Para el descubrimiento de la causa se analizaron los
individuos muertos. Todos presentaron daño en la cavidad peritoneal a
partir de los cuales se aislaron Vibrio harveyi, Edwardsiella tarda y
birnavirus marino. Posteriormente se comprobó que la mortandad se
debió a una co-infección del virus con V. harveyi o E. tarda, ya que los
16
individuos sometidos a prueba únicamente con el birnavirus marino no
presentaron mortalidad alguna (Oh, 2006). Ante la peligrosa
patogenicidad de la bacteria Vibrio harveyi y la resistencia que ha
adquirido a los antibióticos comerciales, se propone como terapia
alternativa el uso de bacteriófagos, aislados de las mismas aguas de los
cultivos larvales en cuestión, tras comprobar su efectividad en la tasa de
sobrevivencia, los cuales servirían como biocontroladores. (Vinod et al.
2006; Karunasagar et al. 2007)
Bacillus sp. fue empleado exitosamente como un probiótico en
pruebas de laboratorio logrando una sobrevivencia del 74% después de
haber enfrentado a V. harvey. Por su parte Lactobacillus casei y L.
acidophilus también han demostrado tener un comportamiento similar al
Bacillus sp. ante el mismo patógeno. (Ruangpan, 1998)
Las enfermedades bacterianas causadas por el género Vibrio en la
crianza de camarones son el principal factor limitante a nivel mundial,
principalmente los brotes de Vibrio harveyi causante de la vibriosis
luminiscente, que ha traído pérdidas catastróficas de grandes
producciones en Asia según se ha reportado. Ante esta problemática
surge una técnica relativamente nueva e innovadora, la técnica de agua
verde. Ella consiste en cultivar los individuos en aguas donde microalgas,
por ejemplo Chlorella, crecen de manera abundante y de esta manera
aprovechar su capacidad de contrarrestar el efecto de bacterias
patógenas. Algunas de las especies de microalgas que han reportado
buen rendimiento están: Tetraselmis suecica, Tetraselmis chuii, Chlorella
minutissima, Chlorella sp, Chaetoceros calcitrans, Nitzchia sp,
Leptolyngbia sp y Skeletonema costatum. (Regunathan y Wesley, 2004;
Huervana et al. 2006; Lio-Po et al. 2005; Tendencia y de la Peña, 2003;
Makridis et al. 2006).
17
Un mejor aprovechamiento del empleo de las microalgas en el
cultivo de larvas de peces marinos, se evidencia al agregarlas de manera
directa a los tanques aplicando la técnica de agua verde, o usándolas
como alimento de rotíferos. En ambos casos va a ser beneficioso debido
a la disminución del número de bacterias oportunistas y gracias a esto un
aumento en la sobrevivencia de las larvas; de forma similar actúa en el
caso de los rotíferos ya que éstos a su vez también sirven de alimento a
las larvas, por tanto una contaminación en ellos puede desencadenar
alguna enfermedad o muerte masiva de los individuos cultivados (Makridis
et al. 2006).
La técnica de agua verde es, quizás, una de las biotécnicas mas
empleadas en el control de enfermedades, demostrando resultados
promisorios, como el caso de Isochrysis galbana y su mejoramiento en la
sobreviviencia de lubina, y la incubación de la carpa con Spirulina
platensis para mejorar su sistema inmune. También están las
cianobacterias que atenúan las enfermedades bacterianas y virales al
estimular la secreción de sustancias antioxidantes, moléculas
inmunológicamente activas, y compuestos virostáticos; mientras que
Tetraselmis sp produce sustancias antibacterianas que van a proteger a
peces y camarones de los efectos perjudiciales de bacterias patógenas.
(Yeong, 2008).
El hábitat que asocia al fitoplancton con las bacterias se ha
denominado ficósfera, el cual define el área alrededor de las células
algales en donde las bacterias se ubican para alimentarse de los
productos extracelulares que éstas excretan, los cuales son en su
mayoría compuestos orgánicos con grandes proporciones de
carbohidratos y contribuyen con la cadena alimenticia microbiana. Es
importante conocer esta interacción y las relaciones interespecificas que
entre ellas pueden surgir, así como las investigaciones que demuestran
18
los fenómenos de inhibición y crecimiento en microalgas y/o bacterias.
(Riquelme et al., 2003; Sapp, 2006 )
Finalmente, la bioseguridad es y seguirá siendo parte esencial de
la producción intensiva de animales, y en este aspecto la acuicultura está
bien ubicada al mantenerse al tanto de las amezanas de enfermedades y
patógenos, así como de las metodologías de bioseguridad más eficientes
para combatir cualquier amenaza (Pruder, 2004).
19
MATERIALES Y MÉTODOS
I. Obtención de la Muestra Microalgal y su Aislamiento
1. Origen de la cepa
La muestra fue obtenida de los humedales de Puerto Viejo,
ambiente rodeado de lomas arenosas, localizado en la provincia de
Cañete, con los distritos de San Antonio y Chilca. Se encuentra entre
los 12º 33’ 14,96” - 12º 34’ 48,05”S y 76º 42’ 50,49” - 76º 41’ 53,37”O.
Dentro de las condiciones naturales en las que se encontró se
consideraron los siguientes factores: Temperatura entre 17 y 39º C, pH
de 6,5 a 10,5 y una salinidad entre 5 y 90ppm.
2. Clasificación Taxonómica
División Chlorophyta (A. Pascher, 1914)
Clase Prasinophyceae (T. Christiensen, 1962)
Orden Prasinocladales (Fritsch, 1917)
Familia Tetraselmiaceae (Stein, 1878)
Género Tetraselmis (Stein, 1878)
Especie Tetraselmis contracta (N. Carter) Butcher 1959
3. Técnicas de colección algal
20
Se emplearon las técnicas de colecta directa, tomando la muestra
con ayuda de un cucharón del mismo espejo de agua y la colecta con
red fitoplanctónica de 15µ filtrando el agua.
4. Manipulación de la muestra en laboratorio
Una vez trasladada la muestra al laboratorio se procedió a aislar
mediante diferentes técnicas para su posterior cultivo.
Cada paso que requiera llevarse a cabo se hará dentro de
condiciones estériles, tanto el material utilizado como el espacio de
trabajo.
4.1 Tratamiento del agua de mar
El agua de mar fue tratada luego de haber sido extraída de la
bahía del Callao por el sistema de bombeo y pasada por diferentes
filtros de hasta 1µ. El agua se almacenó en tanques
(envejecimiento).
Filtración al vacío:
Una vez envejecida y decantada el agua de mar tratada, se
filtra al vacío con ayuda de una bomba de vacío de 0,5 HP y un
equipo Kitasato. Los filtros utilizados son de nitrocelulosa de
0,45 y 0,22µ, pasando primero por el filtro cuyo poro es de
mayor diámetro y luego por el menor. El agua filtrada a 0,22µ
fue guardada en botellas autoclavables de borosilicato con
capacidad para 2L.
Autoclavado:
21
Para autoclavar se empleó una autoclave digital Yamato SM510
con una capacidad de 40L. Se programó el equipo para una
esterilización a 115º C por 15 minutos, evitando de esta manera
la cristalización de las sales del agua. Al finalizar (indicado por
el equipo a los 90ºC), se procedió a retirar el agua dejando
reposar al ambiente hasta que enfríe para poder utilizarla, en
caso contrario era guardada bajo refrigeración.
4.2 Limpieza y esterilización del material
El lavado del material de vidrio, sobretodo los de cultivo inicial e
intermedio como erlenmeyers de 100, 250, 500 y 1000mL, tubos de
ensayo, así como probetas, pipetas, varillas aireadoras, botellas,
beakers, etc., se realizó con Extran neutro al 5% (detergente
biodegradable de laboratorio). En casos necesarios (material muy
contaminado) se dejaba reposar por un periodo máximo de 24
horas, luego se enjuagaba con abundante agua potable para retirar
cualquier resto de detergente o residuo y finalmente con agua
destilada.
La esterilización del material se realizó en la estufa por un periodo
de 90 minutos a 130º C, después se retiraba con ayuda de guantes
protectores y una vez tibios la parte superior de los erlenmeyers,
probetas y beakers fueron cubiertos con papel aluminio y papel
kraft ; las pipetas y varillas fueron envueltas en su totalidad con
papel kraft y guardados en tubos de aluminio y los tubos de ensayo
con tapa rosca envueltos en papel krakt en paquetes de 10
unidades. Todo el material envuelto fue introducido una vez más en
la estufa por un periodo de 15 minutos para una esterilización
completa, y luego almacenados.
22
El material de plástico, como las mangueras conectoras siguió el
mismo protocolo de esterilización pero con una permanencia menor
en la estufa (sólo 30 minutos) debido a la naturaleza del material.
Al momento de su uso se limpió cada una de ellas con alcohol para
contrarrestar el punto crítico, de igual forma se procedió con las
llaves aireadoras.
4.3 Medio de cultivo
El medio de cultivo empleado fue F/2 modificado (Guillard, 1973).
(ver composición en ANEXOS)
La preparación del medio se hizo directamente en la botella de
borosilicato que contenía los 2L de agua autoclavada, a la cual se
le adicionaron tres soluciones: nitratos y fosfatos, metales traza y
vitaminas, a razón de 1mL de cada una de ellas por cada litro de
agua de mar estéril. La salinidad del medio no se modificó,
manteniéndose a 35ppm.
4.4 Adaptación de la especie
Una vez trasladadas al laboratorio las tres muestras recolectadas
se mantuvieron en una cámara de cultivo, a una temperatura que
oscilaba entre 24 y 26º C y la fuente lumínica era sólo artificial
suministrada por tubos fuorescentes de 20 Watts. Esta cámara se
encontraba dentro del Laboratorio de Microalgas, cuya temperatura
es de 18º C controlada por un sistema de aire acondicionado y la
fuente lumínica también es artificial suministrada por tubos
fluorescentes de 40 Watts.
La observación al microscopio (Leica de contraste de fases),
demostró que sólo una de las muestras contenía exclusivamente la
23
especie de interés, mientras que en las otras se encontraba junto
con Arthrospira. A pesar de eso, se procedió a sembrar una
microplaca de 6 pocillos por cada muestra madre, en la cual se
inoculó 1mL de muestra por cada pocillo conteniendo 5mL de
medio. Se trató en lo posible de retirar las células que estaban
formando columna en las muestras mediante una pipeta pasteur.
Las microplacas se mantuvieron en la cámara de cultivo designada
para este trabajo.
5. Aislamiento de la microalga
El aislamiento se realizó mediante las técnicas de dilución y lavado
celular, utilizando para ambas el mismo medio antes descrito. Este
proceso tiene como finalidad purificar la muestra obteniéndose cultivos
clonales. (Guillard, 1973; Aguilar, 1995). El trabajo de aislamiento fue
realizado bajo estrictas medidas requeridas para un ambiente estéril
bajo campana de extracción dentro de la cámara de siembra y con el
uso de guantes quirúrgicos.
5.1 Conteo
El conteo de células para conocer la densidad celular o capacidad
de carga en esta técnica y en cualquier momento que se requiera,
se realizó con una cámara de Neubauer por triplicado para obtener
un valor promedio más real. La muestra se diluyó en caso que lo
amerite para facilitar el conteo.
5.2 Técnica de dilución
24
Mediante esta técnica, la toma de inóculos cada vez más diluídos
en número de células algales va a permitir una purificación a través
de su crecimiento.
Para ello se emplearon 10 microplacas de 6 pocillos cada una
dentro de los cuales se vertieron 6mL de medio. El inóculo inicial
fue de 0,25mL del cultivo madre, tomado con ayuda de una pipeta
volumétrica de 1mL y vertido para los 10 casos en el pocillo
numero uno; es a partir de éste que se diluirá 5 veces más dentro
de los pocillos restantes, tomando la misma cantidad (0,25mL) para
ir inoculando consecutivamente. Al llegar al sexto pocillo se toma
0,25mL de la muestra inoculada y se desecha para obtener
volúmenes uniformes.
Las microplacas son rotuladas y selladas con parafilm para evitar
cualquier agente contaminante, para luego ser incubadas en la
cámara de cultivo.
5.3 Técnica de lavado de células
Mediante esta técnica la utilización de micropipetas y su acción de
capilarización permite capturar células algales individuales. A
diferencia de la técnica anterior, ésta se trabaja bajo observación
microscópica. Se coloca una gota de la muestra elegida en el
primer pocillo de una lámina excavada y tras su observación al
microscopio se trata de capturar el menor número de células en la
micropipeta para vertirlas en otras gotas de medio colocadas en los
pocillos contiguos. El continuo traslado de las células de gota en
gota a través de la micropipeta es lo que va a permitir su lavado.
Este proceso se repite indefinidas veces hasta obtener una sola
célula por gota de medio, la cual será vertida a manera de inóculo
en un tubo de ensayo de tapa rosca conteniendo 10mL de medio f2
25
fresco y estéril. Los tubos se flamearon al mechero antes de
taparlos para disminuir el riesgo de contaminación (Guillard, 1973;
Aguilar, 1995; Lee et al. 2004).
Para este caso, la técnica se repitió muchas veces hasta obtener
10 tubos inoculados con una sola célula, los cuales posteriormente,
se llevaron a incubar a la cámara de cultivo a una temperatura de
23±1°C y un fotoperiodo de 14:10 L:O, con una iluminación de
3500 Lux, siendo observados diariamente.
II. Flujo de Cultivo
Una vez obtenida la cepa se procedió a levantar el cultivo microalgal
según el flujo programado, que en este caso empezó con un cultivo inicial
de 250 y 500mL, seguido de un cultivo intermedio de 1000mL, hasta
finalizar en cultivo masivo de 10L.
Para los cultivos inicial e intermedio, el medio de cultivo empleado fue
el F2 Guillard modificado y el sembrado se realizó en la cámara de
siembra bajo campana extractora, tomando las medidas necesarias de
bioseguridad; asimismo, se mantuvo en ambos el mismo protocolo de
esterilización de agua de mar y del material de vidrio, para asegurar de
esta manera un crecimiento exitoso, optimizando el tiempo y la calidad del
cultivo.
En el caso del cultivo masivo, debido a que se trata de volúmenes
mayores, no es del todo necesario que se mantenga el mismo cuidado
que se mantuvo anteriormente; sobretodo con respecto al tratamiento del
agua de mar, la cual no fue filtrada hasta las 0,22µ ni autoclavada, sólo
fue necesario hacerla envejecer un par de semanas mas de lo establecido
26
para obtener una buena base al momento de su transformación en medio
de cultivo, que para este nivel se vio enriquecido por el fertilizante
industrial orgánico Bayfolan ®. Si bien a mayores volúmenes el grado de
esterilidad no es tan extremo, se guardó el mayor grado de limpieza e
higiene posible.
1. Cultivo Inicial
El cultivo inicial partió de cepa con un volumen de 250mL, cuyo
inóculo fueron los 10mL contenidos en el tubo de ensayo y llegó a una
concentración máxima de 104 cel.mL-1 al séptimo día. Para ello se
prepararon 2 erlenmeyers de 250mL como cultivo inicial.
A este nivel no hizo falta aireación porque todavía no se busca
alcanzar una densidad celular muy alta, basta con moverlo
periódicamente para homogenizar el cultivo. Su incubación aún se
mantuvo dentro de la cámara de cultivo. Los 250mL sirvieron de
inóculo para dos nuevos cultivos de 500mL respectivamente.
En este nuevo nivel se contaron con 2 erlenmeyers de 500mL de
cultivo, los cuales si tuvieron aireación, obteniendo su mayor
concentración en el menor tiempo posible para el inóculo de
numerosos cultivos con volúmenes cada vez mayores.
Una vez alcanzados los 500mL no se incubaron dentro de la
cámara, sino que pasaron a la sala de microalgas donde la
temperatura es de 23º C ±1 controlada por un sistema de aire
acondicionado y tiene una intensidad lumínica de 2000 Lux.
2. Cultivo Intermedio
27
El cultivo intermedio constó de una batería de 10 cultivos de
1000mL cada uno, cuyos inóculos fueron distribuidos de igual manera
y proporcionados sólo por 2 cultivos de 500mL, por ello la necesidad
de sincronizar el tiempo de crecimiento con la capacidad de carga y
calidad del cultivo.
Este nivel se mantuvo con aireación continua dentro de la sala de
microalgas bajo las mismas condiciones antes mencionadas;
esperándose lograr una densidad celular mínima de 107 cel.mL-1 en 4
días ya que constituiría la base del cultivo masivo, que es el objeto de
estudio. (Fig. 1)
3. Cultivo Masivo
El cultivo masivo constó de una batería de 4 balones de 10L y 2
erlenmeyers de 5L, donde los inóculos fueron de 2 y 1L de cultivo
intermedio respectivamente. Como se dijo anteriormente, el agua de
mar no es filtrada al vacío ni autoclavada, pero para disminuir
cualquier riesgo se vierte pasando por una malla nytal de 20µ, y
posteriormente se fertiliza con Bayfolan ® a razón de 1mL por cada 5L
de agua de mar. (Fig. 2)
Los cultivos permanecieron dentro de la sala de microalgas con
abundante aireación bajo las mismas condiciones que estuvieron
desde los 1000mL.
III. Instalación de Acuarios de Pruebas
28
Para la realización de las pruebas correspondientes, se prepararon
4 acuarios rectangulares, de los cuales 3 serían las pruebas de los
tratamientos y 1 el control; estaban hechos de acrílico de
policarbonato de ¼” de espesor y una capacidad de 120L.
1. Lugar de ejecución
Se colocaron en las instalaciones del Laboratorio de Peces Planos,
correspondiente al Laboratorio de Cultivos Marinos de la Unidad de
Acuicultura, Dirección de Investigaciones en Acuicultura, Gestión
Costera y Calidad Ambiental del Instituto del Mar del Perú.
2. Limpieza
El lavado de los acuarios se realizó con ayuda de accesorios de
limpieza (esponja verde, escobillas, etc), detergente industrial y una
manguera de agua potable con fuerte presión. También se realizó el
lavado de las mangueras conectoras, las llaves de aireación y las
piedras aireadoras
3. Especie elegida para el experimento
La especie elegida fue Cheilodactylus variegatus “pintadilla”, las
cuales fueron extraídas de su ambiente natural en la bahía del Callao
encontrándose en estado juvenil. Antes de distribuirlas se procedió a
tomar sus mediciones morfométricas para comparar al término de la
experiencia.
29
4. Instalación
Se instalaron los cuatro acuarios de manera contigua sobre una
base de PVC, luego se llenaron con agua de mar pasada por el
sistema de bombeo y los filtros de 1µ. El volumen de agua de mar
vertida fue de 100L, inmediatamente después se aireó por 2 horas
para luego colocar los individuos de Cheilodactylus variegatus,
distribuyéndolos a razón de 10 individuos por cada acuario para su
acondicionamiento y adaptación.
5. Acondicionamiento y Adaptación de Cheilodactylus variegatus
En esta etapa la especie debió aprender a reconocer su estado de
cautiverio como nuevo hábitat; lo cual tomaría 8 semanas, de las
cuales 5 fueron de acondicionamiento, es decir, se les dio el mismo
trato a los cuatro acuarios; mientras que las otras 3 semanas restantes
fueron de adaptación, simulando las pruebas que se realizarían
posteriormente e involucrarían un cambio en su medio.
5.1 Acondicionamiento
El acondicionamiento se realizó por un periodo de 5 semanas.
Durante este tiempo se les suministró 10g diarios de alimento
peletizado en dos tandas, 5g a las 11am y los otros 5g a las 4pm.
Se realizaron cambios parciales de agua durante siete días (50%)
mediante succión según la poca o abundante presencia de
desechos fecales como de alimento no digerido o en
descomposición; transcurridos los siete días se limpiaban los
acuarios, mangueras y piedras aireadoras para nuevamente
30
llenarlos con 100L de agua de mar y repetir la operación 4 veces
más. La aireación se mantuvo constante durante todo el periodo.
5.2 Adaptación
Durante este periodo de 3 semanas, el medio en que se
encontraban los peces sufrió un cambio, producido por la adición
de un 20% de cultivo microalgal con una concentración de 107
cel.mL-1 de la totalidad del volumen de agua que solía verterse
(100L).
Esta fase es similar a la de acondicionamiento en modo de
operación, en la cual se simularon las pruebas que debían
realizarse como parte de esta investigación, y se empezaron a
tomar datos sobre los factores físico-químicos. En la adaptación se
pretendió lograr individuos en buen estado que soporten
condiciones de estrés.
Los acuarios se distribuyeron de igual forma eligiendo tres de ellos
para las pruebas (tratamientos) y uno como control, el cual no
contó con la presencia de microalgas y su trato se mantuvo tal cual
había sido durante el acondicionamiento para evitar el desgaste en
vano de sus individuos. El volumen de cambio de agua diario en
este caso fue máximo de 10L, tratando de esta manera de retirar
todo resto orgánico depositado en el fondo mediante la misma
técnica de succión. Para una succión más eficaz se retiró la
aireación por tiempo máximo de una hora para permitir la caída
total de los restos suspendidos y retirar una mayor cantidad de
ellos en un mínimo volumen de agua. Otro punto variable es el
tiempo de permanencia de los peces en estas condiciones, porque
debido a los diversos factores fisicoquímicos que se tomaron en
cuenta, sólo se permitió una permanencia de 5 días.
31
IV. Realización de las Pruebas Mediante la Técnica de Agua Verde
La técnica que se empleó como base para esta investigación fue la
Técnica del Agua Verde, la cual es actualmente usada en cierto sector de
la industria acuícola y cuyo principio es el aprovechamiento de la biomasa
microalgal en el mantenimiento de diferentes cultivos. Para tal fin fue
necesario contar con cultivos microalgales de calidad y con elevadas
densidades celulares que hagan significativa su presencia en cada
tratamiento puesto a prueba ya que se vertieron en una proporción de 5:1
(agua de mar : cultivo microalgal), lo suficiente para que cumpla el rol
indicado. (Fig. 3 y 4)
Esta etapa de realización, las pruebas duraron 4 semanas continuas,
realizándose una prueba por semana, y cada prueba con una duración de
5 días, al cabo de los cuales se procedió a realizar el análisis
microbiológico de la misma y preparar nuevamente todo para la prueba
siguiente. El procedimiento fue el mismo realizado durante la época de
adaptación. No sólo se tomó en cuenta el cambio de los factores
fisicoquímicos según el transcurrir de los días, sino también los análisis
microbiológicos recogidos al final de cada prueba, ambos en combinación
y/o individualmente, permitieron evaluar el objetivo de la investigación.
1. Acuarios de Tratamiento
Los tratamientos puestos a prueba fueron hechos en repeticiones
de tres, distribuidos cada uno de ellos de la siguiente forma: 80 litros
de agua de mar más 20 litros de cultivo microalgal de Tetraselmis
32
contracta, 10 individuos de Cheilodactylus variegatus, aireación
constante, 10g de alimento peletizado diario en 2 tandas de 5g a las
11am y 5g a las 4pm, iluminación natural con aproximadamente 12
horas de luz y 12 horas de oscuridad.
2. Acuario Control
El cuarto acuario o acuario control se llenó de la misma forma que
se había venido haciendo, con 100 litros de agua de mar, aireación y
alimentación diaria. Para las 4 semanas de pruebas, el trato será el
mismo para los cuatro acuarios, esto quiere decir que, la succión diaria
de agua será máximo de 10L también para este caso, de tal manera
que se encuentren uniformemente sometidos a las mismas
condiciones para analizar y comparar posteriormente sus reacciones.
3. Parámetros fisicoquímicos
Todos los parámetros fisicoquímicos se midieron diariamente antes
de succionar el fondo por el número de días que duró cada tratamiento
con ayuda de equipos y kits.
3.1 Oxígeno
El oxígeno se midió empleando un Oxímetro SCHOTT®. Una vez
calibrado, se introdujo en cada uno de los acuarios. Para esto fue
preferible cortar la aireación para obtener valores más cercanos a
la realidad y mantener el bulbo lejos de la piedra aireadora.
3.2 pH
33
El pH fue medido con ayuda de un Potenciómetro Mettler Toledo®.
Una vez calibrado con una solución neutra de pH 7 se tomaron los
datos evitando que el bulbo choque con el fondo donde se
encontraban todos los restos orgánicos. Se midió de igual forma
que el oxígeno, con la diferencia de que después de cada medición
se limpiaba el bulbo para calibrar nuevamente antes de pasar al
siguiente tratamiento, asegurando valores más confiables.
3.3 Amonio y Nitratos
Ambos fueron medidos empleando 1 kit Sera® para cada fin, en el
cual se tomaban 5mL de la muestra de agua para añadirle 3
diferentes reactivos indicadores, luego de 5 minutos se dió lectura
del resultado en la tabla de valores.
3.4 Temperatura
La temperatura se midió usando un termómetro de campo, cuyo
rango iba de -10 a 120º C. Esta temperatura era generalmente
confrontada con la temperatura indicada en el potenciómetro y el
oxímetro para tener mayor exactitud.
4. Procedimiento/ Registros por día
4.1Día 1
Se lavó los acuarios, mangueras y piedras aireadoras antes de
instalar el sistema de tratamiento. Una vez limpio se instalaron
como se explicó anteriormente, 3 acuarios del mismo tratamiento
con cultivo microalgal y un acuario control sin tratamiento
microalgal. Inmediatamente después se midieron los parámetros
34
fisicoquímicos y se sacó una muestra del agua de mar para su
análisis microbiológico, para saber en que condiciones ingresó.
Estas actividades se realizaron en el transcurso de la mañana, así,
una vez listos, se dejaron reposar una hora a los peces antes de
alimentarlos para que se relajen, ya que la manipulación de
haberlos retirado y vuelto a colocar en su lugar les causa cierto
nivel de estrés.
4.2 Del día 2 al día 4
Durante los 3 días siguientes la rutina fue la misma. Lo primero que
se hizo fue cortar la aireación para tomar los parámetros
fisicoquímicos de los 4 acuarios, mientras que, también se
aprovechó para que decanten los restos orgánicos que se
encontraban suspendidos en la columna de agua. Al transcurrir
aproximadamente una hora se realizaba la limpieza de los
acuarios; primero se succionaban para remover la mayor parte de
desechos procurando no sobrepasar los 10L y luego con ayuda de
una malla pequeña se retiraban manualmente algunos restos que
hubieran quedado flotando, o natas de grasa producidas por el
alimento. Una vez retirada la mayoría de desechos se reponía el
volumen de agua de mar extraído y la aireación.
Luego de aproximadamente una hora se alimentaban con la
primera ración del día (5g) y 5 horas después con la segunda
ración (5g).
4.3 Día 5
Durante el último día el procedimiento fue el mismo para tomar los
parámetros fisicoquímicos, e inmediatamente después se tomó una
35
muestra de agua de cada uno de los acuarios para su análisis
microbiológico.
La limpieza del quinto día fue completa, se vació todo el contenido
de los acuarios y se llenaron con agua de mar. Permanecieron así
por 2 días mientras se procesaban las muestras obtenidas, luego
se volvía a preparar todo para la prueba siguiente.
V. Análisis Microbiológicos
1. Colimetría
Este análisis permite determinar la contaminación fecal de las
muestras por parte de enterobacterias, coliformes y coliformes fecales,
bacterias entero patógenas termotolerantes como la E. coli
principalmente, y determinar el grado de contaminación según la
presencia de gas en el cultivo.
El análisis de colimetría se hizo siguiendo la metodología del
Número Más Probable, NMP APHA, 1992. El NMP es una estrategia
eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente
cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es
factible. La técnica se basa en la determinación de presencia o
ausencia (positiva o negativa) en réplicas de diluciones consecutivas
de atributos particulares de microorganismos presentes en la muestra.
Cada paso del procedimiento descrito a continuación se realizó en
ambientes estériles.
1.1 Preparación del Medio de Cultivo y batería de tubos
36
El medio empleado fue el Caldo Lauryl Sulfato (ver composición en
ANEXOS). En un erlenmeyer de 1000mL se preparó 35.6 g del
medio y se enrasó hasta 1000mL con agua destilada. Agitando
constantemente y con ayuda de una bagueta se trata de disolver el
medio lo mayor posible hasta lograr un aspecto claro sin grumos.
Luego se sirvieron 10mL de medio en 36 tubos de ensayo sin tapa,
cada tubo contenía una campana de Durham como parte de la
metodología, donde se observaría la presencia de gas en el caso
que hubiera. Con el fin de evitar falsos resultados se debió
asegurar que ningún tubo contenga burbuja alguna dentro de la
campana, ya que al momento de le lectura podría prestarse a una
mala interpretación del resultado. Finalmente los tubos se taparon
con algodón (lo cual permite el intercambio gaseoso) y se
autoclavan a 121º C durante 15 minutos.
1.2 Dilución de las muestras
Cada una de las muestras (M1, M2, M3, M4control) de agua fue
sometida a 3 diluciones como parte de la metodología empleada,
de esa forma obtuvimos las muestras por triplicado: M1-1, M1-2, M1-
3; M2-1, M2-2, M2-3; M3-1, M3-2, M3-3; M4c-1, M4c-2, M4c-3.
La dilución fue hecha en agua de mar estéril para no alterar la
naturaleza de la muestra.
1.3 Siembra
La siembra se realizó en réplica de tres para cada dilución.
Cada una de estas diluciones tuvo una réplica de tres:
Muestra 1: 3 tubos con 3 diluciones. Inóculo 1mL
Muestra 2: 3 tubos con 3 diluciones. Inóculo 1mL
37
Muestra 3: 3 tubos con 3 diluciones. Inóculo 1mL
Muestra 4 (control) : 3 tubos con 3 diluciones. Inóculo 1mL.
Una vez finalizada la siembra se agitaron suavemente los tubos
para homogenizar el inóculo en el medio y se incubaron a 37º C por
24 horas.
2. Conteo de colonias
Para el conteo de colonias se preparó una batería de 20 placas de
Agar Play Count y 20 placas de Agar Marino (ver composición en
ANEXOS)
La siembra se hizo por difusión con el asa Dragasky. Las muestras
de diluyeron 2 veces (M-2) para realizar la siembra de la siguiente
manera:
2.1Incubación a 37º C
Agar Play Count:
Se sembaron 2 placas de Agar Play Count para cada dilución
de la muestra.
Agar Marino:
Se sembraron 2 placas de Agar Marino para cada dilución de la
muestra.
2.2 Incubación a 20º C
Agar Play Count:
Se sembaron 2 placas de Agar Play Count para cada dilución
de la muestra.
38
Agar Marino:
Se sembraron 2 placas de Agar Marino para cada dilución de la
muestra.
De esta forma obtuvimos 2 réplicas de placas para observar el
comportamiento a diferentes grados de incubación ya que se trató de
bacterias marinas. El recuento de colonias de cada una de las
diluciones, y se hizo mediante observación directa de la placa
aplicando la siguiente fórmula:
UFC = #colonias x FD-1 x 1/Vol total
Donde: # colonias, es la cantidad de colonias presentes en la placa
FD, es el factor de dilución de la muestra
Volumen total, es el volumen del inóculo
3. Aislamiento de Vibrio a partir de las muestras
Vibrio es el género bacteriano blanco en esta etapa de la investigación
debido a sus efectos patológicos que son actualmente bastante conocidos
en el ambiente acuícola.
3.1 Primera siembra. Caldo APA
La siembra en caldo APA (ver composición en ANEXOS) fue el
primer paso a seguir en el aislamiento de Vibrio. La preparación
del medio se hizo con un día de anticipación, con agua destilada y
se separó en 4 erlenmeyers de 200mL, conteniendo cada uno
45mL de caldo, luego se autoclavó a 121º C por 15 minutos.
39
La siembra se realizó directamente de la muestra obtenida el quinto
día de prueba, en una proporción de 1:1, es decir, se agregaron
45mL de cada muestra pura en los 45mL de caldo.
Este cultivo de dejó incubar a temperatura ambiente de 22º por 24
horas, tiempo suficiente para observar la aparición de una nata
superficial, la cual debería contener dicha bacteria.
3.2 Segunda siembra. Agar TCBS
El agar TCBS (ver composición en ANEXOS) es específico para el
crecimiento de Vibrio. Se prepararon 10 placas un día antes y se
mantuvieron en refrigeración hasta el día de su uso.
La siembra se realizó bajo campana de extracción y con mechero
prendido para reducir cualquier riesgo de contaminación. Se tomó
una asada de la nata superficial contenida en el caldo APA y se
sembró mediante estrías. Se sembraron 2 placas por muestra,
obteniendo finalmente 8 placas las cuales se incubaron a 37º C por
24 horas.
3.3 Citocromo Oxidasa
Una vez transcurrido el tiempo de incubación se leyeron las placas
de TCBS para identificar las colonias amarillas o verdes solitarias y
realizar la prueba de citocromo Oxidasa.
Esta prueba consistió en tomar 1 banda indicadora Bactident ®
Oxidase (ver composición en ANEXOS), en la cual se colocó una
mínima porción de la colonia elegida con ayuda del asa de siembra,
evitando el contacto del asa con la banda. La reacción positiva
40
significó la aparición de una mancha violeta azulada al contacto con
la colonia.
3.4 Aislamiento en Agar TSA
El agar TSA permite mantener la cepa obtenida por periodos de
tiempo prolongados (ver composición en ANEXOS)
El medio se preparó un día antes con una concentración de NaCl al
3%, separándolo en viales con 8mL de medio cada uno, luego se
autoclavaron a 121º C por 15 minutos. Al finalizar el esterilizado se
dejaron a temperatura ambiente dentro de la cámara de siembra en
plano inclinado para que solidifique.
La siembra se realizó directamente de la colonia elegida tan pronto
como se supo el resultado positivo de la prueba de citocromo
oxidasa. La técnica de sembrado fue mediante estrías. Finalmente
se rotuló la cepa y se sella con parafina para evitar cualquier
intercambio de gases.
4. Pruebas Bioquímicas
Las pruebas bioquímicas realizadas para la identificación de la
especie fueron las siguientes: Simmons Citrate Agar, Lysine Iron Agar,
SIM Médium (Sulfuro, Indol y Motilidad), Triple Sugar Iron (Lactosa,
sacarosa, glucosa), Hugh y Leifson (Oxidación/Fermentación), y
crecimiento en diferentes concentraciones de NaCl, TSB 3%, TSB 6%
y TSB 10%. (ver composición de los medios en ANEXOS)
La batería de pruebas se prepararon con un par de días de
anticipación. Un día antes de la siembra la cepa debió ser activada en
medio TSB al 3% de NaCl. Una vez activada la cepa después de 24
41
horas de incubación al 37º C se procedió a realizar las pruebas,
mediante siembra en estría o hincando el medio según corresponda.
VI. Mediciones Morfométricas
Los 40 individuos de Cheilodactylus variegatus que se instalaron a
razón de 10 por cada acuario se pesaron en una balanza digital y se
midieron con un ictiómetro para obtener su peso y talla antes de ser
sometidos al experimento y al final de este y poder comparar el
crecimiento y sobrevivencia que presentaron a lo largo de este tiempo
entre los que se encontraban bajo efectos del tratamiento y los de control.
VII. Estadística
El procesamiento de los datos obtenidos se realizó mediante el
programa estadístico SYSTAT ®. La diferencias significativas de los
parámetros del agua entre tratamiento y control fueron determinadas
mediante la prueba t-studen con corrección de Bonferroni. Previamente se
evaluó la normalidad de los datos con el test de Lilliefors y se realizó la
transformación de datos en caso que fuera necesario.
La metodología se encuentra a continuación representada
gráficamente en un flujograma, donde se muestra la secuencia de
actividades detallando brevemente lo que se realiza en cada etapa.
42
Obtención de muestra
Origen: Puerto Viejo Método: Colecta Directa Especie: Tetraselmis contracta
Adaptación: A condiciones de laboratorio Al medio de cultivo
Aislamiento Dilución
Lavado celular
Cepa
Flujo de cultivo:
Inicial
Intermedio
Masivo
Instalación de acuarios:
Acondicionamiento
Adaptación de individuos
(parámetros fisicoquímicos)
Pruebas: Técnica de agua verde
Toma de datos:
Fisicoquímicos diarios
Microbiológicos al final de la prueba
Análisis microbiológicos:
Colimetría
Recuento de colonias
Determinación de Vibrio
Obtención de resultados
43
RESULTADOS
1. Adaptación y aislamiento
Las microplacas sembradas con inóculo directo de la muestra madre
se mantuvieron en incubación hasta observar cambios que indiquen su
crecimiento. Transcurridos 30 días se hizo la observación microscópica, y,
efectivamente, el mejor crecimiento se observó en la microplaca
proveniente de la muestra madre casi pura del género Tetraselmis, la cual
sirvió para realizar el aislamiento algal, así como para mantener un cultivo
unialgal de 250mL mientras no se obtenían resultados.
Morfológicamente se observaron que células elipsoidales y/o
cilíndricas y algo aplanadas con una longitud de 7µ ±1, presentan 4
flagelos los cuales emergen a través de un poro ubicado en el extremo
apical de la célula, formando una depresión en la pared celular, y su
longitud es ligeramente mas pequeña que la longitud de la célula. (Fig. 5)
De las dos técnicas de aislamiento, ambas dieron resultados en
tiempos diferentes. De los 10 tubos inoculados con 1 célula cada uno, 6
dieron positivos (60%), es decir, al cabo de 45 días de incubación se
evidenció el crecimiento de la nueva cepa, a partir de la cual se
desarrollará el flujo de cultivo y se mantendrá la cepa como parte del
Banco de Germoplasma Algal del Laboratorio de Biotecnología Acuática.
La técnica de dilución también dio resultados positivos en las 10 placas
multipocillos (100%) en menor tiempo, en sólo 15 días ya se observó un
ligero crecimiento; pero se prefirió trabajar con la obtención de cepa
mediante lavado celular. La cepa obtenida fue codificada como IMP-LBA-
001.
44
2. Flujo de cultivo
2.1 Cultivo inicial
Los cultivos de 250mL alcanzan una concentración promedio de
104 cel.mL-1 después de 7 días de incubación. A partir de éstos se
siembran 2 cultivos de 500mL que alcanzan en 5 días una
concentración promedio de 106 cel.mL-1 .
2.2 Cultivo intermedio
Los 10 cultivos alcanzan una concentración promedio de 107
cel.mL-1 transcurridos 3 días desde su siembra.
2.3 Cultivo masivo
Los balones alcanzan una concentración promedio de 107 cel.mL-1
transcurridos 3 días desde su siembra.
3. Factores Físico-químicos
Los resultados de la variación de los factores físico-químicos durante
las siete pruebas realizadas en que se tomaron los datos se detallan a
continuación y se represen en curvas, donde los valores simbolizan la
media y las barras el error estándar. La curva de tratamientos representa
el promedio de datos de las tres réplicas.
3.1 Oxígeno
La Figura 6 representa la curva de variación de los valores de
oxígeno tanto para los tratamientos como para el control. En ella se
indica las concentraciones de oxígeno disuelto en mg/L por cada
día mientras duró la prueba. La curva que indica la variación de los
tratamientos contiene los siguientes valores en orden cronológico:
45
5.65; 6.02; 5.78; 5.79; 5.48; mientras que para el control fueron:
5.5; 5.56; 5.57; 4.81; 4.77; datos expresados en mg/L. El último día
existe una diferencia de 0.71 entre ambas curvas que favorece a
los tratamientos. Los datos recopilados durante el experimento que
originan los valores de cada uno de los puntos se detallan en la
Tabla 1.
3.2 pH
La curva de variación para los valores de pH del tratamiento y el
control se ilustran en la Figura 7, donde el tratamiento obtuvo los
siguientes valores en orden cronológico: 7.71; 7.77; 7.87; 7.86;
7.85; mientras que para el control fueron: 7.70; 7.66; 7.79; 7.71;
7.82. Ambas curvas tuvieron un desarrollo paralelo, con una
diferencia final de 0.033 entre ellas. Los datos recopilados durante
el experimento que originan los valores de cada uno de los puntos
se detallan en la Tabla 2.
3.3 Amonio
El aumento del amonio para ambos casos esta representado por la
Figura 8. Para este caso, el resultado mostró una diferencia
significativa (p<0.001) al quinto día del tratamiento donde la
concentración de amonio en el agua para el control fue mas del
doble de la concentración de los tratamientos. Los valores para la
curva de tratamiento fueron cronológicamente: 0.003; 0.022; 0.027;
0.028; 0.032; y para el control: 0.003; 0.016; 0.027; 0.028; 0.0328;
datos expresados en mg/L. El comportamiento de la curva control
evidencia claramente el despliegue en sus concentraciones de
amonio a partir del tercer día de prueba. Los datos recopilados
durante el experimento que originan los valores de cada uno de los
puntos se detallan en la Tabla 3.
46
3.4 Nitrito
Los valores de nitrito para ambas curvas, tratamiento y control, se
ilustran en la Figura 9. En ella se aprecia un aumento moderado y
casi paralelo en los dos casos hasta el cuarto día, a partir del cual
se dispara la curva control notablemente alcanzando valores
mayores en un 44.4% al de los tratamientos. Los valores de la
curva de tratamiento cronológicamente fueron: 0.10; 0.25; 0.50;
0.69; 0.76; y para el control: 0.10; 0.15; 0.31; 0.44; 1.71; datos
expresados en mg/L. Los datos recopilados durante el experimento
que originan los valores de cada uno de los puntos se detallan en
la Tabla 4.
3.5 Temperatura
La temperatura fue el factor mas constante, la variación entre
tratamientos y control no mostró mayor diferencia, lo que se puede
observar en la Figura 10, donde los valores para la curva de
tratamientos fueron cronológicamente: 18.65; 19.82; 20.33; 20.28;
20.29; y para el control: 18.75; 19.90; 20.37; 20.38; 20.40; datos
expresados en grados centígrados (ºC). Los datos recopilados
durante el experimento que originan los valores de cada uno de los
puntos se detallan en la Tabla 5.
4. Análisis Microbiológicos
4.1 Colimetría
El análisis de colimetría tuvo resultados negativos para todas las
pruebas. La formación de gas en la campana de Durham,
acompañada de turbidez, indica la presencia de coliformes,
47
característica que no se encontró en ninguno de los tubos a través
de todo el experimento, por lo cual se presume que el agua estuvo
libre de concentraciones significativas de coliformes totales, valor
que se expresa como <30UFC para todos los casos.
4.2 Conteo de colonias
La Figura 11 muestra el crecimiento bacteriano en dos diferentes
agares (Plate Count y Agar Marino) a una temperatura de
incubación de 37º C para los tratamientos y para el control. La
máxima carga bacteriana alcanzada por los tratamientos fue de
13.2 x 104 UFC.mL-1 y 12.4 x 104 UFC.mL-1; mientras que para el
control fue de 29.3 x 104 UFC.mL-1 y 27.3 x 104 UFC.mL-1 para el
Agar Marino y Plate Count respectivamente.
La Figura 12 muestra el crecimiento bacteriano en dos diferentes
agares (Plate Count y Agar Marino) a una temperatura de
incubación de 20º C para los tratamientos y para el control. La
máxima carga bacteriana alcanzada por los tratamientos fue de
13.4 x 104 UFC.mL-1 y 11.2 x 104 UFC.mL-1; mientras que para el
control fue de 29.8 x 104 UFC.mL-1 y 28.4 x 104 UFC.mL-1 para el
Agar Marino y Plate Count respectivamente.
Los valores se presentan en promedios, tanto para los tratamientos
(1,2,3) como para el control para una mejor observación.
4.3 Identificación de Vibrio
Transcurrido el tiempo de incubación se dio lectura a las placas de
TCBS, que fueron sembradas a partir del caldo APA, mediante
observación directa de la placa. Se identificaron de 3 a 4 colonias
color amarillo y en algunos casos verdes, circulares con un
48
diámetro aproximado de 2mm y que se encuentren solitarias para
cada muestra. (Fig. 13)
La prueba de citocromo oxidasa se llevó a cabo con las colonias
elegidas de cada placa. Todas las colonias elegidas dieron como
resultado citocromo-oxidasa positivos.
Las pruebas bioquímicas realizadas para corroborar la presencia
de esta bacteria tuvieron los siguientes resultados para todas las
cepas aisladas:
Simmons Citrate Agar: Positivo K/K (alcalinidad)
Lysine Iron Agar: Positivo
SIM: Positivo para Motilidad e Indol, negativo para H2S.
Triple Sugar Iron: negativo K/A (alcalinidad/acidez)
Oxidación/Fermentación: Ambas pruebas reaccionaron, tanto
en presencia como en ausencia de oxígeno.
Concentración de sales al 0%: No hubo crecimiento
Concentración de sales al 3%: Hubo crecimiento
Concentración de sales al 6%: Hubo crecimiento
Concentración de sales al 10%: No hubo crecimiento
La coloración Gram mostró que se tratan de bacterias Gram
negativas.
5. Crecimiento y sobrevivencia
La Figura 14 indica el crecimiento en talla (cm) de los individuos de los
cuatro acuarios durante las siete semanas de pruebas, donde los tres
primeros corresponden a los tratamientos y el cuarto al control. Al inicio
del trabajo los individuos presentaron tallas promedios de 12.84, 13.21,
49
13.29, 13.33 cm respectivamente para cada acuario. La talla promedio
alcanzada para los tratamientos fue de 15.81, 15.90, 16 cm para cada
acuario respectivamente, mientras que el cuarto acuario control alcanzó
una talla promedio de 13.79.
La Figura 15 indica el crecimiento en peso (g) de los individuos de los
cuatro acuarios durante las siete semanas de pruebas, donde los tres
primeros corresponden a los tratamientos y el cuarto al control. Al inicio
del trabajo los individuos presentaron tallas promedios de 31.12, 32.29,
33.30, 33.13g respectivamente para cada acuario. La talla promedio
alcanzada para los tratamientos fue de 49.85, 49.59, 50.32g para cada
acuario respectivamente, mientras que el cuarto acuario control alcanzó
una talla promedio de 33.39.
Los resultados se muestran en valores promedios. Para mayor detalle
de los datos individuales ver Tablas 6 y 7.
Al final del experimento se determinó una taza de supervivencia del
70% para el control y de 100% para los tratamientos, ya que durante las
pruebas murieron 3 individuos del cuarto acuario.
50
DISCUSION
La microalga Tetraselmis contracta demostró una buena
adaptación a las condiciones de laboratorio, sobretodo en un inicio y en
cultivos de menor volúmen, lo que resultó muy útil para poder realizar el
aislamiento.
Si bien los resultados de ambas técnicas de aislamiento se dieron
en tiempo diferentes, se prefirió esperar a obtener los resultados de la
técnica de lavado de células debido a la calidad de cepa que se obtiene,
garantizando un buen desarrollo y aprovechamiento de su biomasa.
Como es sabido, cualquier variación en la actividad biosintética de las
células está influenciada por el origen y tipo de clones a partir de los
cuales si inició el cultivo, así como de las condiciones en que se
mantengan (Skulberg, 2004).
Los cultivos de mayor escala se adaptaron lentamente a las
condiciones de laboratorio; tras un buen manejo dela cepa, se logró un
comportamiento ideal, óptimo para la realización del flujo de cultivo tal
cual se había planificado. Esta característica es un factor importante y
requisito crítico para cultivar de manera comercial, las microalgas deben
ser una conexión entre estabilidad y productividad alta (Skulberg, 2004).
Para aplicar la técnica de agua verde fue necesario contar con
densidades celulares elevadas como mínimo de 107 cel.mL-1 para que se
logre evidenciar la propiedad antibacteriana principalmente por medio de
la producción de substancias que mitiguen estos microorganismos, dentro
de las cuales el género Tetraselmis ha sido extensamente descrita como
una microalga con capacidad inhibitoria de bacterias, fenómeno
considerado como natural.
51
Los productos extracelulares de las microalgas han sido, desde
tiempo atrás, un objetivo importante en la investigación ficológica. Ciertos
metabolitos son generalmente producidos durante la fase estacionaria de
crecimiento de un cultivo de microorganismos cualquiera, y son más
conocidos como metabolitos secundarios, constituyendo algunos de los
productos biotecnológicos más importantes de la humanidad (Skulberg,
2004). Sin embargo, el efecto antibacteriano de la microalga Tetraselmis
contracta, y de otras especies, no está del todo esclarecido, si bien es
cierto que se debe a la secreción de sustancias extracelulares, quepa
también la posibilidad de que se trate de otros mecanismos de interacción
bacteriana. Situándonos en el hecho de que, para el presente caso, el
efecto antibacteriano se deba a la producción de metabolitos, los cultivos
se cosecharon al día siguiente del término de fase Log, es decir, con 24
horas de permanencia en la fase estacionaria, tiempo suficiente para
obtener el producto deseado, y, a su vez, gozar de un cultivo joven, factor
importante considerando que luego pasarían a estar estancadas y
sometidas a condiciones totalmente diferentes como parte del
experimento.
Las algas por su naturaleza autótrofa son empleadas en
biorremediación de aguas residuales y como filtros biológicos en diversos
cultivos acuícolas, debido a que van a consumir los productos de la
actividad metabólica como fuente de nutrientes, entre ellos los
compuestos derivados del nitrógeno que son los que mayor problema
representan en la industria.
De todos los factores físico-químicos considerados, los niveles de
amonio presentaron una diferencia significativa entre los tratamientos y el
control (p<0.001). Una elevada concentración de amonio indica grado de
contaminación del agua causando intoxicación y muerte de los
organismos cultivados. Como se mencionó anteriormente, las microalgas
tienen la propiedad de remover este compuesto tóxico del medio debido a
52
que lo absorve de manera natural como nutriente para realizar su propia
actividad metabólica. Su desempeño en este experimento fue positivo,
pero según Voltolina et al. (2005) analizaron su rol en biorremediación
como purificadora de aguas, afirmando que aunque se les considera
como eficientes removedores, esta actividad es causada sólo en parte por
la toma natural de nutrientes y su empleo en la síntesis de nueva
biomasa; mientras que, su actividad fotosintética es la que juega un rol
mucho más importante en los cambios químicos en el agua. Para la
remoción de compuestos nitrogenados mediante microalgas deben
tenerse en cuenta factores ambientales como luz, pH y disponibilidad de
fuentes de carbono (Fierro et al., 2007), que en este caso estuvo limitado
con respecto a la iluminación, ya que por motivos logísticos, el
experimento contó sólo con la luz natural del día que a su vez fue limitada
al encontrarse bajo techo; la luz artificial no fue utilizada en ningún
momento del día, por tanto es probable que la actividad fotosintética se
haya visto limitada, lo que se refleja en los valores reportados.
Dentro de los demás parámetros tomados en cuenta, también se
encontraron diferencias entre la presencia de agua verde y el control con
una tendencia favorable hacia los tratamientos, aunque no hayan sido
estadísticamente significativas. Los niveles de oxígeno, aunque
diferentes, se mantuvieron dentro de los márgenes aceptables (sobre los
4mg/L) y no variaron mucho en relación a la concentración con la cual
ingresó de forma directa del mar. Si bien otra de las cualidades atribuidas
a las microalgas es la producción de oxígeno tomando como fuente el
CO2, cabe resaltar que los valores que mostraron fueron superiores al
control, y, aunque no fueron significativos, es necesario tener en cuenta la
presencia de bacterias que también van a consumir el oxígeno presente,
así como el hecho de que no había una iluminación buena ni constante
que permita la misma actividad fotosintética que tuvo al ser cultivada
como se mencionó anteriormente.
53
Con respecto al nitrito, es otro factor cuyos valores fueron
favorables para los tratamientos. Este compuesto se forma como producto
intermedio en el proceso de descomposición de las heces. Es importante
mencionar que dentro de las bondades de la técnica de agua verde, está
el hecho de que proporciona un ambiente amigable para el pez, larvas o
cualquiera que sea el organismo que se cultive, dando cierto grado de
turbidez que les permite, paradójicamente, ver mejor y orientarse dentro
del medio, reduciendo el nivel de estrés. Esta característica relaciona de
manera directa el nivel de contaminación con la presencia de heces, dado
que la ingesta de alimento fue mucho mayor en los tratamientos que en el
control, aumentando de esta manera la concentración de nitrito en el
medio; esto debió elevar los niveles de amonio en el medio, sin embargo
no fue así gracias a la presencia de microalgas y su efecto purificador.
La reducción de carga bacteriana fue el principal blanco de esta
investigación, conociendo la naturaleza de la especie microalgal. Dentro
del amplio espectro de diversidad bacteriana se optó por un mayor
enfoque a contrarrestar la presencia de Vibrio por varios motivos, dentro
de ellos está la literatura que afirma y confirma mediante diversos
estudios citados anteriormente que el género Tetraselmis posee actividad
antibacteriana específica contra este grupo de bacterias, y por otro lado
está el hecho de que se trata de una bacteria patógena responsable de
grandes pérdidas económicas en la industria acuícola al ser causante de
graves enfermedades. (Vinod et al. 2006; Karunasagar et al. 2007)
Si bien los resultados cualitativos demuestran la presencia de
Vibrio tanto en los tratamientos como en el control, no es tan simple como
parece. Es necesario analizar la bibliografía para interpretar los resultados
de recuento de colonias y la taza de mortandad, y así, dar cuenta de la
importancia de la presencia de Tetraselmis en la calidad micribiológica del
agua.
54
Las placas de conteo de colonias de los tratamientos en relación al
control revelaron una disminución considerable en la carga bacteriana en
general de los tratamientos en relación al control. Aunque no podemos
afirmar que esa reducción sea exclusivamente de Vibrio, ya que el conteo
de colonias se hizo en Agar Plate Count y Agar Marino que permiten el
crecimiento de cualquier microorganismo, se puede deducir que
efectivamente hubo una disminución de este grupo de bacterias.
No existe un protocolo para la determinación y cuantificación de
Vibrio en estos casos. Regunathan et al. (2004) emplearon una técnica
similar a la empleada en este trabajo, sembrando directamente la muestra
en agar TCBS específico para Vibrio, y asumiendo de esta forma su
presencia en la formación de cualquier colonia amarilla o verde. Como se
sabe, los agares específicos favorecen el crecimiento de ciertas bacterias
e inhiben el crecimiento de otras, mas no es 100% confiable ya que el
comportamiento de estos microorganismos es variable y pueden ser
capaces de desarrollar inclusive en medios no esperados. La técnica
empleada para la determinación de Vibrio en esta investigación, necesitó
un enriquecimiento previo de dicha bacteria, que garantice su presencia al
momento de pasar al agar, de lo contrario, el cambio brusco de su medio
natural al medio de cultivo puede provocar que no se manifieste,
originando falsos resultados. Es debido a esto que no se puede cuantificar
su presencia, ya que el caldo de enriquecimiento promueve no sólo su
vitalidad, sino también su proliferación.
Investigaciones in Vitro sí pueden obtener resultados cuantitativos
mas reales. Es por ello que la mayoría de pruebas sobre este tema se
realizan en laboratorio, con ensayos microbiológicas y muestras traídas
de campo en el mejor de los casos, o si no, se simulan preparando agua
contaminada con bacterias ya codificadas (Lio-Po et al. 2005). Estos
resultados son válidos aunque muchas veces en la realidad no se
obtienen los mismos resultados que en laboratorio por diferentes factores.
55
Lio-Po et al. (2005) aisló diferentes bacterias de tanques de camarones y
tilapias, y obtuvo una cepa de V. harveyi de manera comercial para probar
su inhibición por parte de microalgas (obtenidas de una colección
ficológica de laboratorio) y de las mismas bacterias que actuarían como
probióticos. Empleó el método de co-cultivo inoculando V. harveyi a un
caldo bacteriano de cada una de las bacterias aisladas, y luego del tiempo
de incubación lo llevó a placa para el recuento de colonias, el medio
empleado fue agar nutritivo con 1.5% de NaCl, asumiendo el crecimiento
de cualquier colonia como Vibrio. Este método le permitió cuantificar,
aunque no se puede descartar la presencia de otras bacterias al momento
del recuento por la naturaleza misma del agar.
Para obtener resultados más certeros sobre la autenticidad de
Vibrio se realizaron pruebas bioquímicas, que nos aseguraron que se
trata de dicho género, y aunque no se puede afirmar con exactitud la
especie, los resultados obtenidos indican que podría tratarse de Vibrio
alginolyticus por haber sido reportado anteriormente en la zona del Callao
de donde se obtuvo el agua de mar.
Para comprender mejor el fundamento de la técnica de agua verde
y la actividad antibacteriana de las microalgas, es necesario conocer la
relación que existe entre ellas y las bacterias, la cual no es precisamente
antagónica en todos los casos. La actividad antibacteriana es la que se
refleja al momento de realizar los ensayos, pero no es exclusivamente por
la producción de compuestos extracelulares; puede deberse también a la
composición bioquímica de los ácidos grasos presentes en cada célula,
donde aquellos que contengan mas de 10 átomos de carbono en su
estructura van a producir la lisis del protoplasto bacteriano. En este caso,
es bastante conocida la naturaleza del género Tetraselmis, ya que es
empleada como alimento vivo por su alto valor nutricional y su riqueza
lipídica. Otra teoría es que dicha capacidad inhibitoria es provocada por
bacterias asociadas a ellas mismas, y esto se apoya en que la mayoría de
56
estudios se han hecho con cultivos no axénicos, en donde existiría una
interrelación entre microalgas y bacterias (Riquelme et al. 2003)
De esta forma, los microorganismos evolucionan desarrollando
mecanismos de producción de sustancias con actividad antibiótica,
manteniendo así la dinámica y estructura de las poblaciones bacterianas
en los microambientes algales (Riquelme et al., 2003).
57
CONCLUSIONES
El aislamiento y cultivo de la microalga Tetraselmis contracta, se
realizó satisfactoriamente, sin presentar problemas adaptativos, logrando
un desarrollo exitoso al momento de cultivar a mayor escala.
La densidad del cultivo de Tetraselmis contracta alcanzó
concentraciones de 107 cel.mL-1, lo que sirvió de base para evaluar su
eficiencia como biocontrolador en los cultivos de “pintadilla”
Cheilodactylus variegatus durante 7 semanas de pruebas continuas.
La evaluación de los parámetros físico-químicos demostró la acción
de la microalga como agente purificador.
Los análisis microbiológicos han demostrado que efectivamente
existe una reducción en la carga bacteriana de más del 50% y una taza
de sobrevivencia del 100% de los individuos de Cheilodactylus variegatus,
lo que confirma la actividad de Tetraselmis contracta como biocontrolador
microbiano de la calidad de agua para uso acuícola.
58
REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
Aguilar-Samanamud, C.P., 1995. Crecimiento y ciclo de vida de la
microalga Dunaliella salina Teodoresco (Chlorophyta, Volvocales) de
las salinas de los Chimus (Ancash) y las salinas de Chilca (Lima).
Tesis para optar el título de Licenciada en Biología. Universidad
Ricardo Palma, Lima-Perú.
Alpat, S.K., Alpat, S., Kutlu, B., Özbayrak, Ö., Büyükışık, H.B., 2007.
Development of biosorption-based algal biosensor for Cu(II) using
Tetraselmis chuii, Sens. Actuators B: Chem. (2007),
doi:10.1016/j.snb.2007.06.011
Aslan, S., & Kapdan, I., 2006. Batch kinetics of nitrogen and
phosphorus removal from synthetic wastewater by algae. Ecological
engineering 28 (2006) 64–70.
Avnimelech, Y., 2006. Bio-filters: The need for a new comprehensive
approach. Aquacultural Engineering 34 (2006) 172–178.
Bansemir, A., Blume, M., Schröder, S., Lindequist, U., 2006. Screening
of cultivated seaweeds for antibacterial activity against fish pathogenic
bacteria. Aquaculture 252 (2006) 79–84.
Boopathy, R., Bonvillain, C., Fontenot, Q., Kilgen, M., 2007. Biological
treatment of low-salinity shrimp aquaculture wastewater using
sequencing batch reactor. International Biodeterioration &
Biodegradation 59 (2007) 16–19.
Choudhury S., Sree A., Mukherjee S.C., Pattnaik P., Bapuji M., 2005.
In Vitro Antibacterial Activity of Extracts of Selected Marine Algae and
59
Mangroves against Fish Pathogens. Asian Fisheries Science 18
(2005): 285-294.
Das, B., J. Pradhan, P. Pattnaik, B. Samantaray, S. Samal, 2005.
Production of antibacterials from the freshwater alga Euglena viridis
(Ehren). World Journal of Microbiology and Biotechnology 21, Number
1 (2005) 45-50
Fierro, S., Sánchez-Saavedra, M., Copalcúa, C., 2007. Nitrate and
phosphate removal by chitosan immobilized Scenedesmus. Bioresour.
Technol. (2007), doi:10.1016/j.biortech.2007.02.043
González-Barreiro, O., Rioboo, C., Herrero, C., Cid, A., 2006. Removal
of triazine herbicides from freshwater systems using photosynthetic
microorganisms. Environmental Pollution 144 (2006) 266-271.
Guillard, R., 1973. Handbook of Phycological Methods-Culture
Methods and Growth Measurements. J. Stein ed. Cambridge Univ.
press: London.
Gutierrez-Wing, M., & Malone, R.F., 2006. Biological filters in
aquaculture: Trends and research directions for freshwater and marine
applications. Aquacultural Engineering 34 (2006) 163–171.
Huervana, F.H., De la Cruz, J.Y., Caipang, C.M., 2006. Inhibition of
luminous Vibrio harveyi by green water obtained from tank culture of
tilapia, Oreochromis mossambicus. Acta Ichthyologica et piscatoria
(2006) 36 (1): 17.23
Jiménez-Pérez, M.V., Sánchez-Castillo P., Romera O., Fernández-
Moreno, D., Pérez-Martínez, C., 2004. Growth and nutrient removal in
60
free and immobilized planktonic green algae isolated from pig manure.
Enzyme and Microbial Technology 34 (2004) 392–398.
Kahla-Nakbi, A., Besbes, A., Chaieb, K., Rouabhia, M., Bakhrouf, A.,
2007. Survival of Vibrio alginolyticus in seawater and retention of
virulence of its starved cells. Marine Environmental Research 64
(2007) 469–478.
Kalyani, S., Srinivasa-Rao, P., Krishnaiah, A., 2004. Removal of nickel
(II) from aqueous solutions using marine macroalgae as the sorbing
biomasa. Chemosphere 57 (2004) 1225–1229.
Kandhasamy, M. & Arunachalam, K.D., 2008. Evaluation of in vitro
antibacterial property of seaweeds of southeast coast of India. African
Journal of Biotechnology Vol. 7 (12), pp. 1958-1961.
Karunasagar Indrani, Shivu, M.M., Girisha, S.K., Krohne, G.,
Karunasagar Iddya, 2007. Biocontrol of pathogens in shrimp hatcheries
using bacteriophages. Aquaculture 268 (2007) 288–292.
Kellam, J. S & Walker, M. J. 1989. Antibacterial Activity from Marine
Microalgae in Laboratory Culture. European Journal of Phycology,
24:2,191 – 194.
Lee, Y.K., Shen, H., 2004. Basic Culturing Techniques. En Handbook
of Microalgae Culture Biotechnology and Applied Phycology. A.
Richmond ed. 40-56p. Blackwell Publishing Co. Iowa, USA.
Lio-Po, G.D., Leaño, E.M., Peñaranda, M.D., Villa-Franco, A.U.,
Sombito, C.D., Guanzon, N.G. Jr., 2005. Anti-luminous Vibrio factors
associated with the “green water” grow-out culture of the tiger shrimp
Penaeus monodon. Aquaculture 250 (2005) 1– 7.
61
Makridis, P., Alves-Costa, R., Dinis, M., 2006. Microbial conditions and
antimicrobial activity in cultures of two microalgae species, Tetraselmis
chuii and Chlorella minutissima, and effect on bacterial load of
enriched Artemia metanauplii. Aquaculture 255 (2006) 76–81.
Neori, A., Krom, M.D., Rijn, J., 2007. Biogeochemical processes in
intensive zero-effluent marine fish culture with recirculating aerobic and
anaerobic biofilters. Journal of Experimental Marine Biology and
Ecology 349 (2007) 235–247
Oh, M.J., Kim, W. S., Kitamura, S.I., Lee, H.K., Son, B.W., Jung, T.S.,
Jung, S.J., 2006. Change of pathogenicity in Olive flounder
Paralichthys olivaceus by co-infection of Vibrio harveyi, Edwardsiella
tarda and marine birnavirus. Aquaculture 257 (2006) 156–160.
Pang, S.J., Xiao, T., Bao, Y., 2006. Dynamic changes of total bacteria
and Vibrio in an integrated seaweed–abalone culture system.
Aquaculture 252 (2006) 289– 297
Peña-Castro, J.M., Martínez-Jerónimo, F., Esparza-García, F.,
Cañizares-Villanueva, R.O., 2004. Heavy metals removal by the
microalga Scenedesmus incrassatulus in continuous cultures.
Bioresource Technology 94 (2004) 219–222.
Pruder, G.D., 2004. Biosecurity: application in aquaculture.
Aquacultural Engineering 32 (2004) 3–10.
Raikar, V., & Wafar, M., 2006. Surge ammonium uptake in macroalgae
from a coral atoll. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology
339 (2006) 236–240.
62
Regunathan, C., & Wesley, S.G., 2004. Control of Vibrio spp. in shrimp
hatcheries using the green algae Tetraselmis suecica. Asian Fisheries
Science 17 (2004): 147-158.
Riquelme, C., & Avendano-Herrera, R., 2003. Interacción bacteria-
microalga en el ambiente marino y uso potencial en acuicultura.
Revista Chilena de Historia Natural 76: 725-736
Ruangpan, L., 1998. Luminous bacteria associated with shrimp
mortality. En Flegel TW (ed) Advances in shrimp biotechnology.
National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Bangkok
Sapp, M., 2006. Interactions of marine bacteria in the pelagic food
web. Tesis para obtención de doctorado, Universidad Christian
Albrechts, Kiel – Alemania.
Skulberg, O.M., 2004. Bioactive Chemicals in Microalgae. En
Handbook of Microalgae Culture Biotechnology and Applied
Phycology. A. Richmond ed. 485-512p. Blackwell Publishing Co. Iowa,
USA.
Tendencia E.A., & De la Peña, M., 2003. Investigation of some
components of the greenwater system which makes it effective in the
initial control of luminous bacteria. Aquaculture 218 (2003) 115–119.
The Second Hatchery Feeds and Technology Workshop, Sydney,
September 30 - October 1, 2004.
Velez, A., 2002. Producción de alimento vivo para hatchery de peces
marinos. En Conferencia Internacional Aqua Sur. Fundación Chile.
63
Vinod, M.G., Shivu, M.M., Umesha K.R., Rajeeva B.C., Krohne G.,
Karunasagar Indrani, Karunasagar Iddya, 2006. Isolation of Vibrio
harveyi bacteriophage with a potential for biocontrol of luminous
vibriosis in hatchery environments. Aquaculture 255 (2006) 117–124.
Voltolina, D., Gómez-Villa, H., Correa, G., 2005. Nitrogen removal and
recycling by Scenedesmus obliquus in semicontinuous cultures using
artificial wastewater and a simulated light and temperature cycle.
Bioresource Technology 96 (2005) 359–362.
Yeong, Y. S., 2008. Protection of Artemia from vibriosis by heat shock
and heat shock proteins. Tesis para obtener el grado de PhD.
Universidad de Ghent, Bélgica.
66
Fig. 3: Preparación de los tres acuarios tratamiento empleando la técnica de
agua verde y un control.
69
3
4
5
6
7
1 2 3 4 5
Tiempo (días)
Oxíg
eno (
mg/L
)
Tratamiento
Control
Fig. 6: Curva de Oxígeno. Curva de variación de los valores promedio de oxígeno entre
tratamiento y control, por un período de 5 días de duración de cada prueba.
6
6.5
7
7.5
8
8.5
1 2 3 4 5
Tiempo (días)
pH
Tratamientos
Control
Fig. 7: Curva de pH. Curva de variación de los valores promedio de pH entre
tratamiento y control, por un período de 5 días de duración de cada prueba.
70
*
0
2
4
6
1 2 3 4 5
Tiempo (días)
Am
onio
(m
g/L
)
Tratamientos
Control
Fig. 8: Curva de Amonio. Curva de variación de los valores promedio de amonio entre
tratamiento y control, por un período de 5 días de duración de cada prueba. El asterisco
indica diferencia significativa.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
1 2 3 4 5
Tiempo (días)
Nitr
ito (
mg/L
)
Tratamientos
Control
Fig. 9: Curva de nitrito. Curva de variación de los valores promedio de nitrito entre
tratamiento y control, por un período de 5 días de duración de cada prueba.
71
14
16
18
20
22
1 2 3 4 5
Tiempo (días)
Tem
pera
tura
(ºC
)
Tratamiento
Control
Fig. 10: Curva de temperatura. Curva de variación de los valores promedio de
temperatura entre tratamiento y control, por un período de 5 días de duración de cada
prueba
72
Recuento de colonias (37º)
13.2E+4 12.4E+4
29.3E+427.3E+4
00.0E+0
5.0E+4
10.0E+4
15.0E+4
20.0E+4
25.0E+4
30.0E+4
35.0E+4
medios de cultivo
UF
C
tratamientos
control
Agar marino Plate Count
Fig. 11: Crecimiento bacteriano. Promedio del recuento de colonias incubadas a 37º analizados
durante cuatro semanas de pruebas microbiológicas continuas.
Recuento de colonias (20º)
13.4E+411.2E+4
28.4E+429.8E+4
00.0E+0
5.0E+4
10.0E+4
15.0E+4
20.0E+4
25.0E+4
30.0E+4
35.0E+4
medios de cultivo
UF
C
tratamientos
control
Agar marino Plate Count
Fig. 12: Crecimiento bacteriano. Promedio del recuento de colonias incubadas a 20º analizados
durante cuatro semanas de pruebas microbiológicas continuas.
74
Crecimiento
12.8413.21 13.29 13.22
15.81 15.9 16
13.79
10
12
14
16
18
1 2 3 4
acuarios
Ta
lla
(c
m)
Tallas iniciales
Tallas f inales
Fig. 14: Tallas al inicio y término de las pruebas. Crecimiento en talla (cm) de los individuos
durante siete semanas que se les sometió a la prueba de agua verde.
Crecimiento
31.1232.29 33.3 33.13
49.85 49.59 50.32
33.39
20
30
40
50
60
1 2 3 4acuarios
Pe
so
(g
)
Peso inicial
Peso final
Fig. 15: Pesos al inicio y término de las pruebas. Crecimiento en peso (g) de los individuos durante
siete semanas que se les sometió a la prueba de agua verde.
75
Tabla 1: Valores de oxígeno (mg/L). La tabla muestra los promedios de los valores de oxígeno obtenidos para los tratamientos (acuario 1, 2, 3) y para
el control (acuario 4) durante las siete pruebas consecutivas de cinco días de duración cada una.
Pruebas Promedio Tratamientos (acuarios 1,2,3) Control (acuario4)
Oxígeno dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5
prueba1 6.43 7.08 6.1 5.78 5.75 6.35 5.92 4.8 4.56 5 prueba2 6.08 6.17 6.03 5.66 5.66 6.14 8.38 6.81 5.25 prueba3 5.13 5.66 5.56 6.33 6.03 5.19 5.31 5.19 6.03 6.17 prueba 4 4.99 5.14 5.28 5.32 4.02 4.96 5.21 4.42 3.51 2.51 prueba 5 6.17 6.5 6.2 4.76 5.52 5.18 5.9 3.2 4.05 prueba6 5.6 5.36 5.12 5.22 5.32 5.09 3.68 4.1 4.52 prueba7 5.18 6.26 6.46 6.11 6.82 5.73 5.64 6.64 5.5 5.89
PROM 5.65428571 6.02428571 5.78666667 5.79833333 5.48 5.5 5.56666667 5.57285714 4.81571429 4.77 ES 0.21783411 0.25697746 0.22173057 0.18230774 0.34083231 0.179761747 0.16345574 0.59325059 0.50739699 0.467674
76
Pruebas Promedio Tratamientos (1,2,3) Control
pH dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5
prueba1 7.78 7.84 7.51 7.68 7.51 7.45 prueba2 7.65 7.75 7.8 7.86 7.63 7.48 7.72 7.54 7.72 prueba3 7.74 7.78 8 7.81 7.81 7.76 7.53 8 7.6 7.59 prueba 4 7.7 7.79 7.86 7.9 7.88 7.61 7.58 7.57 7.7 7.87 prueba 5 7.73 7.72 7.9 7.88 7.81 7.78 7.65 7.84 7.83 7.84 prueba6 7.74 7.81 7.89 7.91 7.9 7.81 7.83 7.91 7.94 7.98 prueba7 7.74 7.82 7.91 7.84 7.89 7.85 7.9 8 7.92 7.95
PROM 7.71666667 7.77833333 7.87714286 7.86333333 7.85833333 7.707142857 7.66428571 7.79285714 7.71142857 7.825 ES 0.0147573 0.01536591 0.02783577 0.01605546 0.01621042 0.047142857 0.05826283 0.07507819 0.07238878 0.0600416
Tabla 2: Valores de pH. La tabla muestra los promedios de los valores de pH obtenidos para los tratamientos (acuario 1, 2, 3) y para el control (acuario
4) durante las siete pruebas consecutivas de cinco días de duración cada una.
77
Pruebas Promedio Tratamientos (1,2,3) Control
Amonio dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5
prueba1 0.009 0.03 0.03 0.03 0.03 0.009 0.009 0.025 0.03 prueba2 0 0.02 0.05 0 0.02 0.03 0.09 0.09 prueba3 0 0.025 0.03 0.03 0.03 0 0.02 0.03 0.07 0.09 prueba 4 0.0045 0.02 0.025 0.03 0.03 0.0045 0.02 0.03 0.09 0.09 prueba 5 0.009 0.009 0.02 0.02 0.03 0.009 0.009 0.02 0.03 0.09 prueba6 0 0.02 0.03 0.03 0.03 0 0.02 0.03 0.03 0.09 prueba7 0 0.03 0.03 0.03 0.03 0 0.02 0.03 0.03 0.09
PROM 0.00321429 0.022 0.0275 0.0283333 0.03285714 0.003214286 0.0168571 0.02785714 0.05285714 0.09 ES 0.00161782 0.00275162 0.00170783 0.0016666 0.00285714 0.001617822 0.0020287 0.0014869 0.01106567 6.20634E-18
Tabla 3: Valores de amonio (mg/L). La tabla muestra los promedios de los valores de amonio obtenidos para los tratamientos (acuario 1, 2, 3) y para el
control (acuario 4) durante las siete pruebas consecutivas de cinco días de duración cada una.
78
Pruebas Promedio Tratamientos (1,2,3) Control
Nitrito dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5
Prueba1 0.1 0.1 0.3 0.3 0.3 0.1 0.1 0.3 0.3 0.3 Prueba2 0.1 0.3 0.3 0.53 0.6 0.1 0.1 0.3 0.1 0.3 Prueba3 0.1 0.17 0.53 0.5 0.67 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 Prueba 4 0.1 0.3 0.37 1 1 0.1 0.1 0.1 0.3 0.3 Prueba 5 0.1 0.3 0.5 1 0.1 0.1 0.1 0.3 1 Prueba6 0.1 0.3 0.5 0.5 1 0.1 0.3 1 5 Prueba7 0.1 0.3 1 1 1 0.1 0.3 1 1 5
PROM 0.1 0.25285714 0.5 0.69 0.76166667 0.1 0.15714286 0.31666667 0.44285714 1.714285714
ES 5.6656E-
18 0.03137441 0.09099974 0.1132002 0.11805131 5.66558E-
18 0.03688556 0.14240006 0.14777258 0.855076875
Tabla 4: Valores de nitrito (mg/L). La tabla muestra los promedios de los valores de nitrito obtenidos para los tratamientos (acuario 1, 2, 3) y para el
control (acuario 4) durante las siete pruebas consecutivas de cinco días de duración cada una.
79
Tabla 5: Valores de temperatura. La tabla muestra los promedios de los valores de temperatura obtenidos para los tratamientos (acuario 1, 2, 3) y para
el control (acuario 4) durante las siete pruebas consecutivas de cinco días de duración cada una.
Pruebas Promedio Tratamientos (1,2,3) Control
Temperatura dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5
prueba1 19.33 19.23 18.9 18.97 19.1 20 19.5 19 19.1 19.3 prueba2 18.27 19 20.97 20.5 19.97 18.5 19.1 20.9 20.5 20.1 prueba3 18.73 19.4 21 20.03 20.03 18.6 19.4 21 20.2 20.2 prueba 4 17.87 19.63 19.8 19.4 19.9 18.2 19.7 19.8 19.5 19.9 prueba 5 17.73 19.77 19.23 20.73 21.03 17.5 19.8 19.3 20.9 21.2 prueba6 17.67 20.97 21.53 20.77 21.03 17.5 21 21.6 20.8 21.1 prueba7 21 20.8 20.9 21.57 21 21 20.8 21 21.7 21.1
PROM 18.6571429 19.8285714 20.3328571 20.2814286 20.2942857 18.75714286 19.9 20.3714286 20.385714 20.414285 ES 0.45120323 0.28941179 0.3829442 0.33480932 0.28188867 0.491284586 0.27255406 0.37588897 0.3326864 0.2763956
80
Mediciones Iniciales
Acuario 1 Acuario 2 Acuario 3 Control
Talla (cm) 12.3 13.5 12.9 12.8 Talla (cm) 12.5 13.2 13.3 13.6 Talla (cm) 12.7 13.4 13.4 13.5 Talla (cm) 12.6 13.5 12.8 13 Talla (cm) 13.2 13.4 13.5 12.9 Talla (cm) 13 13.1 13.3 13.6 Talla (cm) 12.7 12.9 13.7 12.8 Talla (cm) 13.2 12.8 13.6 12.9 Talla (cm) 12.9 13.1 12.9 13.5 Talla (cm) 13.3 13.2 13.5 13.6
Promedio (T) 12.84 13.21 13.29 13.22
DE 0.33 0.24 0.32 0.36
Peso (g) 29.3 34.3 30.1 31.4 Peso (g) 29.9 33.5 33.5 36.4 Peso (g) 31.5 31.6 33.8 35.1 Peso (g) 29.9 32.8 32.2 33.2 Peso (g) 32 31.4 35.6 32.6 Peso (g) 33.4 32.6 34.6 34.6 Peso (g) 33.2 31.4 33.9 31.4 Peso (g) 32 30.2 34.2 32.2 Peso (g) 31.4 30.5 35.4 31.8 Peso (g) 29.8 32.3 30.4 32.6 Peso (g) 29.9 34.6 32.6 33.1
Promedio (P) 31.12 32.29 33.30 33.13
DE 1.44278771 1.4432287 1.82208672 1.610025409
Tabla 6: Mediciones al inicio del las pruebas. Pesos y tallas de los individuos
de Cheilodactylus variegatus al inicio de las pruebas, dispuestos en un número de
diez para cada acuario (tres réplicas de tratamientos y un control)
81
Mediciones Finales
Acuario 1 Acuario 2 Acuario 3 Control
Talla (cm) 15 16.3 15.9 13 Talla (cm) 15.5 15.6 16.4 14.5 Talla (cm) 15.8 15.8 16.1 14.5 Talla (cm) 15.5 16 15.6 14 Talla (cm) 16 16.3 15.8 13.5 Talla (cm) 16.1 15.5 16.4 13.5 Talla (cm) 15.9 15.7 16.1 13.5 Talla (cm) 16.2 16.2 15.9 Talla (cm) 15.9 15.9 15.8 Talla (cm) 16.2 15.7 16
Promedio (T) 15.81 15.9 16 13.79
DE 0.38 0.29 0.26 0.57
Peso (g) 43.4 50.9 48.5 26.9 Peso (g) 48.2 48.9 52.5 40.6 Peso (g) 50.3 49.1 52.1 38.2 Peso (g) 46.7 49.5 48.5 32.2 Peso (g) 51.2 51.6 48.5 33.4 Peso (g) 52 48.4 52.8 30.6 Peso (g) 50.9 48.8 52 31.8 Peso (g) 51 50.9 49.5 33.4 Peso (g) 52.5 49.7 49.4 Peso (g) 50.5 48.9 49.5 Peso (g) 51.6 48.8 50.2
Promedio (P) 49.85 49.59 50.32 33.39
DE 2.71711746 1.06532112 1.70400598 4.2923312
Tabla 7: Mediciones al término de las pruebas. Pesos y tallas de los individuos
de Cheilodactylus variegatus al término de las pruebas, dispuestos en un número
de diez para cada acuario (tres réplicas de tratamientos y un control). Los espacios
vacíos representan la muerte del individuo.
82
Medios de cultivo empleados
Medio f/2 Guillard modificado para microalgas marinas
Nitratos y fosfatos g/L
KNO3 75
NaH2PO4.2H2O 5.65
Traza de metales (quelantes) g/L
EDTANa2 4.360
FeCl3.6H2O 3.150
CuSO4.5H2O 0.010
ZnSO4.7H2O 0.022
CoCl2.6H2O 0.010
MnCl2.4H2O 0.180
NaMoO4.2H2O 0.006
Mezcla de vitaminas g/L
Cyanocobalamina 0.002 Tiamina HCl 0.100 Biotina 0.001
Solución de metasilicato de sodio mL/L
Na2SiO3.5H2O 10
H3ClO4 5
Caldo Lauryl Sulfato (Lauryl Sulfate Broth)
Componentes g/L
Triptosa 20 Lactosa 5 Cloruro de Sodio 5 Sulfato Lauryl de Sodio 0.1 Fosfato hidrógeno di-potasio 2.75 Fosfato di-hidrógeno de potasio 2.75
83
Agar Plate Count
Componentes g/L
Peptona de caseína 5 Extracto de levadura 2.5 D(+) glucosa 1 Agar-agar 14
Agar Marino
Componentes g/L
Bacto peptona 5 Extracto de levadura 2 Bacto Agar 15 Agar-agar 14
Agua de mar envejecida 750mL
Caldo de enriquecimiento APA
Componentes g/L
Cloruro de Sodio 100 Peptona 20
Agar TCBS ( Thiosulfate Citrate Bile Sucrose)
Componentes g/L
Peptona de caseína 5 Peptona de carne 5 Extracto de levadura 5 Citrato de sodio 10 Tiosulfato de sodio 10 Bilis ox 5 Colato de sodio 3 Sacarosa 20 Cloruro de Sodio 10 Citrato de Fe (III) 1 Azul de timol 0.04 Azul de bromotimol 0.04 Agar-agar 14
84
Agar LIA (Lysine Iron Agar)
Componentes g/L
Peptona de carne 5 Extracto de levadura 3 D(+) glucosa 1 Monohidrocloruro de L-lisina 10 Tiosulfato de sodio 0.04 Citrato Fe(III) de amonio 0.5 Morado de bromocresol 0.02 Agar-agar 12.5
Bactident Oxidasa (cintas)
Componentes Concentración
Cloruro diamonio de N,N-dimetil- 1,4 fenileno………………………. 0.1µmol 1-naftol…………………………… 1µmol
Agar TSA (Tryptic Soy Agar)
Componentes g/L
Peptona de caseína 15 Peptona de soya 5 Cloruro de Sodio 5 Agar-agar 15
Citrato (SIMMONS Citrate)
Componentes g/L
Fosfato dihidrógeno de amonio 1 Fosfato hidrógeno di-potasio 1 Cloruro de sodio 5 Citrato de sodio 2 Sulfato de magnesio 0.2 Azul de bromotimol 0.08 Agar-agar 13
85
Oxidación Fermentación (O/F Basal medium acc. TO Hugh & Leifson)
Componentes g/L
Peptona de caseína 2 Extracto de levadura 1 Cloruro de sodio 5 Fosfato hidrógeno di-potasio 0.2 Azul de Bromotimol 0.08 Agar-agar 2.5
Medio SIM (SIM Medium)
Componentes g/L
Peptona de caseína 20 Peptona de carne 6.6 Citrato Fe(II) de amonio 0.2 Tiosulfato de sodio 0.2 Agar-agar 3
Agar TSI (Triple Sugar Iron Agar)
Componentes g/L
Peptona de caseina 15 Peptona de carne 5 Extracto de carne 3 Extracto de levadura 3 Cloruro de sodio 5 Lactosa 10 Sacarosa 10 D(+) glucosa 1 Citrato Fe(III) de amonio 0.5 Tiosulfato de sodio 0.5 Rojo de fenol 0.024 Agar-agar 12
Caldo TSB (Tryptic Soy Broth)
Componentes g/L
Peptona de caseína 17 Peptona de soya 3 D(+) glucosa 2.5 Cloruro de Sodio 5