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INGENIERÍA GENÉTICA I
• Primrose SB, Twyman RM y Old RW. (2001). “Principles of Gene
Manipulation”, 6th ed. Blackwell Science.
• Sambrook J, Russell DW y Sambrook J. (2001). “Molecular Cloning: A
Laboratory Manual”, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
1
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1. ELECTROFORESIS
2. PCR
3. SECUENCIACIÓN
2
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ELECTROFORESIS
• Agarosa
• Poliacrilamida
3
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Finalidad de la electroforesis
• Separar
• Identificar
• Purificar
4
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1
2
3 4
5
5
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Migración
• Tamaño del ADN
• Concentración de agarosa
• Tipo de agarosa
• Conformación del ADN
• Voltaje
• Presencia de bromuro de etidio
• Tampón de electroforesis
7
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Concentración de
agarosa
Tamaño de los
fragmentos
de ADN separados
0.3%
0.5%
0.7%
1.0%
1.2%
1.5%
2.0%
5-60 kpb
1-30 kpb
0’8-12 kpb
0’5-10 kpb
0’4-7 kpb
0’2-3 kpb
0’05-2 kpb
8
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Tinción del ADN
• Bromuro de etidio
– absorbancia a 302 y 366 y emisión a 590 nm.
– Detecta hasta 10 ng de ADN.
• Sybr-Green
• Sybr-Gold (x1000)
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PCR
11
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APLICACIONES DEL PCR
• Amplificación de genes utilizados como
cronómetros evolutivos (ARNr 16s y 18s,
ITS, etc.)
• Amplificación de genes característicos
• Clonación
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ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DE
NUCLEÓTIDOS
3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’5’-A-3’5’-AGA-3’5’-AGACCTGCA-3’5’-AGACCTGCATTTA-3’5’-AGACCTGCATTTATAA-3’5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCA-3’
4 reacciones: ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP
ddATP
5’-A-3’
5’-AGA-3’
5’-AGACCTGCA-3’
5’-AGACCTGCATTTA-3’
5’-AGACCTGCATTTATA-3’
5’-AGACCTGCATTTATAA-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCA-3’
ddATP
3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’
5’-AG-3’
5’-AGACCTG-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAG-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCG-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCG-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCAG-3’
ddGTP
3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’
5’-AGACCT-3’
5’-AGACCTGCAT-3’
5’-AGACCTGCATT-3’
5’-AGACCTGCATTT-3’
5’-AGACCTGCATTTAT-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCAGT-3’
ddTTP
3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’
5’-AGAC-3’
5’-AGACC-3’
5’-AGACCTGC-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGC-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCC-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGC-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCC-3’
ddCTP
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGC-3’
16
3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
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http://www.ebi.ac.uk/services/
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