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INMUNOHEMATOLOGÍA
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DEFINICIÓN: Es la parte de la hematología que estudia los
procesos inmunitarios que tienen lugar en el organismo en relación con los elementos sanguíneos.
Uno de los aspectos más importantes de la inmunohematología es el estudio y cuantificación de los grupos sanguíneos eritrocitarios que son componentes antigénicos presentes en la superficie de los hematíes, ya que se relaciona directamente con la terapéutica transfusional y la prevención de accidentes hemolíticos graves.
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En primer termino se identificaron sobre los hematíes, pero luego se describieron determinantes antigénicos plaquetarios, leucocitarios y séricos.
Los genes determinantes de los grupos sanguíneos transmiten, generalmente, caracteres codominantes ( se expresan en homocigotos y heterocigotos).
Existen genes “amorfos” que no generan productos que puedan ser identificados como antígenos ( ej: gen d)
Todos los antígenos de los grupos sanguíneos han sido definidos serológicamente por la presencia de sus anticuerpos correspondientes.
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Grupos Eritrocitarios y sus Antígenos
Fya, FybDuffy
Jka, JkbKidd
K, k, Kpa, KpbKell
Lua, LubLutheranP1, P2P
Lea, LebLewis
M, N, S, s, UMNS
D, C, c, E, eRh
A, B, AB, OABO
ANTÍGENOS MAS IMPORTANTES
GRUPOS SANGUÍNEOS
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Karl Landsteiner (1868-1943)GRUPOS SANGUÍNEOS
1900
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LOS GRUPOS SANGUÍNEOS SON ALOGÉNICOS.
La mayoría de los individuos desarrollan anticuerpos frente a los antígenos ABO alogénicos aunque no hayan sido expuestos a eritrocitos extraños; esta sensibilidad se debe al contacto con epítopes idénticos que casualmente expresan de forma rutinaria una gran cantidad de microorganismos.
Los anticuerpos frente a los antígenos ABO son muy frecuentes, lo que hace especialmente importante la verificación de los grupos del donante y del receptor antes de llevar a cabo una transfusión sanguínea.
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SISTEMA ABO: GENÉTICA. Interacción con el sistema Hh Un sistema de grupo sanguíneo consiste en un locus
génico que codifica un Ag de la superficie de las células sanguíneas (generalmente de los eritrocitos). En cada uno de los sistemas puede haber 2 o mas fenotipos. Por ejemplo, en el sistema ABO existen 4 fenotipos ( A, B, AB y O ), por lo tanto son posibles 4 grupos sanguíneos.
Un individuo con un determinado grupo sanguíneo es capaz de reconocer los eritrocitos que posean antígenos de un grupo sanguíneo alogénico y producir ANTICUERPOS contra ellos.
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El locus ABO tiene tres alelos: A, B y O, y por el hecho de ser diploide todo individuo será portador de dos alelos.
Los genes A y B son codominantes,y producen enzimas que actuan como transferasas específicas, capaces de transformar por glicocilación la SUSTANCIA H, presente en todos los hematíes en los ÁNTIGENOS A y B, mientras que el gen 0 es recesivo, no expresando ningún producto antigénico.
Ello hace que existan seis genotipos diferentes (AA, AO, BB, BO, AB y OO) pero solo cuatro fenotipos posibles: A, B, AB y 0.
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SISTEMA ABO: Genotipos posibles para cada Fenotipo.
Anti-A yAnti-B
ninguno
Anti-A
Anti-B
Anticuerpos séricos frente a
ABO
42,10HOOO
3,57A y BA1BA2B
A1BA2B
8,65BBBBO
B
45,56AA1A1A1A2
A1 OA2 A2
A2 O
A1A2
Frecuencia(%)
AntígenosGenotiposposibles
Grupo sanguíneo( fenotipos)
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SISTEMA ABO: GENÉTICA
Los genes A y B controlan la expresión de las sustancias A y B.
El gen 0 se denomina “amorfo” por no corresponderle ningun antígeno.
Sin embargo, los hematíes del grupo 0 expresan un “antígeno H”, que es reconocido por determinados antisueros y lectinas vegetales.
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Sustancia precursora TIPO I
Sustancia precursoraTIPO II
Glc-NACGal GalGlc-NACGal Gal GR GR
Unión 1,3 Unión 1,4
El precursor de TIPO I tiene una galactosa terminal (Gal)unida a una N-acetil-glucosamina subterminal(GlcNac) por una unión 1,3.
Los mismos azucares se unen mediante un enlace 1,4 en el precursor de TIPO II.
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Sustancia HTIPO I
Sustancia HTIPO II
Glc-NACGal GalGlc-NACGal Gal GR GR
Fuc Fuc
1,2 fucosiltransferasa
Gen H
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ANTÍGENO A(TIPO II)Glc-NACGal Gal
GR
Fuc
Gal Glc-NAC Gal
GR
Fuc
NAcGal
GalANTÍGENO B
(TIPO II)
1,3 N-acetilgalactosaminiltransferasa
1,3 galactosiltransferasa
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SUBGRUPOS ABO Von Durgern y Hirszfeld en 1910 descubrieron estos subgrupos. Al observar que si al suero del grupo B se adiciona sangre del
grupo A, hace perder su poder de aglutinación y así mismo podía continuar aglutinando otras sangres de los grupo A y AB.
Así surgieron los subgrupos de estos grupos A1, A2, A1B y A2B.
Sustancia H1 H1
Precursora H2 H2
H3
H4
Fenotipo A1 A2
Frecuencia 80 % 20 %
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GRUPO BOMBAY Los individuos con genotipo HH o Hh producen la enzima 1,2-
fucosiltransferasa que transforma la sustancia precursora en Sustancia H.
Los individuios con fenotipo BOMBAY con genotipo hh no producen dicha enzima, por lo que no pueden modificar la sust. precursora, lo que hace que no puedan sitetizar SUSTANCIA H.
Esto condiciona a que los genes del sistema ABO (si los tuviesen ) no pueden expresarse, por lo que parecen ser del grupo O.
Presentan de manera constante además de anti-A y anti-B, unanticuerpo natural anti-H muy activo a 37ºC, capaz de hemolisar los hematíes de cualquier individuo que no sea de fenotipo BOMBAY.
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El antiAB producido en individuos de fenotipo O no es una mezcla de antiA y antiB, sino que se trata de un tercer anticuerpo que presenta reacción cruzada con un antigeno presente en los hematíes AB. Este antigeno se denomina “Antigeno C” o “Compuesto AB”.
Los títulos de antiA y antiB con frecuencia están disminuidos en pacientes ancianos y con hipogammaglobulinemia, por lo que puedo tipificar erróneamente cuando haga el GRUPO SERICO.
Los RN no producen títulos normales de antiA y antiB hasta los 36 meses de edad, alcanzando el titulo máximo entre los 5 a 10 años de edad.
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Anti-A y Anti-B No anticuerpos Anti-A Anti-B En el plasma
Noantígenos
Antígenos A y B
AntígenoB
AntígenoA
En la membrana
Glóbulos rojos
OABBAGrupo sanguíneo
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SISTEMA RH En 1939 Levine descubre que una mujer embarazada
forma anticuerpos contra un antigeno eritrocitario de su hijo, el Rh (D). Es asi como se descubre la existencia de ALOANTICUERPOS.
En 1940 Landsteiner y Weiner inyectaron glóbulos rojos de primates (Macacus rhesus) en conejos, luego extrajeron suero de los conejos inmunizados y observaron que aglutinaban el 85 % de los hematíes de los primates y el mismo porcentaje en humanos.
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FISHER-RACE:
Se heredan de cada progenitor 3 genes.
Situados en loci próximos.
Los alelos se designan: D y d, E y e, C y c.
Cada gen codifica para un Ag especifico: D, C, c, E , e.
La presencia o ausencia del Ag D determina si un individuo es Rh positivo o Rh negativo.
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WIENER: Herencia de un solo gen procedente de
cada progenitor.
Cada gen con una estructura de mosaico.
Ej.: El gen R1, codificaría factores que corresponden a C, D y e de la nomenclatura Fisher- Race; el gen r produciría los antígenos c y e pero no D, C, ni E.
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Comparación de las nomenclaturas para los Ag del Sistema Rh
Rh5ehr”
Rh4ch`r
Rh3Erh”
Rh2Crh`
Rh1DRho
RosenfieldFisher –RaceWiener
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cde
cdE
Cde
CdERh-
cDe
cDE
Cde
CDERh+
GenesFenotipos
Fisher-Rice
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Características del Antígeno D
10.000 a 40.000 sitios D
Ag de maduración eritroide
Polipeptidos membranales hidrófobos (28-32 Kda)
No están glicosilados ni fosforilados
Poseen residuos palmitilados y acilados
Asociados al citoesqueleto
Marcadores de línea celular
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COMPLEJO RH
Polipéptidos Rh
Glicoproteína asociada Rh50
Otras glicoproteínas LW, GPB, CD47 y Banda 3
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Complejo Rh
RhD
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Antígeno D debil
El antígeno Du aparece como un Rh(+) con ciertos antisueros y como Rh(-) con otros
El antígeno Du se transmite según las leyes de Mendel
Existen dos tipos de Du: Alto grado Bajo grado (detectados sólo por absorción – elución)
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Determinación de Ag D debil
Coombs Indirecto
Enzimas proteolíticas
Técnicas en gel
Pruebas de absorción-elución (de referencia)
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Importancia
Es especialmente importante su detección en los dadores de sangre (el antígeno Du esinmunógeno)
En las mujeres embarazadas (no debeaplicarse la gamaglobulina anti-D)
Antígeno relativamente raro en la raza blanca
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ANTICUERPOS anti-Rh
Todos los anticuerpos del Sistema Rh provienen de una alo-inmunización por embarazo o transfusión. Son Aloanticuerpos
Este sistema no posee anticuerpos naturales Clase IgG (IgG1 ó IgG3) no aglutinantes en salino
(enzimas, TCI) No fijan complemento Excepcionalmente IgM fuertemente aglutinantes
El antígenos D es el mas inmunógeno.Los anticuerpos anti-Rh son clínicamente significativos.
Enfermedad Hemolítica ReacciónFetoneonatal Transfusional
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Especificidades Anti-D: es el mas frecuente. Puede causar RT y
EHFN severa. Anti-c: muy frecuente. Puede causar RT y EHFN severa. Anti-E: muy frecuente. Puede causar RT y
EHFN severa. Anti-C: raramente solo; está presente en
mezclas: antiC+D. Pueden provocar RT y EHFN.
Anti-Cw: puede causar RT y EHFN. Anti-e: poco frecuente. Puede causar RT y
EHFN. Especificidad encontrada frecuentemente como autoanticuerpos
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Asociación a enfermedades
Los individuos con fenotipos Rh null padecen anemia hemolítica compensada.
Se ha observado una expresión reducida de los Ag Rh y mosaicismo Rh en leucemias, metaplasia mieloide, mielofibrosis y policitemia.
Los genes Rh y la esferocitosis hereditaria están ligados al cromosoma 1.
En poblaciones del sudeste asiático con ovalocitosislos antígenos del Rh están expresados débilmente.
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Determinacion del fenotipo Rh
En la practica clínica se dispone de para la tipificación del fenotipo Rh de :
anti-D, anti-C, anti-c, anti-E y anti- e
Determinacion del genotipo Rh La identificacion del fenotipo no siempre permite la deduccion
confiable del genotipo, me permite deducir el genotipo mas probable.
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Frecuencias fenotipicas del Sistema Rh
98e30E80c70C15D(-)85D (+)
Frecuencia ( %)ANTIGENO Rh
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Otros grupos sanguíneos Sistema Kell: Los antigenos mas importantes de este sistema son: K, k , Kpa,
Kpb, Kpc, Jsa y Jsb. Todos de importancia clínica. El anti- K es el anticuerpo irregulas mas común después del anti-
D, ya que puede causar severas reacciones transfusionales y EHFN. Es un anticuerpo del tipo IgG, que reacciona a 37 C por TCI.
El anti- k fue encontrado por primera vez en una mujer cuyo bebe desarrollo EHFN. Tiene las mismas características del anti- K.
Sistema Duffy. Sistema Kidd: Puede ocasionar EHFN y reacciones
transfusionales hemoliticas. Sistema MNSs :EHFN y reacciones transfusionales hemoliticas. Sistema I/ i
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FORMAS DE ESTUDIAR LOS GRUPOS FORMAS DE ESTUDIAR LOS GRUPOS SANGUSANGUÍÍNEOSNEOS Hay diferentes formas de evidenciar una
reacción Antígeno-Anticuerpo:
Dado que los Ags eritrocitarios, se encuentran el la superfície de la células, las formas mas utilizadas para su estudio son: AGLUTINACIÓNy HEMÓLISIS.
AGLUTINACIÓNHEMÓLISISINHIBICIÓN ABSORCIÓN Y
ELUCIÓN
ELISA
RIA
PRECIPITACIÓN
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ETAPAS DE LA AGLUTINACIÒN
La aglutinación se produce en dos etapas:
La primera es la unión Ag-Ac La segunda la formación de puentes
intercelulares que producen el fenómeno visible de la aglutinación.
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PRIMERA ETAPA
Está influenciada por las siguientes variables: Temperatura: IgM reaccionan a 4ºC, IgG a37ºC Afinidad entre Ag y Ac PH optimo :6.5 y 7.6 Concentraciòn relativa del Ag y Ac.puede ocurrir disminuciòn de
la aglutinaciòn cuando hay exceso de Ac(prozona) o exceso de Ag(postzona)
Fuerza iónica del medio : al disminuir ,disminuye la nube de cationes que rodea lo GR favoreciendo la uniòn Ag- Ac
Medios de potenciaciòn: *Soluciones de baja fuerza iònica :LISS: reduce la neutralizaciòn de cargas opuestas aumentando la velocidad de reacciòn y tambien la cantidad de Ac unido al hematíe.
Tiempo de incubación: Las diferentes reacciones Ag-Ac alcanzan el equilibrio en tiempos diferentes. Incubación varía : 15 a 60 min
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SEGUNDA ETAPA
Potencial Z Densidad del Ag Clase de Ig involucrada Para potenciar las reacciones de aglutinaciòn se
emplean diversos métodos: centrifugación controlada, adición de medios macromoleculares, de Enzimas proteolìticas y el uso del test de Coombs permite detectar la sesibilizaciòn de los GR por IgG que generalmente no producen aglutinaciòn
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Potencial Z
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Enzimas proteolíticas que eliminan las cargas (-) de la superfície celular
Papaína Bromelina Eliminan el Acido Sálico Tripsina
Otras sustancias: ● Albúmina bovina● Dextrán
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GR con menos cargas negativas en su superficie, lo que permite que se aproximen lo suficiente para que se establezcan los puentes de unión por moléculas de IgG.
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Soluciòn salina de baja fuerza iónica :LISS
Permite aumentar hasta 1000 veces la afinidad entre Agy Ac.
Aumenta la sensibilidad de la prueba de Coombs. Permite detectar Ac en baja concentración y de baja
afinidad Permite reducir el Tiempo de incubaciòn de la Coombs
de 30´ a 10´ Por esta razòn el TCI en LlSS es la prueba de elecciòn para la detecciòn e identificaciòn de Acde tipo IgG
Se la utiliza : Prueba de compatibilidad pretransfusionaly detección de Ac irregulares en donantes y receptores, detección de Ac irregulares en embarazadas y tipificación de Ag eritrocitarios.
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Antisueros específicos Anti-A Anti-B Anti-D :pueden ser de origen
Humanos,animal o monoclonales,tambien pueden ser extractos de tejidos vegetales (Lectinas).Se debe considerar la especificidad, tìtulo,intensidad de la aglutinaciòn, avidez
Anticuerpos obtenidos por inmunizaciòn: Son policlonales (mezcla de Ac contra distintos epitopes
d euna misma molècula) Se obtienen por imnunizaciòn de animales o persona
sensibilizadas
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Anticuerpos monoclonales Se obtienen de los hibridomas son monoclonales (clon
de células que poseen especificidad contra un único epitope).
Los antisueros hemoclasificadores anti-A, anti-B yanti-AB son monoclonales
El antisuero anti-D : mezcla de monoclonal IgM que favorece la reacciòn en placa y un Ac IgG policlonalhumano para el TCI en la determinaciòn del Du
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Reactivo Antiglobulina Humana Se obtiene inyectando a conejos con globulinas
humanas purificadas Reactivos poliespecíficos : Contiene 2 anticuerpos :anti-IgG y anti-C3d en los
estudios de Ac irregulares ,la presencia de anticomplemento favorece la detección de anti-Jka ,anti-JKb, anti-K
Cuando el test de CD da (+) ,debe investigarse mediante los sueros antiglobulina monoespecificos el tipo de anticuerpo o fracción del complemento unido al GR
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Reactivo Monoespecifico: Anti-IgG ,Anti-IgM, Anti-IgA Anti-C3d, Anti-C3b, Anti-C4b Se obtienen de modo análogo ,inyectándolas distintas
fracciones separadas y purificadas a los conejos TCD: Sensibilidad : permite detectar entre 100 y 500
moléculas de Ig/GR y entre 400-1100 moléculas de C3d/GR
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PRUEBA ANTIGLOBULINICA ( Coombs)
Detecta Acs de tipo IgG o fracciones del C`adheridos a los GR.
Existen dos técnicas: a) Directa: Detecta Acs adheridos a los GR “in vivo”.
b) Indirecta: Determina Acsexistentes en el suero o plasma del paciente, previa incubación del suero con GR apropiados.
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DIRECTA: TCD● Diagnostico de AH y EHRN.● Investigación de reacciones dudosas
en una transfusión.● Investigación de enfermedades autoinmunes.
INDIRECTA: TCI● Screening de sueros de donantes y pacientes para
Acs.● Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión.●Identificación y titulación de Acs encontrados ensueros.
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PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD
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AGLUTINACIAGLUTINACIÓÓN N ÓÓ HEMHEMÓÓLISIS EN CUALQ. PASO ( +): LISIS EN CUALQ. PASO ( +): INCOMPATIBLE.INCOMPATIBLE.
SUSPENSISUSPENSIÓÓN HOMOGENEA EN TODOS LOS PASOS ( N HOMOGENEA EN TODOS LOS PASOS ( -- ):):COMPATIBLE.COMPATIBLE.
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DETECCIÓN DE ACS IRREGULARES
TITULACIÓN
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TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9
S F - 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL100 µL 100 µL
100 µL 100 µLDEL TUBO 2 SE TOMA 100 µL Y SE LO PASA A LOS DEMAS EN FORMA
SUCECIVARESERVAR 100 µL DEL TUBO 10 SUEROS 100 µL 100 µL
100 µL 100 µL
100 µL 100 µL
GR 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
DILUCION 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
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CRIOAGLUTININAS
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TUBOS
1/4 1/16 1/64 1/256 1/1024 1/4096
6 Gts SF 2 Gts Suero
2 gotas
2 gotas
6 Gts SF 2 Gts Suero
2 gotas
2 gotas
6 Gts SF 2 Gts Suero
2 gotas
2 gotas
6 Gts SF 2 Gts Suero
2 gotas
2 gotas
6 Gts SF 2 Gts Suero
2 gotas
2 gotas
6 Gts SF 2 Gts Suero
2 gotas
2 gotas
SERIE 1
SERIE 2
SERIE 3
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AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2GTS SUSPENSIAGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2GTS SUSPENSIÓÓN HEMATIES N HEMATIES PACIENTEPACIENTE
AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS SUSPENSIAGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS SUSPENSIÓÓN HEMATIES DEL N HEMATIES DEL GRUPO O IGRUPO O I
AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS DE LA SUSPENSIAGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS DE LA SUSPENSIÓÓN DE N DE HEMATIES DE CORDON O iHEMATIES DE CORDON O i
Incubar los tubos a 4 Incubar los tubos a 4 ºº c c -------- 24hs24hs
SERIE 1
SERIE 2
SERIE 3
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PARA DETERMINAR RANGO TERMICO , EFECTUAR LAS TITULACIONES PARA DETERMINAR RANGO TERMICO , EFECTUAR LAS TITULACIONES E INCUBARLAS A 37 E INCUBARLAS A 37 ºº C ( 1H ) ,A 20C ( 1H ) ,A 20ºº C ( 4 HS ) y A 4 C ( 4 HS ) y A 4 ºº C ( 24 HS ) C ( 24 HS )
V N : TV N : TÍÍTULO MAYOR 32 TULO MAYOR 32
SI DSI DÁÁ (+ ) EN LA SERIE CON AUTOGLOBULOS Y GL(+ ) EN LA SERIE CON AUTOGLOBULOS Y GLÓÓBULOS BULOS DE ADULTO, LA ESPECIFICIDAD ES ANTI I DE ADULTO, LA ESPECIFICIDAD ES ANTI I
SI DSI DÁÁ ( + ) EN LA SERIE DE AUTOGL( + ) EN LA SERIE DE AUTOGLÓÓBULOS Y GLBULOS Y GLÓÓBULOS BULOS DE CORDDE CORDÓÓN , LA ESPECIFICIDAD ES ANTI i N , LA ESPECIFICIDAD ES ANTI i
SI DSI DÁÁ ( + ) CON LAS 3 SUSPENSIONES ES NECESARIO ( + ) CON LAS 3 SUSPENSIONES ES NECESARIO EFECTUAR UN PANEL IDENTIFICADOR .EFECTUAR UN PANEL IDENTIFICADOR .
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E H F N
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CLASIFICACIÓNSegún la especificidad del Ac
EHFN: por acs contra ags del sistema RH ( más severa )Madres RH ( neg) sensibilizadas con anti-D
EHFN: por acs contra ags del sistema ABO ( menos severa )
Madres de grupo “ 0 “
EHFN : por acs contra ags de otros sistemas
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ENFERMEDED HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO (EHRN)
* Ictericia Signos * Anemia
* Esplenomegalia* Hepatomegalia
Causas + común ( Incompatibilidad sanguínea materno-fetal)
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DIAGNÓSTICO : Etapa prenatal + ABO , Fenotipo R D débil ( RH negativo ) Determinación Ag Kell
INCOMPATIBILIDAD POTENCIALMujer “ O “ C c D E E kHombre “ A “ C c D e e k
INCOMPATIBILIDAD REAL
Investigar Acs irregulares ( panel eritrocitario select)- Medio salino- Medio enzimático- LISS / Coombs
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•Acs irregulares : título e identificación 16 / 18 semSi es ( - ) repetir 28 / 32 semSi es ( + ) repetir 20 / 22 sem ó c/ 15 dias
si aumenta* Estudios de LA ( mujeres con título > 16 + historia obstetrica
* Genotipificación R H D fetal
* Feto – Ultrasonido -----EC ( hígado- bazo )_ Muestra sangre fetal ( 18 sem )
ESTUDIOS EN LA MUJER EMBARAZADA
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PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN
* A la madre : Tipificación ABO Y RH ( VARIANTES DU )Panel selector ( aloanticuerpos maternos )
* En el niño : Tipificación A B O y R H P C DH b , Hto cordón , BRR I de cordónReticulocitos
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T T O de la mujer aloinmunizada
PLASMAFÉRESIS ( pueden ser removidos hasta un 75 % de alo Acs pero tienden a rebotar )
ADMINISTRACIÓN DE GAMMA GLOBULINA ( en altas dosis 400mg / kg de peso materno durante 5 días)
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El tratamiento del neonato ya afectado depende de la severidad de la condición.
LEVE: Aumento agresivo de
líquidos Fototerapia usando
lámpara de bilirrubina.KERNICTERUS:
Exanguinotransfusion(pueden requerirse varias)
Fototerapia
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HALLAZGOS HEMATOLÓGICOS EN EL RECIEN NACIDO
* Aumento de reticulocitos . 10- 30 %evidencia de proceso hemolítico
compensado
* Eritroblastos en sangre periférica 8---15 %
* Microesferocitos 80 %
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