INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
Identificación de algunos factores que afectan la interacción jitomate‐
Ralstonia solanacearum‐ bacteriófago ITL‐1
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN CIENCIAS
EN
MANEJO AGROECOLÓGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES
PRESENTA
GUADALUPE MONSERRAT ALVARADO JASSO
YAUTEPEC, MORELOS, DICIEMBRE DEL 2013
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Roberto Montes Belmont y al Dr. Jesús Hernández Romano por la oportunidad de
trabajar con ustedes. Gracias por su conocimiento transmitido, por la disposición y por
aguantarme estos dos años y medio.
A los integrantes de mi comité tutorial y comisión revisora que sin duda sus comentarios y
observaciones enriquecieron la tesis.
A todos mis compañeros y trabajadores del CeProBi, especialmente a Itzel Ramos
Figueroa, Maribel García Mahecha y Jaime Rivera Contreras por el apoyo incondicional y
por haber hecho una estancia divertida e inolvidable.
Al Instituto Politécnico Nacional (IPN), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(CONACYT) y al programa de formación e investigadores (PIFI) del IPN por el apoyo y
financiamiento para realizar mis estudios de maestría.
ÍNDICE
Páginas
RESUMEN I
ABSTRACT II
I INTRODUCCIÓN 1
II Antecedentes 3
2.1 Importancia del cultivo de jitomate 3
2.2 Marchitez bacteriana 4
2.3 Síntomas y ciclo de la enfermedad en jitomate 8
2.4 Manejo de la marchitez bacteriana en jitomate 10
2.5 Bacteriófagos en el control biologico 12
2.6 Clasificación y ciclos de vida de os bacteriófagos 14
2.7 Receptores fágicos en la bacteria Ralstonia solanacearum 18
2.8 Uso de bacteriófagos para el manejo de Ralstonia solanacearum 20
2.9 Factores que intervienen en la aplicación de bacteriófagos como control biológico
23
2.10 Objetivo general 24
2.11 Objetivos específicos 24
III Materiales y Métodos 25
3.1 Origen de la cepa bacteriana y del bacteriófago ITL‐1 25
3.2 Estandarización de la técnica de producción in vitro del
bacteriófago ITL‐1
25
3.2.1 Preparación del stock bacteriano 27
3.2.2 Titulación de bacteriófagos mediante la técnica de doble capa de agar 27
3.3 Evaluación de los efectos preventivo y curativo del bacteriófago ITL‐1 29
3.3.1 Diseño experimental para evaluar el efecto preventivo y curativo del
bacteriófago ITL‐1
29
3.3.2 Evaluación de la progresión de la enfermedad 30
3.3.3 PCR de colonia para determinar la presencia de R. solanacearum en 31
aislamientos microbianos
3.4 Evaluación de la patogenicidad de la cepa bacteriana utilizada 32
3.5 Evaluación de la estabilidad del bacteriófago ITL‐1 en diferentes
sustratos utilizados para el cultivo de jitomate en Morelos
32
3.5.1 Evaluación de la utilidad de la técnica de PCR tiempo real para cuantificar al bacteriófago ITL‐1
33
3.6 Comportamiento de factores ambientales durante los experimentos de
infección
36
3.7 Influencia del origen del agua de riego sobre la actividad del bacteriófago
ITL‐1
37
IV Resultados y discusión 39
4.1 Producción in vitro del bacteriófago ITL‐1 39
4.2 Efecto preventivo y curativo del bacteriófago ITL‐1 en plantas de
jitomate
41
4.3 Comportamiento de los factores ambientales durante la infección con R.
solanacearum en los ensayos en el bioespacio e invernadero
46
4.4 Evaluación de oligonucleótidos para la cuantificación viral por PCR‐RT 49
4.5 Evaluación del efecto de diferentes sustratos sobre la actividad del
bacteriófago ITL‐1
45
4.6 Evaluación del efecto de diferentes sustratos sobre la actividad del
bacteriófago ITL‐1
51
4.7 Influencia del origen del agua de riego sobre la actividad del bacteriófago
ITL‐1
54
VI Conclusiones 58
VII Bibliografía 59
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Diferencia entre biovares de R. solanacearum de acuerdo a su
metabolismo oxidativo de diversos azúcares
6
Cuadro 2. Determinación de razas en R. solanacearum y relación con
los biovares
7
Cuadro 3. Descripción de algunas ventajas y desventajas de los
bacteriófagos
13
Cuadro 4. Mezcla de reacción utilizada para el PCR‐RT 35
Cuadro 5. Concentraciones fágicas utilizadas en la curva patrón para el
fago ITL‐1, cuantificado por PCR‐RT
36
Cuadro 6. Ciclo umbral (Ct) obtenido por cada uno de los tres pares de
oligonucleótidos evaluados para cuantificar al bacteriófago ITL‐1
por PCR‐RT
50
Cuadro 7. Valores de capacidad de retención, pH y conductividad eléctrica
de los sustratos
52
Cuadro 8. Valores de pH y conductividad eléctrica obtenidos por cada
fuente de agua
55
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Síntomas de marchitez bacteriana en jitomate causada por
R. solanaceraum
9
Figura 2. Ciclo lítico y Ciclo lisogénico de bacteriófagos 15
Figura 3. Clasificación de Bacteriófagos considerando características
genómicas, morfología y la presencia o ausencia de cola
17
Figura 4. Fagos que infectan a R. solanacearum 22
Figura 5. Microfotografía electrónica del bacteriófago ITL‐1 25
Figura 6. Representación gráfica de la cuantificación viral 28
Figura 7. Ubicación en el genoma del bacteriófago ITL‐1 de los tres pares
de oligonucleótidos
34
Figura 8. Perfiles de crecimiento bacteriano después de inocular al
bacteriófago ITL‐1 en diferentes momentos de la curva de
crecimiento microbiano
40
Figura 9. Corte transversal del tallo de la planta de jitomate 42
Figura 10. Plantas de jitomate expuestas a R. solanacearum 43
Figura 11. Identificación cultural y por PCR de R. solanacearum en
exudados de los tallos de las plantas de jitomate
44
Figura 12. Condiciones de temperatura y porcentaje de marchitez que se
presentaron durante 19 días en el bioespacio y el invernadero
47
Figura 13. Condiciones de humedad relativa y porcentaje de marchitez que
se presentaron durante 19 días en el experimento de infección
48
Figura 14. Perfiles de amplificación del fago ITL‐1, utilizando tres pares de
oligonucleótidos diferentes
49
Figura 15. Perfiles de amplificación del fago ITL‐1, utilizando el par de
oligonucleótidos ITL1‐RT1 y seis diluciones en base 5
50
Figura 16. Curva patrón para la cuantificación del fago ITL‐1 por PCR‐RT
utilizando los oligonucleótidos ITL1‐RT1
51
Figura 17. Influencia del sustrato en la actividad del bacteriófago ITL‐1. Las 53
literales iguales indican que no hay diferencia estadísticamente
significativa
Figura 18. Estabilidad del bacteriófago ITL‐1 en agua de diferente origen 56
I
RESUMEN
La marchitez bacteriana del jitomate (Solanum lycopersicum) causada por Ralstonia
solanacearum, es uno de los principales factores limitantes de la producción de este
cultivo. Una de las alternativas para el manejo integrado de esta enfermedad es el control
biológico a base de bacteriófagos. En este trabajo se evaluó la interacción entre el
bacteriófago ITL‐1, el fitopatógeno bacteriano Ralstonia solanacearum y la planta de
jitomate. El proceso de producción del bacteriófago se analizó a nivel laboratorio para
reducir el tiempo de producción. Se evaluaron los efectos protector y curativo del
bacteriófago ITL‐1 bajo un diseño completamente al azar con 5 tratamientos y 10
repeticiones, utilizando plantas crecidas en un sustrato de tepojal/turba 0.5/0.5. Después
de un mes, no se encontraron plantas con síntomas de la enfermedad y tampoco se
detectaron fagos en lixiviados de macetas con plantas tratadas, por lo que se procedió a
analizar las posibles causas de estos resultados. Se comprobó la presencia de la bacteria
en las plantas inoculadas y se realizaron análisis de la influencia de la temperatura y la
humedad relativa, así como del efecto de diferentes sustratos y fuentes de agua de riego
sobre la estabilidad del fago utilizando como sustratos turba, turba‐tepojal (0.5/0.5),
tezontle, tepojal, fibra de coco, suelo de Coatlán del Río y suelo de Zacatepec. Se preparó
una solución fágica con 1x106 PFU/mL para aplicarse a cada uno de los sustratos y se
cuantificó la concentración viral en el lixiviado, registrando sus valores de pH y
conductividad. Los resultados mostraron que en los lixiviados derivados de la turba y de la
mezcla de ésta con tepojal, el pH disminuyó a cerca de 3.0. Se realizó un análisis de
viabilidad del fago en agua de cinco orígenes y usadas para el riego de cultivos de
jitomate, procedentes de Coatlán del Río, Zacatepec, San Gaspar, y dos muestras de agua
potable de la UPEMOR. Para esto, a cada agua se le aplicó una concentración de 1x106
PFU/mL y se titularon los lixiviados a las 3 h y posteriormente a los días 3, 6, 9, 12, 15 y
18. Los resultados mostraron que hay diferencias sustanciales a la viabilidad del fago
cuando se cultiva en el agua de diferente origen. Finalmente, los datos de temperatura y
humedad relativa sugieren que no se presentaron las condiciones adecuadas para que se
desarrollara la enfermedad en las plantas expuestas al fitopatógeno.
II
ABSTRACT
Tomato bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is one of the main limiting factors
of production. One of the alternatives for the integrated management of this disease is
the use of biological control based on bacteriophages, these are ubiquitous in the world
and are the most abundant biological entities on earth, the estimates range of population
is 1030‐1032. Bacteriophages have been used in pharmaceutical, food industry and as
biological control method. For this reason, in this work it was evaluated the interaction
between bacteriophage ITL‐1, Ralstonia solanacearum and tomato (Solanum
lycopersicum). Bacteriophage production process was optimized at laboratory level to
reduce the production time. Later, it was done an in situ assay testing the protective and
curative effect of bacteriophage ITL‐1 under a completely randomized design with 5
treatments and 10 replicates, after a month into the experiment, there were no wilt
plants, so we proceeded to analyze the possible causes of this result. It was evaluated the
effect of different substrates and water sources for irrigation for bacteriophage stability,
and the influence of temperature and relative humidity on disease development..
Evaluated substrates were peatmoss, peatmos‐tepojal 50% ‐50%, tezontle, tepojal, and
soil samples of Coatlán del Río and Zacatepec. Bacteriophage solution was prepared with
1x106 PFU/mL to apply to each of the substrates and viral concentration in the leachate
was quantified 1 hour after application, registering values of pH and conductivity. The
results showed that the peatmoss and the mix of this with tepojal decreased the pH, so
we assumed that this condition inactivated the bacteriophage. In the case of water supply,
it was made a stability analysis of phage in five water sources from Coatlán del Río,
Zacatepec, San Gaspar, and potable water from UPEMOR, to every source of water was
applied a concentration of 1x106 PFU/mL and virus were quantified at 3 hours and 3, 6, 9,
12, 15 and 18 days later. The results showed that there are substantial differences
between each water sources in terms of phage viability. Finally, the data of temperature
and relative humidity showed that there were no suitable conditions for disease
development in plants.
1
I INTRODUCCIÓN
Dentro del grupo de las hortalizas, el jitomate es un cultivo muy dinámico por la creciente
demanda de la población de todo el mundo. De acuerdo al censo agropecuario del 2007
en México, el jitomate fue la principal hortaliza cultivada y ocupó el 7° lugar de los
principales cultivos producidos. Según el servicio de Información Agroalimentaria y
Pesquera (SIAP) de México, del 2000 al 2009, se tuvo una reducción del 30% de la
superficie sembrada con jitomate, registrando la mayor superficie (76,687 ha) en el 2001 y
la menor con 55,888 ha en el 2012. El estado de Morelos se encontraba en la década de
los 80 dentro de los 3 principales estados que sembraban jitomate a nivel nacional, pero
cayó hasta el lugar 8 en el 2011 (SIAP 2011). Algunos motivos por los que se presenta este
problema en el estado de Morelos, son causados por problemas fitosanitarios, entre ellos
las virosis transmitidas por mosca blanca, el tizón tardío (Phytophthora infestans), el tizón
temprano (Alternaria solani), la cenicilla (Leveillula taurica), el cancro bacteriano
(Clavibacter michiganensis) y la marchitez bacteriana (Ralstonia solanacearum).
La marchitez bacteriana es una enfermedad que afecta a cultivos de gran importancia
económica, es causada por R. solanacearum, una bacteria Gram negativa. Esta bacteria
tiene una amplia gama de hospederos, afecta a más de 200 especies pertenecientes a más
de 50 familias botánicas, incluyendo cultivos de importancia económica. En el campo, R.
solanacearum se difunde fácilmente a través del suelo, agua contaminada de riego, agua
de superficie, equipo agrícola, y material biológico infectado. Las células bacterianas
pueden sobrevivir durante muchos años, en asociación con hospederos alternativos, y en
2
suelo la fumigación con bromuro de metilo, Vapam, o cloropicrina tiene una eficacia
limitada. Debido a que el bromuro de metilo afecta la capa de ozono, la producción y el
uso de este gas fue eliminado en 2005 en virtud del Protocolo de Montreal. La marchitez
bacteriana sigue siendo un problema grave para los cultivos en zonas tropicales,
subtropicales y cálidas del mundo (Jarvis 1991).
En los últimos años se han venido investigando aplicación de bacteriófagos líticos en los
cultivos como método de control (Yamada 2007). Al igual que otros métodos de control
biológico, una ventaja de la terapia fágica es la reducción en el uso de agentes químicos
contra los agentes patógenos, esto evita problemas asociados a la contaminación del
medio ambiente y residuos de productos químicos en los cultivos. La terapia fágica en
ambientes agrícolas, se exploró extensivamente hace 40 a 50 años como un medio de
control para fitopatógenos. En las últimas décadas, el uso de la terapia de fágica ha sido
explorado con mayor entusiasmo (Yamada 2007).
En este trabajo, se pretendió determinar el efecto protector y/o curativo del bacteriófago
ITL‐1 sobre la marchitez bacteriana causada por R. solanacearum bajo condiciones de
invernadero. Adicionalmente, debido a la carencia de información sobre el modelo de
infección Ralstonia solanacearum ‐Jitomate y la influencia de las condiciones de cultivo
sobre los fagos, en caso de no obtener los efectos deseados, se buscaría evaluar la
influencia de algunos de los factores involucrados, tales como evaluación de sustratos
utilizados en el estado de Morelos para el cultivo de jitomate, evaluación de agua de
diferente origen y la relación de la temperatura y humedad con la marchitez bacteriana.
3
II Antecedentes
2.1 Importancia del cultivo de jitomate
El jitomate (Solanum lycopersicum L.) es originario de América de Sur, aunque se
considera a México como centro de su domesticación. Actualmente forma parte de la dieta
alimenticia de varias culturas en el mundo. Ya sea como hortaliza o como fruto, el jitomate
ocupa en nuestros días el segundo lugar en importancia entre los productos agropecuarios,
apenas aventajado por los cereales. Se estima que junto con la papa, contribuyen con el
50% de la producción de hortalizas en el mundo; lo anterior indica el enorme valor que
este producto posee, no sólo en el ámbito comercial y económico, sino también en el
sistema alimentario mundial. El consumo per cápita anual en Norte y Centroamérica, es
alrededor de 26.9 kg, mientras que a nivel mundial es de 12.6 kg (SAGARPA 2005; 2006).
En México, el jitomate es una de las especies hortícolas de mayor importancia debido al
valor de su producción y a la demanda de mano de obra que genera el cultivo; tan sólo en
el 2012, se cultivaron 55,888 Ha con una producción de 2,800,000 toneladas y con un
consumo per capita/año de 18 kg. Además, es el principal producto hortícola de
exportación, ya que representa el 37% del valor total de las exportaciones de legumbres y
hortalizas y el 16% del valor total de las exportaciones agropecuarias, sólo superada por el
ganado vacuno (SAGARPA 2005; 2006). El estado de Morelos se encuentra dentro de los
10 principales estados que siembran jitomate a nivel nacional, pero cae hasta el lugar 8
por la cosecha (SIAP 2011).
4
2.2 Marchitez bacteriana
En el estado de Morelos, el jitomate es de las hortalizas de mayor importancia
económica y social, esta especie vegetal actúa como hospedero de diversas bacterias
fitopatógenas, entre las que se encuentra R. solanacearum, causante de la “marchitez
bacteriana”. En los últimos 3 años, esta enfermedad ha llegado a ser un problema en
plantas sólo en invernadero, sin presentar casos a cielo abierto (Hernández 2011). En
otros estados del país, R. solanacearum no solamente se encuentra en jitomate, sino que
también en otros hospederos como plátano, chile, papa y tabaco afectando el
rendimiento de manera notable (Hayward 1991).
R. solanacearum es una bacteria fitopatógena de tipo Gram negativa, aerobia,
clasificada en la subdivisión β de las Proteobacterias. Por más de 50 años, esta
bacteria se nombró como Pseudomonas solanacearum, perteneciente al grupo II de
homología de rARN, que incluía otras Pseudomonas no fluorescentes como P. mallei, P.
caryophylli, P. cepacia, P. pickettii y P. gladioli. Sin embargo, basados en secuencias
16S del rARN, homologías ADN‐ADN, perfil de ácidos grasos y otras características
fenotípicas, el grupo II de Pseudomonas se colocó en el género Burkholderia. Sin
embargo, la información filogenética mostró que P. solanacearum, P. pickettii y Alcaligenes
eutrophus se encuentran muy relacionadas, por lo que se agruparon en el nuevo género
Ralstonia (Schell 2000).
R. solanacearum es causante de la enfermedad llamada “marchitez bacteriana” en
alrededor de 200 especies de plantas, destacando los cultivos de importancia económica
como la papa, berenjena, tabaco y jitomate (Hayward 1991). Esta enfermedad se
5
presenta en zonas húmedas tropicales, subtropicales y algunas regiones templadas del
mundo. La marchitez bacteriana se reportó por primera vez a finales del siglo XIX en
papa, tabaco y jitomate en Asia, el sur de EUA y América del sur (EPPO 2004).
R. solanacearum es un microorganismo fitopatógeno que se encuentra principalmente
habitando en el suelo y agua en ausencia de hospedero. Esta bacteria puede sobrevivir
por días y años en agua contaminada, suelos húmedos y en la rizosfera, formando un
reservorio de inóculo el cual puede dispersarse. La población de R. solanacearum
disminuye rápidamente a bajas temperaturas (menores a 4 ° C), pudiendo sobrevivir en
un estado latente viable pero no cultivable (VBNC, por sus siglas en inglés). En el estado
VBNC, la bacteria se encuentra en un estado viable, es decir, fisiológicamente activa
para causar infección, pero no es posible detectarla en algún medio de cultivo artificial
(McDougald et al. 1998). Este estado puede ser inducido por varios factores, en R.
solanacearum se ha reportado que los principales factores pueden ser la incubación o
exposición a temperaturas por debajo de 4 ° C por periodos prolongados o a la
exposición a iones cobre (Grey et al. Steck 2001).
El fitopatógeno está ampliamente distribuido alrededor del mundo y es considerado un
“Complejo de especies” debido a las variaciones que existen dentro del mismo grupo. R.
solanacearum se clasifica en 5 biovares, con base en la capacidad de las cepas de oxidar
diversos azúcares y alcoholes (Cuadro 1) y en 5 razas basadas en su rango de hospederos
(Cuadro 2) (Hayward 1964; EPPO 2004). La marchitez bacteriana del jitomate puede ser
causada tanto por la raza 1, la raza 3 y ocasionalmente por la raza 2, presentando en
todos los biovares los mismos síntomas (Sánchez et al. 2008; Lin et al. 2009).
6
Cuadro 1. Diferencias entre biovares de R. solanacearum de acuerdo a su
metabolismo oxidativo de diversos azúcares.
Utilización
de:
Biovar
1 2 3 4 5
Maltosa ‐ + + ‐ +
Lactosa ‐ + + ‐ + Celobiosa ‐ + + ‐ +
Manitol ‐ ‐ + + +
Sorbitol ‐ ‐ + + ‐
Dulcitol ‐ ‐ + + ‐
Hayward 1964; EPPO 2004
A pesar de que no existe una correlación establecida entre la capacidad de oxidar
azúcares o alcoholes (biovares) y los hospederos (razas) de R. solanacearum, aquellas
cepas que presentan el biovar 2 están siempre relacionadas con la raza 3 y cepas de
biovar 5 están usualmente relacionadas con la raza 5 (Denny y Hayward 2001).
En el complejo de R. solanacearum, la Raza 3 biovar 2 (Rs R3Bv2), ha tomado importancia
a nivel mundial, esto a causa de lo devastadora que es en cultivos de jitomate y papa en
varios países, por lo que en el 2002, en EUA R. solanacearum R3bv2 fue enlistada
como un “Agente Patógeno Selecto” de plantas en el Acta de bioterrorismo en plantas y
está sujeta a estrictas regulaciones de bioseguridad, esto con el fin de erradicar a esta
bacteria de EUA ya que R. solanacearum R3bv2 no es endémica en este país. En Europa
7
ha ocasionado grandes pérdidas en la producción de papa, además de las pérdidas
debido a la cuarentena impuesta para este patógeno (Janse 1996).
Cuadro 2. Determinación de razas en R. solanacearum y relación con los
biovares. Raza
Hospederos
Distribucióngeográfica
Biovar DivisiónRFLP
1
jitomate, berenjena, tabaco yChile
Asia, Australia yAmérica
3, 4 y 1
I y II
2 Plátanos y otras Mussa spp
Caribe, Brasil yFilipinas
1
II
3
Papa, jitomates y geranios Todo el mundo,excepto EUA
2
II
4 Jengibre Japón y China 3 y 4 I5 Mora China 5 I
Hayward 1964, EPPO 2004
Actualmente, la clasificación en razas resulta subjetiva por lo que R. solanacearum se
clasifica en cuatro filotipos que corresponden a su origen geográfico, pero también ésta
clasificación se encuentra en discusión, se ha propuesto dividir los cuatro filotipos del
complejo de especies de R. solanacearum por tres especies distintas (Remenant et al.
2010). La clasificación actual de filotipos es: Filotipo I incluye cepas de Asia, Filotipo IIA y
IIB cepas de origen americano, Filotipo III cepas de los alrededores del Océano Índico y de
África, y el Filotipo IV cepas de Indonesia (Fujiwara et al. 2011), de este último filotipo se
propone su separación en una nueva especie junto con Ralstonia syzygii y “Blood Disease
Bacterium” (Remenant et al. 2010).
8
2.3 Síntomas y ciclo de la marchitez bacteriana
La marchitez bacteriana en solanáceas se presenta de manera súbita (Fig. 1‐A), las
plantas muestran un marchitamiento total sin cambios de color, deteniendo el desarrollo
de la planta y provocando la muerte de ésta (Figura 1 A‐B). Los tejidos vasculares de
tallos y raíces toman una coloración café chocolate (Figura 1‐C), cuando se realiza un
corte transversal a los tejidos vasculares se presentan exudados blanquecinos excepto
en casos leves, característicos de esta bacteria (Figura 1‐D), lo que ayuda a su
identificación en campo, mediante la observación de un fluido filamentoso de color
blanco lechoso que emana al sumergir un trozo de tallo infectado en agua limpia (Agrios
2005).
9
Figura 1. Síntomas de marchitez bacteriana en jitomate causada por R. solanaceraum. (A) Síntomas tempranos y (B) muerte de planta. (C) Decoloración del xilema en plantas infectadas de jitomate. (D) Producción de exudados por tejidos infectados con R. solanacearum (Modificada de Agrios 2005).
R. solanacearum infecta a las plantas hospederas principalmente a través de su raíz,
penetrando por heridas formadas por nuevas raíces o por el daño de organismos de
suelo (por ejemplo: nematodos); de igual manera, la bacteria puede penetrar por medio
de insectos, por heridas causadas manualmente o por herramientas. Una vez que la
bacteria infecta la raíz, ésta coloniza los haces vasculares del xilema. La infección es
más severa en plantas en condiciones de temperatura que oscila entre los 24 y 38 ° C y
10
disminuye notablemente cuando la temperatura excede 38 °C o son menores a 16 ° C
(Champoiseau et al. 2009). El patógeno puede ser llevado de cultivos enfermos a sanos
por la transferencia de suelos por la maquinaria y por el agua de riego o lluvias. Los ríos
representan un factor importante de diseminación cuando la bacteria se encuentra
contaminándolos, logrando diseminar la enfermedad a otras regiones con cultivos
sanos (Caruso et al. 2005).
2.4 Manejo de la marchitez bacteriana en jitomate
Para el manejo de la marchitez bacteriana se han utilizado bactericidas (cobre) y
antibióticos (estreptomicina, tetraciclina, gentamicina). Sin embargo, diversas cepas de R.
solanacearum son reportados como resistentes y/o tolerantes a estos productos
químicos (Saddler 2005).
Existen reportes de sólo algunos cultivares que presentan resistencia a R. solanacearum,
sin embargo, no ha sido efectivo para el control de la enfermedad, esto debido a la
variabilidad de las cepas bacterianas (Hanson et al. 1996). En regiones donde el patógeno
ya está establecido, las prácticas culturales pueden ser efectivas bajo ciertas condiciones.
Estas prácticas incluyen rotación de cultivos con plantas no hospederas; no obstante, la
bacteria puede permanecer en estado VBNC por largos periodos hasta que de nuevo
encuentre a su hospedero. Otras prácticas como el tratamiento en semillas, el uso de
antagonistas, manejo adecuado del riego y el manejo de nematodos, han sido utilizadas,
sin mucho éxito (Hanson et al. 1996).
11
Existen otros tipos de tratamientos alternativos para la erradicación de la “marchitez
bacteriana en jitomate” utilizados en varios países, como la modificación del pH del
suelo, inductores de resistencia en plantas (ejem. acibenzolar‐s‐metil), aceites
esenciales (ejem. timol) o ácido fosfórico, todos ellos han demostrado que reducen la
población bacteriana y la severidad de la enfermedad (Anith et al. 2004, Norman et al.
2006, Ji et al. 2007).
12
2.5 Bacteriófagos en el control biológico
Los bacteriófagos son las entidades biológicas más abundantes en el planeta, los
podemos encontrar de manera natural en la tierra, agua, en el océano e incluso en los
alimentos que consumimos, con más de 1030 partículas estimadas en la biosfera, jugando
un papel importante en el equilibrio microbiano. A partir del descubrimiento de los
bacteriófagos por Frederick Twort y Felix D’Herelle, considerados pioneros en la
investigación fágica, estos virus han sido manipulados en un sinfín de estudios y
aplicaciones, ya sea en ámbitos clínicos, veterinarios y agrícolas (Ackermann 2011, Kutter
y Sulakvelidze 2004).
Un método de control biológico utilizado con éxito a nivel laboratorio y comercial es el
uso de bacteriófagos (Yamada 2007) el cual se está expandiendo rápidamente en el área
de protección en cultivos innovando y remplazando los métodos de control químicos
utilizados. Los fagos pueden ser utilizados efectivamente como parte de una estrategia
de manejo integrado. La fácil preparación de los tratamientos y el bajo costo de
producción, los transforma en buenos candidatos no sólo para el control de R.
solanacearum, sino también para su detección, diferenciación de razas y biovares (Jones
et al. 2007).
En el cuadro 3 se mencionan algunas ventajas y desventajas descritas por Greer (2005) y
Vidaver (1976), respectivamente.
13
Cuadro 3: Descripción de algunas ventajas y desventajas del uso de bacteriófagos
descritas por Greer (2005) y Vidader (1976).
Bacteriófagos
Ventajas Desventajas
Se autoreplican y autolimitan, éstos se
replican solamente cuando la bacteria
hospedera está presente en el ambiente y
se inactiva cuando ésta disminuye su
población
La alta especificidad de los fagos puede ser
una desventaja
Son componentes naturales de la
biosfera, pueden ser aislados dondequiera
que la bacteria hospedera se encuentre,
incluyendo suelo, agua, plantas, animales y
cuerpo humano
Los requerimientos del límite de
bacterias (104
–106 UFC/mL) puede limitar
el impacto de los fagos
No son tóxicos para células eucariontes El surgimiento de bacterias mutantes
resistentes a fagos puede hacer
inefectivos a los fagos (sólo en caso que el
bacteriófago sea lisogénico)
Específicos o altamente discriminatorios,
atacando solamente a la bacteria blanco sin
causar daño a otras bacterias
Factores como la temperatura, pH y
fisiología de la bacteria puede obstruir el
control
Los formulados a base de fagos son
relativamente de fácil preparación y no
tienen altos costos de producción,
además pueden ser almacenados a 4 ° C
en oscuridad sin reducciones significativas
en la concentración de partículas virales
Bacteriófagos (lisogénicos) con potencial
de transducción pueden dar características
indeseables, como factores de virulencia.
14
2.6 Clasificación y ciclos de vida de los bacteriófagos
Los bacteriófagos se clasifican en familias y géneros, las familias son definidas por la
naturaleza del ácido nucleico del fago y la morfología, diferenciando si su genoma es de
ADN o ARN, siendo la gran mayoría de ADN de cadena doble (dsADN) pero existen grupos
cuyo genoma puede ser ADN o ARN de cadena sencilla (ssADN, ssARN), e incluso ARN
bicatenario (dsARN), ya sea lineal o circular (Carter y Saunder 2007, Moat et al. 2002,
Ackermann 2011).
Con base en su morfología, los bacteriófagos pueden ser poliédricos, filamentosos o
pleomórficos, y pueden o no poseer una estructura tipo cola que puede ser corta, larga,
contráctil o no contráctil. A aquellos virus que poseen cola también se les llama
caudovirus (Carter y Saunders 2007, Ackermann 2011).
Con base en el ciclo de vida que desarrollan en su hospedero, los bacteriófagos se pueden
clasificar en líticos y lisogénicos (figura 2). Los líticos provocan la muerte celular por
destrucción de su célula hospedera, en los fagos lisogénicos la actividad lítica se reprime y
el genoma del fago con frecuencia se incorpora al de la bacteria, reproduciéndose
simultáneamente con el hospedero, sin ocasionar la muerte celular, este método de
infección puede proteger al hospedero de la infección por otros fagos o cepas similares,
llamando a esto inmunidad de sobreinfección (Carter y Saunders 2007, Ackermann 2011,
Shigenobu et al. 2005).
Dentro de los bacteriófagos con genoma de ADN se encuentran los miovirus (Myoviridae),
que son fagos líticos con cadena doble de ADN (dsADN) y lineal, de cabeza esferoide,
icosahédrica, y con una cola larga contráctil. Los sifovirus (Siphoviridae) son bacteriófagos
15
con genoma de ADN bicatenario lineal, que pueden ser líticos y lisogénicos según las
condiciones ambientales, con cabeza isométrica icosahédrica, y con presencia de una cola
larga no contráctil. Los podovirus (Podoviridae) son bacteriófagos líticos de cadena doble
de ADN bicatenario lineal, de cabeza isométrica icosahédrica, con una cola corta no
contráctil. Estas tres familias representan alrededor del 96% de los fagos (Ackermann
2011).
Figura 2: A) Ciclo lítico y B) Ciclo lisogénico de bacteriófagos. (1) Adsorción e inyección de ADN; (2) replicación del genoma viral, (3) producción de cabeza y tallos, síntesis de holinas y lisinas y empaquetamiento de ADN; (4) ensamblaje de fagos, destrucción de la membrana celular y liberación de progenie; (5) persistencia del genoma viral en el citoplasma bacteriano como elemento episomal, (6) integración de ADN del fago en el genoma del hospedero.
A
B
1
2
3
4
5
6
16
Dentro de los bacteriófagos con genoma de ADN de cadena sencilla, se encuentran los
microvirus (Microviridae), bacteriófagos pequeños que poseen una cabeza icosahédrica,
sin presencia de cola, con actividad lítica. Los inovirus (Inoviridae) son bacteriófagos
filamentosos, con estructura flexible que no presentan actividad lítica, con la capacidad
de infectar la bacteria insertando su material genético al cromosoma de la bacteria.
Los bacteriófagos que presentan material genético compuesto de ARN se clasifican de
igual manera en cadena doble, entre los que se encuentran los cistovirus (Cystoviridae)
que son bacteriófagos esféricos envueltos, que presentan actividad lítica, y los de cadena
sencilla entre los que se encuentran los levivirus (leviviridae) con morfología icosahédrica,
con actividad lítica (figura 3) (Carter y Saunders 2007).
17
Figura 3: Clasificación de los bacteriófagos considerando características genómicas, morfología y la presencia o ausencia de cola (modificada de Carter y Saunders 2007).
18
2.7 Receptores fágicos en la bacteria Ralstonia solanacearum
La infección viral es el proceso en el cual el fago reconoce y se adhiere a la célula
huésped e inyecta su ácido nucleico, atravesando la membrana celular hasta llegar al
citoplasma. En el medio ambiente, la infección es siempre un evento al azar, está
altamente influenciada por la densidad bacteriana. Esto quiere decir que, a mayor
densidad de huésped, mayor oportunidad de infección (Skurnik y Strauch 2006).
El primer paso para la infección viral es el reconocimiento del fago con la bacteria
hospedera. La susceptibilidad de la bacteria al fago depende primeramente si el fago
puede reconocer sitios específicos conocidos como receptores de la célula, éstos se
encuentran en la estructura de las células, así que el reconocimiento del fago al
hospedero estará íntimamente relacionado con el tipo de bacteria. Los receptores se
encuentran en las estructuras celulares en el siguiente orden: membrana exterior de las
bacterias Gram‐negativas, membrana celular de bacterias Gram‐positivas, capa capsular
de bacterias Gram‐negativas, los flagelos y los pilis (Lindberg 1973).
Como ya se mencionó, R. solanacearum es una bacteria Gram‐negativa. En este tipo de
bacterias la membrana celular externa está compuesta por un complejo de
lipopolisacáridos (LPS), proteínas y fosfolípidos. Sólo los LPS están expuestos al exterior
de la célula bacteriana por lo que éstos son accesibles a los fagos y por ello representan
uno de los principales receptores para el reconocimiento fago–hospedero en bacterias
19
Gram‐negativas. Hendrick y Sequeira (1984) reportan que los LPS actúan como receptor
de reconocimiento en los fagos Psso 154 (perteneciente a la familia Mioviridae) y Psso
NCL (perteneciente a la familia Podoviridae) específicos de R. solanacearum. Sin
embargo, no sólo el complejo de LPS ha sido reportado como receptor para el
reconocimiento de fagos de R. solanacearum, los pilis también se reportan como
potenciales sitios de reconocimientos para la adsorción del fago ΦRSM en R.
solanacearum (Askora et al. 2009).
20
2.8 Uso de bacteriófagos para el manejo de Ralstonia solanacearum
En el año 1990, Takana et al. reportaron fagos específicos para R. solanacearum los cuales
lograron reducir la marchitez del tabaco causado por Pseudomonas solanacearum (ahora
Ralstonia solanacearum). Con el uso de fagos específicos contra R. solanacearum y una
cepa avirulenta de R. solanacearum (M4S), observaron que el uso combinado de fagos
más la cepa avirulenta, se disminuyó a 17.6% la marchitez, en comparación con el control
con un 95.8% de marchitez, también observaron que la cepa avirulenta por sí sola
disminuía a un 39.5% el grado de marchitez. Este trabajo es uno de los primeros en los
que se da a conocer un fago específico contra R. solanacearum. Como consecuencia de las
pérdidas económicas que causa R. solanacearum en cultivos de interés agrícola, se han
buscado nuevos fagos específicos y de amplio espectro de acción entre el complejo de
especies en el que se encuentra clasificada R. solanacearum.
En el 2001, Ozawa et al. reportaron el fago P4282 específico de R. solanacearum que
producía una proteína bacteriolítica, la proteína afecta a diversas cepas de R.
solanacearum, por lo que sugieren el uso de esta proteína bacteriolítica para generar
plantas de tabaco transgénicas que tengan resistencia a la marchitez bacteriana.
Actualmente, los principales trabajos de investigación sobre bacteriófagos de R.
solanacearum han sido realizados por el grupo de investigación del Dr. Yamada, de la
Universidad de Hiroshima. Sus trabajos incluyen estudios en planta con fagos filamentosos
y fagos caudovirales (Ozawa et al. 2001). Yamada et al. (2007) reportaron cuatro tipos de
21
fagos que infectan a R. solanacearum: фRSL, фRSA, фRSM y фRSS (Figura 4). Los primeros
dos son fagos de la familia Mioviridae, con dsADN de 240 y 39 kb, respectivamente, éstos
poseen un amplio rango de hospederos. Mientras que los bacteriófagos фRSM y фRSS
pertenecen a la familia Inoviridae, con ssADN de 9.0 kb en фRSM y 6.6 kb en фRSS.
Otro bacteriófago filamentoso que infecta a la cepa de R. solanacearum es PE226,
pertenece a la familia Inoviridae, tiene cola larga flexible y posee un genoma circular de
cadena sencilla y sentido positivo de 5.47 kb (Murugaiyan et al. 2010). Algunos de los
fagos anteriormente mencionados son filamentosos y se han reportado que se comportan
como fagos lisogénico y por esta razón no son los más recomendados para su uso como
biocontrol. Sin embargo, investigaciones recientes con фRSM3 indican que algunos fagos
filamentosos con genes represores, pueden ser herramientas eficientes de biocontrol. Por
ejemplo, фRSM3 reprime genes de virulencia en R. solanacearum, dando como resultado
la incapacidad de enfermar a plantas de jitomate (Addy et al. 2012a). Por otra parte,
фRSL1 también fue evaluado como herramienta de biocontrol para R. solanacearum,
manteniendo la concentración bacteriana limitada por más de 140 h, permitiendo evadir
la enfermedad de la marchitez bacteriana eficazmente (Figura 4) (Fujiwara et al. 2011).
22
Figura 4. Fagos que infectan a R. solanacearum. Curva de crecimiento con 3 fagos diferentes y una mezcla de estos. Las condiciones de cultivo fueron: DO: 600 nm, momento de infección: DO entre 0.1 y 0.3, MOI: 0.5, tiempo de cultivo: 150 horas (tomado de Fujiwara et al. 2011).
En México, en el 2011 se reportó por primera vez R. solanacearum en jitomate en Sinaloa,
Baja California y Jalisco (Perea et al. 2011); en el 2012 se detectó en el estado de Morelos
(Hernández et al. 2012), desde entonces se diagnosticaron molecularmente múltiples
casos de R. solanacearum en invernadero. Por lo que en la Universidad Politécnica del
Estado de Morelos se iniciaron trabajos para el biocontrol de R. solanacearum mediante
el uso de bacteriófagos líticos, y la identificación de factores que interfieren en la
interacción del bacteriófago, la planta de jitomate y la bacteria.
23
2.9 Factores que intervienen en la aplicación de bacteriófagos como control biológico
Una opción de control biológico para reducir la incidencia de R. solanacearum es el uso de
bacteriófagos, como se ha mencionado en los aparatados anteriores, el uso de la
aplicación de bacteriófagos se ha estudiado, pero se desconoce el efecto que tienen sobre
ellos diferentes sustratos utilizados en el cultivo de jitomate.
Se han avaluado diferentes bacteriófagos pero todos en sustratos artificiales y en cámaras
de crecimiento. Por ejemplo el fago PE204 (perteneciente la familia Podoviridae) se
evaluó en un microcosmos de suelo artificial (ASM) analizando la estabilidad del fago en el
suelo, los resultados sugieren que la aplicación adecuada de los fagos líticos en el sistema
de la raíz en la planta con Silwet L‐77 (tensoactivo) puede ser utilizado para controlar la
marchitez bacteriana de los cultivos (Bae 2012). En los trabajos realizados por Fujiwara et
al. (2011) el sustrato utilizado es una mezcla de turba y vermiculita, pero no evalúan las
interacciones de estos sustratos con los fagos.
En Morelos se tienen cultivos de jitomate que utilizan distintas fuentes de agua, por
ejemplo en Jojutla existen invernaderos que utilizan agua de pozo con un claro olor a
sulfuros, en Coatlán del Río utilizan agua de pozo inodora, en Temixco utilizan agua de
lluvia almacenada en ollas, mientras que en Jiutepec existen productores que utilizan agua
potable (Hernández 2012, comunicación personal). Se desconoce el efecto que estas
distintas fuentes de agua pueden tener sobre la actividad de los bacteriófagos, efecto que
pudiera ser de crucial importancia si se busca eventualmente la aplicación de
bacteriófagos en invernadero y campo.
24
Con todos estos antecedentes se planearon los objetivos que a continuación se exponen
2.10 Objetivo general
Identificar algunos factores que afectan la interacción jitomate‐ Ralstonia solanacearum‐
bacteriófago ITL‐1.
2.11 Objetivos específicos
1.‐ Estandarizar la técnica de producción in vitro del ITL‐1.
2.‐ Evaluar el efecto preventivo y/o curativo del ITL‐1 en plantas de jitomate.
3.‐Evaluar el efecto de diferentes sustratos en la actividad lítica del ITL‐1.
4.‐ Evaluar el efecto de agua de diferente origen en la actividad lítica del ITL‐1.
5.‐Relacionar las condiciones de temperatura y humedad relativa con el desarrollo de la
enfermedad.
25
III Materiales y métodos
3.1 Origen de la cepa bacteriana y del bacteriófago ITL‐1
La cepa bacteriana de R. solanacearum utilizada en este estudio fue aislada de un cultivo
de jitomate de la localidad de Coatlán, se denominó R6 y corresponde al filotipo II. La
bacteria se mantuvo en medio NBY. El fago ITL‐1 (figura 5) fue aislado de composta en el
municipio de Miacatlán. Este fago pertenece a la familia Podoviridae y posee como
material genético ADN de doble cadena, una cabeza icosaédrica y cola corta. El fago se
mantuvo a 4 o C en una solución de sulfatos (K2SO4 0.16 g/L, MgSO4 0.45 g/L, K2HPO4 0.10
g/L).
Figura 5: Microfotografía electrónica del bacteriófago ITL‐1, se observa una morfología
compatible con la familia Podoviridae, la cual incluye a fagos con material genético a base
de dsADN, cápside icosaédrica y cola corta (Serrano 2013).
3.2 Estandarización de la técnica de producción in vitro del bacteriófago ITL‐1
Para la producción del bacteriófago ITL‐1, las variables que se consideraron fueron: 1)
volumen de cultivo, 2) tamaño del inóculo bacteriano inicial, 3) tiempo de cultivo
bacteriano hasta el momento de la inoculación viral, 4) multiplicidad de infección (MOI,
por sus siglas en inglés), 5) tiempo de cosecha del virus.
26
El volumen de cultivo se mantuvo fijo, utilizando 3 matraces de 1000 mL conteniendo un
volumen de 500 mL de medio NBY.
El tamaño de inóculo bacteriano inicial fue de 30 ml de un cultivo de entre 36 y 48 horas
de R. solanacearum ajustado al 0.100 de absorbancia a 600 nm.
Para evaluar el tiempo para inocular el virus en el cultivo bacteriano se realizó una cinética
bacteriana en matraces. El crecimiento bacteriano se obtuvo leyendo la absorbancia a
600nm cada 2.5 horas. En base a la curva de crecimiento se decidió inocular el fago a las
5, 10 y 15 horas de crecimiento microbiano, tiempos que coincidían con el inicio y final de
la fase exponencial, así como con el final de la fase de crecimiento lineal del crecimiento
microbiano. Al momento de la inoculación viral se determinó la densidad óptica del
crecimiento bacteriano a 600 nm (DO600nm) y se estimó la concentración bacteriana
utilizando la siguiente fórmula:
UFC/ mL= [1840989* (DO600nm)2 +488150* DO600nm +81064]*1000
la cual se obtuvo a partir del comportamiento del cultivo bacteriano en matraz leyendo la
absorbancia cada hora, cuantificando la bacteria y correlacionando los datos de
cuantificación bacteriana y densidad óptica por medio de un análisis de regresión
polinomial (Serrano 2013). La MOI que se utilizó fue de 0.1 (el número de virus fue 10
veces menor al número de bacterias presentes en el cultivo). Para la adición del virus al
cultivo bacteriano, se estimó el volumen de una solución stock del fago ITL‐1
(concentración de 1.42 x1010 PFU/mL), que contuviera diez veces menos fagos respecto a
las bacterias que se tenían en el matraz, para de esta manera manejar una MOI=0.1. De
acuerdo con la fórmula, el cultivo bacteriano con una densidad óptica de 0.1 a 600 nm,
27
tiene una concentración de 1.5x108 UFC/mL, por lo tanto el volumen de la solución fágica
utilizada fue de aproximadamente 500 µL para cada matraz. La densidad óptica se
continuó leyendo 2.5 horas. En cuanto se registraron dos lecturas mínimas consecutivas y
se observó una tendencia al incremento en la densidad óptica, se detuvo el cultivo y se
procedió a cosechar el virus, tomándose una muestra por matraz y calculando el título
viral, por medio de la técnica de cuantificación viral.
3.2.1 Preparación del stock bacteriano
Para conservar el stock bacteriano se obtuvieron 2 mL de un cultivo de R. solanacearum
crecido 36 y 48 horas, en medio NBY liquido, a 30 ͦ C y 200 rpm. Los 2 mL de cultivo se
centrifugaron a 5000 g por 3 min, se eliminó el sobrenadante y el pellet bacteriano se
resuspendió en 1 mL de agua destilada estéril. Posteriormente se colocó en 20 microtubos
de 1.5 mL, colocando 1 mL de agua destilada estéril y 50 µL de la bacteria resuspendida en
agua. Los 20 microtubos se guardaron a temperatura ambiente.
3.2.2 Titulación de bacteriófagos mediante la técnica de doble capa de agar
Para la técnica de cuantificación viral, se tomaron 10 µL de la solución stock de fagos de
concentración desconocida y se realizaron diluciones seriadas decimales con un volumen
final de 100 μL en microtubos de 0.6 mL. Un cultivo de R. solanacearum de entre 12 y 15
horas de crecimiento, se ajustó a 0.100 de absorbancia a 600 nm y de esta solución se
28
agregaron 50 µL a las diluciones de los fagos previamente preparadas, agitando en el
vortex por 10 segundos. Posteriormente las diluciones se incubaron a temperatura
ambiente durante 5 minutos para después tomar los 150 µL de la mezcla y añadirlos a 3
mL de medio NBY con agar suave mantenido a 40°C. La mezcla se agitó manualmente y se
vertió en una caja de Petri y transcurridas de 24 a 48 horas se procedió a hacer el conteo
de placas de lisis por duplicado, cuidando que se observara el efecto de dilución y la
reproducibilidad entre los duplicados. Para obtener la concentración de la solución viral,
se tomó en cuenta el factor de dilución (considerando aquellas cajas que contengan entre
50 y 100 placas de lisis) y se aplicó la siguiente fórmula (Figura 6).
PFU/mL=FD*#placas/ volumen de diluciónPFU= Plaque‐forming unit por sus siglas en ingles FD= Factor de dilución #placas= número de placas
Figura 6: Representación gráfica de la cuantificación viral. La cuantificación se realiza utilizando diluciones decimales
29
3.3 Evaluación de los efectos preventivo y curativo del bacteriófago ITL‐1
Los fagos producidos previamente se utilizaron para evaluar su efecto preventivo y
curativo en las plantas de jitomate. Esta evaluación se realizó en el periodo del 1 de abril
del 2013 hasta el 25 de abril del mismo año, realizándose cuantificaciones virales de los
lixiviados. Este experimento se llevó a cabo en un bioespacio, el cual se define en este
trabajo como un área de cultivo que presenta una malla antiáfidos que protege al cultivo
del ataque de los insectos pero que carece de control de temperatura y humedad; El
biospacio está ubicado en la Universidad Politécnica del Estado de Morelos. El ensayo
utilizó semillas de jitomate de la marca Harris Moran variedad El Cid F1, que se
germinaron y se mantuvieron en la charola de germinación durante 20 días y después se
trasplantaron en macetas que contenían como sustrato una mezcla de 0.5: 0.5 turba‐
tepojal. El sustrato se esterilizó previamente por autoclave durante 20 min a 15 psi, y
después con una solución de cloro al 0.5%. El exceso de cloro se lavó con agua corriente y
se sometió a un proceso de solarización, por lo cual, se colocó una cubierta de plástico
negra sobre el sustrato durante tres días.
3.3.1 Diseño experimental para evaluar el efecto preventivo y curativo del bacteriófago ITL‐1
Para evaluar los efectos preventivo y curativo del bacteriófago ITL‐1 sobre el desarrollo de
la marchitez bacteriana causada por R. solanacearum, se generaron 5 grupos de 10
plantas cada uno, los cuales se sometieron a los siguientes tratamientos: 1) control,
regado solamente con solución nutritiva (Ca(NO3)2∙4H2O 0.96 g/L, KNO3 0.64 g/L, K2SO4
30
0.16 g/L, MgSO4 0.45 g/ L), 2) regado con la solución de bacteriófagos (50 mL con una
concentración de 1x 106 PFU/mL) los días lunes, jueves y sábado), 3) regadas con solución
de R. solanacearum (50 mL con una concentración de 1X103 UFC/mL) los días lunes y
jueves , 4) aplicación de solución de bacteriófagos (50 mL con una concentración de 1x 106
PFU/mL) los días lunes, jueves y sábado por las primeras dos semanas, seguido de la
aplicación de una solución de R. solanacearum (50 ml con una concentración de 1X103
UFC/mL, los días lunes y jueves) en las semanas 3 y 4, ese grupo se incluyó para evaluar el
efecto preventivo de los bacteriófagos; 5) tratadas en la semana 1 y 2 con la solución de
R. solanacearum (50 ml con una concentración de 1X103 UFC/mL, los días lunes y jueves) y
las semana 3 y 4 con la solución del bacteriófago. Este grupo se incluyó para evaluar el
efecto curativo de los bacteriófagos (50 mL con una concentración de 1x 106 PFU/mL, los
días lunes, jueves y sábado). Estos distintos grupos fueron distribuidos en un diseño
completamente al azar, con 10 repeticiones por tratamiento, siendo una planta la unidad
experimental.
En cada uno de estos grupos se evaluó la progresión de la enfermedad para observar si
había un efecto del momento de la aplicación del bacteriófago sobre el porcentaje de
marchitez o la incidencia de la enfermedad (la cual se definió como el número de plantas
con síntomas de marchitez en un periodo de tiempo).
3.3.2 Evaluación de la progresión de la enfermedad
Para evaluar la progresión de la marchitez bacteriana causada por R. solanacearum en el
jitomate, se evaluó el porcentaje de marchitez ([número de foliolos marchitos/número
31
total de foliolos]*100) para cada planta y el promedio de marchitez para cada grupo. Este
análisis se realizó diariamente hasta que cada grupo presentara el 100% de marchitez o
durante 30 días, esto equivaldría a la muerte de las plantas.
Una vez manifestada la marchitez bacteriana, se realizó un análisis de datos considerando
los parámetros evaluados para hacer análisis de varianza y prueba de comparación de
medias de Tukey con un p=0.05, evaluando el error experimental.
3.3.3 PCR de colonia para determinar la presencia de R. solanacearum en aislamientos microbianos
Para evaluar en plantas de jitomate la presencia de R. solanacearum en aislamientos
microbianos obtenidos de plantas de jitomate expuestas al fitopatógeno, se utilizó la
técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). Para esto
se tomó con un palillo estéril una cantidad mínima de la colonia a analizar, misma que se
colocó en el fondo de un tubo de PCR. En cada experimento se agregaron dos controles,
un control positivo (ADN genómico de R. solanacearum purificado) y un control negativo
(muestra sin ADN molde). Para la reacción en cadena de la polimerasa se utilizó los
oligonucleótidos 759 (Fegan y Prior 2005), los cuales amplifican la región río arriba del gen
IpxC. El amplicon de este fragmento de ADN tiene un tamaño de 282 pares de bases (pb).
La reacción de amplificación se realizó por 40 ciclos. La mezcla de reacción consistió en
1µL de buffer 10X (Thermo Scientific cat#EP0402), MgCl2 1.5 mM, dNTP’s 200 µM, los
oligonucleótidos se utilizaron a una concentración de 0.5 µM cada uno y el volumen de
32
reacción fue de 10 µL, en cada reacción se colocó una unidad de Taq polimerasa. La
presencia o ausencia del amplicon de 282 pb. se analizó en un gel de agarosa al 2%.
3.4 Evaluación de la patogenicidad de la cepa bacteriana
Para verificar que la cepa bacteriana utilizada era capaz de causar enfermedad en las
plantas de jitomate, se tomó una pequeña cantidad de cultivo liquido de la bacteria y se
transfirió hacia 10 plantas sanas previamente heridas, evaluando el desarrollo de lesiones
a los 20 días de la inoculación.
3.5 Evaluación de la estabilidad del bacteriófago ITL‐1 en diferentes sustratos utilizados para el cultivo de jitomate en Morelos
Para evaluar el efecto de los diferentes tipos de sustrato en la actividad fágica (la
capacidad del bacteriófago para formar placas de lisis), se eligieron sustratos que son
comúnmente usados en el cultivo de jitomate en el estado de Morelos. Los sustratos
fueron: turba, tepojal, turba‐tepojal 0.5:0.5, tezontle, fibra de coco, suelo proveniente de
Zacatepec y de Coatlán del Río. Los sustratos se llevaron a peso seco en una estufa a 150 ͦ
C por 24 horas. Posteriormente por duplicado cada sustrato fue pesado en tubos Falcon y
llevado a 85% del volumen total del tubo. Los tubos se perforaron en la base para
recuperar los lixiviados de cada sustrato. Previamente se preparó una solución fágica con
un título de 1x 106 PFU/mL, empleando solución nutritiva como diluyente.
Además del efecto sobre la actividad del bacteriófago, a cada sustrato se le midió su
capacidad de retención de líquidos, así como el pH y la conductividad de los lixiviados que
33
se obtenían a partir de cada uno de ellos. La capacidad de retención de cada sustrato se
midió vertiendo 40 mL de solución nutritiva a cada tubo y el porcentaje de retención se
calculó con la siguiente fórmula: (volumen inicial ‐volumen final) / g de sustrato).
El pH y la conductividad se midieron con un sensor multiparamétrico (HANNA modelo
HI98130). Una vez humedecido el sustrato, se dejó lixiviar durante 24 h, y posteriormente
se adicionaron 30 mL de la solución nutritiva con fagos. Los fagos fueron titulados a partir
de los lixiviados que se obtuvieron. La titulación de cada lixiviado se hizo por duplicado.
Los resultados se analizaron en el software Sigma plot 11.0 realizando un ANOVA de un
vía.
3.5.1 Evaluación de la utilidad de la técnica de PCR tiempo real para cuantificar al bacteriófago ITL‐1
Con el objetivo de determinar si era factible aplicar la técnica de la reacción en cadena de
la polimerasa en tiempo real (PCR‐RT por sus siglas en inglés) para la cuantificación de los
bacteriófagos en los lixiviados, se implementó esta técnica, estandarizando
oligonucleótidos previamente diseñados en el laboratorio y evaluando el desempeño de la
reacción al utilizar lixiviados.
Para realizar la cuantificación fágica por la técnica molecular de PCR en tiempo real (PCR‐
RT), se evaluó la sensibilidad de la amplificación por PCR‐RT con tres distintos pares de
oligonucleótidos, cada uno localizado en una región genómica distinta del genoma de fago
ITL‐1 (figura 7).
34
Figura 7. Ubicación en el genoma del bacteriófago ITL‐1 de los tres pares de
oligonucleótidos evaluados por PCR‐RT.
Para preparar la curva patrón se utilizó un stock fágico con un título de 1x108 PFU/mL, el
cual se preparó precipitando los fagos por centrifugación a alta velocidad (40,000 g por
una hora a 4 ͦ C) y solubilizando el pellet fágico en solución de sulfatos. Esta solución fágica
se tituló por duplicado. Se prepararon seis diluciones seriales base diez, cada una de 50
µL, para esto se tomaron 5 µL del stock viral, mezclando con 45 µL de agua libre de
nucleasas.
Para estimar el intervalo de concentraciones fágicas que podían detectarse con cada uno
de los tres pares de oligonucleótidos, inicialmente se realizó una serie de reacciones, que
incluían una sola reacción por dilución para cada par de oligonucleótidos. El volumen de
reacción fue de 10 µL. La mezcla de reacción que se utilizó comprendía los reactivos y
concentraciones señalados en el cuadro 4.
35
Cuadro 4. Mezcla de reacción utilizada para el PCR‐RT
Reactivo Concentración
inicial Concentración
final Cantidad para una reacción
Master mix* 2x 1x 5 µL
Mix de
Oligonucleótidos 3 µM (c/u) 0.3 µM 1 µL
H2O libre de
nucleasas ‐‐‐ ‐‐ 3 µL
TOTAL 9 µL *Maxima SYBR‐ Green, Thermo Scientific, cat. #K0242 Promega, cat. #P1193 Los oligonucleótidos se utilizaron mezclando cada par de forma de que cada uno quedara a una concentración de 3 µM. Cada mezcla de ligonucleótidos se denomino ITL1‐TR1, ITL1‐TR2 y ITL1‐TR3.
En cada tubo de reacción se colocó de forma independiente 1µL de la dilución fágica a
evaluar para completar los 10µL de reacción.
El termociclador (Qiagen Rotor‐Gene Q) se programó de la siguiente manera: se aplicó una
etapa inicial de desnaturalización y activación de la enzima a 95°C por 10 min. Después se
aplicó una segunda etapa que se repitió durante 50 ciclos, la cual consistía en una fase de
desnaturalización a 95°C por 10 segundos, una fase de alineamiento a 60°C por 15
segundos y una fase de elongación a 72°C por 20 segundos, en esta etapa se registra la
fluorescencia de la muestra. Finalmente se aplicó una etapa de obtención de la curva de
desnaturalización (“melting”) iniciando a 60°C y terminando en 95°C, incrementando 1
grado en cada paso, con 5 segundos de tiempo de espera entre cada incremento.
36
Para determinar el par de oligonucleótidos con la mayor sensibilidad, se consideró en
aquellos que presentaran los menores valores de ciclo umbral (Ct, por sus siglas en inglés)
a una misma concentración fágica.
Una vez seleccionado el par de oligonucleótidos con la mayor sensibilidad, se preparó una
curva patrón incluyendo las concentraciones señaladas en el cuadro 5. El volumen que se
tomó de cada dilución para una reacción de PCR‐RT fue de 1 µL, cada reacción realizó por
triplicado. Los componentes de reacción son los mismos que se muestran en el cuadro 6.
Cuadro 5. Concentraciones fágicas utilizadas en la curva patrón para el fago ITL‐1,
cuantificado por PCR‐RT
3.6 Comportamiento de factores ambientales durante los experimentos de infección
Se realizaron dos experimentos. El primero en un bioespacio y otro en un invernadero. En
el primero las aplicaciones de la solución fágica se realizaron tres veces por semana y la
solución bacteriana dos veces por semana, en un periodo de 28 días. La solución fágica
(1x106 PFU/ml), se preparó 10 minutos antes de la aplicación en plantas regándolas con
Factor de dilución Concentración fágica (PFU/µL)
0 1x105
5 2X104
25 4x103
125 8x102
625 160
3,125 32
15,625 6.4
37
una probeta directamente al pie del tallo de la planta, cada planta se regó con 500 mL de
la solución fágica.
Para el experimento del invernadero, realizado por la alumna Christian Rodríguez Salazar,
se utilizó una solución bacteriana con una concentración de 1.5 X108 UFC/ml la cual se
aplicó una sola vez a los 3 días después del trasplante, regando cada planta con 50 mL de
la solución bacteriana. En este segundo experimento no se aplicaron bacteriófagos dado
que el objetivo fue analizar las condiciones en las que se desarrollaba la marchitez.
Durante el tiempo que duró cada experimento, se monitoreo la temperatura y humedad
relativa, tomando lecturas cada 15 minutos con dispositivos electrónicos para el registro
de estas variables (Dataloggers HOBO modelo U10‐003), además de registrar la incidencia
de la enfermedad.
3.7 Influencia del origen del agua de riego sobre la actividad del bacteriófago ITL‐1
En la literatura no hay información en cuanto al efecto del agua de diferente origen en la
actividad de los bacteriófagos, por lo tanto se evaluó el efecto que tiene el agua de riego
de diferente origen sobre la actividad del fago ITL‐1. El agua se colectó de San Gaspar
(agua potable), Coatlán del Río (agua de pozo) y Zacatepec (agua de pozo), que son sitios
donde se siembra jitomate, incluyendo dos muestras de la Universidad Politécnica del
estado de Morelos nombradas M3 y M4 (agua potable).
En tubos Falcon con capacidad de 50 mL, se vertieron 40 mL de agua por duplicado
teniendo al final 10 tubos. A cada tubo se le agregaron 23 µL de la solución stock de fagos
38
que contenía un título inicial de 1.3x108 PFU/mL, para llevar a un título de 1x106 PFU/ mL.
La solución se incubó durante 3 h y se procedió a la titulación de cada solución,
transcurridas 24 h se realizó otra titulación, y posteriormente cada tercer día durante 2
semanas, titulando por duplicado cada tubo obteniendo así 4 repeticiones por unidad. A
cada muestra de agua se le midió el pH y la conductividad eléctrica.
39
IV Resultados y discusión
4.1 Producción in vitro del bacteriófago ITL‐1
La inoculación del bacteriófago ITL‐1 a diferentes tiempos en los cultivos de R.
solanacearum (figura 8), mostró que el mejor rendimiento fágico (1.85 x1011 PFU/ mL) se
obtuvo al inocular el fago a las 5 h después de iniciado el cultivo bacteriano y que
corresponde al inicio de la fase exponencial de crecimiento microbiano. En el momento en
el que se detuvo el proceso el cultivo bacteriano presentó una densidad óptica de 0.097 a
600 nm.
Otro título fágico (4.20 x1010 PFU/ mL), se obtuvo al inocular el fago a las 10 h de
crecimiento microbiano, al momento de detener la cinética el cultivo presentó una
densidad óptica de 0.948 a 600 nm. El título fágico más bajo (2.14x109 PFU/ mL), se
obtuvo al inocular el fago a las 15 h después de iniciar el crecimiento microbiano, al
momento de detener la cinética el cultivo presentó una densidad óptica de 1.213 a 600
nm. En todos los casos, la cinética de producción viral se detuvo 5 h después de la
inoculación viral.
Se observó que entre mayor es el tiempo de cultivo bacteriano, menor es el rendimiento
fágico que se obtiene. Esto contradice a la idea de que a mayor concentración bacteriana,
mayor rendimiento fágico. Esta contradicción podría explicarse de la siguiente manera:
R. solanacearum es una bacteria Gram‐negativa la cual produce un polisacárido
extracelular (Addy et al 2012a) el cual es liberado al medio por la bacteria.
40
Figura 8. Perfiles de crecimiento bacteriano después de inocular al bacteriófago
ITL‐1 en diferentes momentos de la curva de crecimiento microbiano. La
inoculación de virus se realizó al inicio (………), final de la fase exponencial ( ̶ ̶ ̶ )
y al final de la fase lineal ( ̶ ∙∙ ̶ ) de la curva de crecimiento microbiano. Los títulos
virales fueron 1.85 x10 11 PFU/ mL, 4.20 x1010 PFU/ mL, 2.14x109 PFU/ mL
respectivamente.
Este componente bacteriano es el que bloquea el xilema de las plantas de jitomate y, si
además funciona como receptor del fago ITL‐1, al encontrarse de manera soluble y no
asociado a bacterias, puede neutralizar a los virus impidiendo que se lleve a cabo una
infección productiva. Existe evidencia de que ciertos bacteriófagos como el Φ 1 y el Φ11,
utilizan a los polisacáridos bacterianos como receptores. Por lo tanto, si la producción de
exopolisacáridos solubles se incrementa con el tiempo de cultivo ello puede explicar el
1.85 x10 11 PFU/ mL
4.20 x10 10PFU/ mL
2.14 x109 PFU/ mL
41
menor rendimiento viral al inocular el virus en cultivos bacterianos con mayor tiempo de
crecimiento (Brito 2013).
Los resultados obtenidos en este trabajo respecto a la amplificación viral (figura 8)
coinciden con los obtenidos en 2011, por Terán quien, trabajando con el fago ITL‐1,
obtuvo los mejores rendimientos virales cultivando el virus por un lapso corto de tiempo
(entre 3 y 7 horas), confirmando que es recomendable cosechar al virus unas horas
después de haber inoculado el cultivo microbiano.
4.2 Efecto preventivo y curativo del bacteriófago ITL‐1 en plantas de jitomate
Durante la evaluación de los efectos preventivo y curativo del bacteriófago ITL‐1, se
observó que: 1) no se desarrolló la enfermedad en las plantas, pre‐requisito indispensable
para evaluar dichos efectos, y 2) no se detectaron bacteriófagos en los lixiviados
obtenidos. Se asumen varios factores que pudieron interferir en el proceso de infección de
las plantas, así como también en la actividad del bacteriófago.
La ausencia de marchitez en las planta, no se debió a la pérdida de viabilidad bacteriana,
porque para las aplicaciones, el cultivo de la bacteria se preparó de 2 a 3 horas antes a
partir de un cultivo fresco; tampoco a la pérdida de patogenicidad por el fitopatógeno,
porque la cepa utilizada es capaz de causar lesiones cuando se inocula en el tallo de las
plantas de jitomate (figura 9).
42
Figura 9. Corte transversal del tallo de la planta de jitomate. Las flechas señalan las
lesiones que causó R. solanacearum.
Después de 25 días de exposición a la bacteria ninguno de los grupos de plantas
presentaron síntomas de marchitez (figura 10). Para evaluar si las plantas se infectaron,
estas se llevaron a laboratorio y el exudado de los tallos de cada planta se sembró en cajas
de Petri con medio NBY.
Después de la siembra del exudado, las colonias presentaron un fenotipo similar al de R.
solanacearum, caracterizado por colonias mucoides, de color blanquecino, elevación
umbonada, con bordes ondulados y pleomórficas (figura 11). La presencia de R.
solanacearum se confirmó por PCR por la presencia del producto de 282 pb.
Estos resultados indican que R. solanacearum infectó a las plantas de jitomate pero no se
manifestó la enfermedad. Probablemente los factores ambientales como temperatura y
humedad relativa no fueron los adecuados para que la infección progresara a
43
enfermedad. Recientemente, Singh (2013) observó una relación entre el incremento de la
temperatura de los cultivos de jitomate y el desarrollo de la marchitez bacteriana por R.
solanacearum, utilizando las variedades de jitomate Pusa Ruby y N‐5, determinando que
la incidencia de la enfermedad se incrementaba a pasar de los 25 a 35 o C, mientras por
debajo de los 25 o C, no se observo desarrolló de la enfermedad. Este reporte refuerza las
observaciones realizadas en este trabajo las cuales muestran que no se desarrolló
enfermedad bajo las condiciones de cultivo que se utilizaron, en las cuales predominó una
temperatura promedio de 22 o C.
Figura 10. Las plantas de jitomate expuestas a R. solanacearum no se infectaron después de 25 días de exposición al fitopatógeno bacteriano. A) plantas de jitomate al final del experimento, B) El exudado de las plantas analizadas fue siempre transparente. C) Se muestra un ejemplo del exudado mucoide que se obtiene cuando una planta está infectada.
A B
C
44
En la figura 11 C se observa que el producto esperado de PCR de 282 pb de R.
solanacearum se encontró en el exudado de los tallos de las plantas (carriles 1 y 2).
Así mismo, el peso molecular de este producto coincide con el encontrado en la
muestra en la que se uso como molde ADN genómico purificado de R. solanacearum
(carril 3) lo que indica que las colonias del exudado de los tallos de las plantas de
jitomate pertenecen a la especie R. solanacearum.
Figura 11. Identificación cultural y por PCR de R. solanacearum en exudados de los tallos de las plantas de jitomate. a) y b) colonias bacterianas obtenidas del exudado, c) Amplificación por PCR del fragmento de 282 pb de R. solanacearum. Carriles 1 y 2, muestras correspondientes a colonias compatibles con la morfología de R. solanacearum. Carril 3, control positivo en el que se usó como molde ADN genómico de R. solanacearum. Carril 4, marcador de peso molecular (Thermo Scientific SM1373 ladder 1).
A B
1 2 3 4800
300
200
100
C
P.M (pb)
282 pb
45
Para explicar la ausencia de la actividad fágica en los lixiviados, en primera instancia se
verificó que el pH de la solución nutritiva estuviera en niveles aptos para el crecimiento
adecuado de R. solanacearum (pH 4‐8) y para la actividad del fago ITL‐1(pH 5‐7, Flores
2012), ya que éste es un factor esencial y, como se describe más adelante, es crítico para
la estabilidad del fago. Los resultados mostraron que el pH de la solución nutritiva estuvo
entre 5.5 y 6.0 por lo que este no era un factor que explicara la ausencia de actividad
fágica en los lixiviados.
Otras posibles causas que pudieran explicar la ausencia de actividad fágica es que el fago
se desestabilizara por el pH conferido a los lixiviados por la turba. Como se muestra en el
cuadro 7, la turba confería a los lixiviados un pH ácido (pH=3.23 – 3.81), condición que no
favorece la estabilidad del bacteriófago (Iriarte 2007), el cual inicialmente se encontraba
en la solución nutritiva con un pH=5‐6. Otra posibilidad es que los fagos podrían quedar
atrapados en la turba, la cual pudiera funcionar como una columna de retención donde se
quedan adsorbidos los virus. Existen reportes que muestran que la radiación solar puede
afectar a los bacteriófagos (Iriarte 2007). En este trabajo se descarta la posibilidad de que
los bacteriófagos fueran inactivados por los rayos solares ya que la solución con
bacteriófagos se transportó al bioespacio protegida de la luz solar, y se aplicó por las
tardes en una hora en la que las plantas no se exponían a los rayos solares, sino hasta el
día siguiente. Se conoce también que la desecación afecta la actividad fágica (Jończyk
2011), pero este factor se descarta porque las plantas se regaron diariamente cuidando
que el sustrato permaneciera húmedo. En consecuencia todo indica que el pH de la turba
impidió la actividad fágica.
46
4.3 Comportamiento de los factores ambientales durante la infección con R. solanacearum en los ensayos en el bioespacio e invernadero
Las condiciones ambientales (humedad relativa y temperatura) no fueron las adecuadas
para que se desarrollara la enfermedad en el bioespacio; en la figura 12 y 13 se muestra
que las condiciones que se presentaron en ambos lugares.
También es posible que la dosis bacteriana utilizada en el experimento realizado en el
biospacio fuera demasiado baja y tal vez no alcanzó la concentración umbral para que las
plantas se infectaran y se desarrollara la enfermedad, sin embargo, Singh (2013), logra
incidencias hasta del 63% de la marchitez bacteriana usando tan solo 100 UFC/mL pero no
indica a que temperatura ocurre este fenómeno.
Entre el bioespacio y el invernadero, los perfiles de temperaturas máximas difirieron de
forma importante (figura 12). En el bioespacio el cultivo se inició con bajas temperaturas,
presentando en la primera semana un máximo de 32 °C y un mínimo de 17.5 °C, mientras
que en el invernadero, en la primera semana se presentó una temperatura muy estable,
con un máximo de 37.8 °C y un mínimo de 35.5 °C. Durante las semanas que siguieron, la
temperatura en ambos lugares fue similar, a excepción de los días 10 y 11 post‐infección,
en los cuales se presentó un descenso en el invernadero. La última semana del
experimento se presentaron temperaturas máximas de 40.4 °C y 38.4 °C en el bioespacio y
el invernadero, respectivamente, y unas temperaturas mínimas de 35.7 °C y 31.3 °C. En el
invernadero donde se manifestó la enfermedad, la caída en la temperatura, coincide con
incremento en el porcentaje de marchitez.
47
Figura 12. Condiciones de temperatura y porcentaje de marchitez que se presentaron
durante 19 días en el bioespacio y el invernadero (dde: días después de la exposición a R.
solanacearum).
Con respecto a la humedad relativa, los perfiles entre el bioespacio y el invernadero son
muy diferentes. La primera semana en el bioespacio se caracterizó por una gran
variabilidad en las máximas humedades registradas, con valores entre el 56.9% y el 99.5%,
mientras que en el invernadero se presentó una humedad relativa estable, con un mínimo
de 94.6% y un máximo de 100%. La aparición e incremento en la marchitez bacteriana en
el invernadero, coincide con el incremento de la humedad relativa, este incremento en la
humedad se debió, como ocurrió con la temperatura, a la anomalía climatológica de los
huracanes Ingrid y Manuel. Durante los días de posteriores a la exposición, el incremento
de la marchitez fue gradual hasta superar el 90% a los 7 días después de la exposición.
48
Figura 13. Condiciones de humedad relativa y porcentaje de marchitez que se presentaron
durante 19 días en el experimento de infección (dde: días después de la exposición a R.
solanacearum)
A partir de la información de las figuras 12 y 13, se sugiere que temperaturas altas al inicio
del experimento podrían favorecer el incremento de la población bacteriana en el
sustrato, además de estresar a la planta, tanto hídricamente como fisiológicamente,
debilitando sus mecanismos de defensa. Adicionalmente, la marchitez se presentó
inmediatamente después de tres días consecutivos de bajas temperaturas y elevada
humedad relativa, este estrés se presentó después de la exposición a altas temperaturas
(figura 12). Estas condiciones pudieron haber jugado un papel importante en el desarrollo
de la enfermedad. Los dos factores que sugieren que la planta se torna susceptible e
inducen la aparición de marchitez bacteriana parecen ser: temperaturas elevadas como
encontró Singh (2013) quien determinó que a temperaturas por arriba de los 35 o C R.
solanacearum presentó incidencias del 63%, (por arriba de 35 o C) y humedad relativa del
49
100% exactamente antes de la manifestación de la enfermedad, ello podrá confirmarse
con la repetición del experimento bajo condiciones controladas.
4.4 Evaluación de oligonucleótidos para la cuantificación viral por PCR‐RT
De los tres pares de oligonucleótidos analizados en las reacciones de PCR‐RT, los
denominados ITL1‐RT1 fueron los que presentaron una mayor sensibilidad puesto que
para una misma cantidad de ADN se obtuvo el menor Ct (cuadro 6, figura 14). Con este
par de oligonucleótidos se preparó la curva patrón, utilizando diluciones base 5 de la
solución stock fágica original.
Figura 14. Perfiles de amplificación del fago ITL‐1, utilizando tres pares de oligonucleótidos diferentes. La línea roja continua corresponde a los oligonucleótidos ITL1‐RT1, la línea azul discontinua corresponde a los oligonucleótidos ITL1‐RT2 y línea negra punteada corresponde a los oligonucleótidos ITL1‐RT3.
Como se observa en la figura 15, el desempeño del PCR‐RT, incluyendo 1µL de cada
solución fágica diluida en solución de sulfatos, corresponde a lo esperado puesto que se
50
observan separaciones más o menos constantes entre cada triplete de curvas de
amplificación. También se observa una adecuada reproducibilidad para cada dilución.
Cuadro 6. Ciclo umbral (Ct) obtenido por cada uno de los tres pares de oligonucleótidos
evaluados para cuantificar al bacteriófago ITL‐1 por PCR‐RT
Concentración viral (PFU/mL)
Ct
ITL1‐RT1 ITL1‐RT2 ITL1‐RT3
1.00E+08 16.78 17.99 17.32
1.00E+07 19.48 21.51 21.08
1.00E+06 22.96 24.64 24.19
Figura 15: Perfiles de amplificación del fago ITL‐1, utilizando el par de oligonucleótidos ITL1‐RT1 y seis diluciones en base 5.
Al analizar la curva patrón se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.99 (Figura 16), lo
que indica que existe un comportamiento lineal entre la concentración viral y el número
Umbral
51
de ciclos del sistema, lo que permitió proceder a evaluar la concentración viral en los
lixiviados.
Figura 16. Curva patrón para la cuantificación del fago ITL‐1 por PCR‐RT utilizando los
oligonucleótidos ITL1‐RT1.
Esta técnica puede ser usada en investigaciones posteriores para estudiar cómo se
modifica la concentración viral durante la amplificación in vitro, así como para su
detección en planta y en el ambiente.
Concentración
Ciclo umbral
r= 0.99750
r2=0.99501
m=3.495
b= 28.366
52
4.5 Evaluación del efecto de diferentes sustratos sobre la actividad del bacteriófago
ITL‐1
A los lixiviados obtenidos a partir de los diferentes sustratos, se les midió el pH, la
conductividad y su capacidad de retención (cuadro 7).
Cuadro 7. Valores de capacidad de retención, pH y conductividad eléctrica de los
sustratos
Sustrato Capacidad de retención (mL/g)
pH Conductividad (µS/cm)
Tepojal 0.46 6.02 2.735
Turba/tepojal 0.75 3.81 3.34
Suelo de Coatlán del Río
0.23 6.37 6.94
Fibra de coco 0.86 5.82 4.51
Suelo de Zacatepec
0.12 6.99 6.83
Tezontle 0.10 6.96 2.04
Turba 2.38 3.23 2.75
En el cuadro 7 se observa que la turba es el sustrato con mayor capacidad de retención
(2.38 mL/g), mientras que el tezontle presenta el menor valor para este parámetro (0.10
mL/g). Los lixiviados con los valores de pH más ácidos fueron: la turba (pH= 3.23), y la
mezcla de ésta con tepojal (pH= 3.81). En relación a la conductividad el tezontle fue el que
presentó la conductividad más baja (2.04 µS/cm) a comparación del suelo de Coatlán del
Río que tiene la conductividad más elevada (6.94 µS/cm).
Al titular los bacteriófagos presentes en los lixiviados, se observó que en los
correspondientes a la turba y en la mezcla de ésta con tepojal, no se detectó la
53
formación de placas de lisis en ninguna dilución y tampoco en los lixiviados sin diluir
(figura 17). En todos los lixiviados en los que se detectó al fago, el título viral fue siempre
cercano a un orden de magnitud de 105, con títulos que van de 8.9 X104 a 6.0 X105
PFU/mL.
Figura 17. Influencia del sustrato en la actividad del bacteriófago ITL‐1. Las literales iguales indican que no hay diferencia estadísticamente significativa.
54
Los títulos virales que se obtuvieron en los sustratos tepojal, fibra de coco, suelo de
Zacatepec, suelo de Coatlán del Río y tezontle se mantuvieron constantes a lo largo del
experimento, a diferencia de lo que ocurrió con la turba y la mezcla de ésta con tepojal,
este resultado se atribuye a los bajos valores de pH (3.23, 3.81) que poseen. Este factor es
probablemente la causa por la cual no hubo actividad fágica. La capacidad que poseen los
bacteriófagos para sobrevivir bajo condiciones desfavorables es muy variable (Ackermann
2004), intervienen diferentes factores físicos y químicos, tales como la temperatura, la
acidez, y la concentración de iones presentes en el medio. Todas estas condiciones
influyen en la actividad del fago (Jończyk 2011).
En la filosfera, los bacteriófagos no pueden permanecer tiempos prolongados ya que se
encuentran limitados por diversos factores: irradiación de la luz solar, la temperatura, la
desecación y la exposición a bactericidas que en su composición contengan cobre (Iriarte
2007). En todos los trabajos publicados referentes a la estabilidad de los bacteriófagos
indican que existe una gran variación en los perfiles de estabilidad a diferentes valores de
pH (Whitman et al. Marshal 1971, Thorne et al. Holt 1974, Feng et al en 2003, Jepson et al.
March 2004, Vivek et al 2009, Yang et al 2010) y que no se puede determinar un patrón
para todos los bacteriófagos, lo que señala nuevamente la necesidad de determinar de
forma individual este tipo de características en los nuevos bacteriófagos aislados.
Los resultados obtenidos por Flores (2012) indican que el bacteriófago ITL‐1 es estable en
un intervalo de pH que va de 5 a 7, empezando a caer la estabilidad a partir de un pH de 8
y perdiéndose totalmente el título a pH’s menores de 5. Esto podría representar una
limitación en la utilidad del bacteriófago como agente de control por lo que la
55
implementación de estrategias que incrementen la estabilidad del bacteriófago ITL‐1 en el
campo ayudaría a utilizar este tipo de mecanismos de control biológico (Ma et al. 2008).
4.7 Influencia del origen del agua de riego sobre la actividad del bacteriófago ITL‐1
Las características de conductividad y pH que presentaba cada tipo de agua evaluado se
muestran en el cuadro 8.
Cuadro 8. Valores de pH y conductividad eléctrica obtenidos por cada fuente de agua
Origen del agua
pH Conductividad eléctrica (µS/cm)
Pozo de Coatlán del Río
6.60 0.46
Agua potable de San Gaspar
6.18 1.37
Pozo de Zacatepec
7.22 1.13
Agua potable UPEMOR (M3)
8.72 0.23
Agua potable UPEMOR (M4)
8.63 0.25
Se observa que la fuente de agua que presenta un valor de pH ligeramente ácido es la de
San Gaspar (pH= 6.18). Las muestras de Zacatepec (pH= 7.22) y Coatlán del Río (pH= 6.60)
presenta un pH cercano a la neutralidad, mientras que las muestras de agua potable de la
UPEMOR (M3 y M4) presentan valores ligeramente alcalinos (8.72 y 8.63,
respectivamente). En relación a la conductividad, las muestras provenientes de la
UPEMOR (M3 y M4) fueron las que presentaron la conductividad más baja (0.23 y 0.25
µS/cm), mientras que la muestra proveniente de San Gaspar tuvo la conductividad más
elevada (1.37 µS/cm).
56
Al poner en contacto el bacteriófago con el agua de estos orígenes, se observó que en los
correspondientes a M3 y M4, no se detectó la formación de placas de lisis en ninguna
dilución y tampoco en la muestra sin diluir (figura 18). En todas las muestras de agua en
las que se detectó al fago, el título viral fue siempre cercano a un orden de magnitud de
104, con títulos que iban de 5.33 X 103 a 3.73 X 104 UFC/mL. Durante el transcurso de 12
días, el título se mantuvo estable en las muestras de agua de San Gaspar, Coatlán del Río y
Zacatepec, sin embargo no se detectó actividad en las muestras de agua provenientes de
la UPEMOR.
Figura 18. Estabilidad del bacteriófago ITL‐1 en agua de diferente origen, (ddi: días
después de la inoculación con R. solanacearum)
57
En el ensayo llevado a cabo sobre el efecto preventivo y curativo del bacteriófago ITL‐1,
además de evaluar el efecto del sustrato sobre la actividad fágica, también se procedió a
evaluar el agua utilizada. No existen reportes que muestren la influencia de las
características del agua en la actividad fágica. Como se mencionó anteriormente, uno de
los factores para que la actividad del bacteriófago tenga éxito es el pH. Varios autores
mencionan la importancia de este y las consecuencias de no estar en rangos aceptables
para la actividad fágica. Es por este motivo que a cada bacteriófago aislado se debe de
evaluar estos factores, los valores obtenidos de pH del agua proveniente de las muestras
de la UPEMOR contenían un pH de 8, eliminando por completo a actividad del
bacteriófago. También se observa que las muestras de la UPEMOR (M3 y M4) fueron las
que presentaron la menor conductividad lo que indica que estas muestras poseen pocas
sales disueltas, Flores (2012) demostró que el bacteriófago ITL‐ 1 es sumamente inestable
en agua destilada y en soluciones que contienen únicamente cloruro de sodio, por lo tanto
es posible que la baja concentración de sales en las muestras de la UPEMOR también
contribuyera a desestabilizar al bacteriófago ITL‐1.
58
VI Conclusiones
Los mayores títulos viales del bacteriófago ITL‐1 (1x109 PFU/mL) se encontraron a las 5 h
después de la inoculación de un cultivo bacteriano con una densidad óptica de 0.1 a 600
nm.
Bajo las condiciones en las que se realizó el experimento de infección de plantas de
jitomate con Ralstonia solanacearum, no se logró el desarrollo de la enfermedad y en
consecuencia no se pudo observar la interacción jitomate‐ Ralstonia solanacearum‐
bacteriófago ITL‐1.
Aparentemente el pH que se genera a partir de la turba en los lixiviados, desestabiliza al
bacteriófago ITL‐1 lo que impide su detección en los mismos.
Los resultados mostraron que hay diferencias sustanciales entre cada una de las fuentes
de agua y tipo de sustrato utilizados, en cuanto a la viabilidad del fago, confirmando que
para cada fuente de agua la conductividad y el pH influyen en la actividad fágica.
Finalmente, los datos de temperatura y humedad relativa sugieren que no se presentaron
las condiciones adecuadas para que se desarrollara la enfermedad en las plantas
cultivadas en el bioespacio.
59
VII Bibliografía Ackermann H. 2004. Bacteriophages, Pp:135‐146, Schaechter M. The Desk Encyclopedia of
Microbiology, Elsevier. China 1166p.
Ackermann H. 2011. Bacteriophage taxonomy.Microbiology.Aust. 4.
Addy H, Askora A, Kawasaki T, Fujie M and Yamada T. 2012a. Loss of virulence of the
phytopathogen Ralstonia solanacearum through infection by φRSM filamentous
phages. Phytopathology 102:469‐477.
Addy H, Askora A, Kawasaki T, Fujie M and Yamada T. 2012b.The filamentous phage фRSS1
enhances virulence of phytopathogenic Ralstonia solanacearum on
Tomato.Phytopathology 102: 244 – 251.
Agrios GN. 2005. Plant pathology. 5ª Edición. Harcourt/Academic Press. 635 p.
Anith KN, Momol M, T Kloepper, JW, Marois J, Olson M and Jones B. 2004. Efficacy of
plant growth‐promoting rhizobacteria, acibenzolar‐S‐methyl, and soil amendment
for integrated management of bacterial wilt on tomato. Plant Disease. 88:669‐673.
Askora A, Kawasaki T, Usami S, Fujie M and Yamada T. 2009. Host recognition and
integration of filamentous phage ΦRSM in the phytopathogen, Ralstonia
solanacearum. Virology 384:69‐76.
Bae JY, Wu J, Lee H, Jo E, Murugaiyan S, Chung E and Lee S. 2012. Biocontrol potential of a
lytic bacteriophage PE204 against bacterial wilt of tomato. Journal of microbiology
and biotechnology, 22:1613‐1620.
Brito A. 2013 Mecanismo que utilizan los bacteriófagos Φ1, Φ10 y Φ11 para infectar a
Rhizobium etli CFN42. Encuentro de jóvenes investigadores‐ CONACYT.
60
http://www.uagro.mx/usr/admin/investigacion/ponencias/biologicas/biol%20%28
67%29.pdf
Carter J and Saunders V. 2007. “Bacterial viruses”.Pp: 229‐255, In: Carter‐ J. Saunders, V.
(eds.) Virology Principles and applications. John Wiley & Sons Ltd. England, 1116p.
Caruso P, Palomo E, Bertolini B, López EG and Biosca. 2005. Seasonal variation of
Ralstonia solanacearum biovar 2 populations in a Spanish river: recovery of
stressed cells at low temperatures. Applied Environmental Microbiology 71:140–
148.
Champoiseau PG, Jones JB, Allen C. 2009. Ralstonia solanacearum race 3 biovar 2 causes
tropical losses and temperate anxieties. Online. Plant Health Progress. 10:313‐01.
Cooksey DA. 1990. Genetics of bactericide resistance in plant pathogenic bacteria. Annual.
Review of Phytopathology 28:201–19.
Denny TP and Hayward AC. 2001. Gram negative bacteria. Ralstonia. Laboratory guide for
identification of plant pathogenic bacteria, Pp:151‐174. In: Schaad N, Jones B, and
Chun W, (eds). APS Press, St. Paul, 798p.
EPPO, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 2004. Diagnostic protocols for regulated pests. 173 –
178.
Fegan M, Prior P, Allen C, and Hayward AC. 2005. How complex is the" Ralstonia
solanacearum species complex". Bacterial wilt disease and the Ralstonia
solanacearum species complex, 449‐461p.
Feng YY, Ong SL, Hu JY, Tan XL and Ng WJ. 2003. Effects of pH and temperature on the
survival of coliphages MS2 and Qbeta. J Ind Microbiology Biotechnology 30:549–552.
61
Fujiwara A, Fujisawa M, Hamasak R, Kawasaki T, Fujie M and Yamada T. 2011. Biocontrol
of Ralstonia solanacearum by treatment with lytic bacteriophages. Applied
Environmental Microbiology 77:4155‐4162.
Flores, D. 2012 Determinación de las condiciones que favorezcan la estabilidad del
bacteriófago ITL‐1, en anaquel y durante su aplicación en campo. Tesis de
Licenciatura. Universidad Politécnica del Estado de Morelos.
Gaber B, and Wiebe W. 1997. Enfermedades del jitomate. Guía Práctica para Agricultores.
Peto Seed Company. 61p.
Greer G. 2005. Bacteriophage control of foodborne bacteria. Journal Food Protection
68:1102‐1111.
Grey B, Steck T. 2001. The viable but nonculturable state of Ralstonia solanacearum may
be involved in long‐term survival and plant infection. 2001. Applied Environmental
Microbiology 67:3866–3872.
Hanson PM, Wang JF, Licardo O, Hanudin, Mah SY, Hartman GL, Lin YC and Chen JT. 1996.
Variable reactions of tomato lines to bacterial wilt evaluated at several locations in
Southeast Asia. HortScience 31:143‐146.
Hayward AC. 1964. Characteristic of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied
Bacteriology 27: 265 – 277.
Hayward AC. 1991. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas
solanacearum. Annual Review of Phytopathology 29:65–87.
Hendrick CA and Sequeira L. 1984. Lipopolysaccharide‐Defective mutants of the wild
pathogen Pseudomonas solanacearum. Applied Environmental Microbiology
48:94‐101.
Hernández J, Ramírez Y. 2012. First report of Ralstonia solanacearum causing tomato
bacterial wilt in Mexico. New Diseases Report 26: 22.
62
Iriarte FB, Jackson LE, Balogh B, Obradovic A and Momol MT. 2007. Factors affecting
survival of bacteriophage on tomato leaf surfaces. Applied and Enviromental
Microbiology 73:1704–1711.
Janse JD. 1996. Potato brown rot in western Europe: History, present occurrence and
some remarks on possible origin, epidemiology and control strategies. EPPO Bull.
26:679‐695.
Jarvis W, and McKeen C. 1991. Tomato diseases.Agriculture Canada.70 p.
Jepson CD, March JB. 2004. Bacteriophage lambda is a highly stable DNA vaccine delivery
vehicle. Vaccine 22:3413–1419.
Ji P, Allen C, Sanchez A, Yao J, Elphinstone JG, Jones JB and Momol MT. 2007. New diversity of
Ralstonia solanacearum strains associated with vegetable and ornamental crops in Florida.
Plant Disease 91:195‐203.
Ji P, Momol MT, Olson SM and Pradhanang PM. 2005. Evaluation of thymol as biofumigant
for control of bacterial wilt of tomato under field conditions. Plant Disease 89:497‐
500.
Jones JB, Jackson LE, Balogh B, Obradovic A, Iriarte FB and Momol MT. 2007.
Bacteriophages for plant disease control. Annual. Review. Phytopathology 45:245–
62.
Jończyk E, Kłak M, Międzybrodzki R and Górski A. 2011. The influence of external factors
on bacteriophages. Review. Folia microbiologica 56:191‐200.
Kutter E, and Sulakvelidze A. 2004. Bacteriophages: Biology and Applications. Estados
Unidos de América.Ed. CRC Press. 528p.
63
Lin CH, Hsu ST and Tzeng KC. 2009. Detection of race 1 strains of Ralstonia solanacearum
in field samples in Taiwan using a BIO‐PCR method. European Journal of Plant
Patholology 124:75–85.
Lindberg A. 1973. Bacteriophage Receptors. Annual Review of Microbiology 27:205‐241.
Ma Y, Pacan JC, Wang Q, Xu Y, Huang X, Korenevsky A and Sabour PM. 2008.
Microencapsulation of bacteriophage Felix O1 into chitosan‐alginate microspheres
for oral delivery. Applied and Environmental Microbiology. 74:4799‐4805.
McDougald D, Rice S, Weichart D and Kjelleberg S. 1998. Nonculturability: adaptation or
debilitation. FEMS Microbiology Ecology. 25:1–9.
Messiha NAS, Van Bruggen AHC, Van Diepeningen AD, de Vos OJ, Termorshuizen AJ, Tjou‐
Tam‐Sin and Janse NNA. 2007a. Potato brown rot incidence and severity under
different management and amendment regimes in different soil types. European
Journal of Plant Pathology 119:367–381.
Moat GA, Foster J, Spector M. 2002. “Bacteriophage Genetics” capítulo 6 en: Microbial
Physiology. cuarta edición, Wiley‐Liss, USA, 1‐38p.
Murugaiyan S, Bae J, Wu J, Lee S, Um H, Choi H, Chung E and Lee J y Lee S. 2010.
Characterization of filamentous bacteriophage PE226 infecting Ralstonia
solanacearum strains.Journal of Applied Microbiology 110: 296:303.
Norman DJ, Chen J, Yuen JM, Mangravita‐Novo A, Byrne D and Walsh L. 2006. Control of
bacterial wilt of geranium with phosphorous acid. Plant Disease 90:798‐802.
Ozawa H, Tanaka H, Ichinose Y and Shiraishi T. 2001. Bacteriophage P4282, a parasite of
Ralstonia solanacearum, encodes bacteriolytic protein important for lytic infection
of its host. Molecular Geneticts Genomics 265:95‐101.
64
Perea SJM, García ERS, Allende MR, Carrillo FJA, León FJ, Valdez TB y López SFSM. 2011.
Identificación de razas y biovares de Ralstonia solanacearum aisladas de plantas de
jitomate. Revista Mexicana de Fitopatología 29:98‐108.
Remenant B, Coupat‐Goutaland B, Guidot A, Cellier G, Wicker E, Allen C, y Prior P. 2010.
Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species
complex reveal significant evolutionary divergence.BioMedCentral Genomics. 11:
1:16.
Saddler G. 2005. Management of bacterial wilt disease. Bacterial Wilt Disease and the
Ralstonia solanacearum Species Complex. C. Allen, P. Prior, and A. C. Hayward, eds.
American Phytopathological Society, St. Paul, MN USA. 121‐132p.
Sanchez PA, Mejia L and Allen C. 2008. Diversity and distribution of Ralstonia
solanacearum strains in Guatemala and rare occurrence of tomato fruit infection.
Plant Pathology. 57:320–331.
Schell MA. 2000. Control of virulence and pathogenicity genes of Ralstonia solanacearum
by an elaborate sensory network. Annual Review of Phytopathology 38:263:92.
Singh D, Yadav DK, Sinha S and Choudhary G. 2013. Effect of temperature, cultivars, injury
of root and inoculums load of Ralstonia solanacearum to cause bacterial wilt of
tomato. Archives of Phytopathology and Plant Protection. In press.
Shigenobu M, Rashel M, Uchiyama J, Sakurai S, Ujihara T, Kuroda M, Ikeuchi M, Tani K,
Fujiedam M and Wakiguchi H and Imai S. 2005. Bacteriophage therapy: a
revitalized therapy against bacterial infectious diseases. Journal of Infectious
Chemotherapy 11:211:219.
Skurnik M and Strauch E. 2006. Phage therapy: Facts and fiction. International Journal of
Medical Microbiology 296:5:14.
65
Sulakvelidze A. 2005. Phage therapy: an attractive option for dealing with antibiotic‐
resistant bacterial infections. Drug Discovery Today 10:807:809.
Tanaka H, Negishi H, Maeda H. 1990. Control of tobacco bacterial wilt by an avirulent
strain of Pseuomonas solanacearum M4S and its bacteriophage. Annual
Phytopathology. Society. of Japan 56:243:246.
Terán I. 2012. Bioprospección de bacteriófagos con actividad lítica hacia Ralstonia
solanacearum. Tesis de Licenciatura Universidad Politécnica del Estado de Morelos.
Thorne CB, Holt SC. 1974. Cold lability of Bacillus cereus bacteriophage CP‐51. Journal of
virology. 14: 1008‐1012.
Vidaver AK. 1976. Prospects for control of phytopathogenic bacteria by bacteriophages
and bacteriocins. Annual Review of Phytopathology 14:451‐465.
Vivek V, Kusum H and Sanjay C. 2009. Characterization of a T7‐Like Lytic Bacteriophage of
Klebsiella pneumoniae B5055: A Potential Therapeutic Agent. Current Microbiology
59: 274‐281.
SAGARPA 2010. Monografía de Cultivos.
http://www.sagarpa.gob.mx/agronegocios/Documents/pablo/Documentos/Mono
grafias/Jitomate.pdf
Serrano R. 2013. Aislamiento, caracterización e identificación de bacteriófagos con
actividad lítica hacia los fitopatógenos del JITOMATE Ralstonia solanacearumY
Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis. Tesis de Licenciatura Universidad
Politécnica del Estado de Morelos.
SIAP 2013. Resumen nacional de la producción agrícola.
http://www.siap.gob.mx/index.php?option=com_wrapper&view=wrapper&Itemid
=258
Whitman PA, Marshal RT. 1971. Isolation of Psychrophilic Bacteriophage‐Host Systems
from Refrigerated Food Products. Applied Microbiology 22: 220‐223.
66
Yamada T, Kawasaki T, Nagata S, Fujiwara A, Usami S and Fujie M. 2007.New
bacteriophages that infect the phytopathogen Ralstonia
solanacearum.Microbiology 153: 2630:2639.
Yang H, Liang L, Lin S and Jia S. 2010. Isolation and Characterization of a Virulent
Bacteriophage AB1 of Acinetobacter baumannii. BioMedCentral Microbiology. 10: 1‐
10.