Interacción Primaria
Comisión 4 – Año 2013
Enzimoinmunoanálisis (EIA)
Radioinmunoensayo (RIA)
Inmunofluorescencia (IFI, IFD)
Interacciónprimaria
Interacción secundaria
Características Interacción simple Ag-Ac
NO VISUALIZABLE
Formación de complejos macromoleculares
VISIBLES MACROSCOPICAMENTE
Factores que la condicionan
POCA INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES DEL MEDIO
DEPENDEN DE TEMP Y FZA IONICA (cc de sales)
Tipo de Ag y Ac involucrado
Ag y Ac monovalentes o polivalentes
NO IMP VALENCIA
Ac MINIMO bivalente Ag polivalente/particulado
VALENCIA > o = 2
Sensibilidad MAYOR MENOR
Interacción primaria
Es la unión entre un epítope y un paratope.
Ac + Hp AcHpk1
k-1
Es una reacción de equilibrio Cuanto más ac agregue a mi muestra mas complejo se formará y más
podré detectar
Esta interacción está principalmente influenciada por la temperaturaA mayor T°, menor tpo preciso
La interacción entre el epitope y el paratope obedece a la ley de acción
de masas.
Parámetros de la Interacción PrimariaAfinidad- Avidez
Afinidad: es la fuerza de unión o reacción entre un solo sitio de combinación del anticuerpo (paratope) con un solo determinante antigénico (epitope). Es la sumatoria de fuerzas de atracción y repulsión entre ellos.
Avidez: es la fuerza total de unión de antígenos multivalentes con anticuerpos multivalentes.
EIA Componentes de los EIA (Enzimoinmunoensayos)
• Componente Incógnita (puede ser Ac o Ag)• Componente que se una al incógnita (puede ser Ac o Ag)
• Componente que revele dicha interacción (en los EIA se une una Enzima, se le agrega el
sustrato y da un producto CROMOGENICO)
• Se mide el color por Densidad Óptica
Interacción
Primaria
Clasificación de los EIA
HomogéneosEn fase líquida
Heterogéneosempleando un soporte en
fase sólida para inmovilizar uno de los inmunoreactantes.
Ej: ELISAELISA
De amplificación de actividadNO COMPETITIVOS
De modulación de actividadCOMPETITIVOS
EIA (Enzimoinmunoensayo)
• Se basan en:- La elevada especificidad de los Ac- La alta actividad de algunas enzimas lo que
permite la señal generada por la muestra.
- Dos etapas grales:- La rx de un inmunoreactante con un ag o un ac- La detección de ese inmunoreactante mediante
la utilización de un conjugado enzimático.
EIA homogéneo
Hp Hp
Do
título
HpHp
Do
Cc de Ag.
1er Caso
2do Caso
EIA homogéneo
• En el 1er caso, el Hp está conjugado con la enzima. El OBJETIVO es determinar el titulo de un Ac específico. La presencia del mismo en la muestra al unirse al Hp, inhibirá la actividad de la enzima. Por tanto, disminuirá la DO cuanto mayor sea el título.
• Como obtengo el título?
EIA homogéneoNo es necesario separar los complejos Ag-Ac del antígeno
libre.
• Importante! El Ac debe cambiar la actividad de la enzima. • Como el ag marcado y la muestra se incuban juntos, esta última no puede contener isoenzimas, sustratos o inhibidores enzimáticos.• Los Hp deben ser de tamaño pequeño, asi la interacción enzima-Ac no son afectadas por el ag.
Usos: Ej - cuantificación de T4
EIA homogéneo
Hp
HpMuestra incógnita
HpHp Hp
HpHp
Hp
Variante competitiva
Do
Cc. de Ag
Por que no usar la variante anterior para cuantificar hapteno?
Porque no tengo Ac específico marcado con enzima.
Clasificación de los EIA
HomogéneosEn fase líquida
Heterogéneosempleando un soporte en
fase sólida para inmovilizar uno de los inmunoreactantes.
Ej: ELISAELISA
De amplificación de actividadNO COMPETITIVOS
De modulación de actividadCOMPETITIVOS
Competitivo…
S
P
Ag sensibilizante
Ac conjugado
Suero problema Do
título
En el 1er caso, el OBJETIVO es determinar el título de un Ac específico.
Para esto se sensibiliza una placa y se incuba la muestra incógnita con un Ac específico marcado.
Cuanto mayor sea la señal, menos Ac en la muestra.
Competitivo…
Ac captura
Ag a determinar
Ag conjugadoS
P
En el 2do caso, el OBJETIVO es determinar un ag.
Entonces, se sensibiliza la placa con un Ac de captura y compite el ag marcado con enzima y el ag sin marcar de mi muestra incógnita.
Cuanto mayor sea la señal, menor cantidad de dicho ag en la muestra.
Do
Cc ag
No competitivo…
Do
título
S
P
Ac conjugado
Suero problema
Ag sensibilizante
IndirectoIndirecto
En el 1er caso, el OBJETIVO es determinarr un Ac específico en una suero problema.
Entonces sensibilizamos una placa con ag específico, incubo con la muestra, lavo, agrego el conjugado.
No competitivo…
S
PAc conjugado
Ac captura
Do
cc del Ag
Ag a determinar
SandwichSandwich
En el 2do caso, el OBJETIVO es determinar un ag.
Asi sensibilizo la placa con un Ac específico, incubo con la muestra, lavo, agrego el conjugado. Mejor si ambos Ac son de la misma especie para evitar reactividad cruzada.Addemás tener en cuenta que sean específicos para distinto epitope, sino no se va a unir el congujado porque va a estar unido al sensibilizante.
Como obtengo la curva?? Con diluciones seriadas de un ag de concentración conocida y los demás componentes del sistema constantes
Do
Cc del Ag
Do
Cc ag
COMPETITIVO NO
COMPETITIVO
Entonces…ELISA no competitivo ELISA competitivo
InmovilizaciónInmovilización del inmunoreactante (Ag o Ac) a la fase sólida
Bloqueo
IncubaciónIncubación con el patrón y/o la muestra
IncubaciónIncubación con el ag marcado así como con el patrón y/o la muestra
Incubación con el Ac de detección
ReveladoRevelado (reacción colorimétrica)
Puesta a punto de la técnica…
Sensibilización de la placa
Materiales más usados (PVC y poliestireno).
Que ag? ADN, proteínas y oligopéptidos, células enteras
Bloqueo
Lavados
• Se eliminan componentes libres o unidos de manera no específica al inmunoreactante inmovilizado en la placa.
• Se utilizan soluciones salinas isotónicas (misma cc de solutos afuera que adentro de las celulas, ej.PBS) suplementadas con detergente (para impedir interacciones hidrofobicas inespecificas , ej.Tween 20).
Titulación del conjugado
Dil conj
suero
1/400 1/800 1/1600 1/3200
Positivo fuerte ++++ +++ ++ ++
Positivo débil +++ ++ + +/-
negativo ++ + - -
Cc óptima de conjugado
ReveladoSe pueden emplear:
• Peroxidasa de rábano (Oxidación)
2 DH + H2O2 2H2O + 2D- COLOR!!
Donante de H: OPD (490nm)
• Fosfatasa alcalina (Desforforilacion)
sustrato: p-nitro fenil fosfato p-nitro fenol (405nm) COLOR!!
Controles
Control Negativo
Suero no inmune
Control Positivo
Suero especifico
Control de inespecífico: Blanco:
OPD++
Aplicaciones • Cualitativas:
– Determinar la presencia de Ac específicos– Determinar la presencia de ag en una
muestra
• Semicuantitativas:– Titulación de Ac específicos
• Cuantitativas:– Determinar la cc de un antígeno en una
muestra
Procesamiento de datos y
expresión de resultados en ensayos inmunoenzimáticos
SENSIBILIDADEs la medida de la habilidad del ensayo de mostrar como positiva a una muestra que
realmente lo es aun cuando esta presente bajas cantidades del componente incógnita.
La capacidad de no producir falsos negativos.
ESPECIFICIDADEs la medida de la habilidad del ensayo de mostrar como negativa a una muestra que
realmente es negativa.
La capacidad de no producir falsos positivos.
Cálculo del valor de corte (cut off)Se construyen curvas para un gran número de sueros negativos y se grafica frecuencia (f) vs DO.
Se calcula
la media y
el DS:
f
DO
xMtras
(-)Mtras
(+)
2SD3SD
Cut offCut off
X+3DS X+3DS si la DO es menor a este valor el suero es negativo con un 99 % de certeza (van a haber falsos negativos) alta especificidad
X+2DS X+2DS cut off si la DO es menor a este valor el suero es negativo con un 95 % de certeza (van a haber falsos
positivos) alta sensibilidad
Ensayo cualitativo (detección de Ac)
Se pone una única dilución del suero y se mide la absorbancia, se informa como positivo si cae por encima del cut off.
Ejemplo:
Abs 1: 0,208
Abs 2: 1,034 Cut off: 1,090
Abs 3: 2,023
Ensayo semicuantitativo
Se hacen diluciones seriadas del suero a valorar y se grafica DO vs dil suero. El título es la inversa de la última dilución que desarrolla una DO mayor al cut off
Frec
DOx
Mtras(-)
Mtras(+)
DO
Dil suero Cutoff
Titulo
Ensayo cuantitativoSe determina la cc de ag por comparación con una curva patrón.
cc antígeno patrón
ccmuestra
DO
DO incógnita