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Felipe Trajtenberg !
Unidad de Cristalografía de Proteínas Institut Pasteur de Montevideo
Introducción a la Cristalografía de Macromoléculas
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Microscopía vs difracción
Microscopía
Difracción ?
luz
luz
objeto
radiación dispersada
lente
FT
imagen magnificada
(rayos X!!!)
(luz visible)
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Microscopía vs difracción
Microscopía
Difracción
luz
luz
objeto
radiación dispersada
lente
detector
FT
imagen magnificada
(rayos X!!!)
(luz visible)
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Por qué es necesario usar rayos-X?
La longitud de onda de los rayos X usados en cristalografía: 1Å - 3Å; 1,54Å (Cu) Frecuencia = c/λ = (3x10-8m/s)/(1,54x10-10m) = 2x 10-18s-1
no es posible diferenciar dos átomos separados a una distancia de 1Å usando luz visible para poder “observar” un objeto, este tiene que ser de un tamaño de al menos la mitad de la longitud de onda de la radiación usada
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… pero, no podemos (aún?) fabricar un microscopio de rayos X : • no hay lentes • aun si las tuviéramos, deberíamos poder pulirlas con
una precisión mejor a 0.1Å!!
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… pero, no podemos (aún?) fabricar un microscopio de rayos X : • no hay lentes • aun si las tuviéramos, deberíamos poder pulirlas con
una precisión mejor a 0.1Å!!
Difracción luz
detector
(X-ray)
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… pero, no podemos (aún?) fabricar un microscopio de rayos X : • no hay lentes • aun si las tuviéramos, deberíamos poder pulirlas con
una precisión mejor a 0.1Å!!
Tenemos que aprender a interpretar patrones de difracción de Rx (no 'refocalizados')--> reconstrucción de la densidad electrónica que los hizo difractar
Difracción luz
detector
(X-ray)
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… pero, no podemos (aún?) fabricar un microscopio de rayos X : • no hay lentes • aun si las tuviéramos, deberíamos poder pulirlas con
una precisión mejor a 0.1Å!!
Tenemos que aprender a interpretar patrones de difracción de Rx (no 'refocalizados')--> reconstrucción de la densidad electrónica que los hizo difractar
William H Bragg & William L Bragg (nobel 1915)
John Bernal (∏ xtals diffract !! 1935)
Watson, Crick & Wilkins; Perutz & Kendrew (nobel 1962)
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Cristalografía de proteínas y difracción de RXPurificación de la proteína
Cristalización de la proteína
Difracción de rayos-X
Obtención de fases
Mapa de densidad electrónica
Construcción de un modelo
Refinamiento Validación
Deposito en la PDB
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from “Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology” by Bernhard Rupp – Garland Science
Decidir bien…como en cualquier proyecto científico!!!
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Cómo cristalizar macromoléculas?
Por qué los cristales son necesarios?
Cómo se resuelve una estructura? y qué información podemos obtener?
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¿Cómo obtener cristales de proteína?
los cristales son agregados ordenados dado que las interacciones que gobiernan no son específicas generalmente es necesario una alta pureza de la proteína y tiempo! también es necesario la búsqueda exhaustiva de condiciones de cristalización
cristales agregados amorfos
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¿Por qué necesitamos cristales?
Amplificación de la señal...
Estructura cristalina = motivo * red cristalina
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¿Cómo obtener cristales de proteína?
diálisis
difusión de vapor
Diagrámas de fases: solubilidad de la proteína en función de diferentes condiciones
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cómo sería un experimento de difusión de vapor
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cómo sería un experimento de difusión de vapor
sin cristales todavía…
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cómo sería un experimento de difusión de vapor
sin cristales todavía…
Cristales creciendo!!!
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Condiciones que uno modifica empíricamente
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Los parámetros que típicamente son variados:
Concentración de proteína (comenzar lo más alto posible)
Precipitante (PEG’s, SA, solventes, sales concentradas, etc)
Presencia de sales (u otros “aditivos”)
pH y tipo de buffer
Temperatura
Condiciones que uno modifica empíricamente
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Algunas imágenes de lo que se obtiene…
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…algunas más…
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Empaquetamiento cristalino
Interacciones proteína:proteína que usualmente son pocas y muy débiles
alto contenido de solvente (>40%)
hay que considerar diferentes elementos de simetría (rotación, translación)
Cytochrome ba3 oxidase (P43212). Hunsicker-Wang et al. 2005
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Difracción de rayos X sobre cristales únicos de macromoléculas (ánodo rotatorio)
Setup experimental
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Difracción de rayos X sobre cristales únicos de macromoléculas (ánodo rotatorio)
Setup experimental
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Hay otras fuentes de radiación adecuadas para hacer difracción de rayos X?
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Tubos sellados : menos intensidad (el ánodo no rota para enfriarse); tecnología más simple (más económico, menos mantenimiento)
Hay otras fuentes de radiación adecuadas para hacer difracción de rayos X?
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Tubos sellados : menos intensidad (el ánodo no rota para enfriarse); tecnología más simple (más económico, menos mantenimiento)
Hay otras fuentes de radiación adecuadas para hacer difracción de rayos X?
![Page 29: Introducción a la Cristalografía de Macromolé · PDF fileFelipe Trajtenberg ! Unidad de Cristalografía de Proteínas Institut Pasteur de Montevideo Introducción a la Cristalografía](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070606/5a8a7e3c7f8b9adb648c020e/html5/thumbnails/29.jpg)
Tubos sellados : menos intensidad (el ánodo no rota para enfriarse); tecnología más simple (más económico, menos mantenimiento)
Anodo rotatorio
Hay otras fuentes de radiación adecuadas para hacer difracción de rayos X?
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Tubos sellados : menos intensidad (el ánodo no rota para enfriarse); tecnología más simple (más económico, menos mantenimiento)
Anodo rotatorio
Hay otras fuentes de radiación adecuadas para hacer difracción de rayos X?
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Tubos sellados : menos intensidad (el ánodo no rota para enfriarse); tecnología más simple (más económico, menos mantenimiento)
Anodo rotatorio
Sincrotrones : caros…pero muy importantes! --->>>
Hay otras fuentes de radiación adecuadas para hacer difracción de rayos X?
![Page 32: Introducción a la Cristalografía de Macromolé · PDF fileFelipe Trajtenberg ! Unidad de Cristalografía de Proteínas Institut Pasteur de Montevideo Introducción a la Cristalografía](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070606/5a8a7e3c7f8b9adb648c020e/html5/thumbnails/32.jpg)
Qué es un sincrotrón?
Un sincrotrón es una máquina que hace circular partículas cargadas (electrones, protones, positrones, etc) confinadas en un camino casi-circular, por medio de campos eléctricos y magnéticos. !Las partículas cargadas, cuando son aceleradas, emiten radiación electromagnética
Cuando las velocidades de las partículas se aproximan a la velocidad de la luz, se denomina Radiación Sincrotrón (propiedades particulares)
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Ventajas de la radiación sincrotrón en Cristalografía de Proteínas
Cristales pequeños: La alta intensidad y el pequeño tamaño del rayo permiten la colección de datos a partir de cristales de < 10m !Difracción Anómala: La longitud de onda sintonizable permite la explotación del fenómeno de dispersión anómala para resolver el problema de las fases !Colección rápida: minutos vs días en comparación con fuentes convencionales de laboratorio
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Setup experimental para hacer difracción de cristales únicos
Resultado experimental: mapas de densidad electrónica (resolucion atomica)
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Sabemos entonces por qué usamos rayos X … Pero por qué obtenemos densidad electrónica?
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Sabemos entonces por qué usamos rayos X … Pero por qué obtenemos densidad electrónica?
Qué son los rayos X?
![Page 38: Introducción a la Cristalografía de Macromolé · PDF fileFelipe Trajtenberg ! Unidad de Cristalografía de Proteínas Institut Pasteur de Montevideo Introducción a la Cristalografía](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070606/5a8a7e3c7f8b9adb648c020e/html5/thumbnails/38.jpg)
Sabemos entonces por qué usamos rayos X … Pero por qué obtenemos densidad electrónica?
Qué son los rayos X?
Fotones = un campo eléctrico oscilante*
*también un campo magnético oscilante de la misma frecuencia, pero ortogonal y desfasado 90°
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Un electrón en un campo eléctrico oscilante
![Page 40: Introducción a la Cristalografía de Macromolé · PDF fileFelipe Trajtenberg ! Unidad de Cristalografía de Proteínas Institut Pasteur de Montevideo Introducción a la Cristalografía](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070606/5a8a7e3c7f8b9adb648c020e/html5/thumbnails/40.jpg)
Un electrón en un campo eléctrico oscilante
Los electrones e- orbitan a una velocidad aprox 1/100th c (≈2x106m/s),
![Page 41: Introducción a la Cristalografía de Macromolé · PDF fileFelipe Trajtenberg ! Unidad de Cristalografía de Proteínas Institut Pasteur de Montevideo Introducción a la Cristalografía](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070606/5a8a7e3c7f8b9adb648c020e/html5/thumbnails/41.jpg)
Un electrón en un campo eléctrico oscilante
Los electrones e- orbitan a una velocidad aprox 1/100th c (≈2x106m/s),
Por lo que en un ciclo del haz de Rx, e- viajará 2x106 m s-1 / 2x1018 s-1 = 10-12m = 0.01Å (no mucho comparado al tamaño del átomo)
![Page 42: Introducción a la Cristalografía de Macromolé · PDF fileFelipe Trajtenberg ! Unidad de Cristalografía de Proteínas Institut Pasteur de Montevideo Introducción a la Cristalografía](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070606/5a8a7e3c7f8b9adb648c020e/html5/thumbnails/42.jpg)
Un electrón en un campo eléctrico oscilante
Los electrones e- orbitan a una velocidad aprox 1/100th c (≈2x106m/s),
Por lo que en un ciclo del haz de Rx, e- viajará 2x106 m s-1 / 2x1018 s-1 = 10-12m = 0.01Å (no mucho comparado al tamaño del átomo)
En otras palabras, los Rx ven a los e- como si estuvieran quietos.
![Page 43: Introducción a la Cristalografía de Macromolé · PDF fileFelipe Trajtenberg ! Unidad de Cristalografía de Proteínas Institut Pasteur de Montevideo Introducción a la Cristalografía](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070606/5a8a7e3c7f8b9adb648c020e/html5/thumbnails/43.jpg)
e- oscilan en un campo eléctrico...la oscilación de e- tiene la misma frecuencia que los Rx la oscilación de e- es mucho más rápida que el movimiento de orbitado la amplitud de la oscilación de e- es grande porque la masa de e- es pequeña. Los núcleos atómicos no oscilan apreciablemente
Ee- e-
e- e-e-
e-e-e-e-
t
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e-
Å
hν
…cargas en oscilación crean fotones!
…en todas las direcciones
Esto es la dispersióne-
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Difracción: Cada electrón dispersa Las ondas emitidas se suman … y se restan!! El resultado final depende de las fases relativas de las ondas adicionadas en cada dirección
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El cristal actúa como un “amplificador de la señal” : muchas moléculas con la misma orientación en fase
Pero…una desventaja importante es que se genera un patrón de interferencia en la difracción
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El cristal actúa como un “amplificador de la señal” : muchas moléculas con la misma orientación en fase
Pero…una desventaja importante es que se genera un patrón de interferencia en la difracción
![Page 48: Introducción a la Cristalografía de Macromolé · PDF fileFelipe Trajtenberg ! Unidad de Cristalografía de Proteínas Institut Pasteur de Montevideo Introducción a la Cristalografía](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022070606/5a8a7e3c7f8b9adb648c020e/html5/thumbnails/48.jpg)
Cuándo dos o más ondas dispersadas están en fase?
cuando la trayectoria recorrida es numero entero de lambda
Difracción : ondas en fase
… como en la reflexión de luz
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nλ = 2d sin θ
Cuándo dos o más ondas dispersadas están en fase?
cuando la trayectoria recorrida es numero entero de lambda
… como en la reflexión de luz
Difracción : ondas en fase
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Microscopía vs difracción
Microscopía
Difracción
luz
luz
objeto
radiación dispersada
lente
detector
FT
imagen magnificada
(rayos X!!!)
(luz visible)
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El patrón de difracción está relacionado al objeto que difractó las ondas, a través de una operación matemática denominada transformada de Fourier
Teoría de Fourier
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El patrón de difracción está relacionado al objeto que difractó las ondas, a través de una operación matemática denominada transformada de Fourier
Teoría de Fourier
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El patrón de difracción está relacionado al objeto que difractó las ondas, a través de una operación matemática denominada transformada de Fourier
Teoría de Fourier
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Cada punto en el detector es una onda simple (A, frecuencia y fase), denominada reflexion
El patrón de difracción esta relacionado al objeto que diffract las onda por una o p e ra c i ó n m ate m á t i c a denominada Transformación de Fourier
€
ρxyz =1V
→
Fhkl e−2πi hx+ky+lz( )[ ]
xyz∫
Teoría de Fourier
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€
ρxyz =1V
Fhkl e−2πi hx+ky+lz( )+iα hkl( )[ ]
l∑
k∑
h∑
€
ρxyz =1V
→
Fhkl e−2πi hx+ky+lz( )[ ]
xyz∫
La densidad electrónica puede considerarse una función periódica compleja. Por ende, puede describirse como la suma de infinitas funciones sinuosidades simples
Amplitud = Proporcional a la intensidad medida para cada reflexión
fase de cada reflexión
volumen de la celda unidad
Teoría de Fourier
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Dado que Fhkl es un vector, tiene una magnitud Y una fase (se comporta como una onda!)
€
! F hkl = Fhkl iαe
Fhkl 2 es directamente proporcional a la intensidad medida Ihkl
…pero la información sobre α se perdió!
El problema de las fases
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Hipótesis (re)emplazo molecular nueva estructura ≈ estructura conocida
!
Perturbar la estructura (y con ella la difracción)
!
Soluciones al problema de las fases :
Reemplazo isomorfo
Difracción anómala
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Construyendo el primer modelo
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Los mapas de densidad electrónica son el resultado final del experimento de difracción. Su interpretación en términos de un modelo molecular es la primer tarea del cristalográfo
Construyendo el primer modelo
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Los mapas de densidad electrónica son el resultado final del experimento de difracción. Su interpretación en términos de un modelo molecular es la primer tarea del cristalográfo
Construyendo el primer modelo
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Los mapas de densidad electrónica son el resultado final del experimento de difracción. Su interpretación en términos de un modelo molecular es la primer tarea del cristalográfo
Construyendo el primer modelo
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Validación de los modelos
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Chequear la geometría del modelo construido: parámetros estereoquímicos, distancias y ángulos de enlace, ángulos dihedros permitidos, etc, etc, etc.
Validación de los modelos
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Chequear la geometría del modelo construido: parámetros estereoquímicos, distancias y ángulos de enlace, ángulos dihedros permitidos, etc, etc, etc.
Gráfico de Ramachandran de ángulos dihedros Φ y φ
Validación de los modelos
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Resolución de los datos