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Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Como a Filogenia pode nos ajudar!!!!
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Considerações importantes
Regiões amplificadas sãs as regiões adequadas á pergunda em questão?
O PCR esta adequado para a realização de uma reação de sequenciamento?
Qualidade da sequência genômica
- Ambiguidades (polimorfismos)
- “N” nas sequências
Qualidade do alinhamento
- “gaps”no alinhamento
Melhor trabalhar com nucleotideos ou aminoácidos (a região é codificante?)?
Análise filogenética
- Método
- modelo
Que sequencias controle usar nas análises !!!!!
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Sempre teremos uma árvore filogenética
Mas o resultado é consistente?????
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objetivos
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Verificar a transmissão do HIV por transfusão
de sangue utilizando análise filogenética de
sequencias de DNA do HIV do doador e
receptor de sangue de um banco de sangue
brasileiro
Material & Métodos
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O que levou a estes estudo!!!
Em 2009 surgiu a suspeita que uma paciente que havia recebido
componentes de sangue numa cirurgia de retirada de cisto de
ovário, tivesse recebido algum desses componentes
contaminados com HIV
A suspeita surgiu quando a paciente reportou, aproximadamente
uma semana após a cirurgia, febre, linfoadenopatias e
alterações hematológicas
Nesta ocasião iniciou-se então a investigação retrospectiva do
doador e do seu parceiro...
Material & Métodos
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Material & Métodos
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Testes realizados
- EIA = enzima imunoensaio
- WB = wetern Blot
- CHHia =Quimioluminescência (prisma)
- RT PCR = Real time PCR
Nested PCR
- envelope = ED5/ED12 e ED31/ED33
- polimerase = DP10/MMRT6 e DP16/MMRT5
Reação de sequenciamento
Análises filogenéticas
- Distância (Mega4)/ tamura Nei / 1000 réplicas de bootstrap
- ML(PHY ML)/ Kimura / 1000 réplicas de bootstrap
Resultados
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Resultados
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conclusão
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Foi observada alta similaridade entre as sequencias
genomicas do doador e receptor
(Menos de 1% de divergência entre as sequencia
nucleotideas)
Foi observada maior similaridade entre as
sequencias do região pol quando comparado com as
sequencias do envelope.
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objetivos
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Avaliar a transmissão do HIV entre casais
numa: coorte de casais HIV positivos
(concordantes), residentes em Dakar no
Senegal
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Material & Métodos
De maio de 2005 até fevereiro de 2009,
pacientes das consultas do ambulatório de
HIV do Centro Hospitalar Universitário Fann,
em Dakar no Senegal foram convidados a
participar do estudo com o seu Parceiro
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Material & Métodos
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Resultados
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Resultados 34 casais – as sequencias agruparam com bootstrap
acima de 80% e distância abaixo do cut off (0,04)
Estas sequências foram consideradas geneticamente relacionadas
6 casais – as sequencias agruparam mas com bootstrap abaixo de 80% e distância abaixo ou acima do cut off
Estas sequências foram consideradas geneticamente indeterminadas
6 casais – as sequências não agruparam e a distância acima do cut off
Estas sequências foram consideradas geneticamente indeterminadas
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Resultados
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Resultados
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conclusão
A maioria dos casais (concordantes) HIV positivos em
Dakar no Senegal mostrou sequencias
geneticamente relacionadas
Dados epidemiológicos indicam o marido como o
provável caso indice, estes dados enfatizam o risco
de mulheres casadas em contrair HIV como resultado
de relações sexuais ocasionais de seus maridos
Compreender as origens e dinâmicas da infecção HIV-
1 em casais na África será crucial para o
planejamento futuro e sucesso de programas de
prevenção do HIV
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objetivos
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Acompanhar o padrão de evolução de HIV-1 na
Ásia durante o período de 17 anos
A actividade biológica e patogenicidade de um dos
mais prevalentes subtipos do HIV (subtipo B) na Ásia
foi determinada com base nas sequências de HIV-1 do
período de 1990 -2007 disponíveis no banco de dados de Los
Alamos
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Material & Métodos
Os data sets foram divididos em 4 grupos
Grupo I: 1990 – 1994Grupo II: 1995 – 1999Gupo III: 2000 – 2004Grupo IV: 2005 – 2007
Foram realizados dois tipos de análises da proteina do envelope e da alça V3 das sequencias retiradas do banco de Los Alamos
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Material & Métodos
Análises filogenéticas baseadas na proteína do envelope
Predição de sitios de glicosilação na proteína do envelope
Alinhamento do dominio V3
Análise do “Motif” GPGX
Determinação de regiões conservadas da região V3
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Resultados
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Resultados
Os clusters B, C, D e E apresentaram divergência e taxas de mutação altas
Os clusters A e F exibem forte seleção e permanecem menos divergentes durante estes período
Foi observado um aumento de heterogeneidade nas sequencias de envelope na população infectada durante este periodo
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Resultados
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Resultados
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Resultados
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Resultados
60% dos sitios da V3
permanecem conservados
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conclusão
A patogenicidade e infectividade do subtipo B do
HIV-1 está aumentada e mostrou uma rápida
evolução e um mecanismo de modulação
Os dados analisados também fornecem
informações úteis sobre a vigilância da infecção do
HIV-1 na Ásia e destaca o padrão evolutivo de
populações de vírus que possam estar sob pressões
variadas de seleção durante os diferentes períodos
de tempo
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objetivos
Analisar as relações filogenéticas de diferentes regiões do genoma do VHC de amostras de casais portadores crônicos
Comparar as sequências genômicas dos casais
portadores de VHC com sequências de portadores crônicos, não relacionados, atendidos no mesmo ambulatório
Avaliar o grau de similaridade entre as sequências
genômicas do VHC dos casais e dos portadores não relacionados
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Material & Métodos
Reação de sequenciamento
Amostra(Soro)
Extração RNA-VHC(QIAamp)
Síntese de cDNAcom Random Primers
1º e 2º PCR
NS5B NS3 1ª estratégia
NS3 2ª estratégia
Neg
Pos
Pos Neg
Excluídos desta análiseReação de sequenciamento
Amostra(Soro)
Extração RNA-VHC(QIAamp)
Síntese de cDNAcom Random Primers
1º e 2º PCR
NS5B NS3 1ª estratégia
NS3 2ª estratégia
Neg
Pos
Pos Neg
Excluídos desta análiseExcluído das análises de NS3
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Reação de sequenciamento
Gel de sequenciamento
Purificação após reação de sequenciamento
Seqüências da região NS5B e NS3
Validação das seqüênciasMontagem da seqüência consenso
(Phred-Phrap- Consed)
Alinhamento das seqüências de cada regiãocom seqüências do GenBank e seqüências controle
(Clustal X)
Reação de sequenciamento
Gel de sequenciamento
Purificação após reação de sequenciamento
Seqüências da região NS5B e NS3
Validação das seqüênciasMontagem da seqüência consenso
(Phred-Phrap- Consed)
Alinhamento das seqüências de cada regiãocom seqüências do GenBank e seqüências controle
(Clustal X)
Genotipagem e Subtipagem Análise do Sinal Filogenético
Construção das topologias das árvores filogenéticas das diferentes regiões com os diferentes métodos e modelos
Alinhamento das seqüências da região NS5Bcom seqüências do GenBank e seqüências controle
Alinhamento das seqüências da região NS3com seqüências do GenBank e seqüências controle
Alinhamento das seqüências da região NS3/NS5Bcom seqüências do GenBank e seqüências controle
Genotipagem e Subtipagem Análise do Sinal Filogenético
Construção das topologias das árvores filogenéticas das diferentes regiões com os diferentes métodos e modelos
Alinhamento das seqüências da região NS5Bcom seqüências do GenBank e seqüências controle
Alinhamento das seqüências da região NS3com seqüências do GenBank e seqüências controle
Alinhamento das seqüências da região NS3/NS5Bcom seqüências do GenBank e seqüências controle
Material & Métodos
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Casal Sexo Genótipo Nascimento Uso Dogas Inj. Tranfusão /ano Promiscuidade** Risco Prof. Tatoo Acupuntura
1 F 3 28/8/1963 Sim Não Não Não Não Não
M 3 4/1/1960 Não Não Não Não Não Sim
2 F 3 30/7/1971 Não Não Não Não Não Não
M 3 22/11/1952 Sim Não Não Não Sim Não
3 F 1 6/7/1942 Não Sim/1975 Não Não Não Sim
M 1 S/Inf* Não Não Não Não Não Sim
4 F 1 15/8/1958 Não Não Não Não Não Não
M 1 4/6/1955 Sim Não Sim Não Não Não
5 F 1 16/6/1954 Não Não Não Não Não Não
M 1 29/5/1945 Não Não Não Sim Não Não
6 F 1 19/6/1957 Não Sim/1984 Não Não Não Sim
M 1 13/2/1949 Não Não Não Não Não Sim
7 F 3 5/8/1962 Não Não Não Sim Sim Não
M 3 29/12/1963 Não Não Não Sim Não Não
8 F 1 S/Inf* Não Não Não Não Sim Não
M 1 S/Inf* Sim Não Não Não Sim Não
9 F 1 S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf*
M 1 S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf*
S/Inf* = Sem informação
** = mais de 2 parceiros no período de 6 meses
Tabela 1 - Características dos pacientes (casais) selecionados (dados obtidos de prontuário)
Material & Métodos
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Controle Nº Sexo Genótipo Nascimento Uso Dogas Inj. Tranfusão /ano Promiscuidade Risco Prof. Tatoo Acupuntura
6947 M 1 1981 Não Sim/1981 Não Não Sim Não
6681 F 1 1962 Não Não Não Não Não Não
8090 F 1 1944 Não Não Não Não Não Não
6625 M 1 1957 Não Não Não Não Não Não
7152 M 1 1951 Sim Não Sim Sim Sim Não
10248 F 1 1963 Não Sim/1986 Não Não Não Sim
8217 M 1 1966 Não Sim/várias Não Sim Não Não
7954 M 1 1961 Não Não Não Não Não Não
7017 M 1 1954 Não Sim/1978 Não Não Não Não
9089 M 1 1967 Sim Não Sim Não Sim Sim
8399 F 1 1963 Não Sim/1988 Não Não Não Não
10402 F 1 1941 Não Sim/1975 Sim Não Não Não
8432 F 1 1968 Não Não Não Não Não Não
10355 M 1 1956 Não Não Sim Não Sim Não
7322 F 1 1952 Não Não Não Não Não Não
7879 F 1 1936 Não Sim/1971 Não Não Não Não
7918 F 1 1940 Não Não Não Sim Não Não
7910 M 1 1972 Não Não Não Sim Não Não
6887 F 1 1931 Não Sim/1983 Não Não Não Não7733 M 1 1952 Não Sim/1974 Não Não Não Não
10187 M 1 1955 Não Sim/1976 Sim Não Não Não
6611 M 1 1934 Não Não Não Não Não Não
10323 M 1 S/Inf* Sim Não Não Não Não Não
6874 M 1 1956 Não Sim/1975 Não Não Não Não
5772 M 1 1949 Não Não Sim Não Não Não
6602 F 1 1977 Não Não Não Não Não Não
10371 M 1 1943 Não Sim/1966 Não Sim Não Não
7692 M 1 1975 S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf*
Material & Métodos
S/Inf* = Sem informação
** = mais de 2 parceiros no período de 6 meses
Tabela 2 – Características pacientes controle (dados obtidos de prontuário)
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Material & Métodos
Tabela 2 - Características dos pacientes controle (dados obtidos de prontuário) (continuação)
10180 M 3 1943 Sim Sim/1980 Não Não Não Não
7647 M 3 1939 Não Sim/1978 Sim Não Não Não
7826 F 3 1938 Não Sim/1992 Não Não Não Não
10654 F 3 1952 Não Não Não Não Não Não
10831 F 3 1930 Não Não Não Não Não Não
7185 M 3 1958 Não Sim/1978 Não Não Não Não
8319 M 3 1954 Não Sim/1963 Não Não Não Não
8487 M 3 1961 Não Sim/1981 Não Não Não Não
7244 M 3 1964 Não Sim/1990 Não Não Sim Não
7748 M 3 1968 Não Não Não Não Não Não
10709 F 3 1951 Não Sim/1975 Não Não Não Não
10749 F 3 1939 S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf*
10698 M 3 S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf* S/Inf*
10173 F 3 1960 Não Não Não Não Sim Não
Tatoo AcupunturaControle Nº Sexo Genótipo Nascimento Uso Dogas Inj. Tranfusão /ano Promiscuidade Risco Prof.
S/Inf* = Sem informação
** = mais de 2 parceiros no período de 6 meses
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Resultados
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Resultados
NS5B 199nt(77 seq)
NS5B 344nt(77 seq)
NS3 619nt(72 seq)
NS3/NS5B960nt
(72 seq)
A B
C D
Análise do sinál filogenético
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Resultados
Similaridade entre as sequências de nucleotídeos dos casais
Região NS5B entre 78,2% e 99,1% (média de 95,45%)
Região NS3 entre 94,7% e 99,2% (média de 97,24%)
Similaridade entre as sequências de nucleotídeos dos controles locais e sequências do Genbank
Região NS5B entre 53,9% e 98% (média de 72,9%)
Região NS3 entre 61% e 98,2% (média de 74,8%)
Variabilidade nucleotidica
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A
BA
B
C
NS3/NS5BMV TBR
TrN+I+G(Bootstrap=1000 réplicas) C
ResultadosAnálise filigenética das regiões NS3/NS5B
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A
BMV TBRNS3/NS5B
TrN+I+G(Bootstrap = réplicas)
A
B
C
C
ResultadosAnálise filigenética das regiões NS3/NS5B
(Com controles)
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
A
B
MVNS5B
TBRTrNef+I+G
(Bootstrap = 1000 réplicas)
A
B
C
C
ResultadosAnálise filigenética da regiãoNS5B
(Com controles)
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Similaridade Bootstrap*** Distância MV Similaridade Bootstrap*** Distância MV Bootstrap*** Distância MV
CF01 97,4% ** MO MO 96,4% ** ? ? ** MO MO
CF02 97,4% ** ? MO 99,2% ** ? ? ** MO MO
CF03 97,1% ** ? ? 94,7% ** ? ? 99 MO MO
CF04 97,7% 98 MO MO NR NR NR NR NR NR NR
CF05 96,8% ** ? ? 96,6% ** ? ? ** ? MO
CF06 97,7% 72 ? MO 97,0% 100 MO MO 100 MO MO
CF07 97,7% 73 MO MO 97,4% ** MO MO 81 MO MO
CF08 99,1% 92 MO MO 99,0% 94 MO MO 100 MO MO
CF09 78,2% ** ? ? NR NR NR NR NR NR NR
MO = Mesma origem (ramo monofilético) (vermelho com Bootstrap acima de 70)
NR = Não Realizado
*** = Valores acima de 70
NS3/NS5b
** = Sem bootstrap significativo (<70)
? = Não apresentam ramo monofilético
MV = Máxima Verossimilhança
Análises sem controles
Familiares NS5b NS3
Resumo das análises das árvores filogenéticas (sem controle)
Resultados
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Resumo das análises das árvores filogenéticas (com controle)
Resultados
Similaridade Bootstrap*** Distância MV Similaridade Bootstrap*** Distância MV Bootstrap*** Distância MV
CF01 97,4% ** MO MO 96,4% ** ? MO ** ? MO
CF02 97,4% ** ? MO 99,2% 79 ? MO ** ? MO
CF03 97,1% ** ? ? 94,7% 88 MO MO 94 MO MO
CF04 97,7% 89 MO MO NR NR NR NR NR NR NR
CF05 96,8% ** ? ? 96,6% ** ? ? ** ? MO
CF06 97,7% ** ? MO 97,0% 99 MO MO 99 MO MO
CF07 97,7% ** MO MO 97,4% ** MO MO 73 MO MO
CF08 99,1% 92 MO MO 99,0% 91 MO MO 98 MO MO
CF09 78,2% ** ? ? NR NR NR NR NR NR NR
MO = Mesma origem (ramo monofilético) (vermelho com Bootstrap acima de 70)
*** = Valores acima de 70** = Sem bootstrap significativo (<70)
Análises com controles
Familiares NS5b NS3 NS3/NS5b
MV = Máxima Verossimilhança
? = Não apresentam ramo monofilético NR = Não Realizado
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
conclusão
A escolha da região genômica e do método de análise
filogenética a ser utilizado são importantes para a
precisão dos resultados
Os dados de prontuário juntamente com as análises
moleculares indicam que a origem dos vírus dos
casais 8, 7, 6, 3 e 4 seja a mesma, dando suporte à
hipótese de transmissão intrafamiliar
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conclusão
A inclusão dos controles nas análises mostrou-se
relevante para a confirmação dos resultados
Dados como similaridade de sequências não são
suficientes para inferir mesma fonte de transmissão
Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Obrigada