i
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PROTEOLITIK PADA
PROSES PENGOMPOSAN LIMBAH DOMESTIK
(Skripsi)
Oleh
LUTHFI HIJRIANTO
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG
2019
ii
ABSTRAK
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PROTEOLITIK PADA
PROSES PENGOMPOSAN LIMBAH DOMESTIK
Oleh
LUTHFI HIJRIANTO
Kompos merupakan salah satu jenis pupuk yang selama proses pembuatannya
dibantu oleh berbagai jenis mikroorganisme dengan mengeluarkan enzim
hidrolitik yang digunakan untuk mengurai material organik sebagai substrat.
Tujuan penelitian ini adalah melakukan isolasi dan identifikasi bakteri proteolitik
pada proses pengomposan limbah domestik. Metode yang digunakan meliputi
isolasi bakteri dari sampel kompos pada beberapa fase pengomposan, uji
proteolitik secara kualitatif, analisis karakter biokimia dan produksi enzim
protease dari isolat terpilih. Hasil menunjukkan bahwa terdapat 13 isolat dengan
indeks proteolitik yang beragam. Hasil pengujian terhadap isolat terpilih dengan
indeks proteolitik dan karakter biokimia yang berbeda, diperoleh 5 isolat untuk
ditentukan kurva pertumbuhan dan aktivitas proteolitik, yaitu isolat PKMA4,
PKMG2, PKTB3, PKTD4 dan PKPG2. Produksi enzim dari 5 isolat terpilih
dilakukan sesuai waktu optimum pertumbuhan masing-masing isolat. Hasil
penentuan aktivitas spesifik isolat terpilih, menunjukkan bahwa aktivitas isolat
PKMA4: 0,1716 U/mg, isolat PKMG2: 0,197 U/mg, isolat PKTB3: 0,333 U/mg,
isolat PKTD4: 0,167 U/mg dan isolat PKPG2: 0,207 U/mg.
Kata kunci: Bakteri proteolitik, Kompos, Limbah domestik, Protease.
iii
ABSTRACT
ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF PROTEOLYTIC
BACTERIA ON DOMESTIC WASTE COMPOSTING PROCESSES
By
LUTHFI HIJRIANTO
Compost is a kind of fertilizer which is produced by synergism of various
degradation microorganisms, that produces hydrolytic enzymes to degrade the
organic material as a substrate. The purpose of this study are to isolate and
characterize some proteolytic bacteria that live in the domestic waste in
composting process. We observed number of colonies in each steps of
composting, and also type of cultived colonies, further more examined some of
biochemical properties and screened for proteolytic using clear zone method. We
obtained 13 isolates which showed proteolytic activity and screened them into 5
isolates namely PKMA4, PKMG2, PKTB3, PKTD4 and PKPG2 isolates. The
enzyme production from 5 selected isolates was carried out according to the
optimum growth time of each isolate. Based on the result, their protease specific
activites are PKMA4: 0.1716 U/mg, PKMG2: 0.197 U/mg, PKTB3: 0.333 U/mg,
PKTD4: 0.167 U/mg and PKPG2: 0.207 U/mg.
Keywords: Compost, Domestic waste, Protease, Proteolytic bacteria.
i
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PROTEOLITIK PADA
PROSES PENGOMPOSAN LIMBAH DOMESTIK
Oleh
LUTHFI HIJRIANTO
(Skripsi)
Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar
SARJANA SAINS
Pada
Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG
2019
iv
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pringsewu pada tanggal 13 Juni 1996,
sebagai anak ke dua dari empat bersaudara, putra dari
pasangan Bapak Muladi dan Ibu Muryanti, S.Pd. Penulis
menyelesaikan pendidikan pertama di TK Dharma Wanita
Kagungan Ratu pada tahun 2002, kemudian melanjutkan
pendidikan ke SD Negeri 1 Kagungan Ratu dan lulus pada tahun 2008. Penulis
kemudian melanjutkan pendidikan di MTs Al-Ikhlas Kagungan Ratu dan lulus
pada tahun 2011. Penulis kemudian melanjutkan pendidikan di SMAN 1
Tumijajar dan lulus pada tahun 2014.
Penulis diterima sebagai mahasiswa Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung
pada tahun 2014 melalui jalur Seleksi Bersama Masuk Perguruan Tinggi Negeri
(SBMPTN). Penulis telah menyelesaikan praktik kerja lapangan pada tahun 2017
dengan judul Uji Cemaran Mikrobia pada Obat Tradisional di Balai Besar
Pengawas Obat dan Makanan Bandar Lampung, yang dilaksanakan di Balai Besar
Pengawas Obat dan Makanan Bandar Lampung. Penulis melaksanakan kegiatan
KKN PPM Pembuatan Kompos dari Limbah Pasar Sidomulyo, di desa Sidomulyo
kecamatan Sidomulyo kabupaten Lampung Selatan pada bulan Juli – Agustus
2016. Selama menjadi mahasiswa, penulis menjadi asisten praktikum Biokimia
v
jurusan Biologi tahun 2018. Penulis tedaftar sebagai Kader Muda Himaki
(KAMI) periode kepengurusan 2014/2015. Penulis selanjutnya aktif sebagai
anggota bidang Sains dan Penalaran Ilmu Kimia (SPIK) Himpunan Mahasiswa
Kimia (HIMAKI) periode kepengurusan 2015/2016 dan periode kepengurusan
2016/2017.
vi
MOTTO
Jika semua yang kita lakukan adalah hanya untuk mengejar ridho-
Nya, tugas kita telah selesai. Karena hasil dari yang kita usahakan
akan dijamin oleh-Nya hingga di kehidupan selanjutnya.
Cobalah berhenti mengeluhkan dan mengkhawatirkan sesuatu yang
belum bisa kita raih, karena apa yang sudah kita lakukan beserta
hasilnya terlalu berharga bila hanya dianggap hal yang berlalu,
bersyukur atas kemampuan kita adalah jalan untuk bersyukur akan
apa yang kita raih selanjutnya.
vii
Dengan mengucap Alhamdulillahirabbil’alamin atas Rahmat dan Kemurahan-Nya
Kupersembahkan Karya Sederhanaku ini
Teruntuk
Bapak dan Ibuku tercinta Yang selalu memperjuangkanku tanpa mengenal lelah, dan
dengan sabar selalu mendo’akan serta mendukungku
Seluruh keluarga besarku yang selalu mendo’akan keberhasilanku
Teman-temanku yang selalu berbagi semangat
dan kebahagian bersama-sama
Guru-guru sekolahku dan seluruh Dosen Jurusan Kimia yang telah membimbing dan membagikan ilmu selama
perkuliahan yang tak ternilai
dan Almamater Tercinta Universitas Lampung
viii
SANWACANA
Alhamdulillahirabbil’alamin, segala puji dan syukur kepada Allah SWT yang
selalu memberikan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan
penyusunan skripsi yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi Bakteri Proteolitik
pada Proses Pengomposan Limbah Domestik” sebagai salah satu syarat untuk
memperoleh gelar sarjana Sains pada Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam. Sholawat serta salam selalu tersanjungakan kepada
Nabiullah Muhammad SAW, yang sangat dinantikan syafaatnya di yaumil akhir
kelak, amin Allahumma amin.
Dengan kerendahan hati, penulis menyadari tidak akan pernah mampu
menyelesaikan tugas akhir ini tanpa ada orang lain di sekitarnya yang turut
membantu sedemikian bentuknya. Oleh karena itu, dengan teriring do’a yang
tulus penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Kedua orang tuaku yang tercinta “Bapak Muladi dan Ibu Muryanti, S.Pd.”,
yang tidak pernah berhenti memperjuangkanku, mendo’akanku,
membimbingku, menasehatiku, mendukungku, dan semua usaha tanpa
lelahmu untukku. Semoga Allah SWT selalu menunggu kehadiran kedua
orang tuaku di janah-Nya tanpa ada penghalang lain kecuali kematian. Amin
ya robbal’alamin.
ix
2. Saudara dan saudariku Mas Irfan, Rahayu, dan Alinda, yang selalu menjadi
penyemangat, mendo’akan, dan memotivasi untuk meraih keberhasilanku.
Semoga Allah SWT selalu memberikan kesahatan dan kebahagian kepada
kalian, serta selalu diberikan rahmat-Nya.
3. Ibu Dr. Nurhasanah, M.Si. selaku pembimbing 1 penelitian saya yang selalu
sabar dan teliti dalam membimbing, mengajar dengan sabar di perkuliahan,
dan memfasilitasi keperluan peneleitian baik dalam bentuk peralatan, bahan
dan pengetahuan sehingga dapat melancarkan terselesaikannya tugas akhir
yang saya kerjakan. Semoga Allah SWT membalas segala kebaikkan beliau,
dan selalu memberikan kesehatan dan juga rahmat-Nya.
4. Bapak Dr. Eng. Heri Satria, M.Si. selaku pembimbing 2 penelitian saya yang
dengan sabar dan teliti dalam membimbing, mengajar dengan sabar dan
semangat di perkuliahan, serta selalu memberikan memberikan koreksi dan
solusi yang membangun sehingga dapat melancarkan tugas akhir yang saya
kerjakan. Semoga Allah SWT membalas segala kebaikkan beliau, dan selalu
memberikan kesehatan dan juga rahmat-Nya.
5. Ibu Dr. Rinawati, M.Si. selaku pembahas penelitian saya yang selalu sabar dan
teliti dalam mengoreksi dan membimbing, mengajar dengan sabar di
perkuliahan, serta memberikan saran dan solusi sehingga dapat melancarkan
tugas akhir yang saya kerjakan. Semoga Allah SWT membalas segala
kebaikkan beliau, dan selalu memberikan kesehatan dan juga rahmat-Nya.
6. Bapak Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M.T. selaku pembimbing akademik
yang dengan sabar membimbing dan memberikan solusi dari awal menjadi
mahasiswa baru hingga terselesaikannya tugas akhir yang saya kerjakan, serta
x
mengajar di perkuliahan dengan sabar dan memberikan motivasi yang sangat
membangun. Semoga Allah SWT membalas segala kebaikkan beliau, dan
selalu memberikan kesehatan dan juga rahmat-Nya.
7. Bapak dan Ibu Dosen Jurusan Kimia FMIPA Unila, yang telah membagikan
ilmu pengetahuan, waktu, pengalaman dan motivasi selama masa perkuliahan.
Semoga Allah SWT membalas segala kebaikkan beliau, dan selalu
memberikan kesehatan dan juga rahmat-Nya.
8. Seluruh civitas akademik Jurusan Kimia FMIPA Unila, yang senantiasa
membantu dan membagikan pengalaman serta solusi selama masa
perkuliahan. Semoga Allah SWT membalas segala kebaikkan beliau, dan
selalu memberikan kesehatan dan juga rahmat-Nya.
9. Teruntuk partner all the time Dessy Tiara Elvia Nita Sari, S.Si., yang selalu
berbagi kebahagiaan, tawa, solusi, waktu, bantuan dalam bentuk apapun,
cerita dan semua penyelesaian masalah yang sudah dilewati. Semoga Allah
SWT selalu memberikan kesehatan, kebahagiaan dan kebaikan yang telah
dilakukan dapat kembali kepadamu, cita-cita yang sangat diimpikan, serta
tetap terjalin silaturahim hingga di kemudian hari.
10. Teruntuk kance-kanceku, M. Ilham Haqqiqi, S.Si., Teguh Wijaya Hakim,
S.Si., Dellania Frida Yulita, S.Si., Dessy Tiara Elvia Nita Sari, S.Si., Riri
Auliya, S.Si., Windi Antika, S.Si. dan Yunita Damayanti, S.Si., terimakasih
atas segala canda tawa, kebahagiaan, cerita dan pengalaman yang telah
dibagikan. Semoga kalian selalu diberikan kesehatan dan dapat menggapai
cita-cita kalian.
xi
11. Seluruh teman-teman nge-lab-ing yang telah berbagi pengalaman,
pengetahuan, waktu, solusi, canda tawa, cerita dan juga jajanan yang selalu
ada menjadi teman ngelab. Semoga Semoga kalian selalu diberikan kesehatan
dan dapat menggapai cita-cita kalian.
12. Seluruh teman-teman kimia’14, kalian keluarga yang telah memulai semua
nya di perkuliahan ini, dan semoga ini dapat terus berlanjut, dan kalian dapat
meraih semua yang telah kalian usahakan.
13. Seluruh kakak-kakak di Jurusan Kimia, terima kasih telah berbagi
pengalaman, ilmu, cerita, canda tawa, saran, nasehat, motivasi dan semuanya
yang telah dibagikan dengan ikhlas. Semoga kakak-kakak semua selalu diberi
kesehatan dan dapat meraih semua yang dicita-citakan.
Akhir kata, penulis memohon maaf atas segala kekurangan dan kesalahan apabila
karya penulis ini masih jauh dari sempurna, semoga karya penulis dapat
bermanfaat sebagaimana mestinya, Amiin.
Bandar Lampung, 01 Februari 2019
Penulis,
Luthfi Hijrianto
i
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI ........................................................................................................... i
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ iii
DAFTAR TABEL ................................................................................................. v
I. PENDAHULUAN .......................................................................................... 1
A. Latar Belakang ............................................................................................ 1
B. Tujuan Penelitian ......................................................................................... 4
C. Manfaat Penelitian ....................................................................................... 4
II. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................. 5
A. Limbah ........................................................................................................ 5
B. Pengolahan Limbah Domestik .................................................................... 8
C. Bakteri Proteolitik ..................................................................................... 10
D. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme .......................................................... 11
E. Uji Biokimia .............................................................................................. 12
F. Enzim Protease .......................................................................................... 16
G. Spektrofotometer UV-Vis ......................................................................... 19
III. METODE PENELITIAN ............................................................................ 23
A. Waktu dan Tempat .................................................................................... 23
B. Alat dan Bahan .......................................................................................... 23
1. Alat ..................................................................................................... 23
2. Bahan .................................................................................................. 23
C. Prosedur Kerja ........................................................................................... 24
1. Tahap Persiapan ................................................................................. 24
2. Pembuatan Kompos............................................................................ 25
3. Pengambilan Sampel .......................................................................... 26
4. Homogenisasi Sampel ........................................................................ 26
5. Isolasi Bakteri dari Sampel Kompos .................................................. 26
6. Skrining Bakteri Proteolitik ............................................................... 27
7. Seleksi Isolat Bakteri Proteolitik ........................................................ 27
ii
8. Karakterisasi Biokimia Isolat Bakteri Proteolitik .............................. 27
9. Pembuatan Starter Isolat Bakteri Proteolitik ...................................... 29
10.Uji Tingkat Kekeruhan/Optical Density (OD) ................................... 29
11.Uji Aktivitas Proteolitik Isolat Bakteri secara Kuantitatif ................. 29
12.Produksi Enzim Protease ................................................................... 30
13.Uji Aktivitas Unit Enzim Protease ..................................................... 31
14.Uji Kadar Protein dan Aktivitas Spesifik ........................................... 32
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................... 33
A. Kompos dari Limbah Domestik ................................................................ 33
B. Bakteri dari Sampel Kompos .................................................................... 34
C. Isolat Bakteri dengan Potensi Proteolitik .................................................. 35
D. Karakter Biokimia Isolat Bakteri Proteolitik Terpilih ............................... 38
E. Tingkat Kekeruhan/Optical Density (OD) Isolat Terpilih ........................ 40
F. Aktivitas Kuantitatif Isolat Proteolitik Terpilih ........................................ 42
G. Enzim Protease Isolat Bakteri dari Kompos ............................................. 44
V. SIMPULAN DAN SARAN .......................................................................... 46
A. Simpulan .................................................................................................... 46
B. Saran .......................................................................................................... 47
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 48
LAMPIRAN ......................................................................................................... 53
iii
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Limbah organik ................................................................................................... 6
2. Limbah anorganik ............................................................................................... 6
3. Proses pengomposan ........................................................................................... 9
4. Skema kerja spektrofotometer UV-Vis ............................................................. 20
5. Kompos limbah domestik ................................................................................. 33
6. Hasil isolasi bakteri ........................................................................................... 34
7. Isolat dengan potensi proteolitik ....................................................................... 36
8. Kurva pertumbuhan bakteri............................................................................... 41
9. Kurva aktivitas proteolitik................................................................................. 43
10. Hasil isolasi metode streak plate fase mesofilik awal .................................... 54
11. Hasil isolasi metode streak plate fase termofilik ............................................ 54
12. Hasil isolasi metode streak plate fase pematangan ......................................... 55
13. Isolat bakteri dengan potensi proteolitik fase mesofilik awal ......................... 56
14. Isolat bakteri dengan potensi proteolitik fase termofilik ................................ 56
15. Isolat bakteri dengan potensi proteolitik fase pematangan ............................. 57
16. Hasil uji Gram fase mesofilik awal ................................................................. 58
17. Hasil uji Gram fase termofilik......................................................................... 58
18. Hasil uji Gram fase pematangan ..................................................................... 59
iv
19. Hasil uji endospora fase mesofilik awal.......................................................... 59
20. Hasil uji endospora fase termofilik ................................................................. 60
21. Hasil uji endospora fase pematangan .............................................................. 60
22. Kurva standar BSA ......................................................................................... 71
v
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Spektrum tampak dan warna komplementernya ............................................... 22
2. Bakteri dari sampel kompos .............................................................................. 35
3. Indeks proteolitik isolat bakteri dari kompos .................................................... 36
4. Karakter biokimia isolat bakteri proteolitik terpilih.......................................... 39
5. Nilai optical density (OD) ................................................................................. 40
6. Nilai aktivitas proteolitik secara kuantitatif ...................................................... 42
7. Nilai aktivitas unit enzim protease isolat bakteri dari kompos ......................... 44
8. Kadar protein dan aktivitas spesifik .................................................................. 45
9. Nilai absorbansi optical density ........................................................................ 63
10. Nilai absorbansi aktivitas proteolitik secara kuantitatif .................................. 66
11. Absorbansi aktivitas unit enzim protease ........................................................ 70
12. Absorbansi aktivitas spesifik enzim protease ................................................. 72
1
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Limbah atau sampah di beberapa negara berkembang seperti Indonesia, menjadi
masalah yang cukup serius dihadapi oleh pemerintah dan juga masyarakat. Selain
menimbulkan kondisi yang tidak nyaman, limbah juga mempengaruhi faktor
kebersihan dan kesehatan lingkungan. Terlebih lagi di daerah perkotaan yang
mayoritas jumlah penduduknya lebih besar daripada daerah pedesaan,
permasalahan mengenai limbah juga menjadi lebih besar. Pasca tahun baru 2018
total jumlah sampah di kota Bandar Lampung meningkat hingga 700 – 800 ton
yang meliputi sampah organik, kertas, plastik, kayu, logam, kaca, karet, kain, dan
lain-lain (Tribun Lampung, 2018).
Limbah dibedakan menjadi beberapa jenis berdasarkan sumbernya, yaitu limbah
industri, limbah pertambangan, limbah pertanian, limbah medis dan limbah
domestik. Penelitian ini difokuskan pada masalah mengenai limbah domestik,
yang merupakan limbah yang berasal dari aktivitas manusia sehari-hari seperti
dari aktivitas makan, minum, memasak, belanja dan lain-lain. Pemilihan limbah
domestik sebagai bahan pembuatan kompos dalam penelitian ini, selain karena
efek buruk yang ditimbulkan terhadap lingkungan, juga sumber limbahnya yang
terus ada setiap harinya dan kurangnya pemanfaatan limbah domestik secara
2
optimal dan produktif. Sehingga potensi ketersediaan bahan yang digunakan
untuk pembuatan kompos cukup menjanjikan (Sudarwanto, 2010).
Sebagian besar masyarakat menggunakan limbah domestik seperti sisa-sisa
makanan untuk pakan ternak secara langsung. Tetapi hal tersebut belum optimal
untuk menanggulangi masalah limbah domestik karena hanya sebatas limbah sisa-
sisa makanan, sehingga perlu dilakukan penanganan yang lebih optimal. Menurut
Sumampouw (2017), terdapat beberapa macam penanganan yang dapat dilakukan
untuk menanggulangi masalah limbah domestik, yaitu pembuangan secara teratur
dan pada tempat yang disediakan, melakukan daur ulang, pembakaran,
pemisahan, pembusukan dan juga pengomposan.
Pengomposan merupakan proses penguraian atau degradasi molekul-molekul
organik oleh berbagai jenis bakteri seperti bakteri lipolitik, selulolitik, amilolitik,
proteolitik (Karina dkk., 2014), serta berbagai macam fungi. Selama
pengomposan berbagai mikroorganisme yang terdapat pada kompos akan
mengeluarkan enzim hidrolitik yang digunakan untuk mendekomposisi limbah
domestik sebagai substratnya.
Enzim yang dapat dihasilkan dari mikroorganisme pada proses pengomposan
yaitu meliputi alkaline phosphatase, acid phosphatase, phosphohydrolase, lipase,
esterase-lipase esterase, leucine aminopeptidase, cystine aminopeptidase,
chymotrypsin, dan trypsin (Jain et al, 1998), serta b-galactosidase, b-glucosidase,
N-acetyl-b-glucosaminidase, a-glucosidase, a-galactosidase, b-glucuronidase,
dan a-fucosidase (Beffa et al., 1995).
3
Menurut Beffa et al (1995), mikroorganisme yang terdapat pada proses
pengomposan yaitu meliputi bakteri, actinomycetes, yeasts, dan fungi. Bakteri
yang terdapat pada proses pengomposan yaitu meliputi Pseudomonas putida,
Pseudomonas sp., Nitrosospira briensis, Salmonella sp., Streptomyces rectus,
Thermonospora curvata, Bacillus brevis, Bacillus subtilis, Actinobifida
chromogena, Pseudonocardia thermophila, dan lain-lain. Adapun fungi yang
terdapat pada proses pengomposan yaitu meliputi Mortierella turficola, Mucor
miehei, Rhizomucor pusillus, Aporothielavia leptoderma, Armillaria mellea,
Coprinus sp., Lanzites sp., Aspergillus fumigatus, Thermomyces lanuginosus,
Paecilomyces sp., dan lain-lain (Insam and Bertoldi, 2007).
Penelitian ini difokuskan pada kelompok bakteri yang memiliki aktivitas
proteolitik. Proteolitik adalah aktivitas yang dihasilkan oleh mikroorganisme
untuk mengekskresikan enzim protease keluar sel. Protease merupakan jenis
enzim yang mengkatalisis pemecahan protein menjadi senyawa yang lebih
sederhana. Saat ini penggunaan enzim protease sudah mencapai hingga skala
industri. Pada industri pangan, enzim protease digunakan dalam pengolahan roti,
biskuit, susu, pematangan keju dan pengempukan daging. Selain itu, enzim
protease juga digunakan dalam beberapa industri seperti industri deterjen, produk-
produk kulit, farmasi dan juga pengolahan limbah industri tersebut (Singh et al.,
2016). Enzim protease juga dapat digunakan dalam proses bioremediasi.
Beberapa enzim lain seperti lipase, amilase, urease, dan selulase juga diketahui
dapat mendegradasi bahan organik (BOD dan COD), sehingga dapat
dimanfaatkan dalam proses bioremediasi (Priadie, 2012). Enzim protease dapat
diisolasi dari berbagai organisme seperti bakteri, hewan, tumbuhan dan jamur.
4
Isolasi dari mikroorganisme seperti bakteri merupakan yang paling sering
dilakukan karena lebih efektif dan efisien, yaitu dengan pertumbuhannya yang
cepat, skala produksi sel yang besar dan waktu produksi yang lebih cepat (Karina
dkk., 2014). Berdasarkan uraian di atas, penelitian ini dilakukan untuk
mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri proteolitik pada proses pengomposan
limbah domestik, serta mengetahui aktivitas enzim protease yang dihasilkan.
B. Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari dilakukannya penelitian ini antara lain sebagai berikut:
1. Mengisolasi bakteri proteolitik dari proses pengomposan limbah domestik.
2. Mengidentifikasi bakteri proteolitik yang diperoleh dari proses pengomposan
limbah domestik.
3. Mengetahui aktivitas enzim protease dari bakteri proteolitik yang diisolasi dari
proses pengomposan limbah domestik.
C. Manfaat Penelitian
Adapun manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat diperoleh bakteri proteolitik
dari kompos yang dapat menghasilkan enzim protease dengan aktivitas yang
relatif lebih baik, sehingga dapat digunakan pada berbagai macam aplikasi seperti
bioremediasi limbah. Penelitian ini juga diharapkan dapat menjadi rujukan
informasi mengenai bakteri proteolitik khususnya yang diisolasi dari proses
pengomposan limbah domestik.
5
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Limbah
Limbah merupakan suatu zat sisa atau buangan dari pengolahan atau proses
produksi yang tidak terpakai, baik dalam skala rumah tangga maupun skala
industri, yang dapat berupa padatan, cairan maupun gas (Doraja dkk., 2012).
Pada umumnya limbah hanya akan menjadi sampah yang dibuang begitu saja
sehingga diperlukan perlakuan khusus untuk menghadapi masalah limbah, supaya
tidak terjadi penumpukan setiap harinya. Pada skala industri yang besar, limbah
akan lebih sulit untuk ditangani terlebih lagi bila limbah tersebut mengandung
senyawa kimia yang berbahaya bagi lingkungan.
Berdasarkan materi penyusunnya, limbah dibedakan menjadi 2 yaitu limbah
organik dan limbah anorganik. Limbah organik merupakan limbah yang
mengandung unsur karbon, seperti buangan makhluk hidup (meliputi kotoran
manusia dan hewan), sisa-sisa makanan (meliputi sayur-sayuran, daging dan
sebagainya), kertas, kardus, karton, minyak goreng bekas dan lain-lain (Hasibuan,
2016) seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. Pada umumnya, limbah organik
dapat membusuk atau terdegradasi oleh mikroorganisme. Hal tersebut mendorong
terbentuknya berbagai macam pengolahan limbah dengan melibatkan kemampuan
degradasi suatu mikroorganisme (Doraja dkk., 2012).
6
Gambar 1. Limbah organik (Badan Litbang Pertanian, 2011)
Adapun limbah anorganik, berdasarkan pengertian kimiawi adalah limbah yang
tidak mengandung unsur karbon. Seperti logam, kaca, plastik, sisa pupuk
anorganik dan lain-lain seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2. Limbah
anorganik juga didefinisikan sebagai limbah yang tidak dapat terdegradasi secara
alami oleh mikroorganisme. Limbah organik seperti karet mengandung unsur
karbon dengan bentuk rantai yang panjang dan kompleks, sehingga sulit
terdegradasi secara alami oleh mikroorganisme (Hasibuan, 2016).
Gambar 2. Limbah anorganik (Hasibuan, 2016)
7
Limbah dibedakan menjadi beberapa jenis berdasarkan sumbernya, yaitu meliputi
limbah industri, limbah pertambangan, limbah pertanian, limbah medis dan
limbah domestik. Limbah industri merupakan limbah yang dihasilkan dari hasil
samping pada proses pengolahan dalam suatu industri. Misalnya zat warna dari
industri tekstil, limbah cair industri tahu, limbah industri alkohol dan lain-lain
(Widayatno dan Sriyani, 2008). Limbah industri hampir sama dengan limbah
pertambangan, akan tetapi limbah industri mengacu pada pembuatan atau sintesis
sedangkan limbah pertambangan mengacu pada hasil samping industri pada
pertambangan. Misalnya industri batubara, limbah pertambangan minyak, emas,
timah dan lain-lain (Nugeraha dkk., 2010)
Limbah pertanian merupakan limbah yang dihasilkan dari proses pertanian seperti
limbah kulit buah, jerami dan limbah pupuk anorganik yang mengandung nitrat,
amonium, sulfur dan lain-lain (Rusydi dkk., 2015). Adapun limbah medis
merupakan limbah yang dihasilkan dari kegiatan medis, rumah sakit dan
sejenisnya, dapat berupa padatan atau cairan seperti sisa bahan kimia, obat-obatan,
kantong infus, alat suntik dan sebagainya (Pratiwi dan Maharani, 2013).
Limbah domestik merupakan limbah yang dihasilkan dari kegiatan atau aktivitas
manusia sehari-hari, misalnya kegiatan memasak, belanja, membakar sampah dan
lain-lain. Contoh dari limbah domestik meliputi air cucian, limbah toilet, bungkus
kemasan, minyak bekas, sisa makanan, sisa sayuran, sisa daging, sisa penjualan
ikan, sisa buah-buahan dan lain sebagainya. Sampah pada daerah perkotaan
hanya 40% yang diangkut menuju tempat pembuangan akhir (TPA), dengan
penanganan yang minim dapat menyebabkan penumpukan sampah secara besar
8
yang menjadi sumber penyakit yang membahayakan manusia maupun lingkungan
sekitar (Sudarwanto, 2010).
B. Pengolahan Limbah Domestik
Solusi untuk menanggulangi masalah limbah domestik, terdapat beberapa cara
yang dilakukan, diantaranya pembuangan secara teratur dan pada tempat yang
disediakan, melakukan daur ulang, pembakaran, pemisahan, pembusukkan dan
juga pengomposan. Penanganan limbah domestik dengan cara pengomposan
merupakan hal yang sangat penting karena selain dapat mengurangi dampak
penumpukan limbah dan perusakan lingkungan, juga dapat menghasilkan produk
yang memiliki nilai jual (Sumampouw, 2017).
Pengomposan adalah proses penguraian material-material organik dengan bantuan
mikroorganisme sebagai agen pendegradasi. Produk pengomposan adalah
kompos yang digunakan sebagai pupuk alami (organik) yang dapat menghasilkan
humus yang berfungsi untuk memperbaiki struktur tanah, sehingga tanah menjadi
lebih subur. Misalnya dapat digunakan pada tanaman hias, tanaman buah,
maupun padi. Secara spesifik, fungsi dari kinerja kompos yaitu untuk
meningkatkan kesuburan tanah seperti pada lahan yang baru dibuka yang biasanya
mengalami penurunan kesuburan, sehingga lahan baru tersebut dapat segera untuk
digunakan (Sulistyorini, 2005). Prinsip pengomposan didasarkan pada penurunan
C/N rasio bahan organik menjadi sama dengan C/N rasio tanah. C/N rasio adalah
hasil perbandingan antara karbohidrat dan nitrogen yang terkandung di dalam
suatu bahan. Nilai C/N rasio tanah adalah pada kisaran 10 – 12. Bahan organik
9
yang memiliki C/N rasio sama dengan tanah, memungkinkan bahan tersebut dapat
diserap oleh tanaman atau bahkan lebih cepat diserap (Widiyaningrum dan
Lisdiana, 2015).
Gambar 3. Proses pengomposan (Badan Litbang Pertanian, 2011)
Terdapat tiga tahap pada proses pengomposan yang ideal, tahap pertama yaitu
tahap penghangatan (fase mesofilik awal). Mikroorganisme mesofilik hidup pada
temperatur 25 – 45 ºC, pada fase ini ukuran partikel bahan organik akan diperkecil
sehingga luas permukaan bahan bertambah sehingga mempercepat proses
pengomposan. Tahap kedua yaitu fase termofilik, mikroorganisme termofilik
hidup pada temperatur 45 – 100 ºC. Pada fase ini molekul karbohidrat dan protein
akan dipecah sehingga bahan kompos dapat terdegradasi dengan cepat.
Mikroorganisme pada fase ini berupa Actinomycetes dan jamur termofilik,
sebagian dari Actinomycetes mampu merombak selulosa dan hemiselulosa.
Kemudian proses dekomposisi mulai melambat dan temperatur puncak dicapai.
Selanjutnya tahap ketiga yaitu tahap pendinginan dan pematangan (fase mesofilik
akhir). Pada tahap ini, jumlah mikroorganisme termofilik berkurang karena bahan
10
makanan bagi mikroorganisme ini juga berkurang, hal ini menyebabkan
mikroorganisme mesofilik mulai beraktivitas kembali. Mikroorganisme mesofilik
tersebut akan merombak selulosa dan hemiselulosa yang tersisa dari proses
sebelumnya menjadi gula yang lebih sederhana, tetapi kemampuannya tidak
sebaik mikroorganisme termofilik (Olaniyi and Ojetayo, 2011).
C. Bakteri Proteolitik
Bakteri proteolitik merupakan bakteri yang mampu memproduksi enzim protease
secara ekstraseluler. Enzim tersebut merupakan enzim yang dapat mendegradasi
protein yang diproduksi di dalam sel dan dilepaskan keluar sel. Bakteri pada
proses pengomposan yang mempunyai aktivitas proteolitik umumnya adalah
bakteri dari genus Proteus, Bacillus, Pseudomonas dan Staphylococcus
(Puspitasari dkk., 2012). Tingkat aktivitas proteolitik secara kualitatif dapat
diidentifikasi melalui pengamatan pertumbuhannya pada media padat yang
mengandung kasein. Besar aktivitas proteolitik ditunjukan dengan semakin
lebarnya zona bening yang terbentuk di sekitar koloni yang tumbuh pada media
tersebut. Hasil perombakan polimer protein ditunjukan dengan terbentuknya zona
bening yang menandakan protein dalam media padat tersebut telah dirombak
menjadi senyawa peptida dan asam amino (Saidah, 2014).
Penelitian yang dilakukan oleh Wahjuningrum dkk (2009) mengenai bakteri
proteolitik, diisolasi dari bagian eksternal ikan nila. Hasilnya menunjukkan
bahwa dari bagian kulit ikan nila diperoleh isolat bakteri dengan indeks proteolitik
paling besar yaitu 3,33, dan dari bagian insang diperoleh diperoleh isolat bakteri
11
dengan indeks proteolitik paling besar yaitu 4,25. Berdasarkan karakter
morfologi, fisiologi dan biokimia, isolat bakteri proteolitik yang diperoleh pada
penelitian oleh Wahjuningrum dkk (2009) merupakan bakteri yang terdiri dari
genus Staphylococcus sp., Necromonas sp. dan Enterobacter sp. Penelitian yang
dilakukan oleh Rizaldi dkk (2018) juga mengidentifikasi bakteri proteolitik, tetapi
berbeda sumber yaitu diisolasi dari tumbuhan lamun. Hasil pada penelitian
Rizaldi dkk (2018) menunjukkan bahwa bakteri proteolitik yang diperoleh terdiri
dari beberapa genus yaitu meliputi Staphylococcus sp., Plesiomonas shigelloides,
Bacillus sp. dan Pseudomonas sp.
D. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme
Setiap bakteri memiliki kemampuan pertumbuhan yang berbeda satu sama lain,
dengan demikian dapat diketahui waktu tertentu yang dapat digunakan untuk
produksi supaya dapat diperoleh hasil yang maksimal. Terdapat empat macam
fase pertumbuhan bakteri yaitu fase lag, fase log (fase eksponensial), fase
stasioner, dan fase kematian:
1. Fase Lambat (lag phase)
Fase lambat mengikuti inokulasi media nutrient, dan dapat merupakan periode
adaptasi. Bila suatu biakan dipindahkan dari suatu lingkungan yang lain,
maka mikroba itu perlu mengorganisasi kembali konstituen mikro dan makro
molekulnya. Selama fase ini massa sel mungkin saja bertambah tanpa diikuti
oleh pertumbuhan jumlah sel (Rahmawati, 2016).
12
2. Fase Eksponensial (log phase)
Fase eksponensial merupakan fase pertumbuhan sel, ini merupakan periode
pertumbuhan yang stabil atau keadaan pertumbuhan yang tenang dan laju
pertumbuhan spesifiknya tetap. Komposisi kimia total cairan fermentasinya
sedang berubah, sebab nutrien-nutrien sedang dikonsumsi mikroba dan
produk-produk metabolit sedang diproduksi.
3. Fase Seimbang (stationary phase)
Fase seimbang ini terjadi bila semua sel telah mencapai kesetimbangan
dengan sel-sel yang mati. Meskipun pertumbuhan bersihnya telah berhenti, di
sana masih mungkin terjadi metabolisme dan mengakumulasikan produk-
produk dalam sel atau cairan fermentasi. Massa total sel mungkin tetap tetapi
jumlah sel yang hidup mungkin menurun.
4. Fase Kematian
Jumlah sel yang mati telah meningkat dan lebih banyak dari jumlah sel yang
hidup, faktor penyebabnya adalah ketidaktersediaan nutrisi dan akumulasi
produk buangan yang bersifat toksik (Pratiwi dan Maharani, 2013).
E. Uji Biokimia
Terdapat beberapa macam uji biokimia yang digunakan dalam karakterisasi suatu
bakteri, diantaranya yaitu meliputi:
1. Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram merupakan salah satu karakterisasi yang sangat umum
digunakan untuk mengidentifikasi suatu bakteri. Metode pewarnaan Gram
13
dilakukan berdasarkan perbedaan ketebalan peptidoglikan yang terdapat pada
dinding sel dan banyaknya lemak pada membran sel. Bakteri dengan
peptidoglikan yang tebal dikategorikan sebagai bakteri Gram positif,
sedangkan bakteri dengan peptidoglikan yang tipis dikategorikan sebagai
bakteri Gram negatif. Dinding sel bakteri Gram positif terdiri dari membran
sitoplasma, lapisan polimer peptidoglikan dengan jumlah besar yang
dihubungkan oleh rantai asam amino dan lapisan luar yang disebut kapsul.
Bakteri Gram negatif memiliki membran luar bilayer, lapisan peptidoglikan
yang tipis dan membran plasma bilayer (Kurjogi and Kaliwal, 2018).
2. Uji Katalase
Uji katalase bertujuan untuk mengetahui sifat bakteri dalam kemampuannya
untuk menghasilkan enzim katalase. Pengujian dilakukan dengan
menggunakan larutan H2O2 yang disuspensikan pada koloni bakteri (Yusuf
dkk., 2009).
3. Uji Indol
Tujuan dari uji indol adalah untuk mengetahui kandungan enzim triptofanase
pada bakteri, yang merupakan enzim yang mengkatalisis penguraian gugus
indol pada asam amino triptofan. Uji indol dilakukan menggunakan air
pepton sebagai media dan reagen Kovac.
4. Uji Sitrat
Tujuan dari uji sitrat adalah untuk mengidentifikasi kemampuan bakteri dalam
menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Media
14
yang digunakan pada uji sitrat yaitu media Simmon’s Citrate, dengan hasil
positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna media menjadi biru.
5. Uji Molalitas
Tujuan dari uji molalitas adalah untuk mengetahui kemampuan gerak aktif
ataupun gerak Brown dari bakteri. Media yang digunakan yaitu media NA
dengan jumlah 1/10 lebih sedikit, dengan uji positif yang ditunjukkan dengan
pertumbuhan yang menyebar di sekitar tusukan (Rahmawati, 2016).
6. Uji Methyl Red (MR)
Tujuan dari uji MR adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
memfermentasi metilen glikon. Media yang digunakan adalah media glukosa
fosfat dan ditambah metil merah. Uji positif ditunjukkan dengan adanya
perubahan warna media menjadi merah.
7. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Tujuan dari uji TSIA adalah untuk membedakan jenis bakteri berdasarkan
kemampuan bakteri dalam memecahkan dextrosa, sukrosa, laktosa dan
pembebasan sulfida. Selain itu uji TSIA juga berfungsi untuk mengetahui
apakah bakteri tersebut dapat menghasilkan gas H2S atau tidak. Terdapat dua
jenis media yang digunakan dalam uji TSIA, yaitu media slant (miring) dan
media butt (tusuk) (Yusuf dkk., 2009).
8. Uji Urease
Tujuan dari uji urease adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
mengubah urea menjadi amonia. Media yang digunakan yaitu media Urea
15
Base Agar, dengan uji positif yang ditunjukkan dengan adanya perubahan
warna media menjadi merah muda.
9. Uji Amilase
Tujuan dari uji amilase adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
menghidrolisis amilum. Media yang digunakan adalah media Starch Agar,
dengan uji positif yang ditunjukkan dengan adanya zona bening disekitar
koloni.
10. Uji Koagulase
Tujuan dari uji koagulase adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
menggumpalkan fibrin. Uji koagulase dilakukan dengan menggunakan reagen
oksidase, dengan hasil positif yang ditunjukkan dengan aglutinasi atau
penggumpalan (Ulfa dkk., 2016).
11. Uji Oksidase
Tujuan dari uji oksidase adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
menghasilkan enzim oksidase. Uji oksidase dilakukan menggunakan kertas
oksidase, dengan mengamati perubahan warna yang terjadi. Uji positif
ditandai dengan adanya perubahan warna kertas menjadi biru violet.
12. Uji Fermentatif
Tujuan dari uji fermentatif adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri
dalam memfermentasi glukosa. Uji fermentatif dilakukan dengan menutup
tabung media dengan menggunakan parafin, sehingga dapat mendukung
terjadinya fermentasi dengan keadaan kedap udara (Yusuf dkk., 2009).
16
F. Enzim Protease
Enzim protease adalah enzim yang dapat menghidrolisis protein menjadi
senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti peptida dan asam amino.
Berdasarkan cara pemotongan ikatan peptida, enzim protease dibagi menjadi 2
yaitu eksopeptidase dan endopeptidase. Eksopeptidase terdiri dari karboksi-
eksopeptidase yang memotong peptida dari arah gugus karboksil terminal dan
amino-eksopeptidase dari gugus amino terminal, sedangkan endopeptidase
memecah ikatan peptida dari dalam (Naiola dan Widhyastuti, 2002).
Berdasarkan jenis residu asam amino dalam sisi aktifnya, enzim protease dapat
dibedakan menjadi empat golongan yaitu protease serin, protease sulfihidril,
protease karboksil dan protease logam.
1. Protease Serin
Protease serin memiliki residu serin pada gugus aktifnya dan bersifat
endopeptidase. Contoh dari protease serin meliputi tripsin, kimotripsin dan
subtilin.
2. Protease Sulfihidril
Protease sulfihidril memiliki residu sulfihidril pada gugus aktifnya, contohnya
meliputi papain dan bromielin (Cuesta et al., 2015).
3. Protease Karboksil
Protease karboksil memiliki dua gugus karboksil pada gugus aktifnya,
contohnya meliputi pepsin dan renin. Kereaktifan protease karboksil dapat
terhambat dengan adanya p-bromo fenasilbromida.
17
4. Protease Logam
Kereaktifan protease logam dipengaruhi dengan adanya logam dan dapat
dihambat menggunakan EDTA. Contoh dari protease logam yaitu enzim
peptidase (Choliq, 2008).
Enzim protease dan juga enzim lain dapat diisolasi dari tumbuhan, hewan dan
mikroorganisme. Penggunaan tumbuhan sebagai sumber protease sangat terbatas
karena hanya memiliki sedikit lahan tanam dan kondisi pertumbuhan yang sesuai,
serta memerlukan waktu produksi enzim yang cukup lama. Produksi protease dari
hewan juga terbatas karena kurangnya ketersediaan ternak penghasil enzim.
Mikroorganisme merupakan sumber enzim yang memiliki potensi paling besar
dibandingkan tumbuhan dan hewan. Penggunaan mikroorganisme juga lebih
menguntungkan karena pertumbuhannya yang cepat, dapat tumbuh pada substrat
yang ekonomis, lebih mudah ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan kondisi
pertumbuhan dan rekayasa genetik (Yuniati dkk., 2015).
Terdapat berbagai jenis bakteri dan kapang yang dilaporkan mampu menghasilkan
enzim protease, yaitu meliputi Bacillus amylolique, B. licheniformis, B. subtilis,
B. cereus, B. polymyxa, B. thermoproteolyticus, Mucor pucillus, M. miehei,
Aspergillus oryzae, A. sojae dan phoenicis. Beberapa diantara mikroorganisme
tersebut telah digunakan dalam skala industri. Kapang Mucor javanicus
merupakan salah satu mikroorganisme yang memiliki daya proteolitik cukup kuat,
sehingga memiliki kapasitas besar untuk dikembangkan sebagai kapang penghasil
enzim protease (Choliq, 2008). Untuk melakukan produksi enzim protease dari
bakteri diperlukan proses pemilihan, isolasi dan identifikasi bakteri unggul, yaitu
18
bakteri proteolitik yang dapat menghasilkan enzim protease dalam jumlah besar
dan aktivitas enzim yang tinggi.
Terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi banyaknya pemilihan bakteri
sebagai sumber enzim, yaitu meliputi:
1. Skala produksi mudah ditingkatkan.
2. Kondisi produksi tidak bergantung pada musim dan waktu produksi.
3. Bakteri lebih cepat dan mudah untuk tumbuh.
4. Waktu produksi lebih singkat.
5. Biaya produksi relatif rendah (Soeka dan Sulistiani, 2017).
Kemampuan enzim protease dalam mempercepat reaksi dipengaruhi oleh
beberapa faktor, yang menyebabkan enzim dapat bekerja dengan optimal. Faktor-
faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim yaitu meliputi konsentrasi enzim,
substrat, senyawa inhibitor dan aktivator, pH serta temperatur lingkungan. Pada
temperatur rendah, reaksi enzimatis berlangsung lambat. Kenaikan temperatur
dapat mempercepat reaksi enzimatis, hingga suhu optimum tercapai dan reaksi
enzimatis mencapai maksimum. Kenaikan temperatur yang melebihi temperatur
optimum menyebabkan enzim terdenaturasi dan menurunkan kecepatan reaksi
enzimatis. Sehingga perlu dilakukan kontrol temperatur yang maksimal dengan
memperhatikan temperatur optimum (Noviyanti dkk., 2012). Kecepatan reaksi
enzimatis tersebut biasa disebut dengan aktivitas enzim. Aktivitas enzim
merupakan kecepatan pengurangan substrat ataupun kecepatan pembentukan
produk pada kondisi optimum. Aktivitas enzim secara kualitatif dapat ditentukan
menggunakan suatu reaksi kimia, yaitu dengan substrat yang dikatalisis oleh
19
enzim tersebut dan secara kuantitatif dengan mengukur laju reaksinya. Aktivitas
enzim protease secara kualitatif tidak selalu menjadi dasar yang baik sebagai
indikasi aktivitas enzimnya, sehingga perlu dilakukan uji aktivitas enzim protease
secara kuantitatif (Saidah, 2014).
Aktivitas unit enzim didefinisikan sebagai jumlah unit yang dapat mengubah
sejumlah mikromol substrat permililiter enzim. Adapun aktivitas spesifik adalah
jumlah unit enzim permiligram protein. Aktivitas spesifik merupakan ukuran
kemurnian enzim, nilainya meningkat seiring dengan proses pemurnian suatu
enzim. Nilai aktivitas spesifik mencapai maksimum apabila suatu enzim telah
murni. Sebagai contoh yaitu penelitian yang dilakukan oleh Sudha et al (2018),
yang memproduksi enzim protease dari bakteri Exiguobacterium profundam sp
MM1. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa enzim protease yang dihasilkan
mempunyai aktivitas berkisar antara 0,2 – 1,1 U/mL. Adapun penelitian lain
yang dilakukan oleh Saidah (2014), memproduksi enzim protease dari bakteri
proteolitik yang diisolasi dari sumber air panas Pacet, Mojokerto. Hasil yang
diperoleh menunjukkan bahwa enzim protease yang dihasilkan mempunyai
aktivitas berkisar antara 0,385 – 0,631 U/mL.
G. Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-Vis merupakan instrumen yang digunakan dalam penelitian
ini untuk mengukur aktivitas enzim yang diperoleh, yaitu dengan mengukur
absorbansi blanko dan ekstrak kasar enzim. Spektrofotometri UV-Vis merupakan
teknik analisis spektroskopi menggunakan sumber radiasi elektromagnetik
20
ultraviolet (10 – 380 nm) dan sinar tampak (380 – 780 nm) dengan menggunakan
instrumen spektrofotometer. Spektrofotometer UV-Vis menggunakan energi
elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga banyak
digunakan pada analisis kuantitatif (Mulja dan Suharman, 2009).
Molekul hanya menyerap radiasi elektromagnetik pada panjang gelombang yang
khusus (spesifik untuk molekul tersebut). Absorbansi cahaya ultraviolet (radiasi
berenergi tinggi) mengakibatkan berpindahnya suatu elektron ke orbital yang
lebih tinggi. Radiasi elektromagnetik yang dipancarkan menyerupai partikel yang
disebut foton, energi foton berbanding terbalik dengan panjang gelombang.
Radiasi dengan panjang gelombang lebih pendek mempunyai energi yang lebih
tinggi, sehingga foton dari cahaya ultraviolet mempunyai energi yang lebih tinggi
dibandingkan dengan foton gelombang radio. Skema kerja dari spektrofotometer
UV-Vis dapat dilihat pada Gambar 4 (Fessenden dan Fessenden, 1997).
Gambar 4. Skema kerja spektrofotometer UV-Vis (Kusnanto, 2013)
21
Kelebihan dari serapan ultraviolet yaitu gugus-gugus karakteristik dapat dikenal
dalam molekul-molekul yang sangat kompleks. Serapan dari radiasi UV-Vis,
pada umumnya disebut dengan spektroskopi elektronika. Molekul-molekul yang
mempunyai orbital d yang terisi sebagian akan mengalami absorbsi pada panjang
gelombang UV-Vis. Hal tersebut diakibatkan oleh interaksi ligan dengan orbital d
dari logam. Pada ion bebas orbital d berada pada tingkat energi yang sama.
Interaksi logam dengan ligan menyebabkan terjadinya pembelahan orbital d
(splitting) (Skoog, 2007). Terdapat beberapa istilah yang umum dalam kajian
spektra elektronik, yaitu meliputi:
1. Auksokrom
Auksokrom merupakan gugus jenuh yang bila terikat pada suatu kromofor
akan mempengaruhi panjang gelombang dan intensitas serapan maksimumnya
(misalnya NH2, OH dan Cl).
2. Kromofor
Kromofor merupakan gugus tak jenuh kovalen yang menyebabkan serapan
elektronik (misalnya C=C, C=O dan O=C=O).
3. Pergeseran Batokromik (pergeseran merah)
Pergeseran batokromik merupakan pergeseran serapan ke arah panjang
gelombang yang lebih panjang karena pengaruh substitusi atau pelarut.
4. Pergeseran Hipsokromik (pergeseran biru)
Pergeseran hipsokromik merupakan pergeseran serapan ke arah panjang
gelombang yang lebih pendek akibat pengaruh substitusi atau pelarut.
22
5. Efek Hiperkromik
Efek hiperkromik merupakan suatu kenaikan intensitas serapan pada panjang
gelombang tertentu.
6. Efek Hipokromik
Efek hipokromik merupakan suatu penurunan intensitas serapan pada panjang
gelombang tertentu.
Secara kualitatif, absorbsi cahaya dapat diperoleh dengan pertimbangan absorbsi
cahaya pada daerah tampak. Objek dilihat dengan adanya bantuan cahaya yang
diteruskan dan dipantulkan. Apabila cahaya polikromatis (cahaya putih) yang
berisi seluruh spektrum panjang gelombang melewati medium tertentu, akan
terjadi penyerapan panjang gelombang lain sehingga medium tersebut akan
tampak berwarna. Oleh karena hanya panjang gelombang yang diteruskan yang
sampai ke mata maka panjang gelombang inilah yang menentukan warna dari
medium. Warna ini disebut dengan warna komplementer terhadap warna yang
diabsorbsi. Adapun tabel spektrum tampak dan warna komplementernya dapat
dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Spektrum tampak dan warna komplementernya
Panjang gelombang (nm) Warna yang diserap Warna komplementer
340 - 450 Lembayung Kuning - Hijau
450 - 495 Biru Kuning
495 - 570 Hijau Violet
570 - 590 Kuning Biru
590 - 620 Jingga Kuning - Hijau
620 - 750 Merah Biru - Hijau
(Triyati, 2013).
23
III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli sampai Oktober 2018, bertempat di
Laboratorium Biokimia FMIPA Universitas Lampung dan UPT Laboratorium
Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi Universitas Lampung. Karakterisasi
biokimia dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi cawan petri, jarum ose,
pipet tetes, mikro pipet, tabung reaksi, labu Erlenmeyer, gelas kimia, gelas
ukur, spatula, batang pengaduk, bunsen, rak tabung reaksi, colony counter,
termometer, neraca analitik, Autoclave (model S-90N), inkubator, sentrifuga,
Laminar Air Flow (LAF) (CURMA model 9005 FL), shaker, shaker
incubator, Spektrofotometer UV-Vis (Varian Cary 50 Probe).
2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi limbah domestik
berwujud padat (meliputi sisa makanan, sayuran dan lain-lain) sebagai bahan
24
baku pembuatan kompos, aquades, alkohol, kapas berlemak, kain kasa, kertas
saring, kertas pH, media Nutrient Agar (NA), media Skim Milk Agar (SMA),
pepton, yeast extract, dextrose, susu skim, kristal violet, larutan iodin,
safranin, malachite green, buffer fosfat, kasein, Asam Trikloroasetat (TCA),
pereaksi C, pereaksi D, Bovine Serum Albumine (BSA) dan NaCl.
C. Prosedur Kerja
1. Tahap Persiapan
a. Sterilisasi Alat, Bahan dan Media
Sterilisasi dilakukan menggunakan Autoclave (model S-90N) pada suhu
121 °C selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. Sterilisasi berfungsi untuk
membersihkan alat, bahan dan media dari mikroorganisme, sehingga tidak
menyebabkan kontaminasi.
b. Pembuatan Larutan Fisiologis
Larutan fisiologis dibuat dengan melarutkan 0,85 g NaCl dalam 100 mL
aquades dan dipanaskan hingga mendidih, kemudian disterilisasi
menggunakan Autoclave pada suhu 121 °C selama 15 menit dengan
tekanan 1 atm. Larutan Fisiologis berfungsi sebagai pelarut yang dapat
mempertahankan kestabilan mikroorganisme dibandingkan dengan pelarut
menggunakan aquades.
c. Pembuatan Media Nutrient Agar
Media ini disiapkan dengan cara melarutkan 2,8 g NA dalam 100 mL
aquades dan dipanaskan hingga mendidih, kemudian disterilisasi
25
menggunakan Autoclave pada suhu 121 °C selama 15 menit dengan
tekanan 1 atm. Media Nutrient Agar digunakan sebagai media umum pada
isolasi bakteri.
d. Pembuatan Media Skim Milk Agar
Media ini disiapkan dengan cara melarutkan 0,5 g pepton, 0,5 g NaCl, 0,2
g yeast extract, 2 g agar, 0,1 g dextrose, 0,5 g kasein dan 2,5 g susu skim
dalam 100 mL aquades (Chu, 2006) dan dipanaskan hingga mendidih,
kemudian disterilisasi menggunakan Autoclave pada suhu 121 °C selama
15 menit dengan tekanan 1 atm. Media SMA digunakan sebagai media
selektif dan juga untuk menentukan aktivitas proteolitik secara kualitatif.
e. Pembuatan Media Cair
Media ini disiapkan dengan cara melarutkan 0,5 g pepton, 0,5 g NaCl, 0,2
g yeast extract, 0,1 g dextrose, 0,5 g kasein dan 2,5 g susu skim dalam
100 mL aquades dan dipanaskan hingga mendidih, kemudian disterilisasi
menggunakan Autoclave pada suhu 121 °C selama 15 menit dengan
tekanan 1 atm. Media cair berfungsi sebagai media produksi enzim dan
media uji tingkat kekeruhan. Komposisi media cair hampir sama dengan
media SMA tetapi tidak ditambahkan agar.
2. Pembuatan Kompos
Pembuatan kompos dilakukan dengan menggunakan limbah domestik
berwujud padat. Limbah domestik dan kompos matang dicampurkan dengan
perbandingan rasio 60:40 dengan penyebaran yang merata, kemudian dicetak
menggunakan kotak dengan ukuran 30×30×50 cm. Campuran diletakkan pada
26
tempat yang terhindar dari sinar matahari langsung, dengan dilakukan
penutupan menggunakan terpal. Campuran harus dipastikan mendapat
sirkulasi udara yang cukup untuk mengatur kelembaban, suhu dan oksigen
pada proses pengomposan dengan dilakukan proses pembalikan secara
berkala.
3. Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel kompos dilakukan pada tiga titik di fase pengomposan,
yaitu mesofilik awal (25 – 45 °C), termofilik (46 – 100 °C) dan mesofilik
akhir/pematangan (25 – 45 °C). Setiap hari dilakukan pengukuran temperatur
untuk mengetahui fase pengomposan. Ketika pengukuran suhu menunjukkan
ketiga fase tersebut, maka pada waktu tersebut dilakukan pengambilan sampel
kompos sebanyak 10 g lalu dicatat suhu dan pHnya.
4. Homogenisasi Sampel
Sampel pada setiap fase ditimbang sebanyak 5 g dan dimasukkan ke dalam
labu Erlenmeyer 250 mL. Kemudian sampel dihomogenkan dengan
penambahan larutan fisiologis hingga larut. Kemudian dishaker selama 15
menit yang bertujuan untuk mengoptimalkan pelepasan mikroba yang masih
terjerat pada sampel. Sampel diencerkan secara bertingkat dari 10-1 – 10-7
dengan menggunakan larutan fisiologis.
5. Isolasi Bakteri dari Sampel Kompos
Sampel dari masing-masing pengenceran dituangkan sebanyak 0,1 mL dengan
metode Spread plate pada media NA dalam cawan petri. Sampel diinkubasi
selama 24 – 48 jam pada suhu inkubasi sesuai dengan suhu pada pengambilan
27
sampel. Kemudian dilakukan penghitungan jumlah koloni yang tumbuh pada
masing-masing pengenceran dengan menggunakan colony counter.
6. Skrining Bakteri Proteolitik
Isolat bakteri dengan koloni terpisah yang tumbuh pada media NA,
diinokulasikan pada media SMA dengan metode tusuk. Kemudian sampel
diinkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu inkubasi sesuai dengan suhu
pengambilan sampel. Indikasi aktivitas bakteri proteolitik ditandai dengan
terbentuknya zona bening (Wahjuningrum dkk., 2009).
7. Seleksi Isolat Bakteri Proteolitik
Koloni murni dari stok pada masing-masing fase pengambilan, diinokulasikan
pada media SMA dengan metode tusuk. selama 24 – 48 jam pada suhu
inkubasi sesuai dengan suhu pengambilan sampel. Zona bening pada koloni
yang tumbuh mengindikasikan adanya aktivitas bakteri proteolitik , dan
dihitung indeks proteolitiknya dengan metode titik. Berikut ini adalah rumus
untuk menghitung indeks proteolitik (IP):
IP = diameter zona bening
diameter koloni
Isolat bakteri dengan indeks proteolitik paling tinggi kemudian dilanjutkan ke
tahap karakterisasi (Karina dkk., 2014).
8. Karakterisasi Biokimia Isolat Bakteri Proteolitik
Terdapat beberapa uji karakterisasi isolat bakteri proteolitik yang dilakukan,
diantaranya yaitu:
28
a. Pengamatan Morfologi
Pengamatan morfologi isolat bakteri proteolitik dilakukan dengan
mengacu pada buku Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology edisi
ke-9, yaitu meliputi bentuk koloni, elevasi koloni dan tepi koloni.
b. Pewarnaan Gram
Proses pewarnaan Gram dilakukan menggunakan lempeng kaca sebagai
lempeng objek. Lempeng kaca dibilas dengan alkohol dan dilewatkan di
atas api bunsen hingga bersih. Sebanyak 2 tetes larutan fisiologis
diteteskan pada permukaan lempeng kaca menggunakan jarum ose steril.
Sebanyak 1 ose isolat bakteri proteolitik diambil dan disuspensikan secara
aseptik pada larutan fisiologis pada lempeng kaca, kemudian dikeringkan
dan dipanaskan sedikit di atas api bunsen. Larutan kristal violet diteteskan
pada isolat bakteri secara merata, dibiarkan selama 1 menit, dibilas dengan
aquades dan dianginkan hingga kering. Selanjutnya larutan iodin
diteteskan pada isolat bakteri secara merata, dibiarkan selama 1 menit,
dibilas menggunakan aquades dan dianginkan hingga kering. Alkohol
95% diteteskan pada isolat bakteri secara merata, dibiarkan selama 1
menit, dibilas menggunakan aquades dan dianginkan hingga kering.
Safranin diteteskan pada isolat bakteri secara merata, dibiarkan selama 1
menit, dibilas menggunakan aquades dan dianginkan hingga kering.
Kemudian diamati menggunakan mikroskop (Safrida dkk., 2012).
29
c. Pewarnaan Endospora
Pewarnaan endospora dilakukan dengan mengambil isolat bakteri
proteolitik sebanyak 1 ose dan diletakkan pada lempeng kaca. Sebanyak 1
– 3 tetes malachite green ditambahkan secara merata, didiamkan selama
15 menit, dibilas dengan aquades, ditambahkan 1 – 3 tetes safranin dan
didiamkan selama 1 menit. Kemudian dilakukan pengamatan
menggunakan mikroskop.
9. Pembuatan Starter Isolat Bakteri Proteolitik
Isolat bakteri proteolitik diinokulasikan sebanyak 1 ose ke dalam 10 mL
media kultur cair, kemudian diinkubasi pada shaker incubator dengan
kecepatan 120 rpm selama 24 jam pada suhu inkubasi sesuai dengan suhu
pengambilan sampel.
10. Uji Tingkat Kekeruhan/Optical Density (OD)
Uji tingkat kekeruhan bertujuan untuk menentukan kurva pertumbuhan bakteri
dari masing-masing isolat. Starter isolat bakteri proteolitik diinokulasikan
sebanyak 2 % dalam 100 mL media cair, kemudian diinkubasi pada shaker
incubator dengan kecepatan 120 rpm selama 72 jam pada suhu inkubasi sesuai
dengan suhu pengambilan sampel. Inokulum bakteri diambil sebanyak 2 mL
pada 0, 12, 24, 36, 48, 60 dan 72 jam. Sampel diukur absorbansinya
menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 600 nm.
11. Uji Aktivitas Proteolitik Isolat Bakteri secara Kuantitatif
Inokulum bakteri yang diambil sebanyak 2 mL pada uji kekeruhan juga diukur
aktivitas proteolitiknya. Inokulum disentrifugasi dengan kecepatan 10.000
30
rpm selama 15 menit. Filtrat diambil sebanyak 0,5 mL dan ditambahkan 0,5
mL buffer fosfat pH 7, kemudian didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit
ditambahkan substrat (2 % kasein dalam buffer fosfat pH 7) sebanyak 0,5 mL
dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 °C. Reaksi dihentikan dengan
menambahkan 1 mL larutan TCA, kemudian diaduk dan didiamkan selama 30
menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15
menit dan dipisahkan filtratnya. Kemudian filtrat diukur absorbansinya
menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 580 nm.
Kontrol dibuat dengan menambahkan larutan TCA pada larutan enzim
sebelum substrat ditambahkan. Aktivitas Unit (AU) enzim dihitung dengan
rumus:
AU = Asp − Abl
Ak − Abl × P ×
1
T
Keterangan:
AU = Aktivitas Unit (U/mL)
Asp = Absorbansi Sampel
Ak = Absorbansi kontrol
Abl = Absorbansi Blanko
P = Faktor Pengenceran
T = Waktu Inkubasi (menit) (Tremacoldi and Carmona, 2005).
12. Produksi Enzim Protease
Produksi enzim protease dilakukan terhadap isolat bakteri proteolitik terpilih.
Starter isolat bakteri proteolitik diinokulasikan sebanyak 2 % dalam 100 mL
media cair, kemudian diinkubasi pada shaker incubator dengan kecepatan 120
rpm pada suhu inkubasi sesuai dengan suhu pengambilan sampel, dengan
waktu yang digunakan adalah waktu optimum yang diperoleh dari uji tingkat
31
kekeruhan dan uji aktivitas proteolitik secara kuantitatif. Kemudian sampel
disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit (Rodarte et al.,
2011). Selanjutnya supernatan diambil dan dipisahkan dari pellet, supernatan
yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim protease.
13. Uji Aktivitas Unit Enzim Protease
Ekstrak kasar enzim protease diambil sebanyak 0,5 mL dan ditambahkan 0,5
mL buffer fosfat pH 7, kemudian didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit
ditambahkan substrat (2 % kasein dalam buffer fosfat pH 7) sebanyak 0,5 mL
dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 °C. Reaksi dihentikan dengan
menambahkan 1 mL larutan TCA, kemudian diaduk dan didiamkan selama 30
menit. Selanjutnya, sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm
selama 15 menit dan dipisahkan filtratnya. Kemudian filtrat diukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang 580 nm. Standar dibuat dengan menambahkan larutan TCA pada
larutan enzim sebelum substrat ditambahkan. Aktivitas Unit (AU) enzim
dihitung dengan rumus:
AU = Asp − Abl
Ak − Abl × P ×
1
T
Keterangan:
AU = Aktivitas Unit (U/mL)
Asp = Absorbansi Sampel
Ak = Absorbansi Kontrol
Abl = Absorbansi Blanko
P = Faktor Pengenceran
T = Waktu Inkubasi (menit) (Tremacoldi and Carmona., 2005).
32
14. Uji Kadar Protein dan Aktivitas Spesifik
Enzim protease sebanyak 0,1 mL ditambahkan 0,9 mL aquades lalu
direaksikan dengan 5 mL pereaksi C dan dihomogenkan. Sampel dibiarkan
selama 10 menit pada suhu ruang. Pereaksi D ditambahkan sebanyak 0,5 mL,
didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang. Kontrol dibuat dengan
mengganti 0,1 mL enzim dengan 0,1 mL aquades, selanjutnya dilakukan
perlakuan sama seperti sampel. Setelah didiamkan selama 30 menit, sampel
dan kontrol disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit,
supernatan dipisahkan dari endapannya kemudian diukur absorbansinya.
Serapan diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang 600 nm. Konsentrasi protein enzim ditentukan menggunakan
kurva standar BSA (Bovine serum Albumin). Sedangkan untuk Aktivitas
spesifik enzim protease (U/mg) merupakan perbandingan antara aktivitas
protease (U/ml) dengan kadar protein (mg/ml) (Suhartono dan Artika., 2017).
46
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan sebagai
berikut:
1. Total koloni yang diperoleh pada tahap awal isolasi antara lain meliputi
fase mesofilik: 4,9 × 108 cfu/mL, fase termofilik: 8,8 × 108 cfu/mL, dan fase
pematangan: 4,4 × 109 cfu/mL.
2. Hasil uji indeks proteolitik yaitu terdapat 13 isolat dengan indeks
proteolitik bervariasi, diantarnya isolat PKMA1, PKMA4, PKMB2,
PKMF1, PKMG2, PKTA1, PKTB3, PKTC6, PKTD4, PKPA1, PKPB2,
PKPG1 dan PKPG2.
3. Hasil karakterisasi biokimia yaitu terdapat 5 isolat terpilih, diantaranya
isolat PKMA4, PKMG2, PKTB3, PKTD4 dan PKPG2.
4. Hasil pengukuran aktivitas spesifik isolat proteolitik terpilih pada kondisi
optimum pertumbuhan yaitu PKMA4: 0,1716 U/mg, PKMG2: 0,197 U/mg,
PKTB3: 0,333 U/mg, PKTD4: 0,167 U/mg dan PKPG2: 0,207 U/mg.
5. Isolat PKTB3 merupakan isolat proteolitik dengan aktivitas yang relatif
lebih baik dibandingkan isolat yang lainnya.
47
B. Saran
Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, pada penelitian selanjutnya
disarankan:
1. Melakukan karakterisasi molekular terhadap isolat-isolat bakteri proteolitik
yang diperoleh, untuk mengetahui kekerabatan dengan spesies terdekat dari
database yang sudah ada.
2. Melakukan optimasi produksi enzim protease menggunakan substrat yang
berbeda untuk mendapatkan aktivitas proteolitik yang lebih baik.
3. Mempelajari lebih lanjut isolat yang diperoleh pada penelitian ini mengenai
karakterisasi enzim yang dihasilkan.
48
DAFTAR PUSTAKA
Badan Litbang Pertanian. (2011). Pupuk Organik dari Limbah Organik Sampah
Rumah Tangga. Jurnal Agro Inovasi. 3: 1 – 11.
Beffa, T., Blanc, M., Marilley, L., Fisher, J.L., Lyon, P.F. and Aragno, M. 1995.
Taxonomic and Metabolic Microbial Diversity During Composting. in The
Science of Composting. Journal of Microbiology Blackies Academic and
Professional. 1: 1 – 8.
Choliq, A. 2008. Aktivitas Enzim Protease dari Mucor javanicus yang
Ditumbuhkan pada Media Tepung Singkong (Manihot utilissima). Jurnal
Mikrobiologi LIPI Bogor. 3: 299 – 303.
Chu, W.H. 2006. Optimization of Extracellular Alkaline Protease Production from
Species of Bacillus. Journal of Microbiol Biotechnol. 34: 241 – 245.
Cuesta, S.M., Rahman, S.A., Furnham, N., and Thornton, J.M. 2015. The
Classification and Evolution of Enzyme Function. Biophysical Journal. 1:
1082 – 1086.
Deng, A., Wu, A., Zhang, Y., Zhang, G., and Wen, T. 2010. Purification and
Characterization of a Surfactant-Stable High-Alkaline Protease from Bacillus
sp. B001. Journal of Bioresource Technology. 1: 7100 – 7106.
Doraja, P.H., Shovitri, M., dan Kuswytasari, N.D. 2012. Biodegradasi Limbah
Domestik dengan Menggunakan Inokulum Alami dari Tangki Septik. Jurnal
Sains dan Seni ITS. 1: 44 – 47.
Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S. 1997. Dasar-dasar Kimia Organik. Bina
Aksara. Jakarta. Pp: 112 – 115.
Gandjar, I., Sjamsuridzal, W., dan Oetari, A. 2006. Mikologi Dasar dan Terapan.
Yayasan Obor Indonesia. Jakarta. Pp: 63 – 68.
Hasibuan, R. 2016. Analisis Dampak Limbah/Sampah Rumah Tangga terhadap
Pencemaran Lingkungan Hidup. Jurnal Ilmiah Advokasi. 1: 42 – 52.
49
Insam, H. and Bertoldi, M.D. 2007. Microbiology of The Composting Process.
Compost Science and Technology. 3: 25 – 48.
Jain, P.C., Lacey, J., and Stevens, L. 1991. Use of API-ZYM Strips and 4-
Nitrophenyl Substrates to Detect and Quantify Hydrolytic Enzymes in Media
and Grain Colonized with Aspergillus, Eurotium and Pennicillium sp.
Journal of Mycological Research. 95: 834 – 842.
Karina, A.N., Hussain, D.R., Johanes, E, dan Nawir, N.H., 2014. Isolasi dan
Karakterisasi Bakteri Proteolitik dari Saluran Pembuangan Limbah Industri
Tahu. Jurnal Biologi Universitas Hasanuddin. 1: 1 – 8.
Kurjogi, M.M. and Kaliwal, B.B. 2018. Rapid and Sensitive Method for Detection
of Staphylococcus Aureus Enterotoxin Genes in Milk Sample. Journal of
Applied Biology and Biotechnology. 2: 15 – 19.
Kusnanto, M.W. 2013. Analisis Spektroskopi UV-Vis “Penentuan Konsentrasi
Permanganat (KMnO4)”. Jurnal FMIPA Jurusan Fisika. 1: 1 – 18.
Mulja, M. dan Suharman. 2009. Analisis Instrumental. Jurnal Kimia Analitik. 1:
114 – 138.
Naiola, E., dan Widhyastuti, N. 2002. Isolasi, Seleksi dan Optimasi Produksi
Protease dari Beberapa Isolat Bakteri. Jurnal Mikrobiologi LIPI Bogor. 3:
467 – 473.
Narihiro, T., Takebayashi, S., and Hiraishi, A., 2004. Activity and Phylogenetic
Composition of Proteolytic Bacteria in Mesophilic Fed-Batch Garbage
Composters. Journal of Microbes Environ. 4: 292 – 300.
Ngan, T.L.K. and Diep, C.N. 2016. Isolation, Identification of Mesophiles and
Thermophiles from Landfills in Cantho City, Vietnam and Their
Application for Biowaste Treatment. World Journal of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences. 9: 373 – 386.
Noreen, S., Siddiqa, A., Fatima, R., Anwar, F., Adnan, M., and Raza, A. 2017.
Protease Production and Purification from Agro Industrial Waste by
Utilizing Penicillium digitatum. International Journal of Applied Biology
and Forensics. 4: 119 – 129.
Noviyanti, T., Ardiningsih, P., dan Rahmalia, W., 2012 Pengaruh Temperatur
terhadap Aktivitas Enzim Protease dari Daun Sansakang (Pycnarrhena
cauliflora diels). Jurnal Biokimia Universitas Tanjungpura. 1: 31 – 34.
Nugeraha, Sumiyati, S., dan Samudro, G. 2010. Pengolahan Air Limbah Kegiatan
Penambangan Batubara Menggunakan Bio Koagulan: Studi Penurunan
Kadar TSS, Total Fe dan Total Mn Menggunakan Biji Kelor (Moringa
oleifera). Jurnal Presipitasi. 2: 57 – 61.
50
Olaniyi, J.O., and Ojetayo, A.E. 2011. Effect of Fertilizer Types on The Growth
and Yield of Two Cabbage Varieties. Journal of Animal & Plant Sciences. 2:
1573 – 1582.
Partanen, P., Hultman, J., Paulin, L., Auvinen, P., and Romantschuk, M. 2010.
Bacterial Diversity at Different Stages of The Composting Process. Journal
of BioMed Central Microbiologi. 4: 1 – 11.
Pratiwi, D. dan Maharani, C. 2013. Pengelolaan Limbah Medis Padat pada
Puskesmas Kabupaten Pati. Jurnal Kesehatan Masyarakat. 1: 74 – 84.
Priadie, B. 2012. Teknik Bioremediasi sebagai Alternatif dalam Upaya
Pengendalian Pencemaran Air. Jurnal Ilmu Lingkungan. 10: 38 – 48.
Puspitasari, F.D., Shovitri, M., dan Kuswytasari, N.D. 2012. Isolasi dan
Karakterisasi Bakteri Aerob Proteolitik dari Tangki Septik. Jurnal Sains dan
Seni ITS. 1: 1 – 4.
Rahmawati, N.H.F. 2016. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Proteolitik dari Feses
Hewan Luwak. Jurnal Biologi Universitas Negeri Yogyakarta. 4: 1 – 8.
Rizaldi, R., Setyantini, W.H., dan Sudarno. 2018. Isolasi dan Karakterisasi
Bakteri Proteolitik yang Berasosiasi dengan Lamun Enhalus acoroides di
Pantai Bama, Taman Nasional Baluran, Situbondo, Jawa Timur. Jurnal
Ilmiah Perikanan dan Kelautan. 1: 12 –20.
Rodarte, M.P., Dias, D.R., Vilela, D.M., and Schwan, R.F. 2011. Proteolytic
Activities of Bacteria, Yeasts and Filamentous Fungi Isolated from Coffee
Fruit (Coffea arabica l.). Journal of Agronomy. 3: 457 – 464.
Rusydi, A.N., Naily. W., dan Lestiana, H. 2015. Pencemaran Limbah Domestik
dan Pertanian Terhadap Air Tanah Bebas di Kabupaten Bandung. Jurnal
Pusat Penelitian Geoteknologi LIPI. 2: 87 – 97.
Safrida, Y.D., Yulvizar, C. dan Devira, C.N. 2012. Isolasi dan Karakterisasi
Bakteri Berpotensi Probiotik pada Ikan Kembung (Rastrelliger sp.). Jurnal
Biologi Universitas Syah Kuala. 3: 200 – 203.
Saidah, A.N, 2014. Isolasi Bakteri Proteolitik Termofilik dari Sumber Air Panas
Pacet Mojokerto dan Pengujian Aktivitas Enzim Protease. Jurnal Biologi.
Pp: 1 – 10.
Singh, R., Mittal, A., Kumar, M., and Mehta, P.K. 2016. Microbial Proteases in
Commercial Application. Journal of Pharmaceutical, Chemical and
Biological. 3: 365 – 374.
Skoog, D. A. 2007. Principles of Instrumental Analysis. Thompson Brooks/Cole.
Kanada. Pp: 76 – 79.
51
Soeka, S.Y. dan Sulistiani, S. 2017. Karakterisasi Enzim Protease dari Bakteri
Stenotrophomonas Sp. Asal Gunung Bromo, Jawa Timur. Jurnal
Mikrobiologi LIPI Bogor. 2: 203 – 211.
Steinkraus, K.H. 2002. Indigenous Fermented-Food Technologies for Small-Scale
Industries. Food and Nutrition Bulletin (7). Pp: 23 – 32.
Sudarwanto, S. 2010. Peran Strategis Perempuan dalam Pengelolaan Limbah
Padat Bernilai Ekonomi. Jurnal Ekosains. 1: 65 – 74.
Sudha, S., Nandhini, S.U., Mathumathi, V., and Nayaki, J.M.A. 2018. Production,
Optimization and Partial Purification of Protease from Terrestrial Bacterium
Exiguobacterium profundam sp. MM1. Journal of Biocatalysis and
Agricultural Biotechnology. 3: 1878 – 1881.
Suhartono, S. dan Artika, W. 2017. Isolasi dan Uji Aktivitas Protease dari
Aktinobakteri Isolat Lokal (AKJ-09) Aceh. Jurnal Biologi Universitas Syah
Kuala. 3: 116 – 120.
Sulistyorini, L. 2005. Pengolahan Sampah dengan Cara Menjadikannya Kompos.
Jurnal Kesehatan Lingkungan. 1: 77 – 84.
Sumampouw, O.J. 2017. Diare Balita: Suatu Tinjauan dari Bidang Kesehatan
Masyarakat. Deepublish. Yogyakarta. Pp: 54 – 59.
Tremacoldi, C. R. and Carmona, E. C. 2005. Production of Extracellular Alkaline
Proteases by Aspergillus clavatus. World Journal of Microbiology and
Biotechnology. 21: 169 – 172.
Tribun Lampung. 2018. Tahun Baru Sisakan Sampah 800 Ton.
lampung.tribunnews.com/2018/01/04/wow-tahun-baru-sisakan-sampah-800-
ton. Diakses pada tanggal 26 November 2018 pukul 22.49 WIB.
Triyati, E. 2013. Spektrofotometer Ultra-Violet dan Sinar Tampak serta
Aplikasinya dalam Oseanologi. Jurnal Oseana. 1: 39 – 47.
Ulfa, A., Suarsini, E., dan Muhdhar, M.H.I. 2016. Isolasi dan Uji Sensitivitas
Merkuri pada Bakteri Dari Limbah Penambangan Emas di Sekotong Barat
Kabupaten Lombok Barat. Proceeding Biology Education Conference. 1:
793 – 799.
Utomo, M.A.P. dan Shovitri, M. 2014. Bakteri Tanah Pendegradasi Bahan
Organik Desa Talango, Pulau Poteran, Sumenep. Jurnal Sains dan Seni
POMITS. 3: 80 – 83.
Valsange, A., Evarkar, S.P., Tawde, S.V., Kareppa, B.M., and Gujar, R.S. 2012.
Analysis of Protease Activity of Enzyme Isolated from Compost Soil.
International Multidisciplinary Research Journal. 6: 1 – 4.
52
Wahjuningrum, D., Mayasari., dan Mubarik, N.R. 2009. Isolasi dan Identifikasi
Bakteri Proteolitik Patogen dari Bagian Eksternal Ikan Nila GIFT
Oreochromis niloticus. Jurnal Akuakultur Indonesia. 2: 169 – 174.
Widayatno T. dan Sriyani, S. 2008. Pengolahan Limbah Cair Industri Tapioka
dengan Menggunakan Metode Elektroflokulasi. Jurnal Teknik Kimia. 1: 85 –
89.
Widiyaningrum, P. dan Lisdiana. 2015. Efektifitas Proses Pengomposan Sampah
Daun dengan Tiga Sumber Aktivator Berbeda. Jurnal Jurusan Biologi. 2:
107 – 113.
Yuniati, R., Nugroho, T., dan Puspita, F. 2015. Uji Aktivitas Enzim Protease dari
Isolat Bacillus Sp. Galur Lokal Riau. Jurnal Biologi. 2: 116 – 122.
Yusuf, N.W.H., Subekti, S., dan Kusdarwati, R. 2009. Isolasi dan Identifikasi
Bakteri Gram Negatif pada Luka Ikan Maskoki (Carassius auratus) Akibat
Infestasi Ektoparasit Argulus sp.. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan. 2:
1 – 15.