Download - Izolace NA z biologického materiálu
![Page 1: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/1.jpg)
Izolace NA z biologického materiálu
MUDr. Michal Jurajda
ÚPF LF MU
![Page 2: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/2.jpg)
Zdroje NA
• Materiál získaný ex vivo - biopsie
• Archivní materiál - FFPE
![Page 3: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/3.jpg)
Uchování a transport biol. materiálu
• Je dán účelem odběru a technikou a místem provedení odběru.
• Obecně se snažíme materiál co nejdříve zpracovat do podoby, kdy co nejméně podléhat degradaci
![Page 4: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/4.jpg)
Charakter zpracovávaných tkání
• Buněčnost – determinuje množství NA
• Přítomnost lipidů – může interferovat s izolačními postupy
• Charakter extracelulární matrix – rozhoduje o možnostech homogenizace tkáně
• Přítomnost inhibitorů PCR – heparin, některé metabolity v rostlinných bb.
![Page 5: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/5.jpg)
Homogenizace tkání
• Homogenizátory, desintegrátory
• Disruption x homogenization
![Page 6: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/6.jpg)
Účel homogenizace a disrupce
• Disrupce – rozbití buněčných stěn, plazmatické membrány a organel.
• Homogenizace – snižuje viskozitu vzorku „trháním“ velkých molekul. (důležité při izolaci RNA).
![Page 7: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/7.jpg)
Typy homogenizátorů
• „Stříkačka jehly“• Rotor-stator
homogenizátor• Kolonky
![Page 8: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/8.jpg)
Mixer Mill
• Mlýn používající wolframové kuličky
![Page 9: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/9.jpg)
Izolace nukleových kyselin
• Extrakce a precipitace
• Adsorpční metody– Kolonky– kuličky
![Page 10: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/10.jpg)
Přístupy k izolaci DNA
buňka DNA
RNA proteiny
Lýza biomembrán
Nukleové kyseli-ny zůstávají v roztoku, bílkovi-ny se sráží a se-dimentují odstře-děním na rozhra-ní, lipidy jsou ex-trahovány do chloroformu
vodný roztok
(DNA, RNA)
chloroform(lipidy)
Rozhraní (bílkoviny)
RNA je příp. odstraněna RNázou
A. Odstraňujeme lipidy extrakcí chloro-formem, bílkoviny srážením fenolem
B. Za určitých podmínek absorbujeme DNA na povrch SiO2, ostatní odsajeme
SiO2 je obvykle v podobě skleně-ných částic, které jsou těžké, snad-no sedimentují, ostatní lze odsát.
Změnou podmínek dojde opět k uvolnění DNA do čistého roztoku
![Page 11: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/11.jpg)
Kolonky Qiagen
buněčný lyzát centrifugace promytí a uvolnění
![Page 12: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/12.jpg)
Izolační kolonky
![Page 13: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/13.jpg)
Odstranění RNA-áz
• DEPC diethyl pyrocarbonate
• Karcinogen
• Deaktivovatelný při 100 st.Chttp://www.ambion.com/techlib/tb/tb_178.html
![Page 14: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/14.jpg)
Izolace RNA
28S
18S
![Page 15: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/15.jpg)
Spektrofotometrické stanovení
• Kyveta z křemičitého skla (quartz, silica)
• A260 – absorbance vlastní NA
• A230 – absorbance složek pufru (Tris, EDTA)
• A280 – absorbance fenolu a proteinů (fenylalanin a tyrosin)
• A320 – absorbance pozadí, NA ani proteiny neabsorbují.
![Page 16: Izolace NA z biologického materiálu](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062309/56814f19550346895dbca909/html5/thumbnails/16.jpg)
Spektrofotometry
• Kyvetové, bezkyvetové