UNIVERZA V LJUBLJANI
PEDAGOŠKA FAKULTETA
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
Študijski program: Biologija in gospodinjstvo
Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella
enterica iz plazilcev v ujetništvu
Mentorica:
Jerneja Ambrožič Avguštin
Kandidatka:
Metka Farkaš
Somentorica:
Martina Turk
Ljubljana, september 2016
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
II
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija biologije in gospodinjstva. Opravljeno
je bilo v laboratoriju Katedre za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov
Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.
Študijska komisija je za mentorico diplomskega dela imenovala doc. dr. Jernejo Ambrožič
Avguštin, za somentorico doc. dr. Martino Turk in za recenzentko doc. dr. Polono Zalar.
Mentorica: doc. dr. Jerneja Ambrožič Avguštin
Somentorica: doc. dr. Martina Turk
Recenzentka: doc. dr. Polona Zalar
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Marjanca STARČIČ ERJAVEC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, oddelek za biologijo
Članica: doc. dr. Jerneja AMBROŽIČ AVGUŠTIN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, oddelek za biologijo
Članica: doc. dr. Martina TURK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, oddelek za biologijo
Članica: doc. dr. Polona ZALAR
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, oddelek za biologijo
Datum zagovora:
Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Metka Farkaš
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Dn
DK
KG plazilci/Salmonella enterica/antibiotiki/virulentni dejavniki
KK
AV FARKAŠ, Metka
SA AMBROŽIČ AVGUŠTIN, Jerneja (mentor)/ TURK, Martina (somentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
LI 2016
IN IZOLACIJA IN GENOTIPIZACIJA BAKTERIJE SALMONELLA ENTERICA IZ
PLAZILCEV V UJETNIŠTVU
TD DIPLOMSKO DELO (univerzitetni študij)
OP IX, 57 str., 8 tab., 13 sl., 2 pril., 65 vir.
IJ sl
JI sl/en
AI Plazilci so v zadnjih letih vse bolj priljubljeni hišni ljubljenčki, pogosto pa se
uporabljajo kot učni pripomoček v šolah. Velikokrat se omenjajo kot možni
prenašalci salmonele, zato je pri delu z njimi potrebna previdnost in ustrezna
higiena. Pri plazilcih zajetih v raziskavo smo salmonelo potrdili pri 42,4% živali.
Največ okuženih je bilo kuščarjev (58,8%), sledile so kače (42,9%), pri želvah
salmonele nismo identificirali. Večina izolatov je pripadala vrsti Salmonella
enterica subsp. enterica, v štirih primerih smo izolirali bakterijo Salmonella enterica
subsp. arizonae. Izmed vseh sevov je bilo 33,3% takšnih, ki so bili odporni proti
izbranim protimikrobnim učinkovinam. Največkrat proti streptomicinu. Preverili
smo tudi prisotnost genov za beta-laktamaze iz skupine CTX-M za odpornost proti
kinolonom (qnr). Čeprav sta bila dva izolata odporna proti ampicilinu, nismo
potrdili prisotnosti genov blaCTX-M in genov skupine qnr. Pri salmonelah iz plazilcev
smo potrdili prisotnost genov za virulentne dejavnike (invA, spoB, sifA, spvC), od
tega največkrat invA (92,3%). Veliko izolatov je vsebovalo dva ali tri testirane gene
za virulentne dejavnike. Zaradi prisotnosti virulentnih dejavnikov so salmonele
lahko potencialno patogene za ljudi. Da preprečimo prenos salmonele, moramo
paziti na ustrezno higieno rok in opreme za plazilce. Poleg tega pa se odsvetuje stik
s plazilci mlajšim otrokom, osebam z oslabljenim imunskim sistemom in starejšim
osebam.
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION
DN Dn
DC
CX reptiles/Salmonella enterica/antibiotics/virulence factors
CC
AU FARKAŠ, Metka
AA AMBROŽIČ AVGUŠTIN, Jerneja (supervisor)/TURK, Martina (co-supervisor)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Biology
PY 2016
TI ISOLATION AND GENOTYPISATION OF SALMONELLA ENTERICA FROM
CAPTIVE REPTILES
DT Graduation thesis (University studies)
NO IX, 57 p., 8 tab., 13 fig., 2 ann., 65 ref.
LA sl
AL sl/en
AB Reptiles are becoming increasingly popular in recent years as pets, and they are
often used as a teaching aid in schools. They are often cited as potential carriers of
salmonella, so working with them requires caution and proper hygiene. In surveyed
reptiles salmonella was confirmed in 42.4% of the animals. The most infected were
lizards (58.8%), followed by snakes (42.9%), while in turtles they were not
identified. Most of the isolates belonged to Salmonella enterica subsp. enterica, in
four cases Salmonella enterica subsp. arizonae was isolated. Thirty-three percent of
salmonella strains were resistant against the tested antimicrobials, majority to
streptomicin. We also verified the presence of genes for beta-lactamases and
quinolone resistance genes (qnr). Although there were two isolates resistant to
ampicillin, we did not confirm the presence of bla genes and qnr genes. In
salmonella strains from reptiles we also confirmed the presence of genes for
virulence factors (invA, spoB, sifA, spvC), of which 92.3% strains contained invA.
The majority of strains contained two or three of the tested genes for virulence
factors. Due to the presence of virulence factors salmonella strains from reptiles are
potentially pathogenic for humans. To prevent transmission of salmonella, we must
pay attention to proper hand hygiene and equipment for reptile handling. Moreover,
young children, people with weakened immune systems and the elderly should
avoid all contact with reptiles.
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
V
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA.…………………………………….III
KEY WORDS DOCUMENTATION……………………………………………………....IV
KAZALO VSEBINE………………………………………………………………………...V
KAZALO TABEL…………………………………………………………………………VII
KAZALO SLIK…………………………………………………………………………...VIII
KAZALO PRILOG…………………………………………………………………………IX
1 UVOD ................................................................................................................................ 1
1.1 NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE................................................................................................ 2
2 PREGLED OBJAV .......................................................................................................... 3
2.1 UPORABA ŽIVALI V UČNE NAMENE ................................................................................................... 3
2.1.1 Plazilci v izobraževanju in kot hišni ljubljenčki ................................................................ 3
2.2 ZNAČILNOSTI PLAZILCEV .................................................................................................................... 5
2.3 ZDRAVSTVENA TVEGANJA PRI ŽIVALIH - ZOONOZE...................................................................... 6
2.3.1 Zoonoze plazilcev ....................................................................................................................... 6
2.3.1.1 Mikobakterioza in klamidofiloza ................................................................... 6
2.3.1.2 Okužbe z aeromonasi in pseudomonasi ......................................................... 7
2.3.1.3 Salmoneloza ................................................................................................... 7
2.3.1.3.1 Pogostost okužb s salmonelo pri plazilcih in njen prenos na človeka ....... 7
2.3.1.3.2 Preprečevanje prenosa okužb na človeka ................................................. 10
2.4 BAKTERIJE RODU SALMONELLA ........................................................................................................ 10
2.4.1 Klasifikacija ............................................................................................................................... 11
2.4.2 Virulentni dejavniki .................................................................................................................. 12
2.4.3 Odpornost proti antibiotikom................................................................................................ 13
2.4.3.1 Odpornost proti beta-laktamskim antibiotikom in kinolonom ..................... 14
3 MATERIAL IN METODE ............................................................................................ 16
3.1 IZOLACIJA BAKTERIJ RODU SALMONELLA IZ PLAZILCEV ............................................................ 16
3.1.1 Vzorci ........................................................................................................................................... 16
3.1.2 Načrt dela ................................................................................................................................... 16
3.1.2.1 Predbogatitev ................................................................................................ 18
3.1.2.2 Bogatitev ...................................................................................................... 18
3.1.2.3 Selektivna izolacija salmonel v čisti kulturi ................................................. 20
3.2 IDENTIFIKACIJA BAKTERIJ RODU SALMONELLA IZ PLAZILCEV .................................................. 21
3.2.1 Fenotipska identifikacija z biokemijskimi testi ................................................................ 22
3.2.2 Genotipska identifikacija na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S rRNA 27
3.3 UGOTAVLJANJE ODPORNOSTI SALMONEL PROTI IZBRANIM ANTIBIOTIKOM ......................... 29
3.3.1 Difuzijski antibiogram po Kirby-Bauerju .......................................................................... 29
3.3.2 Inkorporacijski antibiogram.................................................................................................. 30
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
VI
3.4 GENOTIPSKA METODA ZA UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI BETA-LAKTAMAZ Z RAZŠIRJENIM
SPEKTROM DELOVANJA (ESBL) SKUPINE CTX-M IN GENOV ZA PLAZMIDNO POSREDOVANO
KINOLONSKO REZISTENCO (PMQR) SKUPINE QNR ..................................................................... 30
3.4.1 Pomnoževanje genov beta-laktamaz z razširjenim spektrom delovanja skupine
CTX-M (blaCTX-M) ..................................................................................................................... 30
3.4.2 Pomnoževanje genov za plazmidno posredovano kinolonsko rezistenco (PMQR)
skupine QNR................................................................................................................................. 31
3.5 UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI NEKATERIH VIRULENTNIH DEJAVNIKOV PRI IZOLATIH
SALMONEL IZ PLAZILCEV .................................................................................................................. 33
4 REZULTATI .................................................................................................................. 35
4.1 PRISOTNOST VRST IZ RODU SALMONELLA PRI PLAZILCIH ............................................................ 35
4.2 ODPORNOST IZOLIRANIH SEVOV PROTI IZBRANIM ANTIBIOTIKOM ......................................... 39
4.2.1 Prisotnost genov ESBL skupine CTX – M in PMQR skupine QNR ........................... 41
4.3 PRISOTNOST IZBRANIH VIRULENTNIH DEJAVNIKOV ................................................................... 44
5 RAZPRAVA IN SKLEPI .............................................................................................. 47
5.1 RAZPRAVA ............................................................................................................................................. 47
5.1.1 Prisotnost bakterij rodu Salmonella pri plazilcih ........................................................... 47
5.1.2 Odpornost salmonel proti antibiotikom in prisotnost virulentnih dejavnikov ........ 48
5.2 SKLEPI .................................................................................................................................................... 50
6 POVZETEK .................................................................................................................... 51
7 VIRI ................................................................................................................................. 52
ZAHVALA
PRILOGE
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
VII
KAZALO TABEL
str.
Tabela 1: Univerzalni bakterijski oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje
gena za 16S rRNA. ................................................................................................... 27
Tabela 2: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov ESBL skupine
CTX – M (blaCTX-M) ................................................................................................. 31
Tabela 3: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov qnr. .................... 32
Tabela 4: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov izbranih
virulentnih dejavnikov. ............................................................................................ 33
Tabela 5: Rezultati biokemijskih testov za salmonelo in sorodne vrste ................................ 37
Tabela 6: Rezultati izbranih biokemijskih testov za izolate salmonel iz plazilcev. ................. 38
Tabela 7: Rezultati odpornosti salmonel iz plazilcev proti izbranim antibiotikom ................. 40
Tabela 8: Prisotnost izbranih virulentnih dejavnikov pri salmonelah iz plazilcev. ................. 44
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
VIII
KAZALO SLIK
str.
Slika 1: Kolonije bakterije Salmonella enterica subsp. enterica na selektivnem gojišču XLD.
(Foto: M. Farkaš) ........................................................................................................ 11
Slika 2: Odvzem brisa iz kloake pri kraljevem pitonu (Foto: M. Turk) .................................. 16
Slika 3: Predbogatitev vzorcev iztrebkov v gojišču BPW (epruvete na levi) in bogatitev
vzorcev v gojišču MKTT (epruvete na desni) (Foto: M. Turk) ................................. 19
Slika 4: Mešana kultura s kolonijami potencialnih salmonel na selektivnih in diferencialnih
trdnih gojiščih XLD (levo, rožnate kolonije s črnim centrom) in SSA (desno,
prosojne kolonije s črnim centrom). ........................................................................... 21
Slika 5: Razmerje med številom okuženih (pozitivni) in neokuženih (negativni) živali s
salmonelo pri posameznih skupinah testiranih plazilcev. .......................................... 35
Slika 6: Razmerje med številom okuženih (pozitivni) in neokuženih (negativni) živali s
salmonelo pri posameznih skupinah testiranih plazilcev primerjalno med zasebnimi
gojitelji in izobraževalnimi ustanovami. .................................................................... 36
Slika 7: Razmerje med številom okuženih (pozitivni) in neokuženih (negativni) živali s
salmonelo pri posameznih skupinah testiranih plazilcev primerjalno med
posameznimi zasebnimi gojitelji in izobraževalnimi ustanovami. ............................. 36
Slika 8: Primer difuzijskega antibiograma po Kirby-Bauerju pri sevu salmonele z oznako
EXB L373 (Foto: M. Farkaš) ..................................................................................... 39
Slika 9: Agarozni gel po elektroforezi z nanešenimi pomnožki PCR za ugotavljanje
prisotnosti genov beta-laktamaz (ESBL) skupine CTX – M...................................... 42
Slika 10: Agarozni gel po elektroforezi z nanešenimi pomnožki PCR za ugotavljanje
prisotnosti genov qnr pri izbranih sevih salmonel iz plazilcev. ................................. 43
Slika 11: Prisotnost izbranih virulentnih dejavnikov pri salmonelah iz plazilcev. .................. 45
Slika 12: Število sevov salmonel iz plazilcev, ki vsebujejo določeno število virulentnih
dejavnikov. ................................................................................................................. 46
Slika 13: Prikaz prisotnosti izbranih virulentnih dejavnikov (v odstotkih) glede na vrsto
plazilca iz katerega je bila izolirana salmonela. ......................................................... 46
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
IX
KAZALO PRILOG
str.
Priloga 1: Seznam plazilcev, vključenih v analizo za prisotnost salmonele. ........................... 58 Priloga 2: Delna nukleotidna zaporedja gena za 16S rRNA izolatov salmonel iz plazilcev. .. 61
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
1
1 UVOD
Živali so se v šolah sprva uporabljale kot demonstracijski material ali za seciranje
(Balcombe, 2000). S spremembami učnih načrtov pa se je spremenil tudi namen in
pogostost uporabe živali v šolah (McGriffin, 1980). Prav otroštvo je ključno obdobje za
razvoj zavesti in pozitivnega odnosa do živali, ki je pomemben za ohranjanje biotske
raznovrstnosti (Ballouard, 2011).
V izobraževalnih ustanovah so med najpogosteje gojenimi živalmi predvsem glodavci
(miši, skakači, hrčki), ribe, žuželke (paličnjaki) in plazilci (želve, kače, kuščarji). Plazilci
pa so v zadnjem času zelo priljubljeni tudi kot hišni ljubljenčki, oziroma domače živali.
Vse naštete živali so lahko vir okužb s patogenimi mikroorganizmi, zato je potrebna
previdnost pri rokovanju z njimi. Med najbolj pomembne zoonoze (bolezni, ki se prenašajo
z živali na ljudi) uvrščamo antraks, brucelozo, mikrosporijo, listeriozo, tuberkulozo,
salmonelozo in še nekatere druge zoonoze (Ebani in Fratini, 2005).
Po navedbah Uprave za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin RS (UVHVVR, 2013)
so najpogostejše povzročiteljice zoonoz pri ljudeh bakterije rodov Campylobacter in
Salmonella. Pri živalih se lahko te bolezni pojavljajo brez specifičnih zunanjih znakov,
pogosto pa so te bakterije tudi normalni prebivalci njihove črevesne mikrobiote, zato je
njihovo prisotnost težko ugotoviti. Za človeka pa lahko te živali predstavljajo vir okužbe.
Vir okužbe s salmonelo je najpogosteje uživanje kontaminiranih živil ali pa stik z
obolelimi živalmi.
Tudi pri ljudeh je veliko okužb brez kliničnih znakov, ali pa so v blagih oblikah, bolezen
mine sama v nekaj dnevih. Znaki so driska, slabost, bolečine v trebuhu in povišana telesna
temperatura. Smrtnost je manj kot 1% (UVHVVR, 2015; Hollinger 2000).
Vse pogosteje se kot prenašalci salmonele na človeka omenjajo tudi plazilci, ki jih imajo
ljudje za domače živali (Pedersen s sod. 2009; Ebani in Fratini 2005; de Jong s sod. 2005).
Primarno se bakterije nahajajo v prebavnem traktu živali, preko iztrebkov pa se okužba
lahko prenese tako na druge živali, kot tudi na človeka. Čeprav se plazilci omenjajo kot
prenašalci salmonel, je v literaturi le malo podatkov o patogenosti teh sevov, torej o
prisotnosti genov z zapisi za virulenčne dejavnike, ki omogočajo okužbo ter širjenje in
razmnoževanje salmonele v gostitelju (Ibarra in Steele-Mortimer, 2009). Tudi podatkov o
odpornosti salmonel, ki jih najdemo pri plazilcih, proti različnim antibiotikom je zelo malo
(Ebani s sod., 2005; Corrente s sod., 2004). S poznavanjem prisotnosti genov za virulenčne
dejavnike bi lahko primerjali seve, izolirane iz plazilcev s sevi, izoliranimi iz obolelih
ljudi, in tako ugotavljali njihov patogeni potencial.
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
2
1.1 NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE
Namen diplomske naloge je bil izolirati bakterije rodu Salmonella pri plazilcih, ki živijo v
ujetništvu. Za analizo smo iztrebke plazilcev ali brise njihove kloake zbirali v šolah in
izobraževalnih ustanovah, ki imajo terarije s plazilci, ter tudi pri zasebnih gojiteljih.
Poskusili smo ugotoviti, kolikšen del preučevanih živali je bil okužen s salmonelo. Pri
izoliranih sevih salmonel smo se osredotočili na ugotavljanje prisotnosti nekaterih genov,
ki nosijo zapise za virulenčne dejavnike. Preverjali pa smo tudi odpornost sevov proti
izbranim antibiotikom in poskušali ovrednotiti patogenost salmonel iz plazilcev za
človeka.
Delovne hipoteze:
1. Bakterije iz rodu Salmonella so zelo pogoste bakterije v prebavilih plazilcev.
2. Sevi salmonel, izoliranih iz plazilcev so občutljivi za testirane antibiotike, imajo pa
gene za določene virulenčne dejavnike in so tako lahko patogeni za ljudi.
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
3
2 PREGLED OBJAV
2.1 UPORABA ŽIVALI V UČNE NAMENE
Biologija je veda o življenju, zato bi se morala tudi ukvarjati z živimi organizmi, vendar je
bil poudarek klasične biologije v šolah predvsem na sistematiki in morfologiji, kjer so se
uporabljali na različne načine preparirani organizmi (McGriffin, 1980). Živali so se v šolah
uporabljale že od nekdaj, kot demonstracijski material, ali pa so učenci sami secirali mrtve
živali (Balcombe, 2000). Posledično učenci v mnogih šolah nikoli niso prišli v stik z živimi
organizmi. V zadnjih desetletjih pa je prišlo do sprememb v učnih načrtih in s tem do večje
uporabe živali v šolah (McGriffin, 1980). Kot navaja Balcombe (2000) je to spodbudilo
učence, da so izvajali vaje in znanstvene raziskave. Težava pa se je pojavila, ker so se pri
tem živali pogosto poškodovale. Zelo znani so na primer poskusi na živih žabah. Zaradi
porasta učnih ur, kjer so se izvajali takšne vrste poskusi, je bila javnost močno zaskrbljena.
Uvedli so pravila, ki so prepovedala poskuse na sesalcih, ptičih, plazilcih, dvoživkah in
ribah, ki bi lahko živalim povzročali bolečino ali pa bi bili škodljivi za njihovo zdravje.
V Sloveniji rejo in gojitev živali v šolah urejata Zakon o veterinarskih merilih (Ur. list, št.
93/05) in Zakon o zaščiti živali (Ur. list, št. 16/07). Vsaka reja ali gojitev mora izpolnjevati
predpisane pogoje glede prostorov, namestitve, oskrbe in zdravstvenega varstva živali.
Osnovne in srednje šole, ki začasno zadržujejo ali redijo živali, morajo določiti
oskrbovalca živali, ki je zadolžen za oskrbo živali. Živali morajo biti pod rednim
nadzorom, zagotovljeno morajo imeti ustrezno bivališče, hrano in vodo. Pomembna pa je
tudi svoboda gibanja in mikroklimatski pogoji.
Živali v osnovnih in srednjih šolah so namenjene opazovanju, drugi posegi in poskusi na
živalih pa so prepovedani (Ornik, 2007).
Živali se pri učnih urah uporabljajo iz več razlogov. Prvi je gotovo ta, da učenci lahko
vidijo ali občutijo živali iz različnih skupin. Na primer, da lahko občutijo kačo in spoznajo,
da ni sluzasta in mrzla, temveč presenetljivo suha, njeno telo pa ima sobno temperaturo.
Drugi razlog je razumevanje obnašanja živali, kar najlaže dosežemo z opazovanjem. Živali
v šoli pa imajo tudi pomembno vlogo pri razvijanju odgovornosti (McGriffin, 1980).
Tudi Tomažič I. (2008) ugotavlja pomen neposredne izkušnje z živaljo na spremembo
odnosa do živali in znanja o njej. V raziskavi, v katero so bili vključeni učenci sedmih
razredov je bilo ugotovljeno, da lahko z neposredno izkušnjo učenci pridobijo več znanja,
prav tako pa je bil potrjen pozitiven vpliv na znižanje intrapersonalnih ovir ob stiku z
živalmi. Kot pravi Lačen (2009) je narava najboljši vir informacij, zato se učitelji
velikokrat odločajo za opazovanje in tudi gojenje živali v razredu. V raziskavi je potrjeno,
da ima uporaba živih živali v razredu pozitivne učinke. Izboljša se dojemanje in
spoznavanje lastnosti živali.
2.1.1 Plazilci v izobraževanju in kot hišni ljubljenčki
Hišne živali so živali, ki se vzrejajo, redijo ali gojijo za družbo, rekreacijo ali pomoč
človeku, njihov skrbnik pa mora poskrbeti za dobro počutje živali, jim nuditi primerno
namestitev, hrano in vodo (Uradni list RS, 2009).
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
4
Ljudje se za hišne živali odločajo iz različnih razlogov, dokazan pa je ugoden učinek na
zdravje ljudi, ki imajo pozitivne izkušnje z živalmi. Pri odločitvi za vrsto živali je
pomembno, da razmislimo, kakšno vlogo bo žival imela v našem življenju, kakšen
življenjski stil imamo in koliko časa se bomo posvečali živali (Radford, 2011).
Eksotične živali, med katere štejemo tudi plazilce, so v današnjem času zelo priljubljene.
Predstavljene so v trgovinah za male živali, pojavljajo se v filmih in reklamah (Case,
21.7.2016).
Melissa Kaplan (1997a) opozarja, na kaj vse moramo biti pozorni, oziroma o čem vse
moramo razmisliti, preden se odločimo za nakup plazilca. Večina plazilcev ima zelo
specifične potrebe glede hrane, prav tako pa tudi glede okolja, oziroma bivališča, ki se
mora čimbolj približati razmeram v njihovem naravnem okolju (vlaga, toplota). Veliko
otrok in tudi odraslih ljudi se po začetnem navdušenju kmalu naveliča skrbeti za žival,
sploh če jim ta vzame več časa, kot so ob nakupu predvidevali, zato je pomembno, da se
zavedamo trajne obveze do živali. Žival lahko tudi zraste in preraste terarij. Pred nakupom
se je o željeni vrsti plazilca dobro čim bolj podučiti, ter pomisliti tudi na to, da bo žival
morda potrebovala veterinarsko oskrbo, ki je v naši bližini ni. Svojo vlogo pri odločitvi za
vrsto plazilca ima tudi cena živali, zato je potrebno že v začetku razmisliti, koliko denarja
smo pripravljeni vložiti, ne samo za žival, ampak tudi njeno bivališče in hrano. Pri hrani
velja omeniti tudi to, da je potrebno nekatere vrste plazilcev hraniti z živim plenom.
Strokovnjaki ocenjujejo, da od 50-90% plazilcev umre že v prvem letu ujetništva, velik
odstotek že med transportom. Kasneje pa zaradi nepoznavanja potreb živali ali odrekanja
veterinarske oskrbe. Od vseh vrst živali, ki jih ljudje imamo za hišne ljubljenčke, so
plazilci edini, ki v ujetništvu ne dočakajo višje starosti kot v svojem naravnem okolju
(Kaplan, 1997a).
Plazilci se uporabljajo tudi v izobraževalne namene, pri tem pa se srečujemo z enakimi
težavami, kot pri uporabi ostalih vrst, saj plazilci niso nič bolj, oziroma nič manj nevarni
od ostalih vrst. Prav tako so nekateri bolj primerni, drugi manj. Res pa je, da lahko z
uporabo plazilcev v izobraževanju vplivamo na razširjen negativen pogled nanje (Kaplan,
1997b).
Glede plazilcev (predvsem kač) ima veliko otrok predsodke, vezane na strah in gnus, kljub
temu pa jih večina ljudi, ki obišče vivarij, želi videti od blizu (Tomažič K., 2008).
Pri uporabi plazilcev v izobraževalne namene pri učencih prihaja do osebne rasti in
razvoja. Učenci poleg dejstev o plazilcih, klasifikaciji, ekologiji in obnašanju živali uvidijo
tudi, kakšno vlogo ima žival v ekosistemu. Učenci so predvsem sposobni sprejeti več bolj
kompleksnih informacij. S tem, ko učenec premaga strah, da se živali tudi dotakne, gradi
tudi svojo samozavest in samospoštovanje (Kaplan, 1997b).
Cilj učenja s plazilci pa je predvsem doseči, da plazilci niso strašni plenilci, ter da si žival
ne glede na to, ali je hladnokrvna ali toplokrvna zasluži spoštovanje, ter da je pomembno
ohranjanje vseh živalskih vrst in njihovih ekosistemov. Izobraževanja lahko potekajo v
različnih okoljih, šolah, parkih in knjižnicah. Vse pogosteje pa se izobraževanje povezuje z
zabavo (npr. rojstnodnevna zabava). Na takšnih srečanjih so predstavljene značilnosti
plazilcev, razmnoževanje, prehrana in njihovo naravno okolje. Živali za razstave morajo
biti dobro prilagojene na ujetništvo, nekatere morajo biti navajene na dotike, predvsem pa
je pomembno, da so zdrave (Kaplan, 1997b).
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
5
2.2 ZNAČILNOSTI PLAZILCEV
Plazilci (razred Reptilia) so skupina štirinožnih vretenčarjev (oziroma so potomci
štirinožnih vretenčarjev), njihova telesna temperatura se prilagaja okolju (poikilotermni
organizmi). So prvi kopenski vretenčarji, ki so neodvisni od življenja v vodi, tudi razvoj
zarodkov poteka v celoti na kopnem (Mršić, 1997).
Plazilci, z izjemo želv, imajo podaljšano telo z okončinami ali brez njih. Jasno je izražen
vratni del telesa, na hrbtenici pa so lepo razvidne posamezne regije telesa (vratna, hrbtna,
ledvena, križna, repna). Pri kačah, ki nimajo okončin, je prišlo do sprememb v telesnih
regijah. Telo plazilcev je zaradi življenja na kopnem zaščiteno z močnim slojem
poroženelih in roženih celic na površini povrhnjice, prav tako pa imajo vsi plazilci tudi
okostenine v usnjici. Kožne tvorbe (nameščenost in oblika tvorb) so pomemben
taksonomski znak za določanje vrste in pripadnost posameznim skupinam. Koža plazilcev
je tudi brez žlez, izjema so kuščarji, pri katerih so žleze nameščene na zadnjih nogah,
močneje pa so razvite pri samcih. Poroženela plast kože se stalno obnavlja, kjer se odmrli
vrhnji sloj ob levitvi odlušči (Tome, 2003).
Na glavi plazilcev so dobro razvite oči z vekami, ki so pri kačah in gekonih zrasle v
prozorno veko, ki popolnoma prekriva oko.
Želve in kuščarji (z izjemo slepcev) imajo dobro razvite okončine, ki so pri morskih želvah
preoblikovane v plavuti. Na nogah je po pet prstov z močnimi kremplji. Slepci še imajo v
telesu ostanke oplečja in okončin, pri kačah pa so okončine popolnoma pokrnele.
Spolni dimorfizem se pri plazilcih kaže predvsem v velikosti in obarvanosti telesa, samice
pa so praviloma večje od samcev (Mršić, 1997).
Plazilci imajo nestalno telesno temperaturo, ki je odvisna od temperature okolja. Če se
temperatura v okolju zniža pod določeno mejo otrpnejo, kar pomeni, da se preneha vsako
gibanje, upočasnjeni pa so tudi ostali življenjski procesi. Razširjeni so po vsem svetu, z
izjemo severnega in južnega tečaja, ter nad nadmorsko višino 3500 m. Največ vrst pa živi
v tropskih krajih (Mršić, 1997). V Sloveniji živi 22 avtohtonih vrst plazilcev in 1
neavtohtona vrsta (želva vrste Trachemys scripta, kamor spadata rdečevratka in
rumenovratka) (Krofel, 2009).
Na svetu najdemo več kot 6550 živečih vrst plazilcev, ki jih uvrščamo v 4 rede, 48 družin
in 905 rodov (Mršič, 1997; Tome, 2003).
RED PODRED
želve (Testudines) kritovratke (Cryptodira)
vijevratke (Pleurodira)
luskarji (Squamata) kuščarji (Sauria)
kolutniki (Amphisbaenia)
kače
prakuščarji (Rhynchocephalia)
krokodili (Crocodylia)
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
6
2.3 ZDRAVSTVENA TVEGANJA PRI ŽIVALIH - ZOONOZE
Zoonoze so bolezni oziroma infekcije, ki se po naravni poti neposredno ali posredno
prenašajo od živali na ljudi. Do okužbe lahko pride z neposrednim stikom z okuženo
živaljo, zaužitjem kontaminirane hrane, lahko pa tudi s posrednim stikom iz
kontaminiranega okolja (Uprava RS za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin, 2015).
V Sloveniji, kjer v programu spremljanja zoonoz in povzročiteljev zoonoz sodeluje več
institucij (Uprava za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin RS, Zdravstveni
inšpektorat RS in Nacionalni inštitut za javno zdravje), se spremljanje izvaja pri živalih,
živilih živalskega izvora, živilih neživalskega izvora in krmi za živali.
Že Pačnik (2008) navaja, da se veterinarji v vsakodnevni praksi pogosto srečujejo z
eksotičnimi živalmi, med katere uvrščamo ptice, male sesalce, plazilce, dvoživke in tudi
druge vrste, njihovo število pa se je v zadnjih letih zelo povečalo. Ptice so lahko prenašalci
bakterije Chlamydophila psitaci. Simptomi okužbe pri ljudeh so podobni simptomom
gripe, bolezen pa lahko napreduje v hudo pljučnico z možnimi drugimi zapleti. Ljudje se
lahko okužijo tudi z bakterijami iz rodu Salmonella sp., pogoste pa so tudi okužbe z
mikobakterijami vrste Mycobacterium avium. Med malimi sesalci, kamor veterinarji
uvrščajo kunce, morske prašičke, činčile, podgane in druge, so zoonoze zelo številne.
Pogoste so različne glivične okužbe, pojavljajo pa se tudi kampilobakterioza, salmoneloza,
listerioza in druge bolezni.
Tudi plazilci so mnogokrat prenašalci različnih mikrobov, povzročiteljev zoonoz.
2.3.1 Zoonoze plazilcev
V zadnjih letih narašča število plazilcev, ki jih ljudje gojijo kot domače živali.
Najpogostejše so želve, pogosti pa so tudi kuščarji in kače. Te živali so lahko videti
povsem zdrave, vendar so lahko prenašalci različnih patogenov, ki pod stresnimi pogoji
povzročijo infekcijo pri živali, lahko pa pride tudi do prenosa mikrobov na človeka, sploh
če lastnik ni podučen o pravilni higieni in negi živali. S plazilcev na človeka se pogosto
prenašajo salmonele, mikobakterije, klamidije in klamidofile, ter aeromonasi in
pseudomonasi (Ebani in Fratini, 2005).
Tako bolane živali kot tiste brez simptomov okužbe, so pogosti prenašalci tudi drugih
bakterij. Mednje spadajo Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter
spp., Proteus spp., in druge (Ebani in Fratini, 2005).
2.3.1.1 Mikobakterioza in klamidofiloza
Bakterije rodu Mycobacterium so povzročiteljice mikobakterioz in so prisotne v vodi,
prahu in zemlji. Tam lahko plazilci pridejo v stik z njim. Plazilci imajo razvito naravno
odpornost proti mikobakterijam, saj se okužba pri njih pojavi zelo redko, oziroma šele
takrat, ko je njihov imunski sistem močno načet. Mikobakterije iz plazilcev so potencialno
patogene za ljudi, Mycobacterium chelonae in Mycobacterium fortuitum povzročata
predvsem bolezni pljuč, lahko pa tudi lokalne okužbe kože, osteomielitis, ter poškodbe
mehkega tkiva, Mycobacterium cansasii pa povzroča kronične pljučne bolezni podobne
pljučni tuberkulozi (Ebani in Fratini, 2005).
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
7
Klamidofilozo povzročajo obligatni intracelični paraziti, bakterije iz rodu Chlamydophila.
Bolezen je razširjena tako pri domačih kot divjih živalih, prisotna pa je tudi pri človeku,
pogosto kot atipična pljučnica. Bolezen je bila opažena pri hladnokrvnih živalih, vendar je
število okužb verjetno višje, kot navaja literatura, saj kronični znaki bolezni niso vidni, da
gre za okužbo živali s temi bakterijami pa ponavadi ugotovimo šele, ko žival pogine
(Ebani in Fratini, 2005).
2.3.1.2 Okužbe z aeromonasi in pseudomonasi
Bakterije iz rodov Aeromonas in Pseudomonas so po Gramu negativne bakterije, splošno
razširjene v okolju in so potencialno patogene za ljudi in živali. Velikokrat jih odkrijejo pri
živalih, ki imajo dermatitis, stomatitis, okužbo kloake, ušesno ali dihalno okužbo ter
ognojke(Ebani in Fratini, 2005).
2.3.1.3 Salmoneloza
Salmoneloze so bolezni, ki jih povzročajo bakterije rodu Salmonella. Plazilci se s
salmonelo lahko okužijo ob neposrednem stiku z drugo okuženo živaljo ali s hrano. Možna
je tudi okužba jajc skozi lupino. Pri želvjih jajcih npr. lahko salmonela že v roku ene ure
prodre iz zunanjosti v jajce. Bakterije se zadržujejo v prebavnem traktu živali, znaki
okužbe pa največkrat niso vidni, vse dokler pod stresnimi pogoji ne pride do izbruha
bolezni. Klinični znaki okužbe s salmonelo so lahko zelo različni. Salmonela lahko
povzroči septikemijo, pljučnico, abscese, hipovolemični šok ter smrt pri okuženih živalih
(Ebani in Fratini, 2005). Po podatkih je salmonela velikokrat izolirana tako iz plazilcev v
ujetništvu, kot iz prosto živečih. Živali, ki ne kažejo kliničnih znakov salmoneloze, ni
potrebno zdraviti. Če pa se okužene živali uporabljajo na razstavah ali so v stiku z otroki,
jih je potrebno umakniti, ni pa jih potrebno usmrtiti. Potrebno je le ustrezno zdravljenje
(Mitchell, 2001).
Mitchell (2001) prav tako navaja, da je bila salmonela prvič izolirana iz kuščarja vrste
Heloderma suspectum leta 1944, čeprav se navajajo tudi nepotrjene informacije iz leta
1939. V skupini petih kuščarjev vrste Heloderma suspectum so 4 živali umrle v roku 18 ur
do treh mesecev. V kači, najdeni na puranji farmi so prav tako potrdili prisotnost
salmonele, to pa je bil tudi prvi primer, kjer so bili prisotni kar trije različni serotipi
salmonel. Prvo poročilo o prisotnosti salmonele pri želvah je potrdilo prisotnost v jetrih,
vranici, pljučih in črevesju. O salmonelozi so poročali tudi iz krokodilje farme. Prizadete
živali so bile shirane, septikemija pa je privedla do smrti.
2.3.1.3.1 Pogostost okužb s salmonelo pri plazilcih in njen prenos na človeka
O prvem primeru prenosa okužbe s salmonelo iz želve na človeka so poročali že leta 1943,
pogostost prenosov pa je v naslednjih dvajsetih letih naraščala, težave pa so se pojavljale
predvsem pri otrocih. Od leta 1990 se je pogostost s plazilci povezanih okužb dramatično
zvišala, kar je posledica vse večje priljubljenosti plazilcev kot hišnih ljubljenčkov
(Mitchell, 2001).
Po ocenah Centrov za nadzor in preventivo CDC (Centers for Disease Control and
Prevention), se v Združenih državah Amerike vsako leto pojavi okrog 93 000 primerov
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
8
salmoneloze pri ljudeh, ki je povezana s plazilci ali dvoživkami (Center for Food security
& Public Health, 5.8.2016).
Želve, ter mnogi drugi plazilci, se v živalskih vrtovih lahko prosto gibljejo, saj niso nevarni
ljudem. Salmonela pa je zelo odporna in obstojna v okolju, lahko se indirektno prenaša in
povzroči okužbo. Znan je primer okužbe v Denverju, kjer je zbolelo veliko otrok, ki so
obiskali živalski vrt, okužili pa so se posredno, preko lesene ograde. Kot navaja Bauwens s
sod. (2006), so v živalskem vrtu v Antwerpnu v raziskavi zbrali vzorce iz iztrebkov
zdravih in bolnih plazilcev, pregledali pa so tudi vzorce iz okolja (ograde, kuhinja, javni
prostori). Potrjena je bila prisotnost salmonele v vzorcih iz okolja, prav tako pa so bili sevi
bakterije najdeni v 47 (47%) od 100 vzorcev iz iztrebkov. Od skupno 66 sevov, ki so bili
serotipizirani jih je 29 (43,9%) predstavljalo vrsto Salmonella enterica subsp. enterica, 3
(4,5) subsp. salamae, 29 (43,9) subsp. arizonae ali diarizonae, 4 (6,1%) subsp. houtenae,
pri 1 (1,5%) pa je prišlo do avtoaglutinacije. V istem obdobju so bili testirani tudi vzorci
plazilcev in ptic. Ob primerjavi rezultatov je bilo ugotovljeno, da se salmonela pogosteje
pojavlja pri hladnokrvnih živalih.
Od 91 vzorcev iz živalskega vrta v Rimu in vzorcev zasebnih gojiteljev, ki so bili testirani
z uporabo standardnega protokola za izolacijo salmonele iz hrane, jih je bilo kar 46
(50,5%) pozitivnih na salmonelo. S tem je bila potrjena visoka razširjenost sevov
salmonele pri plazilcih, zlasti pri kačah in kameleonih, nasprotno pa je bila pri želvah zelo
nizka. Večina serotipiziranih sevov je pripadala vrsti Salmonella enterica subsp. enterica
(Corrente s sod., 2004).
Kljub opozorilom nevarnosti salmoneloze pri ljudeh, ki se pojavlja kot posledica stika s
plazilci, število plazilcev gojenih v ujetništvu še vedno narašča. Vzorci iztrebkov in brisov
iz kloak, ki so bili zbrani v Braziliji, so v 39,1% vsebovali bakterije iz rodu salmonela
(Abalem de sá, Solari, 2001).
V Južni Ameriki (Francoska Gvajana) so bili zbrani vzorci prosto živečih plazilcev in
plazilcev iz ujetništva. V 23,2 % so živali bile okužene s salmonelo. Isti serotipi (64,3%)
pa so bili izolirani tudi pri obolelih ljudeh. Plazilci so lahko vir okužbe in predstavljajo
tveganje za javno zdravje, sploh če se ti pogosto pojavljajo v okolici hiš in živine. Nekateri
plazilci so tudi hrana ljudem, zato je higiena pri pripravi in higiena v kuhinjah zelo
pomembna (Gay, 2014). Tudi Ebani s sod. (2004) poroča o prisotnosti salmonele pri
plazilcih. V letih 2001 in 2002 so pri pregledu vzorcev, ki so bili zbrani v trgovini z
živalmi v Italiji v 23,93% ugotovili prisotnost sevov Salmonella enterica. Ta se je
največkrat pojavila pri kuščarjih (60,27% vseh pozitivnih živali).
Prisotnost salmonele v iztrebkih pri želvah je nižja v primerjavi s kuščarji in kačami. Od 38
pregledanih želv je bila salmonela potrjena le v enem primeru, medtem, ko je bilo s
salmonelo okuženih kar 61% kuščarjev in 73,8% kač. Najpogostejša je bila Salmonella
enterica subsp. enterica, nato pa Salmonella enterica subsp. diarizonae, sta v svoji
raziskavi ugotovila Geue in Löschner (2002).
Živalski vrtovi imajo pogosto posebne oddelke, kjer potekajo delavnice in izobraževanja,
pri katerih obiskovalci pridejo v stik s plazilci. Tako je tudi v živalskem vrtu v
Kopenhagnu. Plazilci so razdeljeni v dve skupini, glavno zbirko plazilcev in plazilce, ki so
namenjeni izobraževanju in rokovanju. Izmed vseh odvzetih vzorcev iz kloak plazilcev
(obe skupini) je bilo 35% živali pozitivnih za salmonelo. Največ ravno na oddelku, kjer s
plazilci pridejo v stik tudi obiskovalci. Največ je bilo okuženih kač, sledile so želve,
najmanj okuženih osebkov pa je bilo med kuščarji. Izmed vseh serotipiziranih salmonel je
prevladovala Salmonella enterica subsp. diarizonae (Hydeskov s sod., 2013).
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
9
Pasmans s sod. (2005) se je v raziskavi osredotočil na kuščarje v ujetništvu. Pregledali so
iztrebke in brise iz kloak kuščarjev zasebnih gojiteljev, trgovin s plazilci in iz zoološkega
inštituta. Med vzorci, pridobljenimi z brisi, je bilo za salmonelo pozitivnih 62,5%, med
vzorci iz iztrebkov pa je bil odstotek salmonele še višji 75,8 %. Vsi serotipi salmonel so
predstavljali vrsto Salmonella enterica, prevladovala je Salmonella enterica subsp.
enterica.
Med leti 1995 in 2006 so na Danskem pregledali plazilce živalskih vrtov, trgovin z
živalmi, nekaj pa je bilo tudi zasebnih gojiteljev. Ugotovitve potrjujejo potencialno
nevarnost okužb v živalskih vrtovih in tudi doma. Vsi izolati salmonele so pripadali vrsti
Salmonella enterica,, največ je bilo Salmonella enterica subsp. enterica, pogosti pa sta bili
tudi Salmonella enterica subsp. diarizonae in Salmonella enterica subsp. houtenae
(Pedersen s sod., 2009).
Pfleger s sod. (2003) je v raziskavo zajel 103 plazilce, pregledani pa so bili njihovi
iztrebki. Pri kačah je bila salmonela prisotna v 24%, pri kuščarjih v 17%, ter pri želvah v
3%. Med vsemi izoliranimi salmonelami je prevladovala Salmonella enterica subsp.
enterica. Ugotovil je da, četudi je odstotek za salmonelo pozitivnih živali nizek, te še
vedno predstavljajo tveganje, zato je pri rokovanju z njimi zelo pomembna higiena.
Po navedbah Mermina s sodelavci (2004), okužba s salmonelo pri ljudeh največkrat
povzroči drisko, lahko pa se pojavijo tudi hujše zdravstvene težave, kot sta sepsa in
meningitis, ki sta za dojenčke ali osebe z oslabljenim imunskim sistemom lahko smrtna.
Glavni vir okužbe so še vedno jajca in surovo meso. Pri preučevanju izbruhov bolezni pa
se je pokazala tudi povezava okužbe s salmonelo po direktnem ali posrednem stiku s
plazilci. Prav okužba preko plazilcev pogosteje pripelje do hospitalizacije. V letih 1996 in
1997 so bili v raziskavo vključeni ljudje, pri katerih je bila potrjena salmoneloza. Vsem so
bila postavljena vprašanja o morebitnem stiku s plazilci (lastništvo plazilca, obisk razstave,
trgovine z živalmi). S študijo je bilo v teh letih potrjenih kar 74 000 okužb, ki so bile
posledice stika s plazilci, okužbe pa so bile neposredne ali posredne, ker lahko salmonela
dolgo preživi v okolju, tudi do 6 mesecev v iztrebkih, ter 6 tednov v vodi.
Med leti 1994 in 1996 so v Kanadi opazili povečano število salmoneloz v povezavi s
plazilci. Že prej, med leti 1960 in 1970 pa je bilo opaziti porast z želvami povezane
salmoneloze, zaradi česar je takrat prišlo do spremembe zakonodaje in tudi do prepovedi
uvoza želv v Kanado. V obdobju med 1991 in 1996 je bilo opaženih veliko različnih
serotipov salmonel pri eksotičnih živalih, najpogosteje pri želvah in kuščarjih. V istem
obdobju so bili pregledani tudi vzorci pri ljudeh. Veliko serotipov je bilo enakih kot pri
eksotičnih živalih, prav tako pa so bili med izoliranimi serotipi tudi takšni, ki se praviloma
pojavljajo predvsem pri hladnokrvnih živalih (Woodward s sod.,1997).
Whitten s sod. (2015) v svoji študiji predstavlja s plazilci povezane okužbe. V anketnih
vprašalnikih, ki so služili kot pripomoček za nadaljne raziskave in ki so jih izpolnjevali s
salmonelo okuženi bolniki, so bila vključena tudi vprašanja v zvezi s plazilci (stik s
plazilci, prehrana plazilca). Med leti 1996 in 2011 je bilo skupno 3,5% okuženih ljudi, ki
so potrdili stik s plazilci. Največkrat so bili to kuščarji, nato kače, ali pa kombinacija več
plazilcev.
V zadnjih letih se je v Severni Ameriki in v Evropi povečalo število okužb ljudi, ki so v
povezavi z razstavami živali. Te so vedno pogostejša oblika razvedrila in tudi
izobraževanja, saj omogočajo neposreden stik z živalmi. Izbruhe največkrat povzročijo
poleg bakterije Salmonella enterica tudi Cryptosporidium parvum in Escherichia coli. Od
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
10
leta 1990 so bili v ZDA vsaj štirje večji izbruhi bolezni, ki so bili posledica razstave živali
(Keen, 2007).
2.3.1.3.2 Preprečevanje prenosa okužb na človeka
Odkrivanje in odpravljanje salmonele pri plazilcih ni dovolj učinkovita rešitev za
preprečevanje salmoneloze pri ljudeh. Do sedaj je bilo narejenih veliko poskusov, ki bi
preprečili širjenje salmoneloze pri plazilcih, vendar neuspešno. V perutninski industriji se
proti salmoneli uspešno uporablja cepivo, ki pa je brez učinka pri plazilcih. Do okužbe, ki
se prenese s plazilca na človeka ne more priti, če se človek zgolj dotakne plazilca, se pa
možnosti za okužbo povečajo, če z delom telesa, ki je bil v stiku s plazilcem sežemo v usta
(Gray, 2011).
Bauwens (2006) ugotavlja, da je potrebno izboljšati preventivne ukrepe, ter izpostavlja
pomen dobre higienske prakse, saj se s tem lahko zmanjša tveganje za prenos okužb.
Mnogo ljudi še vedno misli, da se s salmonelo lahko okužijo le preko hrane, ne vedo pa, da
je prenos okužbe možen tudi z želvami in kuščarji, ter preko njihove hrane. CDC (2016)
opozarja, da si je po rokovanju s plazilci, stikom z njihovim terarijem ali hrano vedno
potrebno umiti roke. Pomembno je tudi, da otroci, mlajši od pet let, ljudje z oslabljenim
imunskim sistemom, ter odrasli nad petinšestdeset let ne rokujejo s plazilci, saj je pri njih
povečano tveganje za okužbo (Radford, 2011). Paziti je potrebno tudi pri stiku s hrano za
plazilce ali z njihovimi terariji, če plazilce kopamo je pomembno, da pri tem ne
uporabljamo kuhinjskega korita ali umivalnika v kopalnici, temveč imamo v ta namen
posodo, ki je ne uporabljamo v druge namene. Plazilcev tudi ne poljubljamo ali si jih
stiskamo k obrazu, saj s tem povečamo tveganje za okužbo (CDC, 2016).
Pomembno je tudi, da plazilcem ne dovolimo prostih izhodov po kuhinji ali kopalnici, ter
da so naše živali zdrave, veterinarsko pregledane, imajo primerno hrano in oskrbo (Gray,
2011).
Veterinarji v zasebnih klinikah ali v zooloških inštitucijah imajo pomembno vlogo pri
preventivi in osveščanju. Lastniki plazilcev in obiskovalci živalskih vrtov pa morajo biti
obveščeni o možnostih tveganja pri rokovanju s plazilci (Mitchell, 2001).
2.4 BAKTERIJE RODU Salmonella
Bakterije rodu Salmonella so po Gramu negativne palčke, ki jih uvrščamo v družino
enterobakterij (razred gamaproteobakterij). Poimenovane so po ameriškem bakteriologu
Danielu Elmer Salmonu.
Velikost bakterije se giblje med 0,7 - 1,5 2,0 – 5,0 µm. Njene kolonije (slika 1) so
okrogle, velike od 2 – 4 mm. Bakterija je fakultativno anaerobna in gibljiva (s peritrihimi
flageli), ima fermentativni in respiratorni tip metabolizma (Garrity s sod., 2005).
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
11
Slika 1: Kolonije bakterije Salmonella enterica subsp. enterica na selektivnem gojišču XLD. (Foto: M.
Farkaš)
Bakterije so patogene tako za ljudi, kot za živali. Pri ljudeh povzročajo enterično mrzlico,
gastroenteritis in septikemijo (Garrity s sod., 2005).
Kot navaja Yan s sodelavci (2003) okužba s salmonelo največkrat mine brez večjih
zapletov, kljub temu pa se včasih (v manj kot 5% primerov) ne moremo izogniti uporabi
antibiotikov, predvsem pri rizičnih skupinah kot so starejši ljudje, bolniki po presaditvah
ali z oslabljenim imunskim sistemom in otrocih.
Habitat salmonel je omejen predvsem na prebavni trakt pri ljudeh in živalih. Njeno
prisotnost v vodi, hrani, ali okolju pa lahko razlagamo kot kontaminacijo z iztrebki.
Nekateri serovarji (serotipi) so omejeni na gostiteljske vrste, npr. serovar Salmonella
Abortusovis (povzroča splave) je omejen samo na ovce (Wray, 2000). Pri ljudeh so zelo
redko odkrite Salmonella enterica subsp. salmae, subsp. arizonae in diarizonae, se pa zelo
pogosto pojavljajo v prebavilih hladnokrvnih živali (Garrity s sod., 2005).
Pri plazilcih so pogosto ugotovljeni različni serotipi Salmonella enterica subsp. enterica,
poleg njih pa najdemo tudi bakterije Salmonella enterica subsp. salamae, S. enterica
subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica
subsp. indica, ter tudi Salmonella bongori. Salmonela se lahko prenaša na ljudi ali druge
živali preko iztrebkov. Okuženi ljudje so lahko prenašalci po več mesecev ali celo več kot
leto. Preko 90% plazilcev je lahko prenašalcev salmonele, do sedaj pa so pri enem osebku
izolirali kar pet različnih serotipov (The Center for Food Security & Public Health, 2013).
2.4.1 Klasifikacija
Sama klasifikacija salmonel v taksonomski sistem oziroma razdelitev rodu v posamezne
vrste je bila že večkrat revidirana in zna biti precej zavajajoča. Po Bergey-u (2005) je rod
sestavljen iz dveh vrst Salmonella bongori in Salmonella enterica, ta je razdeljena še v šest
podvrst, poimenovanih (ali oštevilčenih); enterica (I), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb),
houtenae (IV), indica (VI) in salamae (II). Poleg tega je v veljavi tudi še sistem razdelitve
(klasifikacijska shema po White – Kauffmann) v različne serotipe (serovare) glede na
imunske reakcije z antigeni; K- kapsularni antigen (tudi Vi), H – flagelarni antigen in O –
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
12
somatski antigen (zunanji polisaharidni del lipopolisaharidov v zunanji membrani po
Gramu negativnih bakterij).
Issenhuth – Jeanjean (2014) v dopolnitvi White – Kauffmann in Le Minorjeve sheme
poroča o 63 novih serovarih, ki so bili odkriti med leti 2008 in 2010. Vrsta Salmonella
bongori obsega 22 serovarov, Salmonella enterica pa 2637 serovarov, od tega jih 1586
pripada subsp. enterica, 522 subsp. salamae, 102 subsp. arizonae, 338 subsp. diarizonae,
76 subsp. houtenae ter 13 subsp. indica.
Tako je recimo eden od najpogostejših povzročiteljev salmoneloze pri ljudeh sev
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis, ki ga krajše označujemo kot
Salmonella Enteritidis. Salmonella Enteritidis je tudi najpogosteje izolirana iz jajc,
medtem, ko so s Salmonella Choleraesuis pogosto okuženi prašiči (Yan, 2003).
Serovari iz vrste Salmonella bongori so največkrat najdeni v okolju, pogosto pa so izolirani
tudi iz hladnokrvnih živali, medtem, ko se pri sesalcih in pri ljudeh zelo redko pojavijo
(Yan, 2003).
Leta 2004 je bila predlagana še tretja vrsta rodu Salmonella, S. subterranea (Shelobolina s
sod., 2004).
2.4.2 Virulentni dejavniki
Kot virulenco definiramo sposobnost organizma, da povzroči bolezen v določenem
gostitelju (Johnson, 1991). Salmonele vsebujejo veliko genov za virulenco. Mnogo teh
genov se nahaja na tako imenovanih otokih patogenosti (SPI – Salmonella pathogenicity
islands) na njihovem kromosomu. Otoki patogenosti imajo zapise za določene dejavnike
virulence, ki so ključni za patogenezo bakterije (Marcus s sod., 2000). Virulentni
dejavniki, ki so kodirani na SPI 1, so odgovorni za vstop bakterije v gostitelja, na SPI 2, 3
in 4 pa so zapisi za virulentne dejavnike, ki omogočijo razmnoževanje in preživetje
salmonele v gostitelju. Virulentni dejavniki, kodirani na SPI 5 se vključujejo v fazo vnetja.
Poleg kromosoma se geni za virulentne dejavnike nahajajo tudi na plazmidih, kjer najdemo
npr. gene spvRABCD. Produkte teh genov bakterije potrebujejo za rast in preživetje znotraj
makrofagov (Kastelec in Harlander, 2006).
Geni spv so pomembni za razmnoževanje bakterij v gostiteljskih celicah. Gen spvC se
nahaja na plazmidu povezanim z virulenco, njegov produkt ima fosfotreoninliazno
aktivnost. Lahko inaktivira z mitogenom-aktivirane protein kinaze (MAPK) Erk 1/2, JNK
in p38 v človeških celicah (Ibbara in Steele – Mortimer, 2009; Kaur in Jain, 2011).
Virulentni dejavniki, kodirani na SPI 1, so odgovorni za vdor salmonele v črevesne celice
in pojav driske. Na SPI 1 se nahajajo geni sipA, sipB, sopA, sopB, sopC, sopD, sopE, sptP
in invA. SopB je fosfoinozitid fosfataza, ki hidrolizira fosfatidilinozitol-3,4,5-trifosfat v
fosfatidilinozitol-3-fosfat, ter tako spodbuja reorganizacijo aktinskega citoskeleta,
izločanje Cl- in preoblikovanje plazmaleme gostiteljske celice (Ibbara in Steele –
Mortimer, 2009; Kaur in Jain, 2011). Produkt gena invA pa je strukturni protein
sekrecijskega sistema tipa III (T3SS1), ki je vključen v vdor salmonele v celice črevesnega
epitelija (Hur s sod., 2011).
Na SPI 2 so geni spiC, sseF, sseG, sifA, sifB in drugi, ki omogočajo preživetje salmonele v
gostiteljski celici in sistemske okužbe. SifA je potreben za integriteto membrane
salmonele-vsebujoče vakuole (SCV; Salmonella-containing vacuole) in za tvorbo s
salmonelo-induciranih filamentov (SIF). Tvorba teh je nujna za razmnoževanje salmonele
v gostiteljski celici (Kaur in Jain, 2011).
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
13
2.4.3 Odpornost proti antibiotikom
Antibiotiki so naravne učinkovine, ki jih proizvajajo glive ali bakterije. Na
mikroorganizme delujejo tako, da zavirajo njihovo rast in razmnoževanje, delujejo
bakteriostatično, ali povzročijo propad celice oziroma imajo baktericidno delovanje. S
pojmom protimikrobna učinkovina pa označujemo tako naravne, kot tudi sintetične snovi,
ki prav tako delujejo bakteriostatično ali baktericidno. Danes se izraza velikokrat ne
ločujeta več, predvsem v splošni rabi se uporablja izraz antibiotik, tudi kadar govorimo o
sintetičnih snoveh (Madigan in Martinko, 2006; Reeves, 2012).
Antibiotike delimo v več skupin, npr. aminoglikozidi, beta-laktamski antibiotiki,
tetraciklini, kinoloni in drugi. Streptomicin se uvršča med aminoglikozidne antibiotike, ki
se vežejo na ribosomsko podenoto 30S. Tudi tetraciklin deluje baktericidno tako, da
inhibira sintezo proteinov z vezavo na ribosomsko podenoto 30S. Kloramfenikol pa se
veže na ribosomsko podenoto 50S. Beta-laktamski antibiotiki se na podlagi njihove
kemijske strukture nadalje delijo v skupine, vsem pa je skupen beta-laktamski obroč in
delovanje – zavirajo sintezo celične stene. Delimo jih na peniciline (npr. penicilin,
ampicilin), cefalosporine (npr. ceftazidim, cefotaksim), karbapeneme (npr. imipenem,
ertapenem), monobaktame (npr. aztreonam) in inhibitorje beta-laktamaz (npr. klavulanska
kislina). Uporabljajo se tako v veterini, kot v medicini. Kinoloni so skupina sintetičnih
antibiotikov, glede na razvoj jih delimo v štiri generacije, predstavnik prve generacije je na
primer nalidiksična kislina, druge generacije pa norfloksacin in v humani medicini
najpogosteje uporabljan kinolon ciprofloksacin. Tako kot beta-laktamski antibiotiki se tudi
kinoloni uporabljajo v veterini in medicini, zavirajo pa delovanje topoizomeraz tipa II
(DNA-giraze pri Gram-negativnih bakterijah, topoizomeraze IV pri Gram-pozitivnih
bakterijah). Fluorokinoloni (pogosto uporabljen je ciprofloksacin), uspešno delujejo proti
Gram – negativnim bakterijam (npr. Escherichia coli, Enterobacter, Salmonella) (Reeves,
2012).
Odpornost bakterij proti protimikrobnim sredstvom ni fenomen našega stoletja ali
posledica industrializacije, temveč gre za naraven ekološki pojav, v katerem
mikroorganizmi tekmujejo med sabo, kar je privedlo tudi do razvoja obrambnih
mehanizmov. Kot pravi Helmuth (2000) antibiotiki, ki so danes v uporabi, vplivajo tako na
biokemijske, kot tudi na fiziološke procese v prokariontskih celicah. S splošno uporabo
protimikrobnih sredstev je bil pojav odpornosti opažen skoraj pri vseh bakterijskih vrstah
in proti vsem sredstvom, ki so na voljo (Helmuth, 2000). Problem odpornosti bakterij proti
antibiotikom se v zadnjih letih povečuje in predstavlja večje tveganje za javno zdravje.
Med leti 1989 in 1990 je bilo kar 29% izolatov salmonel odpornih proti vsaj eni
protimikrobni učinkovini. Pri salmoneli je zaskrbljujoč tudi podatek o večkratni
odpornosti, ki je bila opažena proti ampicilinu, kloramfenikolu, streptomicinu in
tetraciklinu (Yan s sod., 2003).
Znani so različni načini, s katerimi si bakterije zagotovijo odpornost proti antibiotikom.
Salmonela je tako zaradi svoje Gram – negativne celične stene odporna proti vankomicinu,
ki s svojimi velikimi molekulami ne more prodreti v celico. Salmonela lahko proizvede
tudi določene encime, s katerimi vpliva na antibiotike, velikokrat pa je odpornost proti
antibiotikom posledica mutacij tarčnih mest (Yan s sod., 2003).
Odpornost proti antibiotikom bakterijam omogočajo tudi plazmidi, do večkratne
odpornosti pa lahko pride ob pretirani uporabi antibiotikov v bolnišnicah, ali če se
antibiotiki dodajajo v živalsko krmo. Tako je serovar Typhi okrog 1990 razvil odpornost
proti že poznanim antibiotikom (Garrity s sod., 2005).
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
14
Odpornost salmonele proti antibiotikom je moč zaznati predvsem v razvitejšem svetu,
medtem ko so raziskave ruralnih območij in divjine pokazale zelo nizko odpornost.
Odpornost proti kinolonom, še posebno fluorokinolonom, je bila opažena že leta 1980, od
takrat pa se pojavlja vedno pogosteje, kar je zaskrbljujoče, saj fluorokinolone uvrščamo
med novejše antibiotike, ki so v splošni uporabi tako v medicini, kot tudi veterini. Tako so
zabeležena poročila o vse manjši občutljivosti za ciprofloksacin in nalidiksično kislino
(Helmuth, 2000).
Domače živali, vključno s plazilci, so se pokazale kot možen vir okužbe s salmonelo,
število teh pa se v zadnjih letih povečuje. Žal pa je le malo podatkov o odpornosti bakterij,
izoliranih iz plazilcev, proti antibiotikom. Tako so na Tajvanu v študijo med leti 2005 in
2006 zajeli plazilce iz živalskega vrta, trgovin z malimi živalmi in z univerze. Salmonela je
bila potrjena pri 30,9 % živali. Prevladovale so kače, sledili so kuščarji, najmanj okuženih
pa je bilo želv. Serotipizirane salmonele so bile odporne proti antibiotikom, 6,9% je bilo
odpornih na 4 ali več antibiotikov. Največ sevov je bilo odpornih proti streptomicinu
(14,7%) in tetraciklinu (9,2%). Odpornost proti nalidiksični kislini so zaznali samo pri
želvah. Zaznana je bila tudi odpornost proti ampicilinu (6,9%), medtem ko odpornosti proti
ciprofloksacinu in norfoksacinu ni bilo (Chen s sod., 2010). Corrente s sod. (2004) je že
pred tem potrdil odpornost salmonel, izoliranih iz plazilcev, proti streptomicinu (32,6%),
tetraciklinu (19,6%), ampicilinu (17,4%) ter tudi odpornost sevov proti nalidiksični kislini
(13,1%). O odpornosti proti klavulanski kislini, ceftazidimu in ciprofloksacinu ne poroča.
Ebani s sod. (2005) je prav tako potrdil antibiotično odpornost salmonel, izoliranih iz
plazilcev. Med izoliranimi sevi so bili vsi odporni vsaj na en antibiotik ali več. Veliko je
bilo odpornih proti ampicilinu (27,4%) medtem, ko so vsi sevi razen enega pokazali
občutljivost za kloramfenikol, ter v 75,34% tudi za tetraciklinu.
2.4.3.1 Odpornost proti beta-laktamskim antibiotikom in kinolonom
Odpornost proti beta-laktamskim antibiotikom je lahko posledica prisotnosti encima beta-
laktamaze. Ta encim prekine beta-laktamski obroč tako, da cepi amidno vez. Nekatere
Gram - negativne bakterije so zaradi svoje lipopolisharidne zunanje membrane naravno
odporne proti beta-laktamskim antibiotikom (Reeves, 2012).
Beta-laktamaze lahko delimo na podlagi njihovih fenotipskih lastnosti ali na podlagi
molekularnega razvrščanja, torej na podlagi nukleotidnega ali aminokislinskega zaporedja
encimov. Nekatere beta-laktamaze posredujejo odpornost tudi proti tretji in četrti
generaciji cefalosporinov (ceftazidim, cefotaksim). To so beta-laktamaze z razširjenim
spektrom delovanja (Extended-Spectrum Beta – Lactamases) ali krajše ESBL (Bush s sod,
1995; Samaha – Kfuory in Araj, 2003). ESBL nadalje delimo v več skupin. V skupino
CTX – M so uvrščeni encimi, ki najverjetneje izhajajo iz bakterij rodu Kluyvera in so se
prenesli na plazmide drugih bakterij, geni za beta-laktamaze CTX – M se najpogosteje
nahajajo na konjugativnih plazmidih. Beta-laktamaze z razširjenim spektrom delovanja
skupine CTX – M sodijo med najbolj razširjene in so najpogostejši vzrok odpornosti
enterobakterij proti cefalosporinom (Bonnet, 2004). Razvrščamo jih v 5 podskupin (CTX-
M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 in CTX-M-25) (Woodford, 2010).
Odpornost bakterij proti kinolonom se povezuje predvsem z njihovo pretirano uporabo.
Odpornost proti njim nastaja zaradi mutacij v nukleotidnih zaporedjih kromosomskih
genov za DNA-girazo ali topoizomerazo IV (topoizomeraze tipa II). Do odpornosti lahko
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
15
privedejo tudi spremembe v izražanju različnih membranskih črpalk in porinov, ki
uravnavajo akumulacijo antibiotika v celici. Identificirali so tudi tretjo obliko odpornosti,.
Gre za prenosljive gene na plazmidih, ki posredujejo nizko raven odpornost proti
kinolonom in fluorokinolonom. To tretjo skupino genov označujemo kot gene za
plazmidno posredovano kinolonsko rezistenco ali krajše PMQR (plasmid-mediated
quinolone resistance). Med njimi so tudi tako imenovani geni qnr, ki kodirajo proteine iz
pentapeptidnih ponovitev, le-ti se vežejo in tako zaščitijo topoizomeraze tipa II pred
inhibicijo s kinoloni. Poznanih je več različic genov qnr: qnrA, qnrB, qnrS, ter qnrC in
qnrD (Robicsek s sod., 2006; Reeves, 2012; Jacoby, 2005).
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
16
3 MATERIAL IN METODE
3.1 IZOLACIJA BAKTERIJ RODU Salmonella IZ PLAZILCEV
3.1.1 VZORCI
Vzorce, iz katerih smo izolirali bakterije, smo zbirali od marca 2010 do februarja 2011.
Zbirali smo iztrebke in vzorce brisov iz kloak (slika 2) plazilcev zasebnih gojiteljev, v
raziskavo pa smo zajeli tudi nekaj šol in visokošolskih zavodov iz Ljubljane in okolice.
Slika 2: Odvzem brisa iz kloake pri kraljevem pitonu (Foto: M. Turk)
3.1.2 NAČRT DELA
Bakterije smo iz iztrebkov in brisov najprej izolirali in identificirali po normativu, ki se
uporablja v mikrobiologiji živil in krme za ugotavljanje vrst rodu Salmonella (ISO
standard 6579:2002). Ker pa smo ugotovili, da so rezultati zadovoljivi tudi s krajšim
postopkom, smo kasneje metodo priredili tako, da smo sveže iztrebke resuspendirali
(oziroma vatenke z brisi potopili) v gojišču BPW in jih stresali pri 37 ºC in 200
obratih/min eno uro ter s tem skrajšali čas predbogatitve za 17 ur, nato pa smo zopet sledili
prej omenjenemu postopku (slika 3).
Gojišča, ki smo jih uporabili v postopku izolacije in identifikacije smo pripravljali sami.
Uporabili smo recepte iz mednarodnega standarda ((ISO standard 6579:2002, gojišči BPW
in MKTT). Preostale recepte za gojišča pa smo povzeli po bakteriološkem priročniku
(Gerhardt s sod., 1994).
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
17
Slika 3: Prikaz postopka izolacije in identifikacije salmonel iz iztrebkov/brisov kloak plazilcev.
PREDBOGATITEV
1 g (1ml) vzorca ali vatenka - bris + 9 ml BPW
1 ura, 37 °C, stresanje 200 obratov/min
BOGATITEV
1 ml suspenzije vzorca v BPW + 9 ml MKTT
24 ur, 37 °C, stresanje 200 obratov/min
SELEKTIVNA IZOLACIJA
10 μl suspenzije vzorca na selektivno gojišče
XLD ali SSA
24 ur, 37 °C
IZOLACIJA ČISTE KULTURE
IDENTIFIKACIJA Z BIOKEMIJSKIMI TESTI
MOLEKULARNO – BIOLOŠKA
IDENTIFIKACIJA NA OSNOVI ZAPOREDJA
GENA ZA 16S rRNA
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
18
GOJIŠČA IN GOJENJE
3.1.2.1 Predbogatitev
PEPTONSKA VODA (BUFFERED PEPTONE WATER - BPW)
Kazein hidrolizat 10,0 g
Natrijev klorid (NaCl) 5,0 g
Dinatrijev hidrogen fosfat dodekahidrat
(Na2HPO4 12H20) 9,0 g
Kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4) 1,5 g
Destilirana voda 1000 ml
Kemikalije smo raztopili v destilirani vodi ob rahlem segrevanju. pH smo umerili na 7,0 z
1M NaOH in raztopino razdelili v infuzijske stekleničke. Avtoklavirali smo 15 min pri 121
ºC.
GOJENJE
Iztrebke ali vatenke z brisi smo dali v epruvete, jih označili, ter dodali BPW v razmerju
1:10. Kjer smo imeli iztrebke resuspendirane v vodi smo vzeli 1 ml suspenzije iztrebka in
dodali 9 ml BPW. Vzorce smo dobro premešali s pomočjo vibracijskega mešala, da so se
čim bolj resuspendirali, nato pa smo epruvete z vzorci stresali pri 37 °C in 200 obratih/min
približno 1 uro (slika 3).
3.1.2.2 Bogatitev
Gojišče MKTT (MULLER – KAUFFMANN TETRATHIONAT – NOVOBIOCIN)
Osnovno gojišče:
Mesni ekstrat 4,3 g
Encimatsko razgrajen kazein 8,6 g
Natrijev klorid (NaCl) 2,6 g
Kalcijev karbonat (CaCO3) 38,7 g
Natrijev tiosulfat pentahidrat (Na2S2O3 · 5H2O) 47,8 g
Soli žolčnih kislin (Oxbile) 4,78 g
Barvilo Brilliant green 9,6 g
Destilirana voda 1000 ml
Kemikalije smo raztopili v destilirani vodi, tako da je raztopina vrela 5 minut. Nato smo
umerili pH na 8,2 z 1M NaOH.
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
19
Raztopina joda in jodida:
Jod 20,0 g
Kalijev Jodid (KI) 25,0 g
Destilirana voda 100 ml
Popolnoma smo raztopili kalijev jodid v 10 ml sterilne destilirane vode, nato smo dodali
jod in dolili sterilno destilirano vodo do 100 ml. Raztopine nismo avtoklavirali.
Raztopina novobiocina:
Novobiocin - kalcijeva sol 0,04 g
Destilirana voda 5 ml
Novobiocin smo raztopili v destilirani vodi, nato pa raztopino sterilizirali s filtracijo
Sestava celotnega gojišča:
Osnovno gojišče 1000 ml
Raztopina joda in jodida 20 ml
Raztopina novobiocina 5 ml
V osnovno gojišče smo sterilno dodali 5 ml raztopine novobiocina in dobro premešali, nato
smo dodali še 20 ml raztopine joda in jodidater ponovno dobro premešali. Po 9 ml gojišča
smo nato razdelili v sterilne epruvete.
GOJENJE
V vsako epruveto smo dodali po 1 ml gojišča BPW s kulturo iz predbogatitve. Zopet smo
dobro premešali, ter epruvete 24 ur inkubirali ob stresanju 200 obratov/min pri temperaturi
37 °C (slika 3).
Slika 3: Predbogatitev vzorcev iztrebkov v gojišču BPW (epruvete na levi) in bogatitev vzorcev v
gojišču MKTT (epruvete na desni) (Foto: M. Turk)
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
20
3.1.2.3 Selektivna izolacija salmonel v čisti kulturi
Za selektivno izolacijo salmonel iz vzorcev smo uporabili selektivni in diferencialni trdni
gojišči agar Salmonella – Shigella ter ksiloza lizin deoksiholatni agar.
Gojišče SSA (SALMONELLA – SHIGELLA AGAR)
Goveji ekstrakt 5 g
Pepton 5 g
Laktoza 10 g
Barvilo Brilliant green 0,33 g
Nevtralno rdeče 0,08 g
Natrijev deoksiholat 8 g
Natrijev tiosulfat 8,5 g
Železov citrat 1 g
Natrijev citrat 8,5 g
Agar 15 g
Destilirana voda 1000 ml
Kemikalije smo raztopili v destilirani vodi, pH umerili na 7,5 z 1M NaOH in segrevali
dokler gojišče ni zavrelo. Nato smo gojišče razlili na sterilne petrijeve plošče.
Gojišče XLD (KSILOZA LIZIN DEOKSIHOLATNI AGAR)
Ksiloza 3,5 g
L – lizin 5 g
Laktoza 7,5 g
Saharoza 7,5 g
Natrijev klorid (NaCl) 5 g
Kvasni ekstrat 3 g
Fenol rdeče 0,08 g
Natrijev deoksiholat 2,5 g
Natrijev tiosulfat 6,8 g
Železov amonijev citrat 0,8 g
Agar 15 g
Destilirana voda 1000 ml
Kemikalije smo raztopili v destilirani vodi, pH umerili na 7,4 z 1M NaOH in segrevali do
vretja. Gojišče smo nato razlili v sterilne petrijeve plošče.
GOJENJE
Po 24 urah smo pregledali vzorce, ki smo jih bogatili v gojišču MKTT, ter iz vsake
epruvete s plastično ezo nacepili po 10 μl kulture na selektivni gojišči SSA in XLD. Plošče
smo inkubirali 24 ur pri 37 °C. Po končani inkubaciji smo pregledali selektivna gojišča, ter
na njih označili kolonije, ki bi po obliki in barvi lahko predstavljale salmonelo (prosojne
brezbarvne kolonije s ali brez črnega centra na agarju SSA (slika 4), rožnate kolonije
(laktoza pozitivne) s ali brez črnega centra na agarju XLD (slika 1 in 4).
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
21
Slika 4: Mešana kultura s kolonijami potencialnih salmonel na selektivnih in diferencialnih trdnih
gojiščih XLD (levo, rožnate kolonije s črnim centrom) in SSA (desno, prosojne kolonije s črnim
centrom). Vcepek je bil bogatitvena kultura iztrebkov v gojišču MKTT.
Za izolacijo čiste kulture smo uporabljali že prej omenjeni selektivni in diferencialni
gojišči SSA in XLD, ter osnovno gojišče hranilni agar.
Gojišče HRANILNI AGAR
Hranilna juha (nutrient broth) 8 g
Natrijev klorid (NaCl) 5 g
Agar 15 g
Destilirana voda 1000 ml
Kemikalije (razen agarja) smo raztopili, gojišče avtoklavirali 15 min pri 121 ºC in ga
sterilno razlili v petrijeve plošče.
GOJENJE
Iz selektivnih gojišč SSA in XLD, na katerih smo označili kolonije, ki bi lahko potencialno
bile salmonele, smo nato le-te izolirali v čisti kulturi. Posamezno kolonijo smo precepili
naprej na selektivno gojišče, po 24-urni inkubaciji pri 37 °C pa na hranilni agar. Če kultura
ni bila čista smo postopek ponovili.
3.2 IDENTIFIKACIJA BAKTERIJ RODU Salmonella IZ PLAZILCEV
Za identifikacijo izoliranih bakterij smo uporabili izbor biokemijskih testov, s katerimi
lahko razlikujemo salmonele od ostalih sorodnih enterobakterij (ISO standard 6579:2002,
Gerhardt s sod., 1994). Fenotipsko identifikacijo pa smo potrdili še z genotipsko
identifikacijo na osnovi delnega nukleotidnega zaporedja gena za 16S rRNA. Za vse čiste
kulture domnevnih izolatov salmonel smo naredili preparat in ga barvali po Gramu, nato
smo izvedli različne biokemijske teste, tako smo dobili njihove delne fenotipske profile in
jih na osnovi teh rezultatov identificirali s pomočjo Bergeyevega priročnika determinativne
bakteriologije (Holt s sod., 1994). V začetku testiranja smo uporabili več različnih
biokemijskih testov, kasneje pa smo jih nekaj opustili. Za te izbrane seve, prepoznane kot
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
22
salmonele, smo nato identifikacijo potrdili še s pomočjo njihovega nukleotidnega
zaporedja gena za 16S rRNA.
3.2.1 Fenotipska identifikacija z biokemijskimi testi
CITRATNI TEST
S citratnim testom ugotavljamo sposobnost mikroorganizmov, da uporabljajo citrat kot
edini vir ogljika. Mikroorganizem, ki lahko uporablja citrat, bo uporabljal amonijevo sol
kot vir N in ob tem sproščal amonijak, zaradi česar gojišče postane alkalno, kar se odraža v
spremembi barve indikatorja. Rezultat je pozitiven, če opazimo spremembo barve iz zelene
v modro, negativen pa, kadar ni spremembe barve in rasti.
Natrijev klorid (NaCl) 5 g
MgSO4 0,2 g
NH4H2PO4 1 g
Na3C6H5O7 · 2H2O 5 g
KH2PO4 1 g
Bromtimol modro (0,2 odstotna raztopina) 40 ml
Agar 20 g
Destilirana voda 1000 ml
Sestavine smo raztopili v destilirani vodi, umerili pH na 6,8, ter razdelili v srednje epruvete
v vsako po 3,5 ml. Epruvete smo avtoklavirali in pripravili poševna gojišča.
V epruvete s poševnim gojiščem smo nacepili kolonijo, ter inkubirali za 4 dni pri 37 °C.
Pri nacepljanju smo pazili, da s cepilno zanko nismo prenašali hranil iz drugih gojišč, ter s
tem vplivali na rezultate testa.
INDOLNI TEST
Z indolnim testom ugotavljamo razgradnjo triptofana do indola, ki ga lahko razgrajujejo
bakterije z encimom triptofanazo. To ugotavljamo z aldehidnim reagentom (Kovacsev
reagent), ki reagira z indolom , tako dobimo obarvan produkt. Rezultat je pozitiven, če je
indikator na vrhu gojišča rdeč (rdeč obroč) in negativen, če je rumen.
Pepton (tripton 10 g ali casiton 15 g) 20 g
NaCl 5 g
Destilirana voda 1000 ml
Sestavine smo natehtali in raztopili v destilirani vodi, umerili pH na 7,2 in gojišče razdelili
v majhne epruvete po 5ml in avtoklavirali.
Indikator: Kovascev reagent
para-dimetilaminobenzaldehid 3 g
izoamil alkohol 75 ml
koncentrirana HCl 25 ml
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
23
V tekoče gojišče smo nacepili kolonijo, nato inkubirali 24 ur pri 37 °C. Po inkubaciji smo
v vsako epruveto dodali 3 kapljice Kovacsevega reagenta, rahlo pretresli ter spremljali
pojav rdečega obroča na vrhu gojišča.
TEST LDC
Ugotavljamo prisotnost encima lizin dekarboksilaze, ki dekarboksilira aminokislino lizin,
pri čemer nastanejo bazični amini. Rezultat je pozitiven, če se gojišče obarva vijoličasto in
negativen, če ne spremeni barve. Če se spremeni tudi barva v kontrolni epruveti, je
potrebno teste ponoviti.
Pepton 5 g
Mesni ekstrat 5 g
Piridoksal 5 mg
Glukoza 0,5 g
Bromkrezol modro 1-odstotna raztopina 0,625 ml
Destilirana voda 1000 ml
Sestavine smo zatehtali in raztopili v destilirani vodi, umerili pH na 6,0 ter gojišče
avtoklavirali. Ločeno smo pripravili aminokislino lizin v 10-odstotni koncentraciji (10 g L-
lizin hidroklorida raztopimo v 100 ml destilirane vode) in raztopino sterilno prefiltrirali. V
osnovno gojišče smo sterilno dodali raztopino lizina (100 ml na 900 ml osnovnega gojišča,
končna koncentracija 1-odstotna), razdelili v sterilne majhne epruvete, v vsako po 2.5 ml in
prekrili s sterilnim mineralnim oljem. Pripravili smo tudi kontrolne epruvete brez dodane
aminokisline.
Nacepili smo tekoče gojišče z aminokislino in kontrolno gojišče brez aminokisline, ter
inkubirali 4 dni pri 37 °C, ob dnevnem spremljanju sprememb.
TEST OF
S tem testom ugotavljamo, ali bakterija razgrajuje ogljikove hidrate po oksidativni, ali po
fermentativni poti. Sprememba barve iz zelene v rumeno da pozitiven rezultat. Test vedno
izvajamo v dveh epruvetah, ena je pokrita z mineralnim oljem (F anaerobna), druga ne (O
aerobna)
Pepton 2 g
Natrijev klorid (NaCl) 5 g
K2HPO4 0,3 g
Agar 3 g
Bromtimol modro 1- odstotna vodna raztopina 3 ml
Destilirana voda 1000 ml
Raztopili smo sestavine, ter umerili pH na 7,2. Po avtoklaviranju smo dodali sladkor
(najpogosteje glukozo, pripravili smo 10-odstotno raztopino sladkorja v destilirani vodi in
jo sterilno prefiltrirali) do končne koncentracije 1% in razdelili po 3-4 ml v male sterilne
epruvete. Polovico epruvet smo prekrili s sterilnim mineralnim oljem.
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
24
Kolonije smo vbodno nacepili v gojišče prekrito z mineralnim oljem, kjer smo ugotavljali
fermentativno razgradnjo škroba (F) in v gojišče brez mineralnega olja, kjer smo
ugotavljali oksidativno razgradnjo škroba (O). Inkubirali smo 24 ur pri 37 °C, nato pa
ugotavljali spremembo barve. Sprememba v epruveti O – oksidativna razgradnja sladkorja,
sprememba v obeh epruvetah – fermentativna razgradnja sladkorja, ni spremembe v
epruvetah – ni razgradnje sladkorja.
OKSIDAZNI TEST
Uporabljamo ga za ugotavljanje prisotnosti encima citokrom c oksidaze, ki lahko oksidira
dodani akceptor elektronov tetrametil-p-fenilen diamin dihidroklorid, ta se ob tem obarva.
Rezultat je pozitiven, če se kultura, ki smo jo nanesli na reagent, po 10 do 15 sekundah
obarva intenzivno modro, negativen pa kadar se kultura ne obarva.
Oksidazni reagent: 1-odstotna raztopina tetrametil-p-fenilen diamina v DMSO
Na košček sterilnega filter papirja smo kapnili malo oksidaznega reagenta in nanj s lesenim
zobotrebcem ali plastično cepilno zanko nanesli kolonijo. Spremljali smo spremembo
barve.
KATALAZNI TEST
Katalazni test uporabljamo za ugotavljanje prisotnosti encima katalaze, ki katalizira
reakcijo pretvorbe dveh molekul vodikovega peroksida do vode in kisika. Rezultat je
pozitiven, če ob nanosu kulture v vodikov peroksid opazimo mehurčke kisika, ter
negativen, če teh ni.
Reagent: 3-odstotni vodikov peroksid v destilirani vodi
Na objektno steklo smo kanili kapljico vodikovega peroksida, ter vanjo s cepilno zanko
vnesli kulturo, rahlo pomešali in opazovali reakcijo.
TEST ONPG
Z ONPG ugotavljamo prisotnost encima β-galaktozidaze, ki cepi laktozo in druge β-
galaktozide. Rezultat testa je pozitiven, če se gojišče obarva rumeno, če pa ostane
brezbarvno, je negativen.
1. Raztopina ONPG
ONPG (orto-nitrofenil--
galaktopiranozid) 0,6 g
Na – fosfatni pufer; 0,01 M, pH 7,5 100 ml
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
25
2. Peptonska voda, 1-odstotna
Pepton 1 g
Natrijev klorid (NaCl) 0,5 g
Destilirana voda 100 ml
Naredili smo raztopino ONPG in jo sterilno filtrirali. Pripravili smo še peptonsko vodo ter
jo avtoklavirali. Sterilno smo dodali 1 del raztopine ONPG v 3 dele peptonske vode.
Raztopino smo razdelili v sterilne male epruvete, v vsako po 1,5 ml.
V peptonsko vodo z ONPG smo s cepilno zanko vnesli kulturo. Nato smo inkubirali 24 ur
pri 37 °C, ter nato opazovali spremembo barve raztopine.
TEST TSI (trojni sladkor z železom)
S tem testom ugotavljamo fermentacijo glukoze, laktoze in saharoze ter produkcijo H2S.
Ob fermentaciji sladkorjev nastanejo kisline, zato se pH gojišča zniža in barva indikatorja
se spremeni iz rdeče v rumeno.
Rezultat:
Kislo dno
RUMENO
Kisla poševna ploskev
RUMENA
Glukoza +
Laktoza + in/ali
saharoza +
Kislo dno
RUMENO
Alkalna poševna ploskev
RDEČA
Glukoza +
Laktoza-
Saharoza-
Alkalno dno
RDEČE
Alkalna poševna ploskev
RDEČA
Glukoza-
Laktoza-
Saharoza-
Produkcijo H2S opazimo kot temno obarvano dno gojišča. Produkcijo plina ob fermentaciji
opazimo kot dvig gojišča z dna epruvete ali razpoke v gojišču.
Mesni ekstrat 3 g
Kvasni ekstrat 3 g
Pepton 20 g
Laktoza 10 g
Saharoza 10 g
Glukoza 1 g
Železov (III) amonijev citrat 0,3 g
Natrijev klorid (NaCl) 5 g
Natrijev tiosulfat 0,3 g
Agar 12,5 g
Fenol rdeče 0,024 g
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
26
Komponente smo raztopili v destilirani vodi, uravnali pH na 7.3, segreli, da smo raztopili
agar in razdelili v srednje epruvete, v vsako po 4 ml, ter avtoklavirali. Po avtoklaviranju
smo epruvete naložili na poševno stojalo, da smo dobili poševna gojišča.
Na poševno gojišče smo nacepili kulturo od zgoraj navzdol, nato pa s cepilno zanko
zabodli še v dno gojišča. Po 18-24 urah inkubacije pri 37 °C smo odčitali rezultate.
VOGES-PROSKAUERJEV TEST
Uporabljamo ga za dokazovanje butandiolske fermentacije glukoze, kjer nastanejo
nevtralni produkti kot je acetoin. Rezultat je pozitiven, če se ob dodatku reagentov v
zgornjem delu gojišča razvije rožnato rdeča barva, negativen pa, če ni spremembe barve.
K2HPO4 0,5 g
Pepton 0,5 g
Glukoza 0,5 g
Destilirana voda 100 ml
Sestavine smo raztopili v destilirani vodi, ter umerili pH na 7,5. Raztopino smo razdelili v
male epruvete, v vsako po 2 ml in avtoklavirali.
Indikator: 40-odstotni KOH, 5-odstotni α – naftol v 96-odstotnem etanolu
V epruvete z gojiščem smo nacepili kulturo, ter inkubirali 48 h pri 37 °C. Nato smo najprej
dodali štiri kapljice α – naftola v 96-odstotnem etanolu, nato pa še dve kapljici KOH.
Spremljali smo spremembo barve.
UREAZNI TEST (po Christensenu)
Ugotavljamo prisotnost encima ureaze, ki cepi ureo do amoniaka. Rezultat je pozitiven, če
se gojišče obarva rožnato, negativen pa, če sprememb v barvi ni.
1.
Pepton 1g
Natrijev klorid (NaCl) 5 g
Kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4) 2 g
Glukoza 1 g
Fenol rdeče (2-odstotna raztopina) 6 ml
Agar 20 g
Destilirana voda 900 ml
2.
Urea 20 g
Destilirana voda 100 ml
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
27
Zatehtali smo sestavine, ki so navedene pod 1. (brez agarja), jih raztopili v destilirani vodi,
ter umerili pH na 6,9 in dodali agar. Raztopino smo avtoklavirali.
Zatehtali smo še ureo in jo raztopili v destilirani vodi, jo sterilno filtrirali in dodali v
raztopino po avtoklaviranju (končna koncentracija uree v gojišču je 2-odstotna).
Gojišče smo razdelili v epruvete, v vsako po 1 ml.
Na poševna gojišča smo nacepili kulturo, inkubirali 24 ur pri 37 °C, nato pa odčitali
rezultate.
3.2.2 Genotipska identifikacija na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S
rRNA
IZOLACIJA DNA
Reagenti: PrepMan® Ultra Samle Preparation Reagent (Thermo Fischer Scientific)
Štiriindvajseturne čiste kulture izolatov smo uporabili za izolacijo DNA. V 1,5 ml
centrifugirko po Eppendorfu smo dali 30 μl reagenta ter vanjo vnesli po eno kolonijo
kulture. Celice smo resuspendirali v reagentu na vibracijskem mešalu in jih kuhali 15
minut, jih nato ohladili, sledilo pa je 10-minutno centrifugiranje pri 16 000 g in sobni
temperaturi. Po centrifugiranju smo v nove centrifugirke odpipetirali supernatant, ki je
predstavljal našo matrično DNA. Do verižne reakcije s polimerazo smo supernatant
shranili pri -20 °C.
PCR – verižna reakcija s polimerazo
Za celokupno 50 μl reakcijo za PCR smo na ledu pripravili mešanico reagentov (velja za
eno reakcijo):
10 polimerazni pufer z MgCl2 (Thermo Fischer Scientific) 5 μl
10 mM dNTP (mešanica deoksiribonukleotidov, Applied
Biosystems)
0,5 μl
10 mM oligonukleotidni začetnik 27F 0,5 μl
10 mM oligonukleotidni začetnik 1495r 0,5 μl
H2O MilliQ 42,37 μl
polimeraza DreamTaq (5U/ μl, Thermo Fischer Scientific) 0,125 μl
Tabela 1: Univerzalni bakterijski oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje gena za 16S
rRNA.
V 0,2 ml centrifugirke za PCR smo odpipetirali po 49 μl mešanice reagentov in dodali še 1
μl supernatanta (matrična DNA).
Vzorce smo dali v aparaturo za PCR (PCR Mastercycler ep Gradient, Eppendorf) in izvedli
verižno reakcijo s polimerazo s padajočo temperaturo prileganja (touchdown PCR) po
programu; začetna denaturacija pri 94 ºC 5 minut, sledi 5 ciklov z denaturacijo pri 94 ºC po
27F (16S rRNA – bakterijski) 5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1495r (16S rRNA – bakterijski) 5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
28
30 sekund, prileganje pri 60 ºC za 30 sekund in podaljševanje pri 72 ºC za 60 sekund. Sledi
5 ciklov (denaturacija pri 94 ºC 30 sekund, prileganje pri 55 ºC za 30 sekund in
podaljševanje pri 72 ºC za 60 sekund) in 30 ciklov (denaturacija pri 94 ºC za 30 sekund,
prileganje pri 50 ºC za 30 sekund, podaljševanje pri 72 ºC za 60 sekund), zaključi pa se s
končnim podaljševanjem pri 72 ºC za 7 minut.
AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA
Reagenti: agaroza, Tris-acetatni-EDTA pufer (TAE), barvilo SybrSafe (Invitrogen), 5-
kratni nanašalni pufer, mešanica fragmentov DNA znanih velikosti (GeneRuler™ 100 bp
Plus DNA Ladder, Thermo Fischer Scientific)
50-kratni pufer TAE (uporabljali smo 1-kratni TAE)
Tris baza 242 g
Ocetna kislina 57,1 ml
0,5 M EDTA pH 8 100 ml
Destilirana voda 1000 ml
5-kratni nanašalni pufer
Bromfenol modro 0,25 g
Ksilen cianol 0,25 g
Glicerol 30 ml
Destilirana voda 100 ml
Z agarozno gelsko elektroforezo smo preverili, če je bila reakcija PCR uspešna. Pripravili
smo 1-odstotni agarozni gel z 1-kratnim pufrom TAE, ki smo mu dodali barvilo SybrSafe
(10 µl na 100 ml 1-odstotne agaroze) in ga razlili v pripravljeni nosilec. Ko se je agarozni
gel strdil, smo na gel nanesli po 3 μl reakcijske mešanice, ki smo ji prej dodali 2 μl
nanašalnega pufra. Na gel smo nanesli tudi 2 μl mešanice fragmentov DNA znanih
velikosti (standard DNA). Elektroforezo smo izvajali pri 120 V. Po končani elektroforezi
smo gel osvetlili z UV transluminatorjem (G-Box Chemi, Syngene) in ga fotografirali.
Velikost pomnožene DNA smo določili primerjalno s fragmenti DNA znanih velikosti.
SEKVENCIRANJE GENA ZA 16S rRNA IN IDENTIFIKACIJA IZOLATOV
Vzorce z uspešno pomnoženim delom gena za 16S rRNA smo poslali na ugotavljanje
nukleotidnega zaporedja (sekvenciranje) v Macrogen (Južna Koreja). Med objavljenimi
nukleotidnimi zaporedji podatkovne zbirke Ribosomal Database Project-II smo s pomočjo
zbirkinih iskalnikov poiskali homologe dobljenim delnim nukleotidnim zaporedjem gena
za 16S rRNA (priloga 1) naših izolatov (http://rdp.cme.msu.edu, 21. 3. 2011). Čiste
bakterijske kulture identificiranih sevov smo shranili v Mikrobiološko zbirko Ex
Infrastrukturnega centra Mycosmo (MRIC UL) pri -80 °C v vialah sistema Microbank
(Pro-Lab Diagnostic).
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
29
3.3 UGOTAVLJANJE ODPORNOSTI SALMONEL PROTI IZBRANIM
ANTIBIOTIKOM
Vse izolirane seve, za katere smo na osnovi fenotipskega profila in nukleotidnega
zaporedja gena za 16S rRNA dokazali, da so salmonele, smo testirali za občutljivost proti
izbranim antibiotikom. Uporabili smo dve metodi in sicer difuzijski antibiogram po Kirby-
Bauerju in inkorporacijski antibiogram.
3.3.1 Difuzijski antibiogram po Kirby-Bauerju
Ta metoda difuzijskega antibiograma z diski je kvalitativna metoda, kjer lahko ugotovimo
le, ali je sev občutljiv ali odporen proti testiranemu antibiotiku. Pri izvedbi smo sledili
navodilom Ameriškega društva za mikrobiologijo (Cavalieri s sod., 2005)
MUELLER – HINTONOVO GOJIŠČE
Mesni ekstrat 3 g
Encimatsko razgrajen kazein 17,5 g
Škrob 1,5 g
Agar 17 g
Destilirana voda 1000 ml
Kemikalije (razen agarja) smo raztopili, dodali agar, gojišče avtoklavirali 15 min pri 121
ºC in ga sterilno razlili po 25 ml v sterilne petrijeve plošče.
V epruvete s 5 ml sterilne fiziološke raztopine (0,9% NaCl) smo vnesli polno ezo kulture
celic, jih resuspendirali, nato smo z dodajanjem fiziološke raztopine uravnali motnost
bakterijske suspenzije na gostoto 0,5 po McFarlandovemu standardu. To suspenzijo celic
smo nato nacepili na gojišče Mueller-Hinton z vatenko tako, da smo ploščo trikrat
prebrisali. Na plošče s konfluentno nacepljeno kulturo smo položili komercialno
pripravljene antibiotične diske enakomerno oddaljene eden od drugega in po inkubaciji 18-
24 ur pri 37 °C izmerili premere cone inhibicije rasti (premer v milimetrih) okrog vsakega
diska, te podatke pa primerjali s kriteriji za interpretacijo premerov con inhibicije rasti.
Uporabili smo naslednje antibiotične diske (Oxoid, Thermo Fischer Scientific):
TE – tetraciklin (30 μg)
IMP – imipenem (10 μg)
S – streptomicin (10 μg)
NOR – norfloksacin (10 μg)
NA – nalidiksična kislina (30 μg)
CIP – ciprofloksacin (5 μg)
CTX – cefotaksim (30 μg)
CAZ – ceftazidim (30 μg)
CAZ/CLA – ceftazidim/klavulanska kislina (30/10 μg)
Za branje rezultatov pa smo uporabili naslednje kriterije za interpretacijo premerov con
inhibicije rasti (CLSI standards M100-S24, 2014):
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
30
Antibiotik Rezistenca Vmesno Občutljivost
TE ≤ 11 12-14 ≥ 15
IMP ≤ 13 14-15 ≥ 16
S ≤ 11 12-14 ≥ 15
NOR ≤ 12 13-16 ≥ 17
NA ≤ 13 14-18 ≥ 19
CIP ≤ 15 16-20 ≥ 21
CTX ≤ 22 23-25 ≥ 26
CAZ ≤ 17 18-20 ≥ 21
CAZ/CLA ≤ 22 23-25 ≥ 26
3.3.2 Inkorporacijski antibiogram
Za ugotavljanje odpornosti sevov salmonel proti antibiotiku ampicilinu smo pripravili
hranilni agar s koncentracijo antibiotika 100 mg/l. Založno koncentracijo ampicilina smo
naredili tako, da smo raztopili 100 mg antibiotika v 1 ml destilirane vode in sterilizirali s
filtracijo. Nato smo v pripravljen hranilni agar (priprava opisana zgoraj), ohlajen na 55 °C
dodali 1 ml založne raztopine ampicilina in agar razlili v sterilne petrijeve plošče. Na
ploščo z ampicilinom smo nanesli po eno kolonijo 24-urne čiste kulture posameznega seva,
gojene na hranilnem agarju (4 seve na ploščo). Za preverjanje učinkovitosti antibiotika v
gojišču smo kot kontrolo uporabili sev Escherichia coli BL-11, ki smo ga nacepili na
gojišče z ampicilinom in brez. Po inkubaciji 48 ur pri 37 °C smo na ploščah pregledali, če
so naše kulture rastle. Rast pomeni rezistenco, če ni rasti pa občutljivost bakterije za
ampicilin pri koncentraciji 100 mg/l.
3.4 GENOTIPSKA METODA ZA UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI BETA-
LAKTAMAZ Z RAZŠIRJENIM SPEKTROM DELOVANJA (ESBL) SKUPINE
CTX-M IN GENOV ZA PLAZMIDNO POSREDOVANO KINOLONSKO
REZISTENCO (PMQR) SKUPINE QNR
3.4.1 Pomnoževanje genov za beta-laktamaze z razširjenim spektrom delovanja
skupine CTX-M (blaCTX-M)
Za ugotavljanje prisotnosti genov blaCTX-M pri sevih salmonel, izoliranih iz plazilcev, smo
uporabili oligonukleotidne začetnike, navedene v tabeli 2.
Priprava mešanice za PCR (multipla reakcija)
za 1 vzorec:
- 12,5 μl 2 mešanice reagentov DreamTaq PCR
Master Mix (Thermo Fisher Scientific)
- 1 μl vsakega začetnika F (M1, M2, M8, M9, M25)
- 1 μl vsakega začetnika R (M1, M2, M8, M9, M25)
- 0,5 μl H2O
Program za PCR:
30X
94°C 5 minut
94°C 25 sekund
52°C 40 sekund
72°C 50 sekund
72°C 6 minut
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
31
Tabela 2: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov ESBL skupine CTX – M
(blaCTX-M)
Gen nukleotidno zaporedje (5' - 3')
velikost
pomnožka (bp) referenca
blaCTX - M1 CTX - M1 F (AAAAATCACTGCGCCAGTTC) 415
Woodford s sod., 2006
CTX - M1 R (AGCTTATTCATCGCCACGTT)
blaCTX - M2 CTX - M2 F (CGACGCTACCCCTGCTATT) 552
CTX - M2 R (CCAGCGTCAGATTTTTCAGG)
blaCTX - M8 CTX - M8 F (TCGCGTTAAGCGGATGATGC) 666
CTX - M8 R (AACCCACGATGTGGGTAGC)
blaCTX - M9 CTX - M9 F (CAAAGAGAGTGCAACGGATG) 205
CTX - M9 R (ATTGGAAAGCGTTCATCACC)
blaCTX - M25 CTX - M25 F (GCACGATGACATTCGGG) 327
CTX - M25 R (AACCCACGATGTGGGTAGC)
Vse reagente smo hranili na ledu ter jih pred uporabo dobro premešali z vibracijskim
mešalom. V 0,2 ml centrifugirke po Eppendorfu smo odpipetirali po 23 μl reakcijske
mešanice za PCR ter na koncu v vsako centrifugirko dodali še 2 μl matrične DNA
(pripravljene kot je opisano pod poglavjem 3.2.2). Vzorce smo dali v aparaturo za PCR
(PCR Mastercycler ep Gradient, Eppendorf) in izvedli verižno reakcijo s polimerazo po
protokolu, opisanem zgoraj.
Po končani verižni reakciji smo preverili uspešnost pomnoževanja z agarozno gelsko
elektroforezo kot je opisano zgoraj (poglavje 3.2.2) s spremembami, uporabili smo 2-
odstotni agarozni gel, nanašali po 5 μl reakcijske mešanice, kot mešanico fragmentov DNA
znanih velikosti (standard DNA) pa smo uporabili GeneRuler™ 50 bp DNA Ladder
(Thermo Fischer Scientific). Na gel smo nanesli tudi dve pozitivni kontrolni reakciji
(pomnoženi geni CTX-M8, CTX-M9 in CTX-M25). Po končani elektroforezi smo gel
osvetlili z UV transluminatorjem (G-Box Chemi, Syngene) in ga fotografirali. Pogledali
smo razvrstitev pomnožkov in velikost pomnoženih fragmentov DNA določili primerjalno
z uporabo nanešenega standarda DNA.
3.4.2 Pomnoževanje genov za plazmidno posredovano kinolonsko rezistenco
(PMQR) skupine QNR
Za ugotavljanje prisotnosti genov qnr pri sevih salmonel, izoliranih iz plazilcev, smo
uporabili oligonukleotidne začetnike, navedene v tabeli 3.
Priprava PCR mešanice (multipla reakcija)
za 1 vzorec:
- 12,5 μl 2 mešanice reagentov
DreamTaq PCR Master Mix
(Thermo Fisher Scientific)
- 1 μl vsakega začetnika F (A, B, S)
- 1 μl vsakega začetnika R (A, B, S)
- 5,5 μl H2O
Priprava mešanice za 1 vzorec (qnrC ali
qnrD):
- 12,5 μl 2 mešanice reagentov
DreamTaq PCR Master Mix
(Thermo Fisher Scientific)
- 1 μl začetnik F (C ali D)
- 1 μl začetnik R (C ali D)
- 9,5 μl H2O
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
32
Tabela 3: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov qnr.
gen nukleotidno zaporedje (5' - 3')
velikost
pomnožka (bp) referenca
qnrA qnrA - F (AGAGGATTTCTCACGCCAGG) 580
Cattoir s sod., 2007
qnrA - R (TGCCAGGCACAGATCTTGAC)
qnrB qnrB - F (GGMATHGAAATTCGCCACTG) 264
qnrB - R (TTTGCYGYYCGCCAGTCGAA)
qnrS qnrS - F (GCAAGTTCATTGAACAGGGT) 428
qnrS - R (TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG)
qnrC qnrC - F (GGGTTGTACATTTATTGAATCG) 308 Wang s sod., 2009
qnrC - R (CACCTACCCATTTATTTTCA)
qnrD qnrD - F (CGAGATCAATTTACGGGGAATA) 582 Cavaco s sod., 2009
qnrD - R (AACAAGCTGAAGCGCCTG)
Vse reagente smo hranili na ledu ter jih pred uporabo dobro premešali z vibracijskim
mešalom. V 0,2 ml centrifugirke po Eppendorfu smo odpipetirali po 24 μl reakcijske
mešanice za PCR ter na koncu v vsako centrifugirko dodali še 1 μl matrične DNA
(pripravljene kot je opisano pod 3.2.2). Vzorce smo dali v aparaturo za PCR (PCR
Mastercycler ep Gradient, Eppendorf) in izvedli verižno reakcijo s polimerazo.
PCR smo izvedli po naslednjem programu:
30X
Po končani verižni reakciji smo preverili uspešnost pomnoževanja z agarozno gelsko
elektroforezo, kot je opisano za gene blaCTX-M (poglavje 3.4.2). Na gel smo nanesli tudi
pozitivne kontrolne reakcije, kjer smo pomnoževali dele genov qnr. Po končani
elektroforezi smo gel osvetlili z UV transluminatorjem (G-Box Chemi, Syngene) in ga
fotografirali. Ugotavljali smo prisotnost pomnožkov in velikost pomnoženih fragmentov
DNA določili primerjalno z uporabo nanešenega standarda DNA.
95°C 5 minut
94°C 30 sekund
52°C 30 sekund
72°C 1 minuta
72°C 7 minut
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
33
3.5 UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI NEKATERIH VIRULENTNIH DEJAVNIKOV
PRI IZOLATIH SALMONEL IZ PLAZILCEV
Za preverjanje prisotnosti genov virulentnih dejavnikov invA, sopB, sifA in spvC pri sevih
salmonel, izoliranih iz plazilcev, smo pripravili po 25 μl celokupne reakcijske mešanice za
PCR na vzorec in uporabili oligonukleotidne začetnike, navedene v tabeli 4. Vse reagente
smo ves čas hranili na ledu, ter jih pred uporabo dobro premešali z vibracijskim mešalom.
2 mešanica reagentov DreamTaq PCR Master Mix (Thermo
Fischer Scientific)
12,5 μl
10 mM 5'- oligonukleotidni začetnik F 1 μl
10 mM 3'- oligonukleotidni začetnik R 1 μl
H2O MilliQ 9,5 μl
V 0,2 ml centrifugirke za PCR smo odpipetirali po 24
μl reakcijske mešanice ter na koncu v vsako centrifugirko dodali še 1 μl matrične DNA
(priprava opisana zgoraj, poglavje 3.2.2).
Tabela 4: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov izbranih virulentnih
dejavnikov.
Vzorce smo dali v aparaturo za PCR (PCR Mastercycler ep Gradient, Eppendorf) in izvedli
verižno reakcijo s polimerazo.
Za gena sopB in invA po programu:
30X
Za gen spvC po programu:
30X
gen nukleotidno zaporedje (5' – 3')
velikost
pomnožka (bp) referenca
sopB-F CCTCAAGACTCAAGATG 220
Hur s sod., 2011
sopB-R TACGCAGGAGTAAATCGGTG
spvC-F ACTCCTTGCACAACCAAATGCGGA 571
spvC-R TGTCTCTGCATTTCGCCACCATCA
sifA-F ATGCCGATTACTATAGGCAATGG 1011
sifA-R TTATAAAAAACAACATAAACAGCCG
invA-F ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT 244
invA-R AGACGACTGGTACTGATCGATAAT
94°C 5 minut
94°C 30 sekund
52°C 30 sekund
72°C 30 sekund
72°C 10 minut
95°C 5 minut
94°C 30 sekund
55°C 30 sekund
74°C 1 minuta
74°C 10 minut
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
34
Za gen sifA po programu:
30X
Po končani verižni reakciji smo preverili uspešnost pomnoževanja z agarozno gelsko
elektroforezo, kot je opisano za gene blaCTX-M (poglavje 3.4.2). Kot standard DNA smo
uporabili mešanico fragmentov DNA znanih velikosti (GeneRuler™ 100 bp Plus DNA
Ladder, Thermo Fischer Scientific). Na gel smo nanesli tudi pozitivne kontrolne reakcije,
kjer smo pomnoževali dele genov izbranih virulentnih dejavnikov (navedenih v tabeli 4).
Po končani elektroforezi smo gel osvetlili z UV transluminatorjem (G-Box Chemi,
Syngene) in ga fotografirali. Ugotavljali smo prisotnost pomnožkov in velikost
pomnoženih fragmentov DNA določili primerjalno z uporabo nanešenega standarda DNA.
95°C 5 minut
94°C 30 sekund
55°C 30 sekund
74°C 1,5 minut
74°C 10 minut
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
35
4 REZULTATI
4.1 PRISOTNOST VRST IZ RODU SALMONELLA PRI PLAZILCIH
Plazilci so vedno bolj priljubljene domače živali, ki pa se vse pogosteje omenjajo kot
prenašalci salmonele na človeka. Zato smo proučili, kolikšen del plazilcev, gojenih po
šolah in visokošolskih zavodih ter pri zasebnih gojiteljih v Ljubljani in okolici, je okuženih
s salmonelo. Ker se salmonele primarno nahajajo v prebavnem traktu živali, preko
iztrebkov pa se lahko prenesejo na druge živali ali človeka, smo pregledali iztrebke in brise
iz kloak 66-ih plazilcev. Največji odstotek pregledanih vzorcev so predstavljale kače, ki jih
je bilo 42 (63,6%), 17 (25,8%) je bilo kuščarjev, ter 7 (10,6%) želv (priloga 1).
Od vseh pregledanih živali jih je bilo s salmonelo okuženih kar 42,4 % (28 okuženih živali
od 66-ih). Največji delež okuženih živali smo zasledili pri kuščarjih (10 pozitivnih na
salmonelo; 58,8 %), pri kačah je bil odstotek okuženih živali nekoliko nižji (18 pozitivnih
živali; 42,9 %), pri želvah pa salmonele nismo zasledili (slika 5).
Slika 5: Razmerje med številom okuženih (pozitivni) in neokuženih (negativni) živali s salmonelo pri
posameznih skupinah testiranih plazilcev.
Primerjali smo tudi število živali, okuženih s salmonelo, med zasebnimi gojitelji in
izobraževalnimi ustanovami (slika 6). Pri zasebnih gojiteljih je bila salmonela izolirana iz
17 živali (40,5 %) in sicer pri 13-ih kačah (56,6%) in 4-h kuščarjih (44,4 %). Iz
izobraževalnih ustanov pa je bilo 11 živali pozitivnih na salmonelo (45,8%), od tega 5 kač
(55,6 %) in 6 kuščarjev (75 %).
24
7 7
18
10
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
kače kuščarji želve
šte
vilo
pre
gle
dan
ih ž
ival
i
pozitivni
negativni
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
36
Slika 6: Razmerje med številom okuženih (pozitivni) in neokuženih (negativni) živali s salmonelo pri
posameznih skupinah testiranih plazilcev primerjalno med zasebnimi gojitelji in izobraževalnimi
ustanovami.
Če si ogledamo še razmerja okuženih/ neokuženih živali s salmonelo med posameznimi
gojitelji (slika 7) lahko opazimo, da so bile pri nekaterih izobraževalnih ustanovah vse
pregledane živali okužene s salmonelo (kuščarji pri ustanovi A in kače pri ustanovi F).
Slika 7: Razmerje med številom okuženih (pozitivni) in neokuženih (negativni) živali s salmonelo pri
posameznih skupinah testiranih plazilcev primerjalno med posameznimi zasebnimi gojitelji in
izobraževalnimi ustanovami.
Vse domnevne izolate salmonel smo najprej identificirali z izbranimi biokemijskimi testi.
Izbor biokemijskih testov s podanimi rezultati, ki smo jih uporabili za ločevanje salmonel
od sorodnih enterobakterij, je predstavljen v tabeli 5.
20
5
04
2
7
13
4
0
56
0
0
5
10
15
20
25
30
35
kače kuščarji želve kače kuščarji želve
zasebni gojitelji izobraževalne ustanove
štev
ilo p
regl
edan
ih ž
ival
i
pozitivni
negativni
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
37
Tabela 5: Rezultati biokemijskih testov za salmonelo in sorodne vrste (povzeto po Holt, 1994).
biokemijski test Salmonella Proteus Citrobacter Shigela
LDC + - - -
ONPG - - + - ( + S. sonnei)
Indol - - (+ P. vulgaris) + (- C. freundii) +, -
H2S + +, - - (+ C. freundii) -
Ureaza - + +, - -
fermentacija
glukoze + + + +
fermentacija
laktoze -, + - d -
Legenda; (+) 90 % ali več sevov je pozitivnih; (-) 90 % ali več sevov je negativnih; (+,-) variabilna lastnost;
(d) 11-89% sevov je pozitivnih.
Rezultati fenotipskih lastnosti salmonel, dobljeni z izbranimi biokemijskimi testi, so
predstavljeni v tabeli 6. Fenotipski profili testiranih sevov so večinoma odgovarjali profilu
salmonele.
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
38
Tabela 6: Rezultati izbranih biokemijskih testov za izolate salmonel iz plazilcev.
EXB
oznaka
seva
LDC ONPG indol TSI
urea
glukoza laktoza H2S
L320 + - - + - + -
L328 + - - + - + -
L329 + - - + - + -
L330 + + - + - + -
L339 + - - + - + -
L340 + + - + - + -
L341 + - - + - + -
L342 + - - + - + -
L343 + - - + - + -
L344 + - - + - + -
L345 + - - + - + -
L346 + - - + - + -
L347 + - - + - + -
L348 + + - + - + -
L349 + - - + - + -
L350 + + - + - + -
L351 + - - + - + -
L352 + + - + - + -
L353 + + - + - + -
L354 + + - + - + -
L355 + + - + - + -
L356 + - - + - + -
L369 + - - + - + -
L370 + + - + - + -
L371 + + - + - + -
L372 + - - + - + -
L373 + + - + - + -
L374 + - - + - + +, -
L375 + - - + - + - Legenda:
LDC: (+) prisotnost encima lizin dekarboksilaze; ONPG: (+) prisotnost encima β – galaksidaze; INDOL: (+)
prisotnost encima triptofanaze
TSI (trojni sladkor z železom): (+) (fermentacija glukoze in/ali laktoze, H2S (+) produkcija vodikovega
sulfida; UREA: (+) prisotnost encima ureaze
S krepko pisavo so označeni sevi, za katere smo na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S rRNA
potrdili, da gre za vrsto Salmonella enterica subsp. arizonae. Atipični rezultati so označeni s sivo.
Pri sevih S31, S32B, S33B, S34, S35, S38, S39, S40, S41 in L335 biokemijskih testov
nismo opravljali.
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
39
Da bi potrdili fenotipsko identifikacijo smo vse izolate salmonel še genotipsko
identificirali s pomnožitvijo in sekvenciranjem dela gena za 16S rRNA in primerjali
njihova zaporedja s homologi iz podatkovne zbirke Ribosomal Database Project II.
Ugotovili smo, da se večina sevov uvršča v podvrsto Salmonella enterica subsp. enterica,
le v štirih primerih (sevi EXB L352, L353, L354 in L370) smo izolirali podvrsto
Salmonella enterica subsp. arizonae (priloga 1). Testirane živali so bile okužene ali z eno
ali z drugo podvrsto.
Z analizo nukleotidnega zaporedja dela gena za 16S rRNA smo pri nekaterih izolatih
ugotovili, da ne gre za salmonele in jih izločili iz nadaljnega dela. Večinoma so bili to
izolati rodov Providencia, Citrobacter, Pseudomonas in Klebsiela.
4.2 ODPORNOST IZOLIRANIH SEVOV PROTI IZBRANIM ANTIBIOTIKOM
Za vse izolirane seve salmonel iz plazilcev smo ugotavljali, ali so občutljivi ali odporni
proti desetim izbranim antibiotikom. Uporabili smo tetraciklin, streptomicin
(aminoglikozidni antibiotik), beta-laktamske antibiotike iz skupin penicilinov (ampicilin),
karbapenemov (imipenem) in cefalosporinov 3. generacije (cefotaksim in ceftazidim, tudi
v kombinaciji s inhibitorji beta-laktamaz, kot je klavulanska kislina) ter kinolone
(nalidiksična kislina) in fluorokinolone (norfloksacin in ciprofloksacin). Izvedli smo
difuzijski antibiogram po Kirby-Bauerju za vse testirane antibiotike (slika 8) razen za
ampicilin (inkorporacijski antibiogram). Premeri con inhibicije rasti in rast na ploščah z
ampicilinom so podani v tabeli 7.
Slika 8: Primer difuzijskega antibiograma po Kirby-Bauerju pri sevu salmonele z oznako EXB L373
(Foto: M. Farkaš)
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
40
Tabela 7: Rezultati odpornosti salmonel iz plazilcev proti izbranim antibiotikom
Antibiotiki
EXB oznaka seva
TE IMP S NOR NA CIP CTX CAZ CAZ/CLA AMPc
S31 32 37 17 37 31 40 38 34 34 -
S32B 28 31 9 36 22 38 37 31 32 -
S33B 27 33 17 36 27 38 37 32 32 -
S34 27 34 16 37 33 40 37 31 31 -
S35 29 30 8 36 28 37 36 31 34 -
S38 28 34 8 38 29 37 37 32 32 -
S39 29 37 9 40 28 41 38 31 34 -
S40 29 32 10 37 27 39 37 33 35 -
S41 30 32 10 38 28 38 34 30 32 -
L320 28 35 16 38 31 45 36 32 32 -
L328 28 31 16 36 27 37 37 31 32 -
L329 31 37 17 39 29 42 37 31 35 -
L330 31 34 10 41 32 43 42 37 39 +
L335 30 33 17 41 31 43 38 34 35 -
L339 31 32 17 38 30 39 39 32 34 -
L340 25 34 11 30 22 32 33 30 30 -
L341 8 21 18 41 31 44 46 39 40 -
L342 8 31 19 41 29 42 40 37 37 -
L343 29 37 18 37 29 41 38 32 33 -
L344 30 31 17 31 28 35 35 29 31 -
L345 27 32 16 34 24 37 36 28 30 -
L346 26 30 17 35 26 36 35 30 31 -
L347 25 30 16 35 26 26 35 31 34 -
L348 31 34 11 39 30 41 41 37 37 -
L349 27 31 17 37 26 36 36 31 31 -
L350 29 33 12* 36 30 38 39 34 35 -
L351 29 33 18 37 31 40 40 35 35 -
L352 28 33 18 38 26 39 37 34 34 -
L353 28 35 19 35 25 35 38 33 34 -
L354 29 36 20 36 28 37 37 33 33 -
L355 30 34 20 36 27 36 37 31 31 -
L356 29 37 18 36 30 37 35 30 30 -
L369 31 33 20 39 29 40 37 33 34 -
L370 28 34 18 35 26 36 36 30 32 -
L371 26 34 11 35 22 36 36 32 32 -
L372 30 34 21 41 32 43 39 34 34 -
L373 9 27 16 42 31 41 42 35 35 +
L374 28 33 17 35 27 40 34 28 30 -
L375 27 30 18 35 27 38 34 29 29 -
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
41
Legenda: TE – tetraciklin (30 μg), IMP – imipenem (10 μg), S – streptomicin (10 μg), NOR – norfloksacin
(10 μg), NA – nalidiksična kislina (30 μg), CIP – ciprofloksacin (5 μg), CTX – cefotaksim (30 μg), CAZ –
ceftazidim (30 μg), CAZ/CLA – ceftazidim/klavulanska kislina (30/10 μg), AMPc – ampicilin (100 mg/l)
Številke predstavljajo premer cone inhibicije rasti (v mm). Temneje obarvano okence – sev je odporen proti
testiranem antibiotiku; zvezdica (*) ob številki – sev je intermediaren. Pri inkorporacijskem antibiogramu za
ampicilin AMPc; (+) rast (odpornost proti AMPc), (-) ni rasti (občutljivost proti AMPc). S krepko pisavo so
označeni sevi, za katere smo na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S rRNA potrdili, da gre za vrsto
Salmonella enterica subsp. arizonae.
Proti antibiotikom je bilo odpornih razmeroma malo sevov, izmed 39 sevov le 13 (33,3%).
Od tega je bilo 11 sevov (28,2%) takšnih, ki so bili odporni proti enemu izmed
uporabljenih antibiotikov. Tako sta bila 2 seva (5,1%) odporna proti tetraciklinu in 9 sevov
(23,1%) proti streptomicinu. Samo dva seva (5,1%) sta pokazala hkratno odpornost proti
dvema izbranima antibiotikoma, sev L373 proti streptomicinu in ampicilinu, sev L330 pa
proti tetraciklinu in ampicilinu. V enem primeru je bil sev intermediaren proti
streptomicinu.
Vsi sevi, ki so bili odporni proti antibiotikom so bili sevi podvrste Salmonella enterica
subsp. enterica. Pri sevih podvrste Salmonella enterica subsp. arizonae (L352, L353, L354
in L370) odpornosti nismo zaznali.
4.2.1 Prisotnost genov ESBL skupine CTX-M in PMQR skupine QNR
Pri vseh sevih salmonel smo s PCR preverili prisotnost genov za beta-laktamaze z
razširjenim spektrom delovanja (ESBL) skupine CTX-M (podskupine M1, M2, M8, M9 in
M25) (slika 9).
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
42
Slika 9: Agarozni gel po elektroforezi z nanešenimi pomnožki PCR za ugotavljanje prisotnosti genov
beta-laktamaz (ESBL) skupine CTX-M.
Ob desnem robu je nanešena mešanica fragmentov DNA znanih velikosti (GeneRuler 50bp DNA Ladder
(Thermo Fischer Scientific).
Od 39 sevov pri nobenemu nismo zasledili pomnožka prave velikosti za gene blaCTX-M.
Prav tako smo preverili tudi prisotnost genov za plazmidno posredovano odpornost proti
kinolonom (PMQR) skupine QNR, ki so povezani z nizko odpornostjo proti
fluorokinolonom (slika 10).
Ugotovili smo, da izolirani sevi salmonel iz plazilcev nimajo genov za plazmidno
posredovano odpornost proti kinolonom skupine QNR.
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
43
Slika 10: Agarozni gel po elektroforezi z nanešenimi pomnožki PCR za ugotavljanje prisotnosti genov
qnr pri izbranih sevih salmonel iz plazilcev.
Ob robovih je nanešena mešanica fragmentov DNA znanih velikosti (GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder
(Thermo Fischer Scientific)). Kot pozitivna kontrola je na desni strani vsakega gela tik pred standardom
DNA nanešena pozitivna kontrola (kontroli) z označeno velikostjo.
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
44
4.3 PRISOTNOST IZBRANIH VIRULENTNIH DEJAVNIKOV
S PCR smo pri vseh izoliranih sevih salmonel iz plazilcev preverili tudi prisotnost izbranih
virulentnih dejavnikov (invA, sopB, spvC, sifA) (tabela 8).
Tabela 8: Prisotnost izbranih virulentnih dejavnikov pri salmonelah iz plazilcev.
EXB oznaka seva invA (244bp) sopB (220bp) spvC (571bp) sifA (1011bp)
S31 + - - +
S32B - - - -
S33 + + - -
S34 + + - -
S35 + + - -
S38 + + - -
S39 + + - -
S40 - - - -
S41 - - - -
L320 + + - -
L328 + + - +
L329 + + - +
L330 + + - -
L335 + + - -
L339 + + - +
L340 + + - -
L341 + + - -
L342 + + - +
L343 + + - +
L344 + + - +
L345 + + - +
L346 + - - -
L347 + - - -
L348 + + - -
L349 + + - +
L350 + + + -
L351 + + + +
L352 + + - -
L353 + + - -
L354 + + - -
L355 + + + -
L356 + + - +
L369 + + - -
L370 + - - -
L371 + + - -
L372 + + - -
L373 + - - -
L374 + - - -
L375 + - + +
Legenda: + pozitivno, - negativno
S krepko pisavo so označeni sevi, za katere smo na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S rRNA
potrdili, da gre za vrsto Salmonella enterica subsp. arizonae.
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
45
Gen za virulentni dejavnik invA smo dokazali pri 92,3% vseh salmonel iz plazilcev,
produkt tega gena sodeluje pri vdoru salmonele v celice črevesnega epitelija. Pogost je bil
tudi sopB (74,4%), ki kodira fosfoinozitid fosfatazo, pri 30,8% izolatov pa smo potrdili
tudi gen sifA (Protein SifA omogoča salmonelam razmnoževanje v gostiteljski celici.
Najmanj salmonel je imelo gen spvC (10,3%), produkt tega gena je fosfotreoninliaza, ki
defosforilira MAP kinaze in s tem prepreči odziv gostiteljske celice na napad salmonele.
Na sliki 11 je predstavljeno razmerje med številom pozitivnih in negativnih sevov
salmonel za določen virulentni dejavnik.
Slika 11: Prisotnost izbranih virulentnih dejavnikov pri salmonelah iz plazilcev.
Največ je bilo izolatov, ki so vsebovali 2 gena (46,2 %), 30,8 % izolatov je imelo 3 gene za
virulentne dejavnike, 12,8 % izolatov je vsebovalo 1 gen. Pri treh izolatih (7,7 %) nismo
potrdili nobenega od testiranih genov. En izolat (L351) je vseboval vse štiri testirane gene
za virulentne dejavnike (slika 12).
36
30
4
12
3
9
35
27
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
invA sopB spvC sifA
štev
ilo v
zorc
ev
negativni
pozitivni
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
46
Slika 12: Število sevov salmonel iz plazilcev ki vsebuje določeno število virulentnih dejavnikov.
Pri nadaljnji razdelitvi na kače in kuščarje (slika 13) smo ugotovili, da sevi izolirani iz kač
vsebujejo več genov za virulentne dejavnike kot tisti, izolirani iz kuščarjev. Največja
razlika je pri invA, kjer smo pri vseh sevih salmonel iz kač (100%) potrdili prisotnost tega
gena, medtem ko je bil pri salmonelah iz kuščarjev prisoten v 78,6%.
Slika 13: Prikaz prisotnosti izbranih virulentnih dejavnikov (v odstotkih) glede na vrsto plazilca iz
katerega je bila izolirana salmonela.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 1 2 3 4
število virulentnih dejavnikov
štev
ilo s
evo
v
100
60
12
32
78,6
57
7
28,6
0
20
40
60
80
100
120
invA sopB spvC sifA
Štev
ilo p
ozi
tivn
ih v
torc
ev [
%]
kače
kuščarji
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
47
5 RAZPRAVA IN SKLEPI
5.1 RAZPRAVA
Plazilci so vedno bolj priljubljene domače živali, ki pa se vse pogosteje omenjajo kot
prenašalci salmonele na človeka. Primarno se bakterije nahajajo v prebavnem traktu živali,
preko iztrebkov pa se okužba lahko prenese tako na druge živali, kot tudi na človeka.
V raziskavi smo zajeli plazilce zasebnih gojiteljev in izobraževalnih ustanov iz Ljubljane
in okolice, ter iz njihovih iztrebkov ali brisov iz kloak pridobili seve Salmonella enterica
subsp. enterica in Salmonella enterica subsp. arizonae. Prisotnost salmonele v iztrebkih
plazilcev smo primerjali z dosedanjimi objavami. Izolirane seve smo nato testirali na
odpornost proti izbranim antibiotikom, ter preverili prisotnost nekaterih genov, ki so
povezani z odpornostjo proti beta-laktamskim in kinolonskim antibiotikom. Preverjali smo
tudi prisotnost izbranih genov za virulentne dejavnike.
5.1.1 Prisotnost bakterij rodu Salmonella pri plazilcih
V naši raziskavi smo potrdili prisotnost salmonel pri plazilcih. Odstotek s salmonelo
okuženih živali je bil dokaj visok, saj smo salmonelo potrdili kar pri 42,4 % pregledanih
živali, hkrati pa smo ugotovili, da se pojavnost salmonel med vrstami plazilcev razlikuje
(59 % okuženih kuščarjev, 43 % okuženih kač in nobene okužene želve). Če primerjamo
odstotek s salmonelo okuženih živali drugih raziskav z našo, ugotovimo precejšnja
odstopanja. Ebani s sod. (2004) in Gay (2014) sta ugotovila skoraj za polovico nižje število
okuženih plazilcev, medtem ko je Pasmans s sod. (2005) v svoji raziskavi potrdil prisotnost
salmonele v več kot 60 %. Razlike se pojavljajo tudi pri številu okuženih živali pri
posameznih skupinah plazilcev. Corrente s sod. (2004) in Geue in Löschner (2005) so tako
kot mi potrdili nizko okuženost pri želvah, oziroma salmonel tu niso odkrili. V splošnem
(Ebani s sod., 2004; Corrente s sod., 2004; Pfleger s sod., 2003) velja, da so prenašalci
salmonel največkrat kuščarji. Haydeskov s sod. (2013) pa je v svoji raziskavi največ okužb
potrdil pri kačah, sledile so želve, najmanj okuženih je bilo kuščarjev. V primerjavi števila
okuženih plazilcev pri zasebnih gojiteljih in v izobraževalnih ustanovah bistvenih razlik
nismo ugotovili, pri zasebnih gojiteljih je bila salmonela izolirana pri 40,5%, v
izobraževalnih ustanovah pa pri 45,8% testiranih živali. Zanimiv je rezultat števila
okuženih živali pri izobraževalnih ustanovah, kjer so bile v enem primeru pozitivne vse
testirane kače, v drugem primeru pa vsi testirani kuščarji. Vzrok, da so vse živali pri istem
gojitelju okužene s salmonelo, je lahko okužena hrana živali, lahko je v enem terariju
naseljenih več živali, kjer se okužba prenaša z ene živali na drugo. Glede na to, da so ravno
nekatere izobraževalne ustanove primer, kjer so okužene vse živali, bi do okužb lahko
prišlo tudi posredno. Za živali v šolskih terarijih običajno skrbi več kot ena oseba, prav
tako pa z njimi rokujejo tudi učitelji in učenci pri pouku.
Največkrat izolirana podvrsta salmonel iz proučevanih plazilcev je bila Salmonella
enterica subsp. enterica, odkrili pa smo tudi seve Salmonella enterica subsp. arizonae.
Corrente s sod. (2004) in Pasmans s sod. (2005) sta tako kot mi največkrat izolirala
Salmonella enterica subsp. enterica, medtem ko je Haydeskov s sod. (2013) največkrat
izoliral Salmonella enterica subsp. diarizonae, ki je mi nismo določili. Med pogosto
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
48
izoliranimi se omenja tudi Salmonella enterica subsp. salamae, Salmonella enterica subsp.
arizonae in Salmonella enterica subsp. diarizonae (Bauwens s sod., 2006).
Do vseh teh odstopanj v številu okuženih živali med posameznimi raziskavami lahko pride
že zaradi samih postopkov izolacije, saj se na selektivnih gojiščih za salmonele (kot sta
XLD in SSA) lahko pojavijo tudi atipične salmonele, ki jih tako ne prepoznamo kot
salmonele in jih ne izoliramo. Na rezultate lahko vpliva tudi starost odvzetih vzorcev
(iztrebkov in brisov kloak, ustne votline, površine kože), zato je dobro, da vzorce takoj po
odvzemu nacepimo na primerna gojišča.
Biokemijski testi, s katerimi smo ugotavljali fenotipske lastnosti salmonel, so nam služili
kot pripomoček za lažje določanje vrst in za razlikovanje salmonel od ostalih
enterobakterij. Uporabili smo več različnih testov, dobljene rezultate pa smo primerjali z
opisi iz Bergey-evega priročnika (Holt, 1994), ter izolate na osnovi fenotipskih profilov
posameznih rodov in vrst enterobakterij poskušali identificirati. Ker imajo bakterijske
vrste, ki so si sorodstveno blizu, lahko zelo podobne fenotipske profile in ker imajo lahko
različne podvrste salmonel tudi atipične lastnosti (tabela 6), je identifikacija na osnovi
rezultatov biokemijskih testov nezanesljiva. Zato smo za potrditev uporabili genotipsko
identifikacijo na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S rRNA.
5.1.2 Odpornost salmonel proti antibiotikom in prisotnost virulentnih dejavnikov
Problem odpornosti bakterij proti antibiotikom se povečuje in predstavlja tveganje za javno
zdravje. O sami odpornosti salmonel, izoliranih iz plazilcev, pa do sedaj ni bilo veliko
podatkov (Yan s sod., 2003; Chen s sod., 2010). V literaturi se omenja odpornost salmonel
proti streptomicinu, tetraciklinu, ampicilinu in tudi proti nalidiksični kislini (Corrente s
sod., 2004; Chen s sod., 2010).
V raziskavi smo uporabili 10 različnih antibiotikov in z difuzijskim antibiogramom po
Kirby-Bauerju ter inkorporacijskim antibiogramom preverjali odpornost izoliranih sevov
proti izbranim antibiotikom.
Ugotovili smo, da je med izoliranimi sevi salmonel delež odpornih proti izbranim
antibiotikom relativno majhen. Tako je bilo odpornih 33,3 % sevov, največ proti
antibiotiku streptomicin iz skupine aminoglikozidnih antibiotikov. Med izoliranimi sevi sta
bila tudi dva takšna, ki sta bila odporna proti dvema antibiotikoma. V enem primeru je bil
sev odporen proti streptomicinu in ampicilinu, v drugem primeru pa proti tetraciklinu in
ampicilinu. Vsi sevi, ki so bili odporni proti antibiotikom so pripadali podvrsti Salmonella
enterica subsp. enterica, med podvrsto Salmonella enterica subsp. arizonae rezistenc
nismo odkrili. Salmonele iz plazilcev so tako večinoma občutljive za antibiotike, ki se
danes najpogosteje uporabljajo za zdravljenje bakterijskih okužb.
Z vidika veterine in medicine je najbolj zanimiva odpornost proti beta – laktamskim
antibiotikom in kinolonom, saj sta ti dve skupini antibiotikov največkrat uporabljeni za
zdravljenje številnih bakterijskih okužb. Proti tema dvema skupinama so bili naši sevi
salmonel večinoma občutljivi, z izjemo dveh sevov, ki sta bila odporna proti ampicilinu.
Zaradi splošne uporabe beta – laktamskih antibiotikov in kinolonov, ter pomembnosti teh
dveh skupin antibiotikov za ljudi, smo se odločili preveriti tudi prisotnost beta – laktamaz z
razširjenim spektrom delovanja (ESBL) iz skupine CTX-M, ter prisotnost genov za
plazmidno odpornost proti kinolonom skupine QNR.
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
49
Encimi beta-laktamaze, ki deaktivirajo beta-laktamske antibiotike, so med najbolj
razširjenimi, hkrati pa so tudi najpogostejši vzrok za odpornost enterobakterij proti beta-
laktamskim antibiotikom (Robicsek s sod., 2006; Reeves, 2012; Jacoby, 2005). Beta-
laktamaze z razširjenim spektrom delovanja (Extended-Spectrum Beta – Lactamases;
ESBL) so encimi, ki posredujejo odpornost tudi proti tretji in četrti generaciji
cefalosporinov (ceftazidim, cefotaksim) (Bush s sod, 1995; Samaha – Kfuory in Araj,
2003). Zato smo med izoliranimi sevi salmonel preverjali prisotnost njihovih genov in
sicer skupine CTX-M. Med izoliranimi sevi Salmonella enterica subsp. enterica in
Salmonella enterica subsp. arizonae prisotnosti genov blaCTX-M nismo odkrili. Prisotnosti
genov za plazmidno posredovano odpornost proti kinolonom skupine QNR tudi nismo
potrdili. Odpornost proti kinolonom je največkrat posledica pretirane uporabe in zlorabe
antibiotikov, saj zaradi mutacij prihaja do sprememb v nukleotidnih zaporedjih genov za
tarče kinolonov (topoizomeraze tipa II).
Prisotnost virulentnih dejavnikov pri izoliranih sevih smo preverjali s PCR. Zanimala nas
je prisotnost plazmidno kodiranega gena spvC, genov za dva virulentna dejavnika, ki ležita
na otoku patogenosti SP – 1 (invA in sopB), ter gena za virulentni dejavnik iz SP – 2 (sifA).
Corrente s sod. (2006) je v raziskavi salmonel iz plazilcev potrdil prisotnost gena sopE,
medtem ko gena spvC ni uspel določiti. Tudi Hur s sod. (2011) poroča o virulentnih
dejavnikih, ki se pojavljajo pri salmoneli, največkrat je potrdil gene, ki ležijo na SP – 1 in
SP – 2, ter tudi gene spv. Prisotnost teh genov povečuje patogenost salmonel in možnost
prenosa okužb na človeka. Tako smo v naši raziskavi gen za invA, njegov produkt sodeluje
pri vdoru salmonele v celice črevesnega epitelija, potrdili pri 92,3% vseh izolatov, sledil je
sopB, ki smo ga potrdili pri 74,4 % sevov (produkt tega gena je fosfoinozitid fosfataza, ki
skrbi za reorganizacijo aktinskega citoskeleta in preoblikovanje plazmaleme gostiteljske
celice), nato sifA (30,8 % sevov), najmanj pogost pa je bil gen spvC (10,3 % sevov), ki
kodira fosfotreoninliazo, ta preprečuje odziv gostiteljske celice na salmonelo z
defosforilacijo MAP kinaz. Največ izolatov je vsebovalo dva (30,8%) ali tri (46,2%)
testirane gene za virulentne dejavnike, samo trije (7,7 %) niso imeli nobenega testiranega
gena, 5 (12,8%) je vsebovalo enega, v enem samem izolatu pa smo potrdili prisotnost vseh
štirih testiranih genov za virulentne dejavnike. Zanimala nas je tudi pogostost genov za
virulentne dejavnike med posameznimi skupinami plazilcev, kjer smo ugotovili, da imajo
sevi, izolirani iz kač, več testiranih genov virulentnih dejavnikov, najbolj opazno je bilo pri
invA, kjer smo njegovo prisotnost potrdili prav pri vseh kačah. Isti gen je bil pogost tudi pri
kuščarjih, le v nižjem odstotku (78,6%). Pred začetkom študije smo sklepali, da salmonela
vsebuje gene za virulentne dejavnike, ter da je lahko potencialno patogena za ljudi. Z
rezultati, ki smo jih dobili, lahko to potrdimo, saj smo dokazali prisotnost genov, ki
omogočajo vdor in tudi preživetje salmonele v gostiteljskih celicah.
Z našo raziskavo smo torej potrdili prisotnost salmonele pri plazilcih. Ta se lahko
navzkrižno prenaša iz ene živali na drugo, ali v okolico, hkrati pa obstaja tudi možnost
prenosa na človeka, sploh če pri delu s plazilci nismo previdni. Da preprečimo razširjanje
salmonel je pomembno, da smo pri negi živali previdni, da ne okužimo sebe, drugih ljudi
ali živali iz drugih terarijev. Do prenosa okužbe s plazilca na človeka ne more priti, če se
človek zgolj dotakne plazilca, se pa možnosti za okužbo povečajo, če z delom telesa, ki je
bil v stiku s plazilcem, sežemo v usta (Gray, 2011). Plazilcem ne dovolimo prostih izhodov
po kuhinji ali kopalnici, živali damo tudi veterinarsko pregledati. Prav tako je pomembno,
da pazimo pri higieni hrane za živali in samih terarijev ter da si po vsakem stiku s plazilci,
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
50
njihovim terarijem ali hrano umijemo roke. Pomembno je tudi, da otroci, mlajši od pet let,
ljudje z oslabljenim imunskim sistemom, ter odrasli nad petinšestdeset let ne rokujejo s
plazilci, saj je pri njih povečano tveganje za okužbo (Radford, 2011).
5.2 SKLEPI
1. Od 66 testiranih plazilcev iz izobraževalnih ustanov in zasebnih gojiteljev (Ljubljana z
okolico) smo pri 42,4 % izolirali salmonelo, od tega pri 58 % kač in 42,9 % kuščarjev,
želve, ki smo jih testirali, pa niso bile okužene z njimi. Med zasebnimi gojitelji in
izobraževalnimi ustanovami ni bilo večjih razlik v okuženosti živali, v dveh primerih
izobraževalnih ustanov pa smo potrdili, da so bile okužene vse testirane kače ali kuščarji.
Najverjetneje so se okužbe prenesle z ene živali na drugo v terariju, preko hrane ali preko
oskrbnika.
2. Relativno manjši delež salmonel (33,3 %), izoliranih iz plazilcev, je bil odporen proti
testiranim antibiotikom. Od teh izolatov sta bila samo dva odporna proti dvema
antibiotikoma, ostali pa proti enemu samemu, streptomicinu ali tetraciklinu. Zato lahko
sklepamo, da so salmonele iz plazilcev še relativno občutljive za antibiotike, predvsem za
beta-laktame in kinolone, ki sta zaradi splošne rabe v veterini in tudi humani medicini
pomembni skupini.
3. Prisotnost genov za beta-laktamaze z razširjenim spektrom delovanja skupine CTX-M
nismo potrdili. Genov za plazmidno posredovano odpornost proti kinolonom (PMQR)
skupine QNR, ki so povezani z nizko odpornostjo proti fluorokinolonom, tudi nismo
zasledili.
4. Pri salmonelah iz plazilcev je večina izolatov vsebovala dva ali tri testirane gene za
virulentne dejavnike (invA, sopB, sifA in spvC), s čimer se povečuje možnost patogenosti
za živali in tudi ljudi. Najpogostejši je bil gen za virulentni dejavnik invA, ki ga je
vsebovalo 92,3 % vseh salmonel iz plazilcev, produkt tega gena sodeluje pri vdoru
salmonele v celice črevesnega epitelija.
5. Kljub temu, da pri izolatih iz plazilcev nismo potrdili pomembnejše odpornosti proti
antibiotikom, je pri delu z njimi potrebna previdnost, ker so sevi lahko potencialno
patogeni za ljudi, zaradi prisotnosti genov za virulentne dejavnike.
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
51
6 POVZETEK
Plazilci so v zadnjih letih vse bolj pogosti hišni ljubljenčki, narašča njihova priljubljenost
na razstavah in v živalskih vrtovih, prav tako pa so velikokrat naseljeni v terarijih
izobraževalnih zavodov, kjer služijo kot učni pripomoček, s katerim učenci podrobneje in
lažje spoznavajo živalske vrste in s katerimi se odpravlja tudi predsodke do manj poznanih
živalskih vrst. Kot se omenja v literaturi so plazilci potencialni prenašalci različnih
patogenih organizmov, med njimi tudi salmonel. Tako lahko žival izgleda povsem zdrava,
kljub temu pa je prenašalka salmonel, zato je pri rokovanju z njimi potrebna previdnost in
ustrezna higiena.
V naši raziskavi smo iz iztrebkov in brisov iz kloak plazilcev zasebnih gojiteljev in
izobraževalnih ustanov v Ljubljani in okolici izolirali salmonelo. Na podlagi fenotipskih in
genotipskih lastnosti (zaporedje gena za 16S rRNA) smo identifikacijo salmonel potrdili
pri 42,4% pregledanih plazilcev. Večina izolatov je pripadala podvrsti Salmonella enterica
subsp. enterica, štirje izolati pa Salmonella enterica subsp. arizonae. Največ okuženih
živali je bilo med kuščarji (58,8%), sledile so kače (42,9%), pri želvah salmonel nismo
identificirali. Bistvenih razlik med okuženostjo plazilcev pri zasebnih gojiteljih in
izobraževalnih ustanovah nismo zasledili, izstopala sta le dva izobraževalna zavoda, kjer
so bile okužene vse testirane živali. Tu je šlo najverjetneje za navzkrižne okužbe med
živalmi, ki živijo v istem terariju ali s posrednim prenosom prek oskrbnika, lahko pa je
prišlo do okužbe s hrano. Pri izoliranih sevih salmonel je bil delež odpornih proti izbranim
antibiotikom relativno majhen (33,3% odpornih sevov). Tako je bilo 28,2% sevov
odpornih proti enemu antibiotiku, največ proti streptomicinu (23,1%). Le dva seva sta bila
odporna proti dvema izbranima antibiotikoma, eden proti streptomicinu in ampicilinu,
drugi proti tetraciklinu in ampicilinu. Preverili smo tudi prisotnost genov za beta –
laktamaze z razširjenim spektrom delovanja skupine CTX-M in genov za plazmidno
posredovano odpornost iz skupine QNR. Prisotnost genov blaCTX-M nismo potrdili, prav
tako tudi ne genov qnr. Preverili smo tudi prisotnost genov za izbrane virulentne
dejavnike (invA, spoB, sifA, spvC). Največ izolatov je vsebovalo dva (30,8%) ali tri
(46,2%) testirane gene, v enem samem pa smo potrdili prisotnost vseh štirih genov za
virulentne dejavnike.
Izolati salmonel pri plazilcih torej imajo nekatere gene za virulentne dejavnike in so tako
lahko potencialno patogeni za ljudi. Relativno manjši delež teh izolatov pa je odporen proti
antibiotikom, tudi beta-laktamskim in kinolonom, ki se danes najpogosteje uporabljajo za
zdravljenje bakterijskih okužb. Kljub temu moramo s plazilci rokovati nadvse previdno.
Potrebna je ustrezna higiena rok po stiku z plazilci ali njihovo opremo, previdni moramo
biti, da okužb ne prenašamo iz ene živali na drugo in na ljudi. Ne glede na dobro stran
uporabe plazilcev v šolah velja omeniti, da se rokovanje s plazilci odsvetuje mlajšim
otrokom, osebam z oslabljenim imunskim sistemom, ali starejšim osebam.
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
52
7 VIRI
Abalem de sá I. V., Solari C.A. 2001. Salmonella in Brazilian and imported pet reptiles.
Brazillian Journal of Microbiology, 32: 293 - 297
Balcombe J., Ph. D. 2000. Animals in Higher Education, problems, alternatives &
recomendations. Washington DC, The Humane Society Press: 104
Balluard J. – M., Brischoux F., Bonnet X. 2011. Children Prioritize Virtual Exotic
Biodiversity over Local Biodiversity. Plos One 6, 8: e23152
Bauwens L., Vercammen F., Bertrand S., Collard M. J., De Ceuster S. 2006. Isolation of
Salmonella from enviormental samples collected in the reptile department of Antwerp Zoo
using different selective methods. Journal of Applied Microbiology, 101: 284 - 289
Bonnet R.2004. Groving group of extended - spectrum β lactamases. The CTX – M
Enzymes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 48: 1 – 14
Bush K., Jacoby G., Medeiros A.A. 1995. A functional classification scheme for beta –
lactamases and its correlation with molecular structur. Antimicrobial agents and
chemotherapy, 39 (6): 1211 – 1233
Case R. Best Pet Reptiles for Children, http://www.reptilesmagazine.com/Reptile-Care-
For-Beginners/Best-Pet-Reptiles-For-Children/ (21.7.2016)
Cavaco L. M., Hasman H., Xia S., Aarestrup F. M. 2009. qnrD, a novel gene conferring
transferable quinolone resistance in Salmonella enterica serovar kentucky and
Bovismorbificans strain of human origin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53 (2):
603 – 608
Catoir V., Poirel L., Rotimi V., Soussy C.-J., Nordmann P. 2007.Multiplex PCR for
detection of plasmid – mediated quinolone resistance qnr genes in ESBL –producing
enterobacterial isolates. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 60: 394 - 397
Cavalieri S. J., Harbeck R.J., McCarter Y.S., Ortez J. H., Ramkin I. D., Sautter R. L.,
Sharp S. E., Spiegel C. A. 2005. Manual of Antimicrobial Susceptibility Testing. American
Society of Microbiology, 151 – 166
Coates A. RM., Halls G., Hu Y. 2011. Novel classes of antibiotics or more of the same.
British Journal of Pharmacology, 163: 184 – 194
Corrente M., Madio A., Friedrich G. K., Greco G., Desario C., Tagliabue S., D'Incau M.,
Campolo M., Buanavoglia C. 2004. Isolation of Salmonella strains from reptile faeces and
comparison of different culture media. Journal of Microbiology, 96: 709 – 715
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
53
Chen C. – Y., Chen W. – C., Chin S. – C., Ali Y. – H., Tung K. – C., Chiou C. S., Hsu Y.
– M., Chung C. – C. 2010. Prevalence and antimicrobial susceptibility of salmonelae
isolates from reptiles in Taiwan. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 22: 44 –
50
De Jong B., Andersson Y., Ekdahl K. 2005. Effect of Regulation and Education on Reptile
– associated Salmonellosis. Emerging Infectious Diseases, 11 (3): 398 – 403 str.
Ebani V.V., Cerri D., Fratini F., Mielle N., Valentini P., Andreani E. 2005. Salmonella
enterica isolates from faeces of domestic reptiles and a study of their antimicrobial in vitro
sensitivity. Research in Veterinary Science 78: 117 – 121
Ebani V. V., Fratini F. 2005. Bacterial zoonoses among domestic reptiles. Analli fac. med.
vet. LVIII: 85 – 91
Garity G., Brenner D.J., Krieg N.R. Staley J.R., Bergey's manual of systematic
bacteriology. The proteobacteria, part: The Gammaproteobacteria,
Gay N., Le Hello S., Weill F.-X., de Thoisy B., Berger F. 2014. Salmonella serotypes in
reptiles and humans, French Guiana. Veterinary Microbiology, 170: 167 - 171
Gerhardt P. (glavni urednik), Murray R. G. E. , Wood W. A. Krieg N. R. (uredniki) 1994
Methods for general and molecular bacteriology. American Society for Bacteriology,
Washington DC, 791
Gray Z.T. 2011. Update: Reptiles and Salmonella. Journal of Exotic Pet Medicine, 20, 1:
14 – 17
Helmuth R., 2000. Antibiotic resistane in Salmonella. V: Salmonella in Domestic Animals.
Wray C., Wray A.(ed.), CABI publishing: 89 – 106
Hollinger K. 2000. Epidemiology and salmonellosis. V: Salmonella in domestic animals.
Wray C., Wray A.(ed.), CABI publishing: 341 – 353
Holt J.G., Krieg N.R., Sneath P.H.A., Staley J.T., Williams S.T. 1994. Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology, 9. izdaja, Williams and Wilkins
Hur J., Kim J.H., Park J.H., Lee Y.-J., Lee J.H. 2011. Molecular and virulence
characteristics of multi – drug resistant Salmonella Enteritidis strains isolated from poultry.
The Veterinary Journal, 189 (3): 306 – 311
Hydeskov H.B., Guardabassi L., Aalbæk B., Olsen K. E. P., Nielsen S.S., Bertelsen M.F.
2013. Salmonella Prevalence Among Reptiles in a Zoo Education Setting. Zoonoses and
Public Health, 60: 291 – 295
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
54
Ibarra J.A., Steele – Mortimer O. 2009. Salmonella – the ultimate insider. Salmonella
virulence factors that modulate intracellular survival. Cellular Microbiology, 11 (11): 1579
– 1586
Jacoby G.A. 2005. Mechanisms of resistance to quinolones. Clinical Infectious Diseases,
41 (2): 120 – 126 str.
Johnson J. R.1991. Virulence factors in Escherichia coli urinary tract infections. Clinical
Microbiology Reviews, 4 (1): 80 – 128
Kaplan M. 1997a. So, you think you want a reptile
http://www.anapsid.org/parent.html (21.7.2016)
Kaplan M. 1997b. The use of reptiles in public education
http://www.anapsid.org/repsineduc.html (21.7.2016)
Kastelec B., Harlander T. 2005. Enterobacteriaceae kot povzročiteljice okužb s hrano v
Sloveniji. Zdravstveno varstvo, 45: 165 – 174
Kaur J., jain S.K. 2011. Role of antigenes and virulence factors of Salmonella enterica
serovar Typhi in its pathogenesis. Microbiological Research, 167: 199 – 210
Keen E. J., Durso M. L., Meehan P. T. 2007. Isolation of Salmonella enterica and Shiga –
Toxigenic Echerichia coli o157 from Feces of Animals in Public Contact Areas of United
States Zoological Parks. Applied and enviormental Microbiology, 73, 1: 362 - 365
Krofel M., Cafuta V., Planinc G., Sopotnik M., Šalamun A., Tome S., Vamberger M.,
Žagar A., Razširjenost plazilcev v Sloveniji: pregled podatkov, zbranih do leta 2009.
Natura Sloveniae 11, 2: 61 – 99
Lačen I., Fošnarič S. 2009. Vpliv izkustva ob živih živalih v razredu na učenčevo
poznavanje živali in njihovih lastnosti. Revija za elementarno izobraževanje, 2 – 3: 163 –
174
Letno poročilo o zoonozah in povzročiteljih zoonoz, 2012. 2013. Uprava za varno hrano,
veterinarstvo in varstvo rastlin RS, 83 str.
Letno poročilo o zoonozah in povzročiteljih zoonoz, 2014. 2015. Uprava za varno hrano,
veterinarstvo in varstvo rastlin RS, 98 str.
Madigan M. T., Martinko J. M. 2006. Brock biology of microorganisms. 11th edition.
Upper Saddle River, New Jersey, Perrson Prentice Hall, 992 str.
Marcus L.S., Brumell J. H., Pfeifer C. G., Finlay B.B. 2000. Salmonella pathogenicity
Islands: big virulence in small packages. Microbes and Infection, 2 (2): 145 – 156
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
55
McGriffin H., Brownley N., 1980. Animals in Education: USE of Animals in High School
Biology Classes and Science Fairs. Washington DC, The Institute fort he Study of Animal
Problems: 160 str.
Mermin J., Hutwagner L., Vugia D., Shallow S., Daily P., Bender J., Koehler J., Marcus
R., Angulo F.J. 2004. Reptiles, Amphibians, and Human Salmonella Infection: A
Population – Based, Case – Control Study. Clinical Infectious Diseases, 38, 3: 253 - 261
Micorbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of
Salmonella spp., ISO 2002
Mitchell A. M., Shane M. S. 2001. Salmonella in Reptiles. Seminars in Avian and Exotic
Pet Medicine, 10, 1: 25 – 35
Mršić N. 1997. Plazilci (Reptilia) Slovenije. Ljubljana, Zavod republike Slovenije za
šolstvo: 167 str.
Ornik D. Navodila VURS-A v primerih, ko se na šoli gojijo živali. 2007. Ministrstvo za
izobraževanje, znanost in šport (18.7.2016)
http://www.mizs.gov.si/nc/si/medijsko_sredisce/novica/article/12058/5595/
Pačnik J. 2008. Zoonoze pri pticah, malih sesalcih in plazilcih. Revija Vita. 63: 5
(27.6.2016)
https://www.revija-vita.com/vita/63/Zoonoze_pri_pticah,_malih_sesalcih_in_plazilcih
Pasmans F., Martel A., Boyen F., Vandekerchove D., Wybo I., Immerseel F., V.,
Heyndrickx M., Collard J. M., Ducatelle R., Haesebrouck F. 2005. Characterization of
salmonella isolates from captive lizards. Vetrinary Microbiology, 110: 285 – 291
Pedersen K., Lansen – Nielsen A. – M., Nordentoft S., Hammer A.S. 2009. Serovars of
Salmonella from captive reptiles. Zoonoses and Public Health, 56: 238 – 242
Pfleger S., Benyr G., Sommer R., Hassi A. 2003. Pattern of Salmonella excretion in
amphibians and reptiles in a vivarium. International Journal of Hygiene and Enviormental
Health, 206: 53 – 59
Pravilnik o zaščiti hišnih živali. Ur. l. RS, št. 51/2009
Radford G. Davis 2011. Caring for family pets, choosing and keeping our companion
animals healthy. ABC – CLIO, LLC: 224 str.
Reeves P.T. 2012. Antibiotics: Groups and properties. V: Chemical Analysis of Antibiotic
Residues in Food. Wang J., MacNeil J. D., Kay J. F. (ed.) John Wiley & sons: 1-60
Reptile - associated salmonellosis. 2013. The Center for Food Security & Public Health, 6
http://www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdfs/reptile_associated_salmonellosis.pdf,
(5.8.2016)
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
56
Robicsek a., Jacoby G.A., Hooper D. C. 2006. The Worldwide emergence of plasmid –
mediated quinolone resistance. Lancet Infect Dis, 6 (10):629 – 640
Samaha – Kfoury J., Araj G.F. 2003. Recent developments in β lactamases and extended
spectrum β lactamases. Clinical review, 327: 129 – 1213
Take Care with Pet Reptiles
http://www.cdc.gov/features/salmonellafrogturtle/ (5.8.2016)
Tindall B. J., Grimont P. A. D., Garrity G. M., Euzéby J.P. 2005. Nomenclature and
taxonomy of the genus Salmonella. International Journal of Systematic and Enviormentary
Microbiology, 55: 521 – 524
Tomažič I. 2008. The influence of direct experience of students' attitudes to, and
knowlwdge about amphibiants. Acta biologica Slovenica, 51, 1: 39 – 49
Tomažič K. 2008. Odnos mladostnikov do živali in kako ga vključiti v izobraževalni
proces. Diplomsko delo, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 73
Tome S. 2003. Plazilci - Reptilia. V: Živalstvo Slovenije. Sket B., Gogala M., Kuštor V. 1.
natis. Ljubljana: Tehniška založba Slovenije, str. 512-518
Yan S. S., Pendrak M. L., Abela – Ridder B., Punderson J. V., Fedorko D. P., Foley S. L.
2003. An overview of Salmonella typing Public health perspectives. Cliniccal and Applied
immunology Reviews, 4: 189 – 204
Wang M., Guo Q., Xu X., Wang X., Ye X., Wu S., Hooper D. C., Wang M. 2009. New
plasmid – mediated quinolone resistance gene, qnrC, found in a clinical isolate of proteus
mirabilis. Agents and Chemotherapy, 53 (5): 1892 – 1897
Wayne, P.A. 2014. Supplement. CLSI document M100-S24. CLSI. Performance Standards
for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fourth Informational Clinical and
Laboratory Standards Institute
Woodford N. 2010. Rapid characterization of beta – lactames by PCR. Methods in
Molecular Biology, 642: 181 – 192
Woodward D. L., Khakhiria R., Johnson W. M. 1997. Human Salmonellosis Associated
with Exotic Pets. Journal of Clinical Microbiology, 35 (11): 2786 – 2790
Farkaš M. Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu.
Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2016.
57
ZAHVALA
Najprej se iskreno zahvaljujem mentorici doc. dr. Jerneji Ambrožič Avguštin, ki mi je
tekom dela v laboratoriju pomagala z nasveti.
Posebej bi se rada zahvalila somentorici doc. dr. Martini Turk. Njene spodbudne besede,
potrpežljivost in pripravljenost priskočiti na pomoč, ko se je pri pisanju diplome zataknilo,
so mi olajšale delo in dale motivacijo. Hvala tudi za uvajanje v laboratorijsko delo in
pomoč pri izvedbi raziskave.
Lepa hvala vsem zaposlenim na Katedri za biologijo mikroorganizmov in v laboratoriju
Katedre za molekularno genetiko Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v
Ljubljani, s katerimi sem se srečevala med laboratorijskimi vajami in tudi kasneje pri
raziskavi za diplomsko delo.
Brez vzorcev, ki sem jih pridobila s pomočjo Iztoka Tomažiča, ne bi doživela vseh lepih
trenutkov v laboratoriju. Hvala!
Zahvala gre tudi mojemu fantu Klemnu, ki mi je že tekom študijski let stal ob strani, v
zadnjih tednih pred diplomo pa trpel z mano.
Nenazadnje bi se rada zahvalila tudi svojim staršem, za vso podporo, tako moralno,
predvsem pa finančno, saj so mi s tem omogočili dokončanje študija.
PRILOGE
Priloga 1: Seznam plazilcev, vključenih v analizo za prisotnost salmonele.
V prilogi 1 so zbrani podatki za vse pregledane živali. Navedena so imena živali
(slovensko in latinsko), anonimizirane oznake gojiteljev, šifra sevov salmonel (če so bile
izolirane), shranjenih v Mikrobiološki zbirki Ex Infrastrukturnega centra Mycosmo (MRIC
UL) ter navedba vrste in podvrste salmonele, ki je bila izolirana v iztrebkih ali brisu kloake
plazilca.
Žival Šifra
gojitelja
EXB
oznaka Izolacija salmonele
1. Mlečna kača (Lampropeltis
triangulum) B L339 Salmonella enterica subsp. enterica
2. Ameriški gož (Elaphe guttata) B L370 Salmonella enterica subsp. arizonae
3. Ameriški gož (Elaphe guttata) B / /
4. Tigrasti piton (Python molurus) J / /
5. Rdečerepi udav (Boa
constrictor) J / /
6. Rdečerepi udav (Boa
constrictor) J / /
7. Rdečerepi udav (Boa
constrictor) J / /
8. Tigrasti piton (Python
molurus)- albino C
L340 Salmonella enterica subsp. enterica
L371 Salmonella enterica subsp. enterica
9. Rdečerepi udav (Boa
constrictor) C
L341 Salmonella enterica subsp. enterica
L372 Salmonella enterica subsp. enterica
10. Rdečerepi udav (Boa
constrictor) C L342 Salmonella enterica subsp. enterica
11. Rdečerepi udav (Boa
constrictor) C / /
12. Ameriški gož (Elaphe guttata) C / /
13. Tigrasti piton (Python molurus) C / /
14. Ameriški gož (Elaphe guttata) C / /
15. Mrežasti piton (Python
reticulatus) C / /
16. Podganarica (Elaphe obsoleta) C / /
17. Rdečerepi udav (Boa
constrictor) C / /
18. Kraljevi piton (Python regius) K / /
19. Mlečna kača (Lampropeltis
triangulum) D L373 Salmonella enterica subsp. enterica
20. Leopardji gekon (Eubleparis
macularis) D / /
21. Rdečerepi udav (Boa
constrictor) D / /
22. Peščeni udav (Eryx sp.) D / /
23. Ameriški gož (Elaphe guttata) D L343 Salmonella enterica subsp. enterica
L344 Salmonella enterica subsp. enterica
24. Bradata agama (Pagona
vitticeps) D
L374 Salmonella enterica subsp. enterica
L375 Salmonella enterica subsp. enterica
25. Bradata agama (Pagona
vitticeps) D L345 Salmonella enterica subsp. enterica
26. Bradata agama (Pagona
vitticeps) D L346 Salmonella enterica subsp. enterica
27. Bradata agama (Pagona
vitticeps) D / /
28. Bradata agama (Pagona
vitticeps) D / /
29. Ameriški gož (Elaphe guttata) D L347 Salmonella enterica subsp. enterica
L329 Salmonella enterica subsp. enterica
30. Ameriški gož (Elaphe guttata) D / /
31. Mavrični udav (Epicrates
cenchria cenchria) D
L348 Salmonella enterica subsp. enterica
L330 Salmonella enterica subsp. enterica
32. Madagaskarski udav
(Acranthopis dumerili) D / /
33. Zeleni legvan (Iguana Iguana) D / /
34. Ameriški gož (Elaphe guttata) D / /
35. Ameriški gož (Elaphe guttata) D / /
36. Grebenasti gekon
(Rhacodactylus ciliatus) D
L349 Salmonella enterica subsp. enterica
L328 Salmonella enterica subsp. enterica
37. Tigrasti piton (Python
molurus)-albino D L350 Salmonella enterica subsp. enterica
38. Ognjeni skink (Riopa fernandi) D / /
39. Mlečna kača (Lampropeltis
triangulum) E / /
40. Kraljevi piton (Python regius) E L351 Salmonella enterica subsp. enterica
41. Mlečna kača (Lampropeltis
triangulum) E L352 Salmonella enterica subsp. arizonae
42. Rdečevratka (Trachemys
scripta elegans) O / /
43. Ameriški gož (Elaphe guttata) F L353 Salmonella enterica subsp. arizonae
L354 Salmonella enterica subsp. arizonae
44. Ameriški gož (Elaphe guttata) F L355 Salmonella enterica subsp. enterica
45. Ameriški gož (Elaphe guttata) L / /
46. Močvirska sklednica (Emys
orbicularis) L / /
47. Rdečerepi udav (Boa
constrictor) L / /
48. Rdečevratka (Trachemys
scripta elegans) L / /
49. Rdečevratka (Trachemys
scripta elegans) F / /
50. Rdečevratka (Trachemys
scripta elegans) M / /
51. Rdečevratka (Trachemys
scripta elegans) N / /
52. Zeleni legvan (Iguana Iguana) I / /
53. Ameriški gož (Elaphe guttata) H L369 Salmonella enterica subsp. enterica
L320 Salmonella enterica subsp. enterica
54. Bradata agama (Pagona
vitticeps) G / /
55. Ameriški gož (Elaphe guttata) G / /
56. Mlečna kača (Lampropeltis
triangulum) G L356 Salmonella enterica subsp. enterica
57. Ameriški gož (Elaphe guttata) A S31 Salmonella enterica subsp. enterica
58. Ameriški gož (Elaphe guttata) A / /
59. Rdečevratka (Trachemys
scripta elegans) A / /
60. Jemenski kameleon
(Chamaeleo Calyptratus) A S32B Salmonella enterica subsp. enterica
61. Blavor (Ophisaurus apodus) A S33B Salmonella enterica subsp. enterica
62. Bradata agama (Pagona
vitticeps) A S34 Salmonella enterica subsp. enterica
63. Orjaški madagaskarski
kameleon (Furcufer oustaleti) A S35 Salmonella enterica subsp. enterica
64. Jemenski kameleon
(Chamaeleo Calyptratus) A
S38 Salmonella enterica subsp. enterica
S39 Salmonella enterica subsp. enterica
65. Jemenski kameleon
(Chamaeleo Calyptratus) A
S40 Salmonella enterica subsp. enterica
S41 Salmonella enterica subsp. enterica
66. Rdečerepi udav (Boa
constrictor) D L335 Salmonella enterica subsp. enterica
Priloga 2: Delna nukleotidna zaporedja gena za 16S rRNA izolatov salmonel iz plazilcev (v formatu
Fasta).
>EXB S31
TTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCC
TGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCA
AGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGG
ATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTC
TGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGG
GAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATG
CCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAA
GGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCG
GCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGG
AATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATC
CCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAG
AGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAA
TACCGGTGGCGAAGGCGG
>EXB S32B
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGTTTCGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCACAGCA
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTGAAATG
>EXB S33B
TGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGG
ACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGA
AACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGG
GCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACG
GCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTG
GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC
ACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCG
GGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGC
AATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG
GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGC
AGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCA
TTCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAG
CGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCG
>EXB S34
GTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAAT
GTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATA
CCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAG
ATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGAC
GATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGT
CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGC
CTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTT
TCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCG
CAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGT
GCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAA
GTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAG
GCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTA
GAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGC
>EXB S35
GTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAAT
GTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATA
CCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAG
ATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGAC
GATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGT
CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGC
CTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTT
TCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCG
CAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGT
GCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAA
GTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAG
GCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTG
>EXB S38
GCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGAC
GGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAA
CGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGC
CTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC
TCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGA
ACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCAC
AATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGG
TTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAA
TTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT
AATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGG
>EXB S39
GCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCA
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCG
>EXB S40
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGTTTCGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCACAGCA
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGC
>EXB S41
TCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGTTTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGT
GAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGT
GGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTT
GCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC
AAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGA
GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGG
GCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTA
AAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCACAGCAATTGAC
GTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC
GGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGG
TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAA
ACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGA
AATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCC
>EXB L320
TGCAGTCGACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGAC
GGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAA
CGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGC
CTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC
TCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGA
ACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCAC
AATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGG
TTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAA
TTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT
AATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCC
>EXB L328
GGTATCAGGAAGCACCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAA
TGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAAT
ACCGCATAACGTCGCAAGACCAGAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCA
TATGTGCCCATGTGGGATTAGCTTGGTGGTGAGGTAACGGCTCTAAAGGCGAC
GATCCCTACCTGGTCAGAGAGGATGACCAGCCACACTGCAACTGAAACACCGT
CCAGACTCCTACGGGTGGCACCCGTGGGGAATGTCGCCCATTGGGCGCAACCC
TGATGCCCCCATGCCGTGTGTATGAATATTCCCTTCTGGTTGTAAACTACTTTC
GTCGGGGAGGAACGTGTTGTGGTTAATAACCGTCTCAATTGACGTTACCCTATC
TAAACCCGCCGATTAACTCCGGACCACAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAA
GCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCG
GATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTT
GAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG
ATCTGGAGGAATACCGGTGG
>EXB L329
GCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGAC
GGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAA
CGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGC
CTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCT
CACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGA
ACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCAC
AATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAATAAGGCCTTCGGG
TTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAA
TTGACGTTACCCGCAGAAAAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT
AATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCC
>EXB L330
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCACAGCA
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCC
L335
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCA
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTG
>EXB L339
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTYGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCA
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAG
>EXB L340
TGCAGTCGACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGAC
GGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAA
CGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGC
CTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCT
CACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGA
ACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCAC
AATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGG
TTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAA
TTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT
AATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCAAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAG
>EXB L341
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCA
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACT
>EXB L342
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCA
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGG
>EXB L343
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTYGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTNGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGNGGTTAATAACCGCAGCA
ATTGACGTTACCCGCAGAANAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGG
>EXB L344
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTYGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTWGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGNGGTTAATAACCGCAGCA
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
T
>EXB L345
TGCAGTCGACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGAC
GGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAA
CGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGC
CTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCT
CACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGA
ACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCAC
AATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGG
TTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAA
TTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT
AATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCACGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTATAGGGGGG
>EXB L346
GCAGCTTGCTGCTTTGCTGACAGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAA
ACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAAC
GTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCA
GATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACTTCG
CTAGTCAGAGATGCCAACCAACCTTACTGGAACAGAAAAACATTGCTTACGCC
TAAAGGAGGTTTTGGTTTCAGATTTATATACTTGAAAACTATATCGGAACAAG
AAATGCCTTTGTTGATTCTATTTTGAAAAAATGCAAAAGGATTTCTTTGGAGTA
AAAAAACTATTCCAATTTCACTACTCATTCAAATTGAATTTTTATAAAAGCAAA
GAAAGGGGCATCTCGTCCCCTCATGCGAAGGACTTGAATTCCGACTCCCGGAT
GGATG
>EXB L347
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCACCA
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCGCCCGCGG
TAATACTGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACACC
GGCGGCCTGTCAACTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTC
>EXB L348
GCAGTCGAACGGTAACAGAAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGAC
GGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAA
CGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGC
CTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCT
CACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGA
ACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCAC
AATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGG
TTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAA
TTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT
AATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCC
>EXB L349
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCA
ATTGACGTTACCCCCATAACAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCTCTTCCCGCGGT
AATTCGGAGGGAGCGAGCGGTAATTGGAATTACTGGCCGGGAAGTGGGCGCA
AGCCGGCTGTCCGTTCGGAAGTG
>EXB L350
TGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGNAGTGGCG
GACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGG
AAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCG
GGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAAC
GGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACT
GGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG
CACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTC
GGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCNCAG
CAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGC
GGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCAC
GCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTG
CATTCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCA
>EXB L351
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCACAGCA
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCC
>EXB L352
TGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGG
ACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGA
AACGGTAGCTAATACCGCATAATGTCGCAGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGG
GCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACG
GCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTG
GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC
ACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCG
GGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGATAAGGTTAATAACCTTGTT
CATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG
GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGC
AGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGGCTCAACCTGGGAACTGC
>EXB L353
GCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGAC
GGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAA
CGGTAGCTAATACCGCATAATGTCGCAGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCC
TCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTC
ACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAA
CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACA
ATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGT
TGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGGTTAAGGCTAATAACCTTGTTCAT
TGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTA
ATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAG
GCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATT
CGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGA
>EXB L354
GCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGAC
GGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAA
CGGTAGCTAATACCGCATAATGTCGCAGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCC
TCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTC
ACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAA
CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACA
ATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGT
TGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGGTTAAGGTTAATAACCTTGTTCAT
TGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTA
ATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAG
GCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATT
CGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCG
GTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCC
>EXB L355
TGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGG
ACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGA
AACGGTAGCTAATACCGCATAATGTCGCAGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGG
GCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACG
GCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTG
GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC
ACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCG
GGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGGTTAAGGCTAATAACCTTGTT
CATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG
GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGC
AGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCA
TTCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAG
CGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCC
>EXB L356
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCA
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTG
GACAAAGACTGACGCTCAG
>EXB L369
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCTGCTGACGAGTGGCGG
ACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGA
AACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGG
GCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACG
GCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTG
GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC
ACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCG
GGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGC
AATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG
GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGC
AGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCA
TTCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAG
CGGTG
>EXB L370
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGGTTAAGGTTAATAACCTTGTTC
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTG
GACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGA
>EXB L371
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCA
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTG
>EXB L372
TGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGA
CGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA
ACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGG
CCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGG
CTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGG
AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA
CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCA
ATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA
GGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCAT
TCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGC
GGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGG
>EXB L373
GCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGAC
GGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAA
CGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGC
CTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCT
CACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGA
ACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCAC
AATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGG
TTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAA
TTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT
AATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCAGAATTTCTGGGCGTAAAGCGCACGCAG
GCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATT
CGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCG
GTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGA
>EXB L374
TGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGG
ACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGA
AACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGG
GCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACG
GCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTG
GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC
ACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCG
GGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGC
AATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG
GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGC
AGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCA
TTCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAG
CGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGG
>EXB L375
TGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGG
ACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGA
AACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGG
GCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAACG
GCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTG
GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC
ACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCG
GGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGC
AATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG
GTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGC
AGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCA
TTCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAG
CG
UNIVERZA V LJUBLJANI
PEDAGOŠKA FAKULTETA
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
DIPLOMSKO DELO
METKA FARKAŠ