Download - Kar Yo Typing
-
KARYOTYPING
MUJOSEMEDI
LAB BIOLOGI FK UNS
-
10/29/2012BLOK 3 BIOLOGI MOLEKULER
2
A. KHROMOSOMStrukt spt benang dlm nukleus sel eukaryote yg td DNA &
prot histoneSitogenetika: studi struktur dan sifat-sifat krom, perilaku
krom selama mitosis dan meiosis, pengaruh krom pd fenotip dan faktor-faktor yg menyebabkan perubahankrom (Hare dan Singh, 1979).
24 Tipe khrom dinomori 1 22, X dan Y.
1 22 : autosom X dan Y : kromosom seks atau
gonosom
-
10/29/2012BLOK 3 BIOLOGI MOLEKULER
3
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
4
Gen : suatu segmen molekul DNA yg mengkode sebuah produk fungsional mis.; rantai polipeptide atau molk RNA
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
5
-
10/29/2012BLOK 3 BIOLOGI MOLEKULER
6
Krom terlihat dg baik saat pembelahan konden.
Krom yg dilekatkan pd slide (karyotyping) dicat
Giemsa krom nampak belang. Giemsa mengecat
bag DNA yg kaya Adenine & Thymine.
Bagaimana Scientists membaca krom?
Gunakan 3 gamb kunci utk mengidentifikasi
kesamaan dan perbedaannya:
Size: mudah dibedakan.
Banding pattern: ukuran & lokasi Giemsa bands pd
krom unik.
Centromere position: sentromer nampak sbg
kontriksi, peran dlm pemisahan krom saat
pembelahan sel.
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
7
Condensed chromosome
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
8
Kromosom metafase
-
10/29/2012BLOK 3 BIOLOGI MOLEKULER
9
Juml Krom bbrp organisme :
-
10/29/2012BLOK 3 BIOLOGI MOLEKULER
10
Krom dicat Heterochromatin (gelap: DNA lbh
coiled & lbh banyak seq DNA repetitif) &
Euchromatin (terang : tdp gen-gen mengkode prot).
Karyotipe : Krom diurutkan berdasar ukuran dlm
peta dr yg terbesar sampai yg terkecil. Lengan
pendek (p) diatas dan lengan panjang (q) dibawah.
-
10/29/2012BLOK 3 BIOLOGI MOLEKULER
11
Nomenclature : International System for Human
Cytogenetic Nomenclature (ISCN)
Komponen Karyotipe :
Juml krom, sex, perubahan pertama, perubahan
kedua, dst.
Perubahan krom sex didaftar pertama dan kemudian
yg lain dlm urutan numerik (angka).
Cont : 46, XX, del(5)(p15.3) dg delesi krom no 5
lengan pendek band 15.3 sindrom Cri du Chat.
-
10/29/2012BLOK 3 BIOLOGI MOLEKULER
12
-
B. KARYOTYPING adl studi krom, proses pairing and ordering semua
krom pd sebuah organisme, hg memberikan potretgenom yg luas dr krom-krom individu Karyotype : profil krom sebuah sel, mis ; juml, ukuran
dan morfologi krom sebuah sel. Karyogram /idiogram : gamb ssn mikrofotograf krom
dlm format standard (dlm pasangan, urut dlm ukurandan posisi sentromer). Manfaat karyotype : Utk studi aberasi krom Fungsi seluler Hubungan taxonomi dan studi evolusi.
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
13
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
14
Karyotype dissn dg prosedur pengecatan standard
gamb struktural yg karakteristik utk setiap krom.
Analisis Karyotype utk studi :
mendeteksi perub genetik yg kasar (besar) pd
manusia anomali bbrp megabases DNA atau
lebih
perub juml krom yg diasosiasikan dg aneuploidi,
spt trisomi 21.
perub struktural krom spt delesi, duplikasi,
translokasi, atau inversi krom.
diagnostik cacat lahir yg spesifik, kelainan genetik
-
SEJARAH Karl Wilhelm von Nageli (1842) mengamati krom
pertama kali (pd sel tnman) Walther Flemming (1882), penemu mitosis pd sel
Salamander. Brp juml krom pd sebuah sel manusia (diploid)
normal? Hans von Winiwarter (1912) : 47 krom pd
spermatogonia & 48 pd oogonia, & menyimpulkanmekanisme determinasi seks XX/XO ?
Painter (1922) tdk pasti krom diploid manusia 46atau 48 (?), pertama setuju 46. Kmd merevisinya48, dan menegaskan manusia memp sistem XX/XY.
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
15
-
Teknik baru utk mengetahui juml krom sel diploid manusia :
a. Menggunakan sel kultur yg dipacu untuk masuk fase S dg PHA (phytohemaglutinine)
b. Mitosis ditahan dlm metafase dg larutan colchicine.
c. Pretreating sel dlm larutan hypotonikSel bengkak & krom tersebar.
d. Squashing the preparation on the slide forcing the chromosomes into a single plane.
e. Memotong fotomikrograf & menyusunnya kedlm sebuah karyogram
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
16
-
Karakteristik karyotype yg diamati & dibandingkan adl
perbedaan:
1. Ukuran absolut krom
2.Posisi centromer
3.Ukuran relatif khrom (akibat translokasi/
pertukaran segmentalukuran tdk sama)
4.Juml dasar krom
5.Juml dan posisi satelit
6.Derajad dan distribusi region heterokromatin
(lbh gelap drpd eukromatin) Teknik pemitaan?
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
17
-
Mempersiapkan Karyotype dr sel mitotik : Sumber sel :
biopsi tumor atau bone marrow diagnosiskanker
spesimen drh tepi, dan biopsi kulit diagnosis lain cairan amnion, atau spesimen villus chorionik
prenatal screening Sel mitotik ditahan dlm metafase atau prometafase dg colchicine
Perlakuan lart hipotonik bengkak & pecah. Nukleus difiksasi diteteskan pd glass slide
dicat gambr strukt krom.
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
18
-
POLA PEMITAAN (BANDING PATTERNS)
Sblm perkemb teknik pemitaan, sulit membedakan
krom satu dg yg lain khrom dikelompokkan
berdasarkan ukuran (A - G) dan letak centromer.
Torbjorn Caspersson, dkk. (1970) mendeskripsi teknik
pemitaan pertama Q-banding dg cat fluorescent
quinacrinemengalkilasi DNA.
Skrg sebag besar dicat GIEMSA
o resolusi pita lbh baik, lbh stabil & dpt dianalisis dg
mikroskop bright-field biasa.
oBeda struktur kromatin & komposisi basa DNA
pola band/pita yg beda.
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
19
-
Pd G-banding, varian pengecatan Giemsa lazim diNorth America, krom metafase diperlakukan trypsinsebentar, sebelum dicat Giemsa. Trypsin digest bbrpprot khrom me-relaxing strukt kromatin catGiemsa dpt mengakses DNA.
Bag heterokhromatin tendensi pd DNA kaya AT &relatif lbh sedikit gen tercat lbh gelap pd G-banding.Sebaliknya, kromatin yg kurang konden(eukhromatin), tendensi kaya GC & lbh aktifditranskrip lbh sedikit tercat Giemsa nampak sbgpita (band) terang dlm G-banding.
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
20
-
a). G-banding. b). Q-banding. c). R-banding. d). C-banding
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
21
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
22
Pengecatan Giemsa [Gbr. a)] 400-800 band yg
terdistribusi diantara 23 psg krom manusia (500 band
sel haploid).
R-banding, [Gbr c)] dg Giemsa
o sebag Eropa, hasilkan pola sebaliknya G-banding.
o sebelum dicat Giemsa, krom dipanaskan disrupt
helix DNA pd bag kaya-AT (sebelumnya ikat Giemsa
paling kuat), & meninggalkan bag yg kaya-GC utk
menyerap cat.
o aplikasi utk memberikan critical details bag yg
kaya gen yg terltk di dekat telomer.
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
23
C-banding [Gbr. d)]
o utk mengecat heterochromatin (tdk aktif scr
genetik) jarang utk diagnostik.
oAdl teknik Giemsa spesial utk mengecat krom pd
centromer, yg memp juml besar AT-rich satellite
DNA.
Q-banding [Gbr. b)]
oMetode pertama yg mengidentifikasi 46 khrom .
o krom dicat quinacrine & diperiksa dg chy UV,
o dpt memeriksa translokasi krom, trtm krom Y.
o Pola pita (band) serupa dg G-banding.
T-banding: utk memvisualisasikan telomer.
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
24
PENGORGANISASIAN KHROM DLM KARYOGRAM
Utk informasi diagnostik, image krom disusn kedlm
format standard sbg karyotype atau karyogram [Gbr
a) c)].
Mnrt konvensi internasional, autosom manusia (krom
non-sex), dinomori dr 1-22, dlm urutan yg makin kecil
dlm ukuran, dg perkecualian krom 21 & 22 (krom 21
adl terkecil). Krom seks ditempatkan pd akhir dr
karyogram.
Dlm karyogram, krom dijajarkan, disusun dg lengan
pendeknya p (petite) di atas & lengan panjangnya
q (queue) di bawah.
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
25
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
26
Letak centromer dpt digunakan utk mengidentifikasi
gross morphology, atau bentuk krom. Mis:
Krom metacentric, spt krom 1, 3, & 16 lengan p
dan q panjangnya hampir sama.
Krom submetacentric, spt krom 2, 6, & 10 ltk
centromer tdk ditengah.
Krom acrocentric spt 14, 15 & 21 centromer tltk
dekat ujungnya.
Pola pemitaan (banding pattern) ant 2 kopi krom
(homolog), pd autosom adl hampir sama. Bbrp
perbedaan tak kentara ant homolog pd krom ttt adl
akibat variabilitas struktural natural antar individu.
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
27
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
28
Penyusunan krom dlm karyogram mempermudah
identifikasi abnormalitas.
G-band karyograms rutin utk diagnosis
abnormalitas krom.
Perub krom yg dpt dideteksi dg karyotyping adl bbrp
megabase.
Aneuploidi (akibat absen atau penambahan krom),
mudah dideteksi dg analisis karyotype.
Insersi atau delesi yg lebih tak kentara dpt terdeteksi
sbg deviasi dr pola pemitaan normal.
Translokasi jelas kelihatan pd karyotype.
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
29
-
Classification of Chromosomes for Karyotyping (rasio p/q)
Group A: chromosomes 1-3 are largest with median
centromere.
Group B: chromosomes 4-5 are large with submedian
centromere
Group C: chromosomes 6-12 are medium sized with
submedian centromere
Group D: chromosomes 13-15 are medium sized with
acrocentric centromere
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
30
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
31
-
Group E: chromosomes 16-18 are short with median
or submedian centromere
Group F: chromosomes 19-20 are short with median
centromere
Group G: chromosomes 21-22 are very short with
acrocentric centromere.
Chromosome X is similar to group C.
Chromosome Y is similar to group G
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
32
-
Standarisasi Nomenklatur :a. Konferensi Denver 1960 Nomor diberikan pd tiap
pasang autosom berdasar makin kecilnya ukurankrom, terbesar no 1 & terkecil no 22, krom kelaminXX ( ) dan XY ( ) ada 22 psg autosom + 2 kromkelamin 46 khrom.
b. Konferensi London 1963 : Patau (1960)mengusulkan 7 kelompok krom A G berdsrkemiripan morfologis krom.
c. Konferensi Chicago 1966 : Analisis kariotipepertama dicatat juml khrom, diikuti krom kelamindan yg terakhir adl kelainan tambahan ( 46,XYdan 46,XX).
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
33
-
1970: Casperssono krom manusia diidentifikasi dg fluorescent
quinacrine mustard & diperiksa dibwh UV.o Tiap krom memiliki corak pita fluorescent yg
konstan dan unik.oKelemahan teknik fluoresensi :Pita fluoresensi memudar dlm bbrp menit
hrs difoto segera.Mikroskup fluoresensi mahal.
Teknik Giemsa.omenghasilkan sediaan permanenodpt diperiksa dg mikroskup biasa dibakukan
Sept 1971 dlm Konferensi Paris.
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
34
-
d. Konferensi Paris 1971o Kariotipe Fluoresen oleh Caspersson, dkk sbg
dasar pemberian nomor setiap krom.o Krom 21 lbh kecil dr krom 22 (perkecualian sist
Denver : besar kecil).
PEMBAGIAN KROMOSOM Dlm pemetaan krom, setiap pita sesuai dg grs
tengahnya & bukan dg grs tepinya. Satu region tssn oleh bbrp pita gelap & terang. Landmark (tapal batas) pd suatu krom ditentukan
sbg satu gambran morfologik yg konsisten & nyata
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
35
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
36
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
37
Satu region tltk diantara 2 tapal batas yg berdekatan. Suatu lengan krom yg tdk memiliki tapal batas yg
nyata hanya terdiri atas 1 region.
Penomoran Pita : Region dan pita dinomori berturut-turut mulai dr
sentromer ke ujung lengan krom. Satu pita yg dipakai sbg tapal batas dianggap
seluruhnya milik region disebelah distal tapal batas, disetujui sbg no 1 dlm region itu.
Pita yg dibagi 2 oleh sentromer dianggap sbg 2 pita, diberi label sbg pita 1 pd region 1 dr lengan krom yg berkaitan.
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
38
Lengan panjang = q dan lengan pendek = p.
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
39
Utk menyatakan suatu pita ttt, dibutuhkan 4 bag (item):
a) Nomor kromb) Simbul lenganc) Nomor region dand) Nomor pita dlm region itu.
Item-item diberikan tanpa spasi atau punctuasi, mis1p33 krom no 1, lengan pendek, region 3, pita 3. Jikapita dibagi menjd pita kecil (sub-band), angka pita diikuti ttk desimal dan sub band diberi nomorberurutan dr sentromer ke ujung, mis 1p33.1; 1p33.2; 1p33.3, menyatakan pita 3 region 3 lengan pendekkrom no 1 dibagi menjd 3 sub-band, 33.1 bag proximal dan 33.3 bag distal
-
ARMREGIONBANDSub-BAND, numbering from the centromere progressing distance
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
41
Krom memp pola-pola band yg kharakteristik yg ditimbulkan oleh trypsin dan Giemsa.
-
METHODOLOGY (SIDDIQUE)
Tindakan Aseptik Penyiapan medium RPMI 1640 Pengambilan 10ml darah dg heparin Setting of culture
8 ml of medium
0.1 ml of PHA-M
0.5 ml of blood/plasma
2 ml of autologus plasma/FCS
Inkubasikan pd 37 C selama 72 jam
-
METHODOLOGY
Pemanenan kultur Tambahkan spindle inhibitors Colchicine/
colcemed (0.1 g/ml)
Perlakuan larutan hypotonic 0.075M KCl
Fiksasi (3:1 methanol : acetic acid)
Penyiapan slides
Slides dicat dg 4% Giemsa selama 20-25min
Screening of slides utk studi morfologi krom
Konstruksi/penyusunan karyotype
-
PREPARATION OF CHROMOSOMES
(Siddique)
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
45
Karyotyping
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
46Fotomikrografi dan identikasi kromosom
-
Karyotype manusia:
Karyotype normal : 46,XY
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
48
IDENTIFIKASI KHROMOSOM :FISH (fluorescence in situ hybridization)
o a cytogenetic technique developed by ChristophLengauer that is used to detect and localize thepresence or absence of specific DNA sequenceson chromosomes.o uses fluorescent probes (fluorescent labelled
DNA fragments, ~10.000 bp) that bind to onlythose parts of the chromosome with which theyshow a high degree of sequence similarity.
Fluorescence microscopy can be used to find outwhere the fluorescent probe bound to thechromosomes.
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
49
FISHo used in genetic counselling, medicine, and species
identification.o to detect and localize specific mRNAs within tissue
samples.odefine the patterns of gene expression within cells
and tissues.
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
50
Hibridisasi kromosom dg pelacak fluorescence
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
51
FISH dpt mendeteksi:
Mikrodelesi yg halus
Translokasi yg kompleks
Perubahan telomer
-
TRIPLE KROMOSOM #20 dlm Nukleus
DELESI pd KROMOSOM #22
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
53
Hibridisasi kromosom dg probe DNA
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
54
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
55
Labelling
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
56
Karyogram from a human male lymphocyte probed for the Alu sequence using FISH
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
57
Spectral Karyotype (SKY Technique) Adl teknik sitogenetik molekuler utk
memvisualisasikan scr simultan semua pasang krompd sebuah organisme dlm warna yg berbeda.
Probe (pelacak) melabel DNA spesifik dg fluorescentpd setiap krom dg fluorophore.
Krn jumlah fluorophores yg terbatas, sebuahmethode pelabelan kombinasi digunakan utkmenghasilkan banyak warna yg berbeda.
Perbedaan spectral yg dihasilkan oleh pelabelankombinasi dianalisis dg interferometer yg dilekatkanpd mikroskup fluorescence.
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
58
Spectral human karyotype
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
59
Spectral karyogram of a human female
-
10/29/2012BLOK 3 BIOLOGI MOLEKULER
60
TES PRENATAL : KARYOTYPING
-
10/29/2012Blok 3 Biologi Molekuler
61
QUESTIONS?