Download - Kl ónozás fogalma
![Page 1: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/1.jpg)
Klónozás fogalma
Egy általunk kiválasztott DNS darabot vektor segítségévelgazdasejtbe juttatunk és ott felszaporítunkSzubklónozás: további kisebb darabok hasonló felszaporítása
vektor
Hasítás, A,B enzimekkel
A
A
B
B
inszert
ligálás
Transzformálás, felszaporítás,tisztítás
Vektor: olyan nukleinsav hordozó, amellyel nukleinsavakat sejtbe lehet juttatni,Felhasználás: klónozás, fehérje termeltetés, genetikai manipulációk stb.
Hasítás, A,B enzimekkel
![Page 2: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/2.jpg)
KÓNOZÁSBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLTVEKTORTÍPUSOK
példa inszert méret
plazmidok pUC18,19 < 10 - 15 kbfonalas fágok mp18, 19 < 5 - 10 kbfagemidek pBluescriptKS, SK± < 10 - 15 kb
fágok EMBL3,4 néhányszor 10 kbkozmidok pHC79 néhányszor 10 kb
PLAZMIDOK
replikációs origoORI
rezisztencia marker
Cirkuláris kettősszálú extrakromoszómális elemek
BAC, YAC néhány 100 kbpBAC108L, pYAC3
BAC, YAC: bacterial, yeast artificial chromosome
![Page 3: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/3.jpg)
NÉHÁNY HASZNÁLATOS ANTIBIOTIKUM
antibiotikum működési mód a rezisztencia módja koncentráció
(µg/ml)
ampicillin bakteriocid, sejt fal szintézis inhibitor
a laktamáz elhidrolizálja az ampicillin laktám gyűrűjét
50 -100
klóramfenikol bakteriosztikus, fehérje szintézis inhibitor, kölcsönhat az 50S
riboszoma alegységgel
klóramfenikol acetiltranszferáz (cat) acetilálja a klóramfenikolt
20
kanamicin bakteriocid, fehérje szintézis inhibitor
aminoglikozid foszfotranszferáz illetve nukleotidtranszferáz
foszforilálja vangy adenilálja a kanamicint
30 - 500
tetraciklin bakteriosztatikus, proteinszintézis inhibitor, gátolja az aminoacil-tRNS kötődését a riboszómához
a sejt permeabilitásának csökkentésével a tetraciklin nem tud
bejutni a sejtbe
15
![Page 4: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/4.jpg)
PÉLDÁK PLAZMID REPLIKONOKRA PLAZMID INKOMPATIBILTÁSI CSOPORT KÓPIASZÁM GAZDASPECIFICITÁS
pBR322 ColE1 20 E. coli és még néhány
pUC19 ColE1 300 E. coli és még néhány
F plazmid FI 1-2 E. coli és még néhány
pRK356 (R1, R6)
FII 2 E. coli és még néhány
pRK2501 (RK2)
P 1-4 Gram-negatív
baktériumokban széles
RSF1010 Q 10 Gram-negatív
baktériumokban széles
pRK353 (R6K)
X 13-40 Gram-negatív
baktériumokban széles
P1 Y 1-2 Gram-negatív
baktériumokban széles
![Page 5: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/5.jpg)
Egy ősi plazmid: pBR322
![Page 6: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/6.jpg)
Replikációs kontroll
![Page 7: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/7.jpg)
Magas kópiaszámú változat: pUC19
![Page 8: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/8.jpg)
Inszertet tartalmazó klónok kiválasztása
-antibiotikum rezisztencia, ld. pBR3222, két antibiotikum, az egyik elromlik, ha inszert épül be, fáradtságos szurkálások, két antibiotikum rezisztencia gén szükséges
- kolónia hibridizáció, univerzális mindig használható
- plazmid tisztítás, térképezés restrikciós emésztéssel hosszú fáradtságos
- polimeráz láncreakció sejteken, kombinatorikus gyors ha nincs más szelekció
- kék fehér színszelekció,
- pozitív szelekciós vektorok, kondicionálisan letális gén a vektoron, az inszert beépül, elrontja a gént megszűnik a letalitás
- auxotrofiát komplementáló génbe történő klónozás ugyanaz a probléma, mint az antibiotikumok esetén
![Page 9: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/9.jpg)
Kolónia hibridizáció
![Page 10: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/10.jpg)
LacZ komplementáció
F' plazmidon: defektív - galaktozidáz gén, hiányzik 11- 41. aminosavközötti régió
bevitt vektor: tartalmazza a lacZ szabályozó régiótés az 1-146 aminosavat
a kettő együtt: aktív – galaktozidáz X-gal szubsztráttal kék telep
a bevitt N-terminális fragmentben : polilinker régió (leolvasási keret marad)ebbe lehet klónozni fragmentumot,
ha kis fragmentum és leolvasási keret nem romlik el X-gal szubsztráttal kék telep, ha elromlik vagy nagy fragment X-gal szubsztráttal fehér telep
![Page 11: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/11.jpg)
Egy pozitív szelekciós vektor
![Page 12: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/12.jpg)
Vektor önligálását, üres vektorok képződését gátló módszerek
- kondicionálisan letális gének használata
- vektor defoszforilálása
-korrekt vektor/inszert arány megválasztása
A ligáz csak 5’ foszfát – 3’ OH végeket tudösszekapcsolni,ha a vektort defoszforiláljuk, nem tud önligálódni
![Page 13: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/13.jpg)
![Page 14: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/14.jpg)
![Page 15: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/15.jpg)
PLAZMIDOK SEJTBE JUTTATÁSÁNAK MÓDJAI
1. Kémiai transzformálás
Kompetens sejt: a DNS felvételére alkalmassá tett sejtA sejteket felnövesztés után centrifugáljuk speciális kétértékű kationokat (Ca2+, Mn2+) tartalmazó oldattal kezeljük,sejtfal permeabilitást növelő ágenst (DMSO) adunk hozzá
transzformációs hatékonyság: transzformáns /µg DNSelvi szám a transzformációt£ 1 ng mennyiségű DNS-sel hajtjuk végre
:
normál érték: 106 – 108
nagyon jó: 109
a transzformáció hatékonyságát meghatározó tényezők:-oldatok edények tisztasága,- sejtek növekedési sebessége, a növesztés fázisa, hőmérséklete- hősokk hőmérséklete hossza- permeabilizáló faktor
a lineáris DNS transzformációs gyakorisága kb 2 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a cirkulárisé
egyéb fogások:-spheroplast készítés ozmotikum jelenlétében és ezt transzformáljuk- a DNS-t liposzómába csomagoljuk transzfomálás előtt
![Page 16: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/16.jpg)
Transzformálás hatékonyságát meghatározó tényezők I.
glicerin koncentráció, puffer pH, puffer koncentráció, sók
növesztési hőmérséklet, OD
![Page 17: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/17.jpg)
Transzformálás hatékonyságát meghatározó
tényezők II.plazmid mérete
hősokk hőmérséklete, hossza
permealizáló ágenstárolhatóság
![Page 18: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/18.jpg)
Elektroporáció
A sejteket felnövesztés után kis vezetőképességű, glicerines (nagy ellenállású 600 ) pufferben szuszpendáljuk nagy feszültségű impulzust adunk rá kb 5 ms-igtranszformációs hatékonység 20 - 50 x jobb (1010/µg DNS) sejttípusonként optimalizálni kell maghatározó faktorok: - az oldat ellenállása- az impulzus nagysága, hossza- permeabilizáló, redox potenciált befolyásoló faktorok adagolása
![Page 19: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/19.jpg)
KONJUGÁCIÓ
Sejtből sejtbe történő DNS átadáslépései: párosodás: speciális kontaktus a donor és a recipiens között egy speciális sejtfelszíni ponton keresztül (pl. pilus) DNS átjuttatását közvetítő folyamatok, replikcáció (rolling circle,az egyik szál átjutása)konjugációs elemek
donorból donort csinálaz első ilyen a a szex faktor, F episzóma
másik: IncP csoportba tartozó: RP4, RK2 plazmidok (szilárd fázishoz
mobilizálható plazmidoka recipiensből nem lesz donora plazmid tartalmazza a DNS processzáló apparátust, oriT, mob régió tra gének, pilus: N-acetilált TraA
![Page 20: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/20.jpg)
A KONJUGÁCIÓ MECHANIZUMSA
F pilusF sejt+
5’3’
F sejt-
5’3’
5’3’
5’3’
5’3’
F pilus
az F plazmid eltörik
a DNS egyik szála átmegy a recipiensbe, mialatt a donorba a másik szál szintetizálódik
F sejt+
F sejt+
DNS szintézis a recipiensben
A DNS szintézis befejezõdika sejtek szétválnak
![Page 21: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/21.jpg)
TraI
Töréspont, nick
5’TraI
5’
donor recipiens donor recipiens
TraI
5’
donor recipiens
Egyszálú DNS kötő fehérje
TraC primáz
RNS primer
Replikatív DNS polimeráz
A DNS transzfer mechanizmusa a konjugáció során
![Page 22: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/22.jpg)
Térképezés konjugációval
![Page 23: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/23.jpg)
Konjugatív génátviteli stratégiák
Donor
Akceptor konjugáció
A konjugáció célja
“sima” konjugáció
Irányítottmutagenezis,
homológ rekombináción alapuló integráció
vektor replikációaz utód sejtben
+
-mob
Tn5
RP4 tra
mob
tra
RP4
RP4 tra
mob-
utánelõtt
Random, transzpozon
alapú mutagenezis
![Page 24: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/24.jpg)
Mobilizálható vektorok
Nem tartalmazzák a tra géneket, csak a transzferhez szükséges oriT-ttra gének: integrálva a kromoszómába,
három komponensű konjugáció: sem a donor sejt sem a recipiens nem tartalmazza a transzferhez szükséges géneket, hanem egy harmadik sejt
![Page 25: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/25.jpg)
Ar1Ar2 oriV
Ar2
Ar1
Ar2
oriV
Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis
poláris hatásvad típus mutáns
oriT
oriT
oriV: szűk gazdaspecificitás
Ar: antibiotikum rezisztencia
![Page 26: Kl ónozás fogalma](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081504/5681388f550346895da03e8d/html5/thumbnails/26.jpg)
Ar1oriV
Ar1 oriV
vad típus mutáns poláris hatás ?
Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélkül
oriV: szűk gazdaspecificitás
oriT
oriT
Ar: antibiotikum rezisztencia