Doktori értekezés
FÉLSZÁRAZ ALFÖLDI HOMOKTERÜLETEK SÖTÉT SZEPTÁLT
ENDOFITON (DSE) GOMBÁINAK VIZSGÁLATA
Knapp G. Dániel
Biológia Doktori Iskola
Iskolavezető: Prof. Erdei Anna, az MTA rendes tagja
Kísérletes Növénybiológia Doktori Program
Programvezető: Prof. Szigeti Zoltán
Témavezető: Dr. habil. Kovács M. Gábor, egy. docens, ELTE TTK,
Biológiai Intézet, Növényszervezettani Tanszék
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Intézet
Növényszervezettani Tanszék
Budapest
2015
2
TARTALOMJEGYZÉK oldalszám
BEVEZETÉS 4
1. AZ ENDOFITON GOMBÁK ÁTTEKINTÉSE 5
1.1 Endofiton szervezetek 5
1.2 Endofiton gombák 5
1.2.1 A C-endofitonok 6
1.2.2 Az NC-endofitonok 7
1.3 Gyökérkolonizáló nem patogén gombák 8
1.3.1 Mikorrhiza képző gombák 8
1.3.2 Gyökérendofiton gombák 9
2. A DSE GOMBÁK IRODALMI ÁTTEKINTÉSE 10
2.1 Történeti áttekintés 10
2.2 A DSE gombák 11
2.2.1 A DSE gombák elterjedése 11
2.2.2 A DSE gombák rendszertani besorolása 13
2.2.3 A DSE gombák általános jellemzői 14
2.2.4 A DSE gombák propagulumai 16
2.3 A DSE gombák vizsgálata 17
2.3.1 A DSE gombák növényre gyakorolt hatásának vizsgálata 17
2.3.2 A DSE gombák kolonizációjának fénymikroszkópos vizsgálatai 18
2.3.3 A DSE gombák ultrastruktura vizsgálatai 19
2.3.4 A gombák molekuláris taxonómiai vizsgálata 20
2.3.5 Az Inter Sample Sequence Repeat (ISSR) módszer 21
2.3.6 A fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) alapjai 22
3. CÉLKITŰZÉSEK 24
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 25
4.1 A mintavételi területek 25
4.2 A mintázott növények 26
4.3 A gombák izolálása a gyökerekből 26
4.4 Molekuláris vizsgálatok 27
4.4.1 DNS kivonás 27
4.4.2 Csoportspecifikus PCR és primer fejlesztés 28
4.4.3 Inter Sample Sequence Repeat (ISSR) vizsgálatok 28
4.4.4 DNS régiók amplifikálása és szekvenálása 28
4.4.5 Filogenetikai analízis 30
4.5 Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) 32
4.5.1 A FISH próbák 32
4.5.2 A minták előkészítése 32
4.5.3 Hibridizációs lépés 33
4.5.4 Poszthibridizációs lépés 33
4.6 Inokulációs rendszerek 34
4.6.1 In vitro kísérletek a DSE sajátságok teszteléséhez 34
4.6.2 A FISH vizsgálatok inokulációs rendszere 34
4.6.3 A TEM vizsgálatokhoz összeállított inokulációs rendszer 35
4.7 Mikroszkópos vizsgálatok 36
4.7.1 Fluoreszcens mikroszkópia 36
4.7.2 Festés és fénymikroszkópos vizsgálatok 36
4.7.3 A minták előkészítése és ultrastruktura vizsgálata, TEM 37
4.7.4 Spóraképzés indukálása 37
3
5. EREDMÉNYEK 39
5.1 A félszáraz alföldi területek endofiton gombái 39
5.1.1 Terepi minták mikroszkópos vizsgálatai 39
5.1.2 Az izolátumok 39
5.2 Az inokulációs tesztek eredményei 39
5.3 Az azonosított DSE gombák 40
5.3.1 A tizennégy DSE csoport 43
5.3.2 Gazda és terület specficitás, szezonalitás és inváziós növények 45
5.4 DSE csoportok ISSR vizsgálatának eredményei 45
5.4.1 A kiválasztott DSE csoportok 45
5.4.2 A DSE-1 és DSE-7 izolátumok célzott gyűjtése és a specifikus PCR 46
5.4.3 ISSR primerek és PCR-ek eredményei 47
5.4.4 Az ISSR profilok eredményei 47
5.5 Az in planta FISH eredményei 51
5.6 Az ultrastruktura vizsgálatok eredményei 52
5.7 A taxonómiai vizsgálatok eredményei 55
5.7.1 Az izolátumok spóraképzése 55
5.7.2 Molekuláris taxonómiai eredmények 57
5.7.3 A három új nemzetség és az új fajok taxonómiai leírása 62
6. DISZKUSSZIÓ 70
6.1. Alföldi félszáraz területek DSE gombái 70
6.1.1 A terepi gyökerek kolonizációja 70
6.1.2 A DSE közösség fontosabb csoportjai 71
6.1.3 A DSE-k gazda- és területspecificitása és szezonalitása 74
6.1.4 A DSE közösség vizsgálatának konklúziói 75
6.2. A 3 DSE csoport izolátumainak ISSR vizsgálata 76
6.3. Az in planta FISH 77
6.4. A Cadophora sp. kolonizációjának TEM vizsgálata 79
6.5. A leírt DSE taxonok 81
6.5.1 Az új DSE nemzetségek elhelyezkedése 82
6.5.2 A Darksidea nemzetségbe tartozó más szekvenciák/izolátumok 83
6.5.3 Ivaros alak és spóraképzés a DSE gombáknál 84
7. ÖSSZEFOGLALÁS 85
8. SUMMARY 86
9. IRODALOMJEGYZÉK 87
10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 103
11. FÜGGELÉK 104
12. PUBLIKÁCIÓS LISTA 115
4
BEVEZETÉS
A szárazföldi edényes növények többsége különböző nem patogén gombákkal él
együtt, az esetek többségében gyökerüket sokféle gomba kolonizálhatja, köztük endofitonok
is. Az endofiton gombák életciklusuk teljes, vagy egy meghatározó szakaszán tünetmentesen
élnek a gazdanövényben. Ezek egy formacsoportját alkotják a sötét szeptált endofitonok
(DSE), melyek elnevezésüket a gyökérben inter- és intracellulárisan futó, legtöbb esetben
pigmentált, szeptált hifáikról kapták. Ezekről a gombákról viszonylag kevés ismerettel
rendelkezünk, annak ellenére, hogy jelen vannak az összes ökoszisztémában, különösen
abiotikus stressznek kitett, például száraz-félszáraz élőhelyeken. A DSE gombák életmenet
stratégiájáról, életközösségekben betöltött szerepéről, diverzitásáról, a kolonizációs
lépéseiről és rendszertani besorolásáról információink meglehetősen hiányosak. Dolgozatom
témáját alföldi félszáraz homokterületek DSE gombáinak több irányú vizsgálata adja, mely
közelebbi betekintést adhat a fent említett alapvető kérdések megértéséhez.
A dolgozatban szereplő DSE közösség vizsgálatok már a munkába kapcsolódásom
előtt megkezdődtek (Pintye és Kovács 2006). Mivel ezen korábbi részeredmények az általam
kapottakkal együtt elemezhetők és értelmezhetők jól, továbbá számos új vizsgálatot is
végeztem ezekkel a törzsekkel, a dolgozatomban, jelölve, ezek az eredmények is
szerepelnek.
5
1. AZ ENDOFITON GOMBÁK ÁTTEKINTÉSE
1.1 Endofiton szervezetek
A növények különböző szervezetekkel élnek együtt, melyek a növény felszínén, vagy
szöveteiben is jelen vannak. Az endofiton elnevezés a görög endo (= belül) és phyton (=
növény) szavakból ered, és magában foglalja a növények szöveteiben jelen lévő
organizmusok széles spektrumát a baktériumoktól kezdve a gombákon keresztül a
metazoákig (Wilson 1995). Anton de Bary német botanikus-növénypatológus már 1886-ban
használta az endofiton kifejezést, melyet a növények hajtásaiban jelenlévő
mikroorganizmusok összefoglalására használt (Wilson 1995 alapján). Az endofiton
megnevezés nem feleltethető meg a szimbiózis egyik „de Bary-féle” klasszikus típusának
sem (pl. mutualizmus, kommenzalizmus, parazitizmus), egyedül az adott szervezet
növényben való jelenlétére vonatkozik (Saikkonen és mtsai 1998, Schulz és Boyle 2005,
Junker és mtsai 2012, Andrade-Linares és Franken 2013). Az endofitonok életmenet
stratégiájuk szerint lehetnek például látens patogének, látens szaprotrófok vagy
egyértelműen mutualista gombák is (Porras-Alfaro és Bayman 2011).
1.2 Endofiton gombák
Az endofiton gombák sokféle definíciója ismeretes. Legtöbb esetben azokat a
gombákat nevezzük endofitonoknak, melyek életciklusuk teljes, vagy egy meghatározó
szakaszán megtalálhatók a gazdanövényben, nem okozva látható szöveti károsodást (Petrini
1991, Hirsch és Braun 1992, Wilson 1995, Saikkonen és mtsai 1998, Stone és mtsai 2000,
Hyde és Soytong 2008). Az endofitonok inter- és intracellulárisan kolonizálják a növények
különböző szöveteit, megtalálhatóak az összes biomban és éghajlati övben, így fontos
szerepet tölthetnek be az ökoszisztémákban (Porras-Alfaro és Bayman 2011).
Az endofiton gombákat több féle szempontot figyelembe véve számos módon
kategorizálhatjuk (Hyde és Soytong 2008). Történeti és gazdasági szempontok alapján már a
kezdetektől két nagy csoportra osztották őket, megkülönböztetve/elkülönítve a fás szárú
növények és a fűfélék hajtásainak endofitonjait (Saikkonen és mtsai 1998). A fűfélék
endofitonjait mezőgazdasági jelentőségük miatt főként mezőgazdasági és alkalmazott
mikológiai szempontok alapján kezdték vizsgálni. A biológiai, taxonómiai vagy ökológiai
különbségek csak erősítették az eltérő megközelítésmódot a két különállónak tekintett
endofiton csoportnál (Saikkonen és mtsai 1998). A gazdanövények rendszertani helye és
életmenet stratégiája mellett további alapvető eltérés mutatkozott a két endofiton csoport
6
terjedési stratégiájában (pl. Saikkonen és mtsai 1998, Cheplik és Faeth 2009), mely történhet
ivaros spórával, konídiummal, vagy egyéb képlettel (horizontális terjedés) és a gombák a
növény szaporító képleteiben (pl. mag, szemtermés) is átkerülhetnek a következő gazda
generációba (vertikális terjedés) (Rodriguez és mtsai 2009).
A dolgozatban Rodriguez és mtsai (2009) által bevezetett kategóriák szerint
ismertetem az endofiton gombákat (1. táblázat). Ez a jelenleg is általánosan használt
rendszer (pl. Porras-Alfaro és Bayman 2011, Su és mtsai 2013) az endofitonokat történeti,
filogenetikai, funkcionális, kolonizációs és terjedési sajátosságaik alapján kategorizálja. E
szerint az endofiton gombák két fő csoportba sorolhatók; (i) az egyiket a Clavicipitaceae
(Sordariales, Ascomycota) családba tartozó, fűféléket kolonizáló gombák alkotják, ezeket C-
endofitonoknak nevezzük (CE, Clavicipitaceous endophytes vagy „class-1” endofitonok),
(ii) a másik csoportot a Clavicipitaceae-től eltérő rendszertani csoportokba tartozó NC-
endofitonok (NCE, non-Clavicipitaceous endophytes) alkotják. Az NC-endofitonokat
további három „funkcionális csoportra” oszthatjuk („class-2”, „class-3” és „class-4”, lásd 1.
táblázat) (Rodriguez és mtsai 2009). Ezen csoportokba sorolt gombáknak nincs
meghatározott gazdanövény csoportja, alacsonyabb rendű növények, harasztok,
nyitvatermők és zárvatermők szöveteit is kolonizálhatják.
1.2.1 A C-endofitonok
A C-endofitonok a Clavicipitaceae családba tartozó gombák (pl. Epichloë fajok;
anamorf: Neotyphodium), melyek szisztémásan (jelenlétük nem csak egy szervre-szövetre
korlátozódik) kolonizálják a pázsitfűfélék föld feletti hajtásait (Clay és Schardl 2002,
Rodriguez és mtsai 2009). A C-endofitonokat általánosan a gazdanövény mutualista
partnerének tekintik, főként az intercelluláris terekben fordulnak elő és vertikálisan
(szemterméseken keresztül) is terjednek (Schardl és mtsai 2004, Andrade-Linares és Franken
1. táblázat Az endifiton gombák csoportosítása Rodriguez és mtsai (2009) szerint, módosítva
C-endofitonok NC-endofitonok
szempontok class-1 class-2 class-3 class-4
gazda spektrum szűk széles széles széles
kolonizált szerv hajtás és rizóma hajtás, rizóma
és gyökér hajtás gyökér
kolonizáció mértéke kiterjedt kiterjedt limitált kiterjedt
növényen belüli
diverzitás mértéke alacsony alacsony magas nem ismert
terjedési stratégia vertikális és
horizontális
vertikális és
horizontális horizontális horizontális
7
2013). Az endofiton gombák a C-endofitonoknak köszönhetően kerültek fókuszpontba az
1970-es évek végén, amikor Bacon és mtsai (1977) felfedezték, hogy a legelőfüvekben
előforduló Clavicipitaceae családba tartozó endofiton gombák toxikusak a marhákra és egy
régóta ismert szindróma okozói. Az ezt követő tanulmányok rávilágítottak, hogy mind az
endofitonok, mind a toxinok okozta szindrómák általánosak és elterjedtek. Emiatt válhattak a
C-endofitonok az „egyik legérdekesebb és gazdaságilag legfontosabb típusává” a gomba-
növény interakcióknak (Andrade-Linares és Franken 2013), melyekkel azóta is számos
tanulmány, összefoglaló cikk, könyvfejezet és könyv foglalkozik (pl. Stone és mtsai 2000,
Bacon és White 2000, Faeth és Fagan 2002, Arnold és Lutzoni 2007, Spatafora és mtsai
2007, Cheplick és Faeth 2009, Porras-alfaro és Bayman 2011).
1.2.2 Az NC-endofitonok
Az NC-endofitonokról és ökológiai jelentőségükről relatíve kevesebb ismerettel
rendelkezünk, és csak nagy általánosságokban beszélhetünk erről a csoportról, mivel
rendkívül sokféle gomba sorolható ide. Ezeket feltételezett tulajdonságaik és funkcióik
alapján legalább három csoportba sorolhatjuk (1. táblázat) Rodriguez és mtsai (2009)
kategóriái szerint.
A class-2 endofitonok (1. táblázat) többségükben az aszkuszos gombák
Pezizomycotina altörzsébe tartoznak. Példaként említhetjük többek közt a „Phoma”,
Arthrobotrys, Fusarium culmorum, Colletotrichum magna és a Yellowstone hőforrásoknál
izolált Curvularia protuberata (Redman és mtsai 2002) fajokat. A class-2 endofitonok a
növény gyökerét, szárát és levelét is kolonizálhatják, horizontálisan és vertikális módon is
terjedhetnek. Általában egy speciális élőhelyen kölcsönös „habitat-adaptációt” biztosíthatnak
egymás közt a gazdanövénnyel, illetve egyes esetekben elengedhetetlenek lehetnek a növény
normális fejlődéséhez (Garbary és Macdonald 1995, Rodriguez és mtsai 2009). A „habitat-
adaptált előnyt” abiotikus és biotikus stressznek kitett növényeknek biztosíthatnak, többek
között növelhetik a gyökér és hajtás biomasszáját (pl. Mucciarelli és mtsai 2003), a
patogénekkel szembeni ellenállóképességet (pl. Narisawa és mtsai 2002) és a szárazság-, só-
és hőtűrést (Redman és mtsai 2002, Rodriguez és mtsai 2008).
A class-3 endofitonok (1. táblázat) kizárólagosan a növények föld fölötti szöveteiben
fordulnak elő, horizontálisan terjednek és extrém magas növényen belüli (in planta)
diverzitás jellemző rájuk. Ide sorolható a legtöbb endofiton gomba, melyek a moháktól
kezdve a zárvatermő növényekig, a trópusitól a sarki életközösségekig előfordulnak
8
(Rodriguez és mtsai 2009) a növények szárában, levelében, kérgében, virágában,
gyümölcsében és ide tartoznak a trópusi fák levelében jelen lévő extenzíven vizsgált
endofitonok is (Arnold és mtsai 2000, Tejesvi és mtsai 2005, Arnold és Lutzoni 2007). A
csoport magas diverzitásának köszönhetően nehéz ökológiai vagy egyéb funkcióiról
általános következtetést levonni.
A class-4 csoportba (1. táblázat) olyan endofiton gombák tartoznak, melyek
kolonizációja a növények gyökerére korlátozódik. E gyökérendofiton gombákat
részletesebben tárgyaljuk az 1.3.2 alfejezettől kezdve.
1.3 Gyökérkolonizáló nem patogén gombák
1.3.1 Mikorrhiza képző gombák
A szárazföldi edényes növények többsége mikorrhiza képző gombákkal él együtt. A
tudományos irodalomban növények gyökeréhez asszociált gombák tekintetében legtöbb
esetben ezzel a kapcsolattal találkozhatunk. A mikorrhizák „az abszorpció kettős szervei,
melyek akkor jönnek létre, mikor szimbiotikus gombák kolonizálják a szárazföldi növények
többségének és számos vízi növény és epifiton egészséges felszívó szerveit” (Trappe 1996).
A mikorrhiza képző gombák túlnyomó többsége a valódi gombák három törzsébe, a
Glomeromycota, az Ascomycota és a Basidiomycota törzsekbe tartoznak. A különböző
típusú mikorrhiza kapcsolatokban a gomba partner segíthet a növénynek a víz és a benne
oldott ásványi anyagok felvételében, míg a gombának a növény többek közt asszimilátumot
(cukrokat és más szerves anyagokat) ad át (Smith és Read 2008). Ez a legtöbb esetben
egyértelműen mutualista kapcsolat a gazdanövény és a gomba között, melynek alapja a
kölcsönös anyagátadás, mely sok esetben jól megfigyelhető struktúrákon (pl. intracelluláris
arbuszkulum (AM), intercelluláris Hartig-háló (EcM)) keresztül zajlik (Smith és Read
2008).
Habár a különböző mikorrhizaképző gombákat az endofiton gombák közé
sorolhatnánk az utóbbiak definiciója szerint, azonban viszonylag jól meghatározott
funkcionális tulajdonságaik (pl. mutualista kapcsolat, direkt tápanyag transzfer (Brundrett
2002), és strukturális bélyegeik (pl. köpeny, Hartig-háló, arbuszkulum) alapján a
mikorrhizaképző csoportokat külön kezelik.
9
1.3.2 Gyökérendofiton gombák
A növények láthatóan egészséges gyökereiben gombák széles spektruma megtalálható
(Vandenkoornhuyse és mtsai 2002), melyek között az aszkuszos gombák előfordulása
kiemelkedő mértékű (Addy és mtsai 2005), de mikorrhizát nem képző bazidíumos gombák is
kolonizálhatják a gyökereket (Porras-Alfaro és Bayman 2011, Herrera és mtsai 2010). A
bazídiumos gyökérendofitonok közé tartozik a Piriformospora indica (Basidiomycota,
Sebacinales), melyet egy Indiából származó talajmintában lévő arbuszkuláris mikorrhiza
(AM) képző gomba spórájából izoláltak (Verma és mtsai 1998). Relatíve alapos ismerettel
rendelkezünk e gombáról számos élettani, molekuláris biológiai és kolonizációs vizsgálatnak
köszönhetően (pl. Waller és mtsai 2005, Zuccaro és mtsai 2011, Lahrmann és mtsai 2013).
Néhány tanulmányban mikroszkópos megfigyelések alapján elkülönítették a „fine
endofitonokat”, melyek a gyökerekben általánosan előforduló nagyon vékony, alig látszó és
nehezen festhető hifákkal rendelkeznek és korábban az arbuszkuláris mikorrhiza képző
gombák (AMF) közé sorolták őket Glomus tenue gyűjtőnéven (Olsson és mtsai 2004,
Postma és mtsai 2007). A „fine endofitonok” rendszerani hovatartozása még tisztázatlan és
irodalmi adataik is elenyészők.
Az irodalomban több helyen találkozhatunk a „gyökérasszociált gomba” (RAF, root-
associated fungi) kifejezéssel, mely a gyökerekkel együtt előforduló gombákat jelenti, és sok
esetben (pl. Green és mtsai 2008, Herrera és mtsai 2010, Khidir és mtsai 2010) a gyökerek
felszín-sterilizálását követő molekuláris vizsgálatok során csak DNS szinten kimutatott
gombákat jelöli.
A gyökérendofitonok közül az aszkuszos gombák közé tartozó, pigmentált hifákkal
rendelkező endofiton gombákról viszonylag több ismerettel rendelkezünk, mivel a sötét
hifák relatíve könnyen detektálhatók a gyökerekben és ezek a gombák táptalajon általában
könnyen tenyészthetők (Narisawa és mtsai 2003, Addy és mtsai 2005).
A dolgozat további fejezeteiben az Ascomycota törzs, Rodriguez és mtsai (2009)
szerint class-4 csoportjába (1. táblázat) tartozó, a növények gyökerét kolonizáló és többnyire
pigmentált sejtfalú hifákkal rendelkező sötét szeptált endofiton gombák kerülnek
részletesebb bemutatásra.
10
2. A SÖTÉT SZEPTÁLT ENDOFITONOK IRODALMI ÁTTEKINTÉSE
2.1 Történeti áttekintés
A pigmentált hifákkal rendelkező gyökérkolonizáló gombák történeti áttekintését
Jumpponen és Trappe (1998a) munkája alapján ismertetem röviden.
A gyökereket kolonizáló szeptált hifákról először a XX. század elején Gallaud írt két
növény (Allium sphaerocephalum, Ruscus aculeatus) esetében. A 1920-as évek elején
Peyronel hasonló struktúrákat figyelt meg a nyári búza (Triticum aestivum) gyökerében,
majd Melin izolált „barnás feketés hifákkal rendelkező steril gombákat”, melyeknek a
Mycelium radicis atrovirens (MRA) és a Rhizoctonia sylvestris nevet adta. Előbbi
intracellulárisan, utóbbi a gyökér felszínén képzett szkleróciumokat (lásd Jumpponen és
Trappe 1998a).
Szintén Peyronel pár évvel később 135 zárvatermő növényfaj gyökerében figyelt meg
sötéten pigmentált, a kéregsejteiben pedig aggregált, vastag falú hifákat. A megfigyelt
képleteket „Rhizoctonia-szerű” struktúraként írta le, de tisztában volt vele, hogy ezeket nem
csak ez az egy csoport képzi. Melin később „pszeudomikorrhiza”-ként nevezte meg ezeket a
kapcsolatokat, mivel olyan növényfajokat vizsgált, melyek nem képeznek mikorrhizát és ezt
a kapcsolatot inkább parazita jellegűnek, mint mutualistának tekintette. De tudjuk, hogy ezek
a gombák mikorrhiza képző és nem mikorrhiza képző növények gyökerét egyaránt
kolonizálják (lásd Jumpponen és Trappe 1998a).
A gyökereket kolonizáló, pigmentált és szeptált hifákkal rendelkező gombákkal a
korábbi leírásokban több néven találkozhatunk: alkalmi mikorrhizás endofiton („casual
mycorrhizal endophytic”), pszeudomikorrhizás („pseudomycorrhizal”), Rhizoctonia-szerű,
szeptált endofiton (septate endophytes) és sötét szeptált (dark septate, DS) endofiton (lásd
Jumpponen és Trappe 1998a).
Napjainkban, bár még mindig többféle megnevezéssel találkozhatunk (pl. MRA,
Narisawa és mtsai 2002; DS endofitonok, Cázares és mtsai 2005), és bár O’Dell és mtsai
(1993) már több mint húsz éve jogosan felvetették, hogy a „szeptált endofiton” elnevezés
lenne megfelelő a többek között sok, csak hialin hifával rendelkező gyökérendofiton miatt, a
sötét szeptált endofiton (DSE, Dark Septate Endophytes) maradt a legszélesebb körben
használt megnevezés ezekre a gyökérendofiton gombákra.
11
2.2 A DSE gombák
2.2.1 A DSE gombák elterjedése
A gyökérszerű szöveteket kolonizáló arbuszkuláris mikorrhizaképző gombákat már
körülbelül 450 millió éves ősharasztokban is detektáltak már (Remy és mtsai 1994), ami arra
enged következtetni, hogy a növények szárazföldre lépése idején már meglehetett a
szimbiotikus kapcsolat a gombákkal. Krings és mtsai (2007) egy alsó devon korban jellemző
ősharaszt (Nothia aphylla) rizómájának rizoidszerű struktúráiban figyeltek meg
intracelluláris, nem AMF-re jellemző gombákat, ezért elmondható, hogy endofiton gombák
már legalább 400 millió éve jelen vannak a növények felszívó szerveiben. Klymiuk és mtsai
(2013) mikroszkleróciumhoz hasonló struktúrákat írtak le már az eocénból is.
DSE gombákat 144 növénycsalád közel 600 fajából mutattak ki, melyek közt
mikorrhizát képző és nem képző növények is voltak (Jumpponen és Trappe 1998a, Sieber és
Grünig 2013). A DSE gombák a mikorrhizakápző növényfajok gyökerében a több különböző
mikorrhizaképző gombával egyidejűleg jelen lehetnek (Jumpponen és Trappe 1998a).
Mandyam és Jumpponen (2005) tanulmányukban a különböző ökoszisztémákban
előforduló növények és DSE interakcióinak eloszlását és gyakoriságát foglalták össze. Habár
a DSE gombák jelen vannak az összes nagyobb biomban és éghajlati övben, előfordulásuk
különösen jelentős a szubarktikus, alpesi, mérsékelt övi és száraz területeken, ahol szerepük
a mikorrhizákéhoz is mérhető lehet (Jumpponen 2001), ennek ellenére az elterjedésüket és
diverzitásukat vizsgáló tanulmányok száma elenyésző. Egy korai, mérföldkőnek számító
tanulmány, mely az alpin területek növényeivel együtt élő DSE gombákra irányult (Read és
Haselwandter 1981), azt feltételezte, hogy a DSE gombák jelentősége és előfordulása a
növekvő abiotikus stressznek megfelelően emelkedik egy adott területen. A melanintartalom
is összefüggésbe hozható az abiotikus stressz, különösen a szárazságstressz meglétével (Bell
és Wheeler 1986), és a melanizált sejtfallal rendelkező gombákkal összeállított kísérleti
rendszerekben valóban megnövekedett hőmérsékleti és szárazságstressz elleni rezisztenciát
mutattak ki (Redman és mtsai 2002, McLellan és mtsai 2007). Ezek alapján feltételezhetjük,
hogy a legtöbbször pigmentált hifákkal rendelkező DSE gombák fontos szerepet játszhatnak
az alacsony vízellátottságú ökoszisztémákban.
A szélsőséges körülményeknek kitett élőhelyeken vizsgált növények gyökerében
jelentős mértékben előforduló pigmentált hifák alapján többen valószínűsítették, hogy
kedvezőtlen körülmények között a DSE gombák az arbuszkuláris mikorrhizák szerepét
12
tölthetik be egyes területeken (Haselwandter és Read 1982, Treu és mtsai 1996, Jumpponen
2001, Postma és mtsai 2007). Számos gyökérendofitonokkal foglalkozó, többségükben az
észak-amerikai füves területeken végzett tanulmány is foglalkozott száraz és félszáraz
területek gyökér asszociált gombáival (pl. Porras-Alfaro és mtsai 2008, Mandyam és mtsai
2010, Khidir és mtsai 2010), és egyre több vizsgálat irányul a DSE gombákra, azonban
számos alapvető tulajdonságuk még nem teljesen ismert, például, hogy ezek a gombák
mutatnak-e bármiféle gazda- és területspecificitást, vagy jellemző-e rájuk valamiféle
szezonalitás.
Habár a legtöbb magyarországi mikorrhizáltsági státuszvizsgálat során a szeptált hifák
általi kolonizációt külön jelezték (Kovács 2008), egyes élőhelyek DSE gombáira kevés
kutatás irányult. Alföldi homokterületek vizsgálata során például jelentős gyakoriságú DSE
kolonizációt figyeltek meg (Kovács és Bagi 2001, Kovács és Szigetvári 2002). A fülöpházi
homokgyep növényeinek mikorrhizáltsági státuszvizsgálata során 89 vizsgált növényfajból
63 növény esetében figyeltek meg szeptált gomba általi kolonizációt és 36 esetben találtak
mikroszkleróciumot (Kovács és Szigetvári 2002). Ezek az alföldi homokgyepek a DSE
gombák gyakoriságának köszönhetően ideális területek a DSE közösség vizsgálatához.
Egy endofiton közösségben más gombaközösségekhez hasonlóan lehetnek
gyakori/domináns és generalista gomba csoportok, melyek több növényfajban, többször és
tömegesen fordulnak elő, és lehetnek egy adott növényfajhoz vagy mikrohabitathoz köthető
szórványosan előforduló gombák (pl. Otero és mtsai 2004). Ha szeretnénk információt
szerezni egy gombaközösség általános funkciójáról, a generalista és domináns csoportok
azonosítása és vizsgálata lehet az első lépés.
Tájidegen növények inváziójának a terület növényközösség szerkezetére való föld
fölött jelentkező hatásával régóta tisztában vannak, azonban a földalatti közösségekre
gyakorolt hatásával csak az utóbbi évtizedekben kezdtek el foglalkozni (Hawkes és mtsai
2005). Belnap és mtsai (2005) kimutatták, hogy egy másik fűféle által dominált száraz
területre betörő fedélrozsnok (Bromus tectorum) szignifikánsan lecsökkentette a
talajközösség diverzitását az ízeltlábúaktól a fonalférgeken át a gombákig és feltételezhetően
az eredeti mikrokörnyezethez kevésbé specializálódott fajok maradtak jelen.
Az inváziós növények terjedési sikeressége nagymértékben függ a talajban lévő
mikroorganizmusoktól (Richardson és mtsai 2000, Callaway és mtsai 2004). Rudgers és
mtsai (2005) vizsgálatai során azt az eredményt kapták, hogy egy mutualista endofiton
gomba jelenléte is szignifikánsan növelheti a terjedés és megtelepedés sikerességét egy
13
területre betörő növényfaj esetén. A mikorrhizaképző inváziós növények is sok esetben
arbuszkuláris mikorrhizát képző gombákkal élhetnek együtt, melyekről ismert, hogy
általában generalisták (Richardson és mtsai 2000, Moora és mtsai 2011). Feltételezhetjük, ha
egy inváziós növény gombakapcsolatban él, a gomba generalista lehet, mivel egy specifikus
kapcsolattól való függés gátja lenne a növény sikeres terjedésének.
DSE gomba kolonizációt már kimutattak inváziós növényekből magyarországi
mikorrhizáltsági státuszvizsgálatok során (Kovács és Bagi 2001, Kovács és Szigetvári 2002),
azonban nincs információnk arról, hogy milyen gyökérendofitonok fordulnak elő ezekben a
növényekben.
2.2.2 A DSE gombák rendszertani besorolása
Mivel a DSE gombák a gyökérben előforduló, aszkuszos gombákhoz tartozó
endofitonok egy formacsoportját alkotják (Jumpponen és Trappe 1998a), az ide tartozó fajok
néhány tulajdonságának hasonlósága nem feltétlenül jelent közeli filogenetikai rokonságot.
A DSE gombákat a molekuláris filogenetikai filogenetikai módszerekkel való
meghatározások előtt az aszkuszos és imperfekt gombák különböző csoportjaiba sorolták
(Jumpponen és Trappe 1998a), majd a molekuláris filogenetikai vizsgálatok alapján is az
aszkuszos gombák törzsének számos rendjébe illeszkedtek.
A DSE gombák leginkább a Pezizomycotina altörzsbe és ezen belül többek között a
Helotiales, Pleosporales, Xylariales, Microascales, Hypocreales, Chaetothyriales,
Capnodiales, Eurotiales és Sordariales rendekbe tartoznak (lásd Jumpponen és Trappe
1998a, Addy és mtsai 2005, Kageyama és mtsai 2008, Newsham 2011, Andrade-Linares és
Franken 2013, Diene és mtsai 2013, Walsh és mtsai 2014).
A legújabb DSE fajok leírását is tartalmazó tanulmányok (pl. Diene és mtsai 2013,
Walsh és mtsai 2014) ellenére körülbelül csak 20-25 leírt DSE fajról tudunk (Wang és
Wilcox 1985, Jumpponen és Trappe 1998a, Andrade-Linares és Franken 2013, Sieber és
Grünig 2013). A legtöbb imerettel a Helotiales (Leotiomycetes) rendbe tartozó DSE
gombákról rendelkezünk, melyek például a Cadophora finlandica (syn.: Phialophora
finlandia (Harrington és McNew 2003)), Cadophora orchidicola (syn.: Leptodontidium
orchidicola (Day és mtsai 2012) valamint a relatíve jól ismert és számos tanulmányban
vizsgált Phialocephala fortinii sensu lato - Acephala applanata fajkomplex (PAC) (pl.
Haselwandter és Read 1982, Wilcox és Wang 1987, O’Dell és mtsai 1993, Stoyke és Currah
14
1. ábra Egy MMN táptlajon fenntartott Cadophora (DSE-1 csoport)
izolátum sötéten pigmentált, szeptált hifái. Mérce = 30 µm.
1993, Fernando és Currah 1996, Jumpponen és Trappe 1998b, Narisawa és mtsai 2002,
Upson és mtsai 2009).
A Pleosporales rend a Dothideomycetes osztály legnagyobb és a legtöbb
életközösségben magas fajszámmal reprezentált rendje (Schoch és mtsai 2009, Zhang és
mtsai 2012), mely a legtöbb, félszáraz és száraz területek gyökér asszociált gomba
közösségét vizsgáló tanulmányban is egyike a domináns, a szekvenciák/izolátumok/fajok
többségét tartalmazó rendeknek (pl. Porras-Alfaro és mtsai 2008). Ennek ellenére elsősorban
csak egy ebbe a rendbe tartozó fajt, a Periconia macrospinosa-t vizsgálták több
tanulmányban (pl. Mandyam és mtsai 2012).
2.2.3 A DSE gombák általános jellemzői
A DSE gombákra jellemzők a sötéten pigmentált, szeptált hifák (1. ábra), melyek inter-
és intracellulárisan egyaránt kolonizálják a gyökeret (Currah és mtsai 1993), valamint a
kéregállományban
intracellulárisan létrehozott
jellegzetes struktúrák, a
mikroszkleróciumok (2. ábra)
(Read és Haselwandter 1981,
Jumpponen és Trappe 1998a).
Sok esetben jelenlévő,
azonban kevésbé jól
detektálható képletek a hialin
hifák, melyek többnyire csak
festést követően válnak
láthatóvá, sok esetben pedig még akkor sem (Mandyam és Jumpponen 2008). A sötéten
pigmentált, szeptált hifák könnyen azonosíthatók a gyökérben festés nélkül is. A hifák
struktúrája és pigmentáltsága változhat többek közt kortól, fiziológiás állapottól és
környezeti tényezőktől függően (Zhang és Zhuang 2004, Addy és mtsai 2005). A hifák
sejtfalában a melanin akkumulációja viszonylag gyakori jelenség alacsony hőmérsékleten a
talajokban előforduló gombáknál és fontos szerepet játszhat a hifák környezeti szélsőségek
elleni védelmében (Robinson 2001).
A mikroszkleróciumok legtöbbször a gyökér kéregsejtjeiben elhelyezkedő, általában
erősen pigmentált, vastag sejtfalú struktúrák, azonban lehetnek kevéssé melanizáltak is és
15
2. ábra A DSE1049 Cadophora izolátum (DSE-1 csoport) által
kukorica gyökérben képzett intra- és intercelluláris hifák, valamint a
sejtekben létrejövő kéken festődő mikroszkleróciumok. Mérce = 40 µm.
sok esetben általánosan használt festékekkel is jól festhetők (2. ábra). Megfigyeltek már
vékony falú, hialin struktúrákat is, de valószínű, hogy csupán fiatal, fejlődésük korai
stádiumában lévő mikroszkleróciumokról lehetett szó (Mandyam és Jumpponen 2008).
Jumpponen és Trappe (1998a) a kéregsejtekben intracellulárisan megjelenő melanizált hifák
összességeként nevezte meg a struktúrát, azonban intercelluláris képződést is megfigyeltek
(pl. Münzenberger és mtsai 2009). A mikroszklerócium pontos funkcióját nem ismerjük, a
legnagyobb valószínűség szerint vegetatív szaporító- illetve kitartóképlet lehet, mivel
többnyire vastag falú, pigmentált sejtek alkotják, nagy mennyiségben tartalmaz glikogént,
fehérjéket, polifoszfátot, valamint számos sejtmag található benne (Yu és mtsai 2001).
A hialin hifák
kevésbé vizsgált és
vizsgálható struktúrák,
melyek hasonlóan a sötét
hifákhoz, szeptáltak és
intra- és intercellulárisan
futnak, azonban erősebben
vakuolizáltak és nem
pigmentáltak (Barrow és
Aaltonen 2001, Yu és
mtsai 2001, Mandyam és
Jumpponen 2008).
Barrow és Aaltonen
(2001) elképzelhetőnek tartotta, hogy a hialin hifák falából hiányozhat a kitin, mely általános
alkotóeleme a valódi gombák sejtfalának. Munkájuk során azt tapasztalták, hogy a hifák
nehezen festődnek tripán-kékkel, azonban sudan IV festék használatával láthatóak lettek,
mivel ez megfestette a vakuólumokban található lipidcseppeket (Barrow és Aaltonen 2001).
Egyes feltevések szerint a hialin hifák szerepet játszhatnak a gombák esetleges növénnyel
kialakított anyagcsere-kapcsolatában (Barrow és Aaltonen 2001). Mások azt valószínűsítik,
hogy ezek még pre-melanizációs állapotban lévő, később pigmentálttá váló hifák (Yu és
mtsai 2001).
16
2.2.4 A DSE gombák terjedése
A DSE gombák ivartalan alakban vannak jelen, az anamorf-teleomorf
megfeleltethetőségeik és kapcsolataik nem ismertek (Jumpponen és Trappe 1998a, Grünig és
mtsai 2008, Rodriguez és mtsai 2009). Ivartalan spóraképzés (pl. konidiogenezis) a DSE-
knél nagyon ritka, és sok esetben is csak specifikus kezeléseket követően indukálható (Wang
és Wilcox 1985, Sieber és Grünig 2006). A konídiumot képző gyökérendofiton gombák
esetében megfigyeltek blasztikus akropetális (a konídiumlánc csúcsán van a legfiatalabb
konídium), blasztikus bazipetális (a konídiumlánc alján van a legfiatalabb konídium) és
arthrikus (a vegetatív hifa feldarabolódásával keletkeznek a konídiumok) konídiumképzést
is, melyek alapján már régóta feltételezték a DSE gombák taxonómiai heterogenitását (Addy
és mtsai 2005).
Annak ellenére, hogy a DSE gombák általánosan jelen vannak a nagyobb
ökoszisztémákban és az idetartozó fajok legtöbbször széles körben elterjedtek és különböző
éghajlati övekből is előkerültek, terjedési stratégiájukról kevés ismeret áll rendelkezésre. Az
ivaros spóraképzés hiánya, a csak néhány törzsnél megfigyelhető konídiumképzés vagy a
néhányszor megfigyelt, spórát nem tartalmazó steril termőtestek megjelenése (Currah és
mtsai 1993, Grünig és mtsai 2009) alapvető kérdéseket vet fel e gombák terjedésével
kapcsolatban.
Ha csak érintőlegesen is, de két tanulmányban foglalkoztak ezzel a kérdéssel, melyek
során lehetségesnek tartották, hogy a DSE gombák, kolonizált gyökérdarabokkal és
mikroszkleróciumokkal, emlősállatok közvetítésével terjedhetnek (Herrera és mtsai 2011a,
Fracchia és mtsai 2011). Herrera és mtsai (2011a) észak-amerikai félszáraz területeken négy
növényevő emlős friss ürülékéből mutatott ki a terület gyökérasszociált gomba közösségébe
tartozó szekvenciákat, melyek az összes szekvencia közel 8%-át tették ki. Ezek alapján azt
feltételezték, hogy a gyökerek elfogyasztásával a növényevők szerepet játszhatnak a
gyökérasszociált gombák terjesztésében, ami a gyér földfeletti növényzet miatt száraz
területeken még nagyobb jelentőségű lehet. Fracchia és mtsai (2011) tanulmányukban egy
kistestű rágcsáló (Ctenomys knighti) a DSE gombák terjesztésében játszott lehetséges
szerepét vizsgálták az Argentin Monte-sivatag száraz területein. A rágcsáló ürülékéből
származó gyökérdarabok több mint 96%-át kolonizálták DSE gombák. A vízben feloldott,
kevert és kiszárított ürüléket inokulumnak használva búzával összeállított in vitro tesztek
során a növények 100%-át kolonizálta DSE, valamint további kísérleteik során kilenc, a
területre jellemző növényfajból nyolc esetében figyeltek meg DSE általi kolonizációt.
17
Eredményeik alapján lehetségesnek tartották, hogy rágcsáló fontos szerepet játszik a terület
DSE gombáinak terjesztésében.
2.3 A DSE gombák vizsgálata
2.3.1 A DSE gombák növényre gyakorolt hatásának vizsgálata
Számos vizsgálat irányult DSE gombák és gazdanövényük kapcsolatának
megismerésére, mely során a gombák növényre gyakorolt pozitív, semleges és negatív
hatását is kimutatták (Jumpponen és Trappe 1998a, b, Jumpponen 2001, Addy és mtsai
2005). Az elmúlt években két meta-analízis (Newsham 2011, Mayerhofer és mtsai 2013) az
addigi hatásvizsgálatokat foglalta össze. Mindkét esetben csak kevés tanulmány volt
összehasonlítható és együtt elemezhető, és a két meta-analízis eredményei ellentmondók
voltak. Newsham (2011) által elemzett kutatásokban a DSE gombáknak egyik vizsgált
paraméter alapján sem volt negatív hatása a növényekre. A DSE gombákkal inokulált
növények esetében hajtás és gyökér biomassza, valamint a hajtás nitrogén és foszfor tartalma
is szignifikánsan magasabb volt a kontroll növényekhez képest (Newsham 2011). Ezzel
szemben Mayerhofer és mtsai (2013) által elemzett kutatásokban a DSE gombák
szignifikánsan negatív hatással voltak a teljes növényi biomasszára, a legtöbb más vizsgált
paraméter (pl. gyökér és hajtás biomassza, nitrogén- és foszfortartalom) esetében neutrálisak
voltak. Ezeket az ellentmondó eredményeket a vizsgálatokban különböző gomba- és
növényfajok és kísérleti körülmények beállítása, valamint eltérő paraméterek mérése
magyarázhatja. Például ha egy kísérletben a gomba növényi biomasszára gyakorolt hatását
vizsgálják, nem tapasztalnak szignifikáns hatást, ha azonban a gazdanövény patogénekkel
szembeni ellenállóképességének növekedését vizsgálnák, pozitív hatást tapasztalának (pl.
Redman és mtsai 2001, Rice és Currah 2002, Addy és mtsai2005). Egyes hipotézisek szerint
több DSE gomba látens patogén, és csak a növény legyengülésére „vár” (Promputtha és
mtsai 2007).
A DSE gombák növényre gyakorolt hatását számos kísérletben, számos
gazdanövényen vizsgálták. Az inokulációs kísérleteket legtöbb esetben Helotiales rendbe
tartozó gombafajokkal és ezek közt is kiemelkedően sokszor a Phialocephala fortinii sensu
lato - Acephala applanata fajkomplex (PAC) törzseivel végezték (pl. Fernando és Currah
1996, Jumpponen és Trappe 1998b, Caldwell és mtsai 2000, Tellenbach és mtsai 2011,
Reininger és mtsai 2012).
18
A DSE gombák gazdanövényre (általában ennek biomasszájára) gyakorolt pozitív
hatását többféle módon magyarázhatjuk, például növelhetik a gazdanövény
ellenállóképességét a patogénekkel szemben. Több DSE-nél is megfigyelték, hogy
antibiotikumok termelésével csökkenthetik a rhizoszférában található patogének számát (pl.
Schulz és mtsai 1999, Xu és mtsai 2008). Az endofiton gombák képesek erős védekezési
reakciót kiváltani a gazdanövényben (Schulz és mtsai 1999), ezáltal növelve annak
rezisztenciáját azokkal a patogénekkel szemben, amelyek enélkül képesek lehetnek
válaszreakció kiváltása nélkül betörni a gyökerekbe (Narisawa és mtsai 2002). A talajba
kiválasztott enzimeik révén a DSE gombák a növények számára jobban felvehetővé, jobban
mobilizálhatóvá teszik a talajban oldott szerves és szervetlen anyagokat. Bontóenzimek
(cellulázok, lakkázok, amilázok, lipázok, pektinázok, xylanázok, fehérjebontó enzimek,
tirozinázok, polifenol oxidázok) széles spektrumát kimutatták már különböző DSE
gombáknál (Caldwell és mtsai 2000). A DSE gombák mineralizálhatják a talajban előforduló
szerves nitrogént, aminosavakból tápanyagokat szabadíthatnak fel (Mandyam és Jumpponen
2005, Upson és mtsai 2009), valamint elősegíthetik különböző ionok (pl. magnézium)
felvételét (Postma és mtsai 2007). A pigmentált hifák sejtfalában található melanin szerepet
játszhat a szárazságstressz folyamán létrejött oxigéngyökök megkötésében (Bell és Wheeler
1986, Redman és mtsai 2002).
2.3.2 A DSE gombák kolonizációjának fénymikroszkópos vizsgálatai
Annak ellenére, hogy Gallaud már több mint 100 éve írt gyökerekben futó sötéten
pigmentált hifákról (lásd Jumpponen és Trappe 1998a), ismereteink hiányosak a DSE
gombák gyökérkolonizációjáról. Kevés tanulmány helyezte középpontba a
gyökérendofitonok strukturális és ultrastruktúrális vizsgálatát, és ezek is néhány kivételtől
eltekintve fénymikroszkópos vizsgálatok voltak (lásd Peterson és mtsai 2008).
A DSE gombák mikroszkópos vizsgálataiból származó információkat és a
kolonizációs sajátosságaikat kritikusan kell kezelnünk, mivel ismereteink főként egy adott
rendbe (Helotiales) tartozó néhány gombafaj (PAC, Cadophora finlandica, C. orchidicola)
által kolonizált, főként mikorrhizaképző fásszárú zárvatermők (nyár (Populus sp.), nyír
(Betula sp.) és fűz (Salix sp.)) és nyitvatermők (kéttűs fenyő fajok.) gyökereiről származnak
(Jumpponen és Trappe 1998b, Peterson és mtsai 2008). A PAC fajok általánosságban a
fenyők, vagy más erdőalkotó fafajok gyakori endofitonjai (Grünig és mtsai 2002),
ismereteink viszont hiányosak a száraz területeken megtalálható DSE gombákról és az ottani
19
füves területek növényeinek (főként az itt domináló fűfajok) kolononizációjáról (de lásd pl.
Mandyam és mtsai 2012).
A jól megfigyelhető pigmentált hifák mellett a hialin hifák láthatóvá tétele gyakran,
például a Periconia macrospinosa (Pleosporales rend) esetében nehézkes, mivel a
hagyományosan használt festékek (pl. anilinkék, gyapotkék, tripánkék, tinta) nem minden
esetben festik meg a gomba sejtfalat (Barrow és Aaltonen 2001, Mandyam és Jumpponen
2008).
2.3.3 A DSE gombák ultrastruktura vizsgálatai
Peterson és mtsai (2008) saját eredményeik bemutatása mellett összefoglalják a
gyökérkolonizáló endofiton gombák transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM) és
fénymikroszkópos vizsgálatával foglalkozó meglehetősen kevés számú tanulmányt. Peterson
és mtsai (2008) cikkéből kiindulva kerülnek bemutatásra az eddigi eredmények és
ismereteink erről a témáról.
A legtöbb ultrastruktura vizsgálat során a különböző növények gyökerét kolonizáló
Phialocephala fortinii által képzett struktúrákat és a kolonizáció sajátosságait
tanulmányozták. Több esetben hasonló struktúrák kialakulásáról vagy meglétéről számoltak
be, például a két rokon fafaj, egy fűz (Salix glauca) illetve egy nyár (Populus tremuloides)
faj kolonizálásának vizsgálatánál Fernando és Currah (1996) illetve Cameron (1998) a P.
fortinii azonos kolonizációs tulajdonságait, strukturáit írták le, miszerint elsősorban a
gyökérszőrökön keresztül penetráltak a hifák, majd képeztek mikroszkleróciumot. Más
esetekben teljesen eltérő eredményeket kaptak, például P. fortinii-val inokulált közeli rokon
fenyő fajok (Pinus contorta, P. strobus) kolonizációja teljesen eltérő volt. A gyökérben nem
figyeltek meg ektomikorrhizákra jellemző struktúrákat (köpenyt és Hartig-hálót) csak
intracelluláris hifákat és mikroszkleróciumokat (O’Dell és mtsai 1993, Jumpponen és Trappe
1998b), más esetekben pedig Hartig-háló képződött az intracelluláris hifák mellett és nem
találtak mikroszkleróciumot a gyökérben (Peterson és mtsai 2008).
A P. fortinii ultrastruktura vizsgálata mellett más gombákon, többek közt a rezgőnyár
gyökerét kolonizáló Cryptosporiopsis radicicola (Tsuneda és mtsai 2009) és a kínai
káposztát kolonizáló Heteroconium chaetospira (Ohki és mtsai 2002, Yonezawa és mtsai
2004, Usuki és Narisawa 2007) endofiton gombákon végeztek hasonló kísérleteket.
20
Többek közt a kevés vizsgálatnak és tanulmánynak köszönhetően számos fontos
kérdés mind tisztázatlan. Nem ismerjük a kolonizáció első lépéseit, a penetráció helyét és
módját, illetve hogy hogyan alakulnak ki a jellegzetes gomba struktúrák és milyen sejtszintű
változásokat indít el a kolonizáció mind a gomba mind a növényi sejtekben.
2.3.4 A gombák molekuláris taxonómiai vizsgálata
Mivel a gyökérendofitonok ivartalan alakban fordulnak elő, karakterekben szegények,
ráadásul csak néhányuk képez konídiumokat, melyek segíthetnének a határozásban,
rendszertani besorolásuk nehézségekbe ütközhet. A molekuláris módszerek használata
azonban lehetővé teszi a morfológiai alapon nehezen, vagy nem meghatározható szervezetek
elkülönítését.
A molekuláris filogenetikai taxonómiai vizsgálatokban a különböző szervezetek
homológ DNS szakaszainak összevetésével lehet következtetni a rokonsági kapcsolatokra. A
vizsgálni kívánt DNS szakasz kiválasztása általában az összehasonlítani kívánt csoportok
rendszertani szintjétől is függ. A magasabb taxonok (pl. osztály, rend) vizsgálatánál kevésbé
változó, konzervatív régiókat használunk, viszont ha fajok közti különbségeket keresünk,
akkor a DNS egy variábilisabb szakaszát vetjük össze. A gombáknál legtöbbször vizsgált
szakasz, a sejtmagi genomban több kópiában előforduló, konzervatívabb és variábilisabb
szakaszokat tartalmazó riboszómális RNS génkomplex. A fonalas gombák fajszintű
taxonómiai vizsgálatainál legtöbbször a sejtmagi riboszomális DNS (nrDNS) Internal
Transcribed Spacer (ITS) régióját alkalmazzák, mely két variábilis nem kódoló szakaszból
áll (ITS1, ITS2), melyek a 18S (Small Subunit, SSU), 5,8S és 28S (Large Subunit, LSU)
alegységek között helyezkednek el és azokkal egyetlen transzkripciós egységet alkotnak a
kromoszómákon. A gombák nemzetség és faj szintű meghatározására alkalmasnak tartott
ITS régiót közel 25 éve használják (White és mtsai 1990) rendszertani azonosításhoz és
filogenetikai elemzésekhez. Schoch és mtsai (2012) számos gombafaj több DNS
szakaszának elemzése alapján is az ITS régiót tartották a legalkalmasabb „DNS barcode
marker”-nek, mivel magas kópiaszámában van jelen, könnyen amplifikálható-szekvenálható
és a valódi gombacsoportok nagyrészénél lehetővé teszi a fajszintű elkülönítést. A GenBank-
ban és más adatbázisokban is a valódi gombák esetében az ITS régiók szekvenciája szerepel
legtöbbször, melynek használata könnyebbé teszi az adott szervezetek másokkal való
összevetését.
21
Több esetben azonban nem, vagy csak kevéssé használható a gombák esetében
„vonalkódnak” tekintett ITS régió fajok elkülönítésére, mivel a több kópiában lévő ITS
régiók különbözhetnek fajon belül, vagy azonosak lehetnek különböző fajok esetében (pl.
Geiser és mtsai 2007, Nilsson és mtsai 2008, Kovács és mtsai 2011, Kiss 2012, Carlson és
mtsai 2015).
Az ITS mellett más lokuszokat is sokszor használnak a gombák molekuláris
taxonómiájával foglalkozó tanulmányokban. Ilyenek például a kevésbé variábilis 18S és 28S
nrRNS gének, valamint fehérjéket (pl. aktin, tubulin, kalmodulin, transzlációs elongációs
faktor és RNS polimeráz) kódoló DNS szakaszok. Számos esetben például az aktin gén
szekvenciák (pl. Voigt és mtsai 2000) vagy a tubulin és elongációs faktor gén szekvenciák
(pl. Quaedvlieg és mtsai 2014) eredményeznek az ITS régiónál nagyobb és jobb feloldást
vagy faj szintű elkülönülést. Az elmúlt években a taxonómiai és filogenetikai témájú
tanulmányok túlnyomó többségében már több gén szekvenciáján alapuló elemzésekkel
találkozhatunk, és már meghatározott gomba genomok több száz lókuszának filogenetikai
elemzése sem ritka (pl. Galagan és mtsai 2005, Fitzpatrick és mtsai 2006, Nagy és mtsai
2014).
2.3.5 Az Inter Sample Sequence Repeat (ISSR) módszer
Egy gomba fajon belüli genetikai variabilitásának vizsgálatához variábilis DNS
szakaszok meghatározása mellett használhatunk más technikákat is. Egy egyszerű módszer
az Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) polimeráz láncreakció (PCR), mely során egy
mikroszatellit szekvenciát használnak primerként. A mikroszatellitek olyan DNS szakaszok,
melyek szekvenciája néhány (1-6) nukleotid tandem ismétlődése (Weising és mtsai 2005,
Lim és mtsai 2004). Ha egy mikroszatellit amplifikálható távolságon belül fordított
helyzetben ismétlődik, akkor a PCR a mikroszatellitek által határolt szakasz
felszaporodásához vezet (Reddy és mtsai 2002). Mivel az ilyen szakaszokból a genomokban
több van, a PCR során több különböző méretű amplikon keletkezik. Ezeket gélelektroforézis
után a gélképen vizsgálhatjuk és ideális esetben az amplikonok több DNS sávból álló
mintázatot adnak (3. ábra). Ez a mintázat az ISSR profil, és ennek egy-egy sávja taxonra,
fajra vagy törzsre is jellemző lehet (Grünig és mtsai 2001, Reddy és mtsai 2002, Bornet és
mtsai 2005) az ITS régióénál jóval nagyobb lehet a felbontása. Az ISSR profilok elemzése
alkalmas lehet intraspecifikus genetikai variabilitás felmérésére és adott törzsek/izolátumok
azonosítására gombák esetében is (Grünig és mtsai 2001, Alaniz és mtsai 2009). Az ISSR
22
3. ábra 12 Cadophora sp. (DSE-1) izolátum ISSR profilja. Az (AAG)6 primerrel végzett PCR
termékek láthatók agaróz gélen futtatva (a létrák balról az 1., 7. és 15. zseb).
előnyei, hogy egyszerűen és viszonylag gyorsan kivitelezhető és az egész genomról ad
információt („ujjlenyomatot”). Más DNS fragment elemzésen alapuló technikával szemben
(pl. RAPD, random amplified polymorphic DNA; AFLP, amplified fragment-lenght
polimorphism) nagyobb polimorfizmust mutathat és jobb reprodukálhatósággal rendelkezik
(Bornet és Branchard 2001, Grünig és mtsai 2001, Reddy és mtsai 2002).
2.3.6 A fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) alapjai
Egy egészséges gyökeret egyszerre számos nem-patogén gomba kolonizálhat
(Vandenkoornhuyse és mtsai 2002). Ahhoz, hogy közelebb kerüljünk az endofiton gombák
funkciójának megértéséhez, a különböző endofiton gombafajok növény gyökerén belüli
specifikus detektálása, mely mind a terepi gyökerek vizsgálatánál, mind a különböző
gombákkal beállított inokulációs kísérleteknél alapfeltétel. Nem volt olyan tanulmány,
amiben a tenyésztéses és a szekvencia-alapú detektálás mellett ténylegesen egyszerre
festettek meg specifikusan két különböző gyökérendofiton gombát. Az endofiton gombák
gyökéren belüli hagyományos festése sokszor nehézkes a sejtfal sokszor nem konzekvens és
következetes festődése miatt (Barrow és Aaltonen 2001), a fajspecifikus festés pedig
rengeteg akadályba ütközik.
A különböző molekuláris technikákkal végzett diverzitás vizsgálatok során nagy
gombaközösség diverzitással találkozunk (Hibbett és mtsai 2009), azonban még nem áll
rendelkezésre egy általánosan használt és bevált technika arra, hogy specifikusan tegyük
láthatóvá és lokalizáljunk gombafajokat a növényekben.
23
Vannak módszerek, melyek a hifák egyes sejtfal-komponenseinek festésén (pl. Hood
és Shew 1996, Séjalon-Delmas és mtsai 1998), a hifák autofluoreszcenciáján (pl. Dickson és
Kolesik 1999, Hoch és mtsai 2005, Vierheilig és mtsai 2005, Dreyer és mtsai 2006, Diagne
és mtsai 2011), vagy egyes transzformált gombatörzsek esetén az expresszálódó fluoreszcens
fehérjék detektálásán alapulnak (pl. Lorang és mtsai 2001, Bergero és mtsai 2003, Czymmek
és mtsai 2005). A növényi szöveteken belüli fajspecifikus lokalizációját azonban e
módszerek sem teszik lehetővé.
Egy specifikus jelölési módszer a fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH, fluorescence
in situ hybridization), melyet mikrobiális közösségek fajainak azonosítására is használnak
(Lundberg és mtsai 2012, Wagner és Haider 2012). A FISH-t már használták szabadon élő
gombák azonosítására (pl. Baschien és mtsai 2008, Jones és mtsai 2011) és gyökéren kívüli
AMF hifák jelölésére is (Trouvelot és mtsai 1999). Az RNS-FISH során fluorofórral jelölt
DNS oligonukleotid próbák hibridizálnak a komplementer RNS szakaszokkal,
leggyakrabban a riboszómális RNS-ekkel. Így a sejtek „citoplazmáját” (az abban lévő rRNS-
eket) festhetjük fluoreszcensen (Daims és mtsai 2005, Wagner és Haider 2012). A gombák
18S és 28S rRNS szekvenciáit használva, az RNS-FISH taxonspecifikus módon teszi
lehetővé a célszervezetek vizsgálatát (Daims és mtsai 2005, Baschien és mtsai 2008). A
jelölés intenzitása a riboszómák mennyiségétől függ, így az információt nyújthat a sejtek
állapotáról és metabolikus aktivitásáról is (Daims és mtsai 2005, Baschien és mtsai 2008,
Wagner és Haider 2012). Az rRNS-FISH alkalmazásakor gombák esetén nehézséget
jelenthet a már említett gombasejtek vagy azok környezetének (pl. növényi ill. állati
szövetek) autofluoreszcenciája, a sejtfal aspecifikus festődése a próbákkal, illetve fonalas
gombák esetén az a jelenség, hogy a különböző korú hifaszakaszok eltérő mértékben
festődnek (Vierheilig és mtsai 2005). Egy RNS-FISH alapú módszer kidolgozásával
lehetővé válna a taxon specifikus jelölés, melynek köszönhetően megoldható lenne egy adott
DSE gomba specifikus jelölése akár terepi mintán, akár egy kísérletben egy másik gomba
mellett.
24
3. CÉLKITŰZÉSEK
Célunk volt a generalista domináns DSE csoportok azonosítása az őshonos és inváziós
növények gyökeréről gyűjtött izolátumok alapján, valamint alföldi félszáraz homokterületek
DSE közösségének kompozicionális diverzitás vizsgálata. Célunk volt a DSE gombák
szezonalitás és terület specificitás vizsgálata, in vitro inokulációs rendszerekben tesztelni,
hogy egy izolátum valóban DSE gomba.
Célunk volt még a kiválasztott, domináns DSE csoportokba tartozó izolátumok további
gyűjtését követően, azok genetikai variabilitásának tesztelése az általánosan használt ITS
(internal transcribed spacer) régió „felbontásán” túlmutató és a teljes genomról információt
nyújtó ISSR (inter sample sequence repeat) vizsgálatokkal. Kérdésünk volt, hogy
elkülöníthetővé válnak-e a konspecifikus DSE izolátumok ezzel a módszerrel.
Célunk volt egy domináns DSE gomba gyökéren belüli specifikus jelölésére alkalmas
fluoreszcens mikroszkópiai módszer adaptálása, beállítása és alkalmazása, mellyel terepi
mintákban és különböző gombákkal egyszerre kolonizált gyökerekben is detektálhatjuk a
DSE gombákat.
Célul tűztük ki egy domináns DSE gomba funkcionális anatómiájának jellemzését
ultrastruktara vizsgálatokkal (TEM), mely új ismereteket nyújtana nem csak a vizsgált
gomba, hanem a DSE-k kolonizációjáról és stratégiájáról.
Viszonylag kevés jól meghatározott DSE fajról vannak ismereteink, ezért célul tűztük
ki a munkánk során előkerülő azonosítatlan DSE gombák taxonómiai vizsgálatát és az
esetleges új DSE taxonok leírását.
25
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
4.1 A mintavételi területek
Mintavételi területeink a Kiskunságban elhelyezkedő bugaci, fülöpházi és
tatárszentgyörgyi félszáraz homokterületek voltak (4. ábra).
Ezek meleg-száraz területek, ahol az éves napsütéses órák száma 2000-2100 körüli, a
csapadékmennyiség 500 és 600 mm közötti és az évi középhőmérséklet 10-12oC. A területek
tengerszint feletti magassága 100-150 m között van, és a humusztartalom mindhárom
területen 1%-nál alacsonyabb (Várallyai 1993, Kovács-Láng és mtsai 2000).
A Bugac környéki terület szélhordta homokkúpság-síkság. Talaja túlnyomórészt
futóhomok, de löszös betelepülések is találhatóak. A talaj enyhén bázikus (pH=7,6-7,8), a
K2O-tartalom 45-70 mg/kg, a P2O5-tartalom 35-50 mg/kg, az NH4-N tartalom 2-2,5 mg/kg, a
NO3-N pedig 2-2,5 mg/kg és a CaCO3 3-6 m/m% körül mozog. A Fülöpháza melletti terület
(4. ábra) homokbuckáit dunai eredetű, szél által szállított bázikus homok alkotja, melynek
pH értéke 8-8,2. A talajban a K2O-tartalom 40-60 mg/kg, a P2O5-tartalom 20-35 mg/kg, az
NH4-N tartalom 3-3,5 mg/kg, a NO3-N pedig 0,8-1,3 mg/kg. A CaCO3 10-13 m/m% körül
mozog. A Tatárszentgyörgynél elterülő futóhomokos terület talajának pH értéke 7,5-7,7. A
K2O-tartalom 55-80 mg/kg, a P2O5-tartalom 35-50 mg/kg, az NH4-N tartalom 2-2,5 mg/kg, a
NO3-N pedig 3,5-4 mg/kg. A CaCO3 6-9 m/m% körül mérhető. A területekről gyűjtött
talajminták analízisét az MTA TAKI szolgáltató laborjában végezték.
A kompozicionális
diverzitás, terület
specificitás és szezonalitás
vizsgálatához a három
területről vettünk fel
gyökérmintákat. A
további vizsgálatokhoz
szükséges, célzottan
gyűjtött izolátumok
egyedül a fülöpházi
homokpusztagyepről
származnak.
4. ábra A fülöpházi homokpusztagyep
26
4.2 A mintázott növények
A félszáraz területek DSE közösségének vizsgálata során nyolc őshonos és három
tájidegen növényfajról gyűjtöttünk mintákat. A mintázott növényfajok gyakoriak a területen,
több életforma típust és rendszertani csoportot reprezentálnak. Őshonos növények a
közönséges boróka (Juniperus communis), ékes napvirág (Helianthemum ovatum), heverő
naprózsa (Fumana procumbens), fehér nyár (Populus alba), serevényfűz (Salix
rosmarinifolia), közönséges csikófark (Ephedra dystachia), magyar csenkesz (Festuca
vaginata) homoki árvalányhaj (Stipa borysthenica) és az apró lucerna (Medicago minima).
Inváziós növények pedig az ürömlevelű parlagfű (Ambrosia artemisiifolia), selyemkóró
(Asclepias syriaca), és a bálványfa (Ailanthus altissima). A gyökérmintákat 2005 és 2009
között gyűjtöttük véletlenszerűen kiválasztott, egészségesnek látszó növényekről.
A szezonalitás és terület specificitás vizsgálatokhoz mintáinkat mindhárom területen
10-10-10 megjelölt közönséges boróka egyedről gyűjtöttük két éven át (2008-2009) három
évszakban, tavasszal, nyáron és ősszel.
A genetikai variabilitás vizsgálatokhoz szükséges további mintákat közönséges boróka,
serevényfűz és a bálványfa gyökeréről gyűjtöttük 2012 tavaszán.
A taxonómiai munkákhoz szükséges további izolátumok három őshonos domináns
fűféle, a homoki árvalányhaj, magyar csenkesz és a fedélrozsnok (Bromus tectorum)
gyökeréről lettek gyűjtve 2012 nyarán.
A mintázott növények gyökereit kiástuk, vagy a kisebb növények esetében az egész
gyökérzetet távolítottuk el a talajból. A gyökereket nedves homokkal nylon zacskókban 8oC-
on tároltuk a feldolgozásukig, legfeljebb 3 napig.
A DSE közösség vizsgálatánál a mintavételek és az izolálálások egy részét már
korábban elvégezték (Pintye és Kovács 2006). Mivel ezen korábbi részeredmények az
általam kapottakkal együtt elemezhetők és értelmezhetők jól, továbbá számos új vizsgálatot
is végeztem ezekkel a törzsekkel, a dolgozatomban, jelölve, ezek az eredmények is
szerepelnek.
4.3 A gombák izolálása a gyökerekből
A gyökerek alapos tisztítását és mosását követően 1-1,5 cm hosszú, különböző
elhelyezkedésű és fejlettségű szakaszokat vágtunk le a gyökérről. Ezeket a gyökérdarabokat
felszín-sterilizáltuk (90 mp 2%-os nátrium-hipoklorit, 60 mp 70%-os etilalkohol és 3-4 p
27
steril desztillált víz), 4 részre vágtuk sterilizált szikével, majd a 3-4 mm-es gyökér
szegmenseket 9 cm-es Petri-csészében MMN táptalajra (Marx 1969; 250 mg/l (NH4)2HPO4;
500 mg/l KH2PO4; 150 mg/l MgSO4 x 7H2O; 50 mg/l CaCl2 x 2H2O; 25 mg/l NaCl; 20 mg/l
FeEDTA; 10 g/l glükóz; 3 g/l malátakivonat; 0,1 g/l Tiamin HCl; 15 g/l agar; pH=5,8; 10
μg/ml Streptomycin) helyeztük és 18°C-on sötétben tartottuk. A néhány nap után
gyökerekből kinövő gombákat növekedési jellemzőik alapján szétoltottuk, hogy tiszta
tenyészeteket kapjunk. Növényegyedenként a hasonló növekedésű és morfológiájú telepeket
azonosnak tekintettük, és csak egy törzsből vontunk ki DNS-t. Az izolátumokat fenntartásuk
során 18oC-on sötétben tároltuk és négy-hat havonta átoltottuk.
A taxonómiai és genetikai variabilitás vizsgálatokhoz kiválasztott DSE gombák
további törzseinek célzott izolálását a fent leírtakhoz hasonlóan végeztük. Ebben az esetben
a gyökérből kinövő telepekből egy kis micéliumdarabot 30 μl TE pufferben inkubáltunk
(96°C, 10 perc), majd ezt használtuk a diagnosztikai PCR során, ahol az adott csoportra
specifikus primer párokat használtuk. A pozitív reakciókat adó izolátumokat szétoltottuk és
MMN táptalajon tartottuk fent.
4.4 Molekuláris vizsgálatok
4.4.1 DNS kivonás
A DSE közösség molekuláris vizsgálatához DNS kivonást végeztünk a különböző
tenyészetekből kivágott néhány mm-es micéliumdaraból, egyszerűsített CTAB módszerrel.
A mintákat 400 l CTAB pufferben (2% CTAB; 20 mM pH=8 EDTA; 100 mM pH=9 Tris-
HCl; 1,4 mM NaCl) sterilizált kvarchomokkal és üvegtörővel tártuk fel, majd 50 percen
keresztül 60 oC-on szárazblokkban (M.R.C. LTD., Izrael) inkubáltuk. A mintákat 400 l
kloroform hozzáadásával tisztítottuk, 20 percig 13230 g-n centrifugáltuk (Hettich
Mikro200), majd a felülúszóhoz 1 térfogatnyi kloroformot mértünk és újabb 20 perc
centrifugálás után a felülúszóhoz 2 egység 96%-os etanolt és 0,1 egység nátriumacetátot (3M
pH=4,6, Sigma) adtunk majd 16-18 órán keresztül -20oC-on tartottuk. Ezután a mintákat 50
percig centrifugáltuk 13230 g-n, majd felülúszó eltávolítása és 600 l 70%-os etanol
hozzáadása után újabb 15 percig. A kiszárított pelleteket 30 l steril milli-Q vízben oldottuk.
A taxonómiai vizsgálatoknál a DNS kivonást több esetben UltraCleanTM Microbial
DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories, Inc., Solana Beach, CA, USA) segítségével
végeztük a gyártó használati utasítása szerint.
28
4.4.2 Csoportspecifikus PCR és primer fejlesztés
A terület domináns DSE csoportjainak azonosítását követően a DSE-1 és DSE-7
csoportokra specifikus diagnosztikai PCR-eket terveztünk, melyek lehetővé teszik az
izolátumok gyors azonosítását, és igazolhatják azok illeszkedését a keresett csoportokba.
Csoportokra specifikus primereket terveztünk a Primer3 (http://primer3.ut.ee/cgi-
bin/primer3) online program segítségével a már meghatározott ITS szekvenciák alapján. A
csoportokba tartozó összes eddigi általunk izolált törzs ITS szekvenciáinak és GenBankból
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) származó szekvenciák illesztése alapján választottuk ki és a
primereket az ITS1 és ITS2 régiók csoportra specifikus szakaszaira terveztük.
A csoportspecifikus detektáláshoz használt PCR profilok és reakcióelegyek leírása a
F1. d. táblázatban található.
4.4.3 Inter Sample Sequence Repeat (ISSR) vizsgálatok
Munkánk során az ISSR PCR-hez a már azonosított DSE-1, DSE-3 és DSE-7
csoportokba tartozó törzsek DNS kivonatait használtuk. A kivonatok DNS koncentrációit
NanoDrop 1000 spektrofotométerrel (Thermo Fisher Scientific, USA) mértük, majd
egységesített töménységű (30-40 ng/l DNS) oldatokkal dolgoztunk tovább. Tizenegy
különböző ISSR primert választottunk ki tesztelésre ((AAC)6, (AAG)6, (AGG)6, (AGC)6,
(CCG)6, (ATC)6, (ACG)6, (AC)8, (AG)9, (AAT)6, (AT)8) Lim és mtsai (2004) tanulmánya
alapján, melyben 14 gomba genomban vizsgálták mikroszatellit régiók szekvenciáit és ezek
gyakoriságát. A néhány törzs DNS kivonatával végzett gyors tesztelést követően az (AAC)6,
(AAG)6, (AGG)6, (ATC)6, (CCG)6, (AC)8, (AG)9 primereket használtuk az ISSR
vizsgálatokhoz. Ez utóbbi primerek használatával a vizsgált DSE csoport törzsei esetén
értékelhető, több sávot tartalmazó ISSR profilt kaptunk. Az ISSR PCR profiljai és a
reakcióelegyek az F1. c. táblázatban szerepelnek. A sávok által adott mintázat vizsgálatához
10 µl amplifikált terméket futtattunk etídium-bromidot tartalmazó 2%-os agaróz gélben (100
V, 180 percig). Az ISSR PCR termékeket UV fény átvilágítással detektáltuk.
4.4.4 DNS régiók amplifikálása és szekvenálása
A DSE közösség vizsgálatánál a törzsek azonosításához a nrDNS ITS régióját
határoztuk meg az ITS1F (Gardes és Bruns 1993) és ITS4 (White és mtsai 1990) primer
párral, valamint az LSU egy részét az LR0R (Rehner és Samuels 1994) és LR5 (Vilgalys és
Hester 1990) primerekkel. A polimeráz lánc-reakcióhoz Biometra T-Gradient 96 típusú
29
készüléket használtunk. Az amplikonok tisztítását és szekvenálását az amplifikációhoz
használt primerekkel az LGC GmbH (Berlin, Németország) cég végezte. A PCR
reakcióelegyek és profilok részletei a F1. a. táblázatában szerepelnek.
A taxonómiai munkánál vizsgált izolátumokat és a meghatározott DNS régiókat a F2.
táblázat tartalmazza. Munkánk során az izolátumok nrDNS-ének egy nagyobb szakaszát
amplifikáltuk V9G (de Hoog és Gerrits van den Ende 1998) és LR5 primerekkel, majd az
ITS5 (White és mtsai 1990) és ITS4 illetve az LR0R és LR5 primerekkel végeztük az ITS és
LSU régió szekvenálását. A nrDNS kis alegységét (SSU) az NS1 és NS4 (White és mtsai
1990) primer párral, az aktin gént (ACT) Act-512F (Carbone és Kohn 1999) és ACT-2Rd
(Quaedvlieg és mtsai 2011) primerekkel, az elongációs faktor 1-α gént (EF) pedig aEF1-
728F (Carbone és Kohn 1999) és EF-2Rd (Groenewald és mtsai 2013) primer párral
amplifikáltuk és szekvenáltuk. CAL-228F (Carbone és Kohn 1999) és CAL-2Rd
(Groenewald és mtsai 2013) primerekkel amplifikáltuk és szekvenáltuk a kalmodulin gént
(CAL), és a Cyltub1F (Groenewald és mtsai 2013), Bt-2b (Glass és Donaldson 1995) primer
párral pedig a β-tubulin gént (TUB). A hiszton-H3 gén amplifikálása és szekvenálása
sikertelennek bizonyult a CylH3F és CylH3R (Crous és mtsai 2004) valamint a H3-1a és
H3-1b (Glass és Donaldson 1995) primer párokkal különböző kombinációkat, PCR profilt és
reakcióelegyeket használva, így erről nem teszünk több említést. A PCR termékeket BigDye
Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit használatával (Applied Biosystems, Foster City,
CA, USA) szekvenáltuk a használati utasítás szerint, majd a mintákat Sephadex (Sigma-
Aldrich Co. LLC, USA) segítségével tisztítottuk. A szekvenálási reakció termékének
elektroforézisét ABI Prism 3730XL Sequencer (Applied Biosystems) készülékkel végezték.
A munkánk során használt polimeráz láncreakciók profiljai az F1. b. táblázatban
vannak összefoglalva. A reakciók sikerességét agaróz gélelektroforézis segítségével
ellenőriztük, mely során 4 µl amplifikált terméket futtattuk etídium-bromid vagy Sybr Safe
(Invitrogen) fluoreszcens DNS festéket tartalmazó 1,5%-os agaróz gélen. A PCR termékeket
UV fény átvilágítással detektáltuk a BIO-RAD Geldoc készülékkel.
A kapott elektroforegramokat a Pregap4 és Gap4 programokkal (Staden 2000)
ellenőriztük és javítottuk. A szekvenciákat a GenBank (National Center for Biotechnology
Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) adatbázisban deponáltuk. Szekvenciáinkat a
GenBank BLASTn keresőjével (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) (Altschul és mtsai 1990)
vetettük össze a nyilvános adatbázisban szereplő szekvenciákkal.
30
4.4.5 Filogenetikai analízis
A DSE közösség összetételének azonosításához az ITS szekvenciák illesztését a
MAFFT 6 online programmal (Katoh és Toh 2008) végeztük, majd az alignment
ellenőrzéséhez a ProSeq2.9 (Filatov 2002) programot használtuk. Az előzetes Minimum
Evolúciós fát MEGA4 software-rel (Tamura és mtsai 2007) készítettünk a Maximum
Composite Likelihood modellt és gap-ek páronkénti ignorálását beállítva. Bootstrap
módszert (Felsenstein 1985) alkalmaztunk az elágazások megbízhatóságának
meghatározására, melyek értékeit 1000 ismétlésből számítottuk.
Az ISSR vizsgálatokhoz az egyes minták ISSR profiljai alapján a látható 200bp és
2000bp hosszúság közötti sávokat prezencia/abszencia alapján GelAnalyser
(http://www.gelanalyzer.com) program segítségével bináris adat formájában rögzítettük. Az
adathalmazból a TREECON programmal (Van de Peer és De Wachter 1994) a Nei és Li
(1979) koefficiens alapján UPGMA módszert alkalmazva állítottuk elő a dendrogrammot.
A molekuláris taxonómiai munkák során a molekuláris filogenetikai vizsgálatokhoz
három adatsor elemzését végeztük. A kiválasztott DSE csoportok „rend szintű” elemzéséhez
számos taxont tartalmazó adatsort használtunk, hogy információt kapjunk
elhelyezkedésükről a Pleosporales rendben. A DSE-7 csoport reprezentatív izolátumainak
„család szintű” elemzéséhez a Lentitheciaceae család összes ismert fajának szekvenciáit
használtuk, hogy ez esetben a családon belüli elhelyezkedésükről kapjunk képet. Egy
további adatsor a DSE-7 csoport estében a csoporton belüli viszonyok alaposabb
vizsgálatához volt szükséges. A szekvenciák illesztését a MAFFT 6 online programmal
(Katoh és Toh 2008) végeztük. A megfelelő nukleotid szubsztitúciós modellt a jModelTest
0.1.1 (Posada 2008) program AIC (Akaike information criterion) tesztet alkalmazva
választottuk ki. Az alignmenteket MEGA5 (Tamura és mtsai 2011) programmal ellenőriztük.
A filogenetikai elemzést a MrBayes 3.1.2 (Huelsenbeck és Ronquist 2001, Ronquist és
Huelsenbeck 2003) programmal végeztük, majd a topológiai konvergenciákat az AWTY
online software-rel (Nylander és mtsai 2008) ellenőriztük.
A „rend-szintű” és a „család szintű” több lókuszos filogenetikai elemzést az LSU, SSU
és TEF szekvenciák alignmentje alapján a következő paraméterek beállításával végeztük:
GTR+I+G szubsztitúciós modellt alkalmaztunk a SSU és TEF, illetve SYM+I+G modellt az
LSU-hoz. A „rend-szintű” elemzés esetében a négy Markov-lánc 10.000.000 generáción
keresztül futott, minden ötszázadik esetben vettünk mintát és az elemzés során az első 7500
31
fát nem vettük figyelembe (burn-in), a „család-szintű” elemzésnél négy Markov-lánc
10.000.000 generáción keresztül futott, minden ezredik esetben vettünk mintát és az elemzés
során az első 3000 fát nem vettük figyelembe (burn-in).
A DSE-7 törzsek csoporton belüli elhelyezkedésének vizsgálatához szükséges több
lókuszos filogenetikai elemzést a variábilisabb CAL és TEF szekvenciák illesztése
(alignmentje) alapján a következő paraméterek beállításával végeztük: GTR+I+G
szubsztitúciós modellt alkalmaztunk az ITS, ACT, TUB és TEF, illetve K2P modellt a CAL
esetén. Ahhoz, hogy információt kapjunk az ITS alignment indel régióiból (Nagy és mtsai
2012), a GapCoder program (Young and Healy 2003) használatával kódoltuk a gap-eket és
bináris adatsort hoztunk létre. Ennek elemzéséhez Mk2 Lewis modellt alkalmaztunk. A négy
Markov-lánc 10.000.000 generáción keresztül futott, minden ezredik lépésnél vettünk mintát
és az elemzés során az első 3000 fát nem vettük figyelembe (burn-in). A RAxML analízist a
raxmlGUI 1.3 (Silvestro és Michalak 2012) segítségével végeztük a GTR+G szubsztitúciós
modellt és az ágak támogatásának teszteléséhez 1000 ismétléses ML bootstrap vizsgálatot
alkalmazva. A törzsfákat a FigTree 1.4.0 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree) és a
MEGA5 (Tamura és mtsai 2011) programcsomagokkal szerkesztettük.
32
4.5 Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH)
Az alábbi fejezetben ismertetett in planta FISH protokollt előkísérlet sorozatok előzték
meg, melyek során megoldást találtunk az autofluoreszcencia és a jelölések specificitási
problémáira és beállítottuk az oldatok szükséges koncentrációit és az optimális
hőmérsékleteket. A dolgozatban csak a végleges munkákhoz használt protokoll szerepel.
4.5.1 A FISH próbák
A DSE-1 (Cadophora sp.) csoportra specifikus RNS-FISH próbát a már meglévő LSU
szekvenciák alapján terveztük az LSU gén D1-D2 régiójára. Ahhoz, hogy kikerüljük a
problémát, melyet a növényi szövetek erős autofluoreszcenciája okoz, számos, különböző
életfoma-típust és rendszertani kategoriát reprezentáló növény gyökerének
gerjesztési/emissziós spektrumát vizsgáltuk, és a spektroszkópiai eredmények alapján olyan
hullámhossz tartományban fluoreszkáló fluorofórokat használtunk az oligonukleoditok
jelölésére, melyben az autofluoreszcencia elég gyenge a próbák detektálásához. A
Cadophora specifikus oligonikleotid 5’ vége 546 nm hullámhosszon fluoreszkáló Alexa
Fluor 546 (Sigma) fluorofórral lett jelölve (CadoLSU01_af546: 5’-[A546] GAG AGG AGC
CAC ATT CCC AA 3’). A tervezett DSE-1 csoport specifikus FISH próba mellett AMF
specifikus próbát is terveztünk a Rhizophagus intraradices (Glomus intraradices) LSU
régiója alapján (GintrLSU01_af488: 5’-[A488] CAT ACG GGC AAG TAC ACC CAA 3’),
így lehetővé téve két különböző gyökérkolonizáló gomba együttes, specifikus jelölését.
4.5.2 A minták előkészítése
Az inokulációs rendszerekben nevelt növény gyökereinek alapos mosása és a
talajszemcsék eltávolítása után 6-8 mm hosszú gyökérszakaszokat vágtunk le. A gyökér
szegmenseket (a lipidek eltávolításához és membránok permeabilizálásához) CSK pufferbe
helyeztük (100 mM NaCl, 300 mM szaharóz, 3 mM MgCl2, 10 mM PIPES, 1% Triton
X100, 1 mM EGTA vízben oldva, pH=6.8) és 30 percig szobahőmérsékleten vákuumban
tartottuk. Ezután a gyökereket 4%-os paraformaldehides foszfátpufferbe (PBS, 0.07 M,
pH=7.2) helyeztük és 60 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten, közben kétszer oldatot
cserélve. A gyökérmintákat 70%-os etanolban posztfixáltuk és a felhasználásig -20°C-on
tároltuk.
A gyökerekből 90–120 μm vastagságú metszeteket készítettünk Reichert fagyasztó
mikrotommal (Reichert, Austria), majd ezeket hibridizációs pufferben (20 ml pufferhez: 2
33
ml 20× SSC (NaCl - nátrium-citrát; 3 M NaCl, 0.3 M nátrium-citrát, pH=7.0), 2 g dextrán
szulfát (Sigma), 2 mg BSA (Sigma), 8 ml desztillált víz és 50% dimetilformamid (Sigma))
inkubáltuk szobahőmérsékleten 1 órán át.
4.5.3 Hibridizációs lépés
A hibridizációs folyamat első lépéseként a metszeteket foszfát pufferben inkubáltuk az
etanol kimosódásához, majd 400 μl hibridizációs pufferbe helyeztük mely 1 μl RNáz
inhibítort (RiboLock RNase Inhibitor 40 U/μl, Fermentas), 60 μl lazac DNS-t (10 mg/ml
vízben feloldva, Sigma) és 5 μl FISH próba oldatot is tartalmazott. A FISH próba oldat 20 μg
fluorofórral jelölt nukleotidot tartalmazott 5 μl TE pufferben (10 mM Tris–HCl, 1 mM
EDTA, pH=7.5) oldva. A hibridizációs lépés során a formamid koncentráció és a
hőmérséklet változtatásával tudjuk beállítani jelölés specificitását. Ahhoz, hogy a
hibridizációs beállítások optimalizálásával növeljük specifikus jelölés hatékonyságát két
próba keverékét tettük a pufferbe és a próbákat (CadoLSU01 és GintrLSU01) a Cadophora
izolátum tiszta tenyészetén teszteltük. A formamid koncentráció állandó értéken tartása
mellett a mosási hőmérséklet mértékét és hosszát változtattuk.
Az előzetes eredmények alapján mintáinkat 50%-os formamid koncentrációt
alkalmazva 46°C-on inkubáltuk egy éjszakán keresztül 0.2 ml csövekben PCR készülékben
(Hybaid PCR Sprint).
4.5.4 Poszthibridizációs lépés
A próbák hibridizációja során a felesleges próbák kimosását 1.5 ml csövekben
végeztük 48°C-on MRC szárazblokkon (M.R.C. Ltd). A gyökér mintákat háromszor mostuk
20 percig az előmelegített hibridizációs oldattal (mely nem tartalmazott dextrán szulfátot,
RNáz inhibítort, lazac sperma DNS-t és próbát), ezt követően ismét háromszor 30 percig
mostuk 2xSSC pufferben, majd 4x SSC-ben tároltuk és Fluoroshield (Sigma) lefedőszerrel
fedtük le.
34
4.6 Inokulációs rendszerek
4.6.1 In vitro kísérletek a DSE sajátságok teszteléséhez
Az in vitro kísérletek során a különböző izolátumokkal póréhagymákat (Allium
porrum) inokuláltunk, melyek könnyen csíráztathatók, kisméretűek, gyorsan nőnek és alig
pigmentált, jól vizsgálható gyökereik vannak. A póréhagyma magjait három percig 30%-os
H2O2-ban, 10 percig majd 15 percig steril csapvízben felszínsterilizáltuk. Ezután steril
csapvízzel benedvesített szűrőpapíron Petri-csészékben csíráztattuk őket. A
gyökérendofitonok ITS szekvenciái alapján kapott törzsfa csoportjaiból 1-1 reprezentáns
izolátumot (5. ábra) vizsgáltunk az inokulációs teszttel, hogy el tudjuk dönteni, az adott
csoport DSE gombának tekinthető-e. A növényre látható negatív hatással nem lévő, annak
gyökereit kolonizáló és mikroszkleróciumot képző, és ezekkel egy csoportban lévő
izolátumokat tekintettük DSE gombáknak.
A tenyészetekből pár mm-es, micéliumot tartalmazó agarkockákat vágtunk ki,
melyeket 9 cm-es Petri csészében cukormentes MS táptalajra (Murashige és Skoog 1962,
Sigma Basal Salt Mixture M5524, 15 mg/l agar, pH=5,8, 10 μg/ml Streptomycin) helyezett
14-15 napos hagymanövények mellé tettünk. Egy csíranövény gyökere mellé két telepdarab
került és izolátumonként öt növényt inokuláltunk. Minden vizsgálatsorozatban kontrollként
öt nem inokulált növényt is beállítottunk. A vizsgált növényeket SANYO MRL-350
fényszekrényben neveltük (megvilágítás: 24 oC, 14 óra, kevert fény; sötét: 22
oC, 10 óra) 8-9
héten keresztül. Az inokulálás időtartama alatt a növényeket rendszeresen ellenőriztük és
elrendezésüket változtattuk.
4.6.2 A FISH vizsgálatok inokulációs rendszere
A FISH vizsgálatokhoz DSE gomba partnernek egy DSE-1 kládhoz (Cadophora sp.,
Helotiales, Ascomycota) tartozó, Salix rosmarinifolia gyökeréről származó DSE1049 törzset
használtuk, és ezzel végeztük az inokulációt. A másik gyökérkolonizáló gomba a
Rhizophagus intraradices (Glomus intraradices, Glomeromycota) volt. A G. intraradices
oltóanyagot Yoram Kapulnik (ARO Volcani Center, Israel) bocsátotta rendelkezésünkre. A
növénypartner kukorica (Zea mays) volt, melynek a póréhagymáéhoz hasonlóan kevéssé
pigmentált gyökerei vannak, azonban jóval rövidebb idő alatt nagyobb gyökérzetet fejleszt.
35
A kukorica szemterméseit 50 ml-es Falcon csövekben, csapvízben és 70%-os
etanolban felváltva kétszer-kétszer 1 percig ráztuk, majd a terméseket steril körülmények
között 3 percig 30%-os H2O2-ban, 10 percig majd még 15 percig steril csapvízben tartva
felszínsterilizáltuk. A csíráztatás a fentebb írtakkal megegyező módon történt. A körülbelül
egy hetes csíranövényeket, a gomba inokulumokat és a kétszer sterilizált (2x 30 perc 121°C-
on, és 24 óra szobahőmérsékleten való inkubáció a két autoklávozás között) ültető közeget
(fülöpházi területről származó homoktalaj és zeolit 2:1 arányú keveréke) tartamazó
műanyagcserepekbe helyeztük. A két gombapartnerrel való inokuláláskor a talajba ~40 ml
G. intraradices inokulumot, valamint 10-12 db 5 mm átmérőjű telepdarabot helyeztünk,
melyek MMN táptalajra oltott telepek aktívan növekvő részeiből lettek kivágva. A csak DSE
gombával inokulált rendszerek esetén a cserepek nem tartalmaztak AMF inokulumot.
A vizsgált növényeket SANYO MRL-350 fényszekrényben neveltük (megvilágítás:
24oC, 14 óra, kevert fény; sötét: 22
oC, 10 óra) 6 héten keresztül. Az inokulálás időtartama
alatt a növényeket rendszeresen ellenőriztük és a cserepeket elrendezését változtattuk.
4.6.3 A TEM vizsgálatokhoz összeállított inokulációs rendszer
Az ultrastruktura vizsgálatokhoz az in vitro kísérletek során póréhagymát (Allium
porrum) inokuláltunk a DSE-1 kládhoz (Cadophora sp.) tartozó fentebb már bemutatott
DSE1049 izolátummal.
A póréhagyma magjainak felszín-sterilizálását és nevelését 4.6.1 fejezetben leírtak
szerint végeztük. Ebben a vizsgálatban azonban úgy nevezetett „kivezetett” inokulációs
rendszereket alkalmaztunk. Enyhén megdöntött 9 cm-es műanyag Petri-csészékbe MS
táptalajt öntöttünk, majd a táptalaj megszilárdulását követően izzított csipesszel kb 2-3 mm
széles és mély vájatot égettünk a Petri-csésze alsó részének peremébe (azon a részen ahol a
ferdén öntött MS a legnagyobb teret engedte) és 2-3 mm széles és teljes mélységű rést a
Petri-csésze felső részének peremébe is. Így a Petri-csésze két részét megfelelően
összeillesztve kapott 2-3 mm átmérőjű lyuk lehetővé teszi a növény kivezetését a csésze
oldalán. A körülbelül két hetes hagymákat úgy helyeztük a táptalajt tartalmazó Petri-
csészébe, hogy a gyökérnyak lehetőleg pontosan a résnél legyen és a gyökér bent legyen a
csészében. A Cadophora telepekből pár mm-es micéliumdarabokat vágtunk ki és a gyökerek
mellé helyeztük. A Petri-csészét parafilmmel lezártuk, ügyelve arra, hogy ne legyen rés a
növény mellett. A Petri-csészéket alufóliával borítottuk be, hogy a gyökereket és a gombákat
minél kevesebb fény érje.
36
A rendszereket folyamatosan ellenőriztük (sztereo- és fénymikroszkóppal), és
alkoholos filc-tollal a Petri-csésze alján jelöltük, hogy a gyökerek mely részeit mikor érik el
a hifák. Ezt az időpontot tekintettük a kolonizációs folyamatok kezdetének az adott
gyökérszakaszon. Innentől kezdve 6 héten keresztül kísértük figyelemmel az eseményeket,
és olyan gyökérszakaszokat gyűjtöttünk le, melyek 1, 2, 3, 4, 5 vagy 6 hete lehettek
kolonizálva. Időpontonként összesen 15-20 gyökeret gyűjtöttünk.
4.7 Mikroszkópos vizsgálatok
4.7.1 Fluoreszcens mikroszkópia
A FISH-próbával való jelölés és a gyökérminták előkészítési lépései a 4.5 fejezetben
szerepelnek. A lefedett gyökérminták vizsgálatára epifluoreszcens és konfokális
mikroszkópot alkalmaztunk. Az fluoreszcens vizsgálatokat Nikon Eclipse 80i
epifluoreszcens mikroszkóppal végeztük, a fényképeket pedig Spot 7.4 Slider (Diagnostic
Instruments Inc.) típusú digitális kamerával készítettük.
A konfokális vizsgálatok során a 3D rekonstrukcióhoz Zeiss 410 konfokális lézer
scanning mikroszkóppal (CLSM) 1024 x 1024 pixeles 8 bites szürkeárnyalatos képeket
készítettünk. Az Alexa488-al jelölt DSE próbák esetén argon lézert (488 nm) és 465–495
nm-es gerjesztőszűrőt, 510 nm-es dikroikus tükröt és 525–550 nm-es zárószűrőt
használtunk. Az Alexa546 fluorofórral ellátott AMF próbák esetén hélium-neon lézerrel
(543 nm), 527–556 nm gerjesztési tartományban használható szűrőkockával, 565 nm felett
átengedő dikroikus tükörrel és 575–630 nm-es fénytartományt átengedő zárószűrővel
dolgoztunk.
Az optikai szeletek vastagságát a mikroszkóp szoftvere által javasoltak alapján
állítottuk be. A projekciókat a próbák emissziós hullámhosszának megfelelően színeztük
Adobe Photoshop 5.1 használatával. A két próba együttes alkalmazásánál a képeket
összeolvasztottuk, hogy a különböző struktúrák különböző színben látszódjanak.
4.7.2 Festés és fénymikroszkópos vizsgálatok
A mintavételi területeken mintázott növények gyökeréből és a gombákkal inokulált
póréhagymák gyökereiből fénymikroszkópos vizsgálatokhoz preparátumokat készítettünk. A
gyökereket alapos tisztítás után néhány cm-es részekre vágtuk, majd 10 percig 65 oC-on
10%-os KOH oldatban színtelenítettük, háromszor 15 percig mostuk desztillált vízben,
37
ezután további 10 percen keresztül tejsavas vízben savanyítottuk. A mintákat Anilin-kékkel
festettük meg, majd tejsavas desztillált vízben mostuk ki a felesleges festéket. A festett
gyökereket PVLG-ben (poli vinil alkohol-tejsav-glicerol) fedtük le. A preparátumokat Nikon
Eclipse 80i fénymikroszkóppal vizsgáltuk hagyományos és Nomarski-féle optikát (DIC)
használva.
4.7.3 A minták előkészítése és ultrastruktura vizsgálata, TEM
A póréhagymák különbőző ideje kolonizált, a táptalajban, vagy annak felszínén futó
gyökérszakaszait szikével óvatosan körbevágtuk, és vékony (1-2 mm) agar réteget hagytunk
a gyökér körül, hogy az annak felszínén levő hifák hozzávetőleges elhelyezkedéséről is
információt kapjunk. A gyökérszakaszokat tartalmazó táptalajhasábokat 2,5%-os
glutáraldehidben fixáltuk, 30 percre szobahőmérsékleten vákuumba helyeztük, majd
felhasználásukig 4 o
C-on tároltuk. A mintákat foszfát pufferben (0,07 M, pH=7,2) mostuk 2
órán át 4x puffert cserélve. A mintákat OsO4 1%-os foszfát pufferes oldatában 2 óráig
utófixáltuk / kontrasztosítottuk, majd a mintákat ismét foszfát pufferben mostuk 3x 20 percig
a puffert cserélve. Ezt követően mintáinkat sztereomikroszkóp alatt még kisebb (3x1x1 mm)
darabokra vágtuk és a felszálló alkoholsoros víztelenítést követően Durcupan ACM (Fluka
Chemie AG) műgyantába ágyaztuk. A félvékony hosszmetszeteket neofuxin-
kristályibolyával festettük, majd fénymikroszkóppal vizsgáltuk. Az ultravékony metszeteket
Reichert Jung ULTRACUT mikrotommal (Ausztria) készítettük, majd uranil-acetáttal és
ólom-citráttal festettük (Reynolds 1963) és Hitachi 7100 (Japán) transzmissziós
elektronmikroszkóppal, 75 kV gyorsítófeszültséggel vizsgáltuk.
4.7.4 Spóraképzés indukálása
A taxonómiai vizsgálatok során az izolátumok esetleges spóra képzését a
szakirodalomban ismert módszerekkel próbáltuk indukálni. A telepeket 9 cm-es Petri-
csészékben különböző táptalajokra helyeztük és szobahőmérsékleten inkubáltuk. A
táptalajok PDA (potato-dextrose agar), SNA (synthetic nutrient-poor agar) MEA (malt
extract agar), OA (oatmeal agar) (lásd Crous és mtsai 2009), valamint MMN és MS voltak.
Az utóbbi két táptalajra újra törzseket oltottunk és ezeket 10°C-on inkubáltuk.
Továbbá az izolátumokat szobahőmérsékleten és 10°C-on is SNA táptalajra helyezett
sterlizált növényi szervekre, illetve szövetek mellé oltottuk, melyek segíthetik a
spóraképzést. Ezek a növényi részek árpa levelek, fekete fenyő tűlevelek, csalán szár
38
darabok és rozsnok gyökerek, valamint MS táptalajra helyezett vénic-szil ág darabok voltak.
A növényi részekre oltott törzseket 2 ismétlésben szobahőmérsékleten valamint 10°C-on
inkubáltuk. További három egyidejű kezeléshez MMN-re és MEA-ra oltott törzseket
használtunk, melyeket (i) izzított lándzsatűvel égettünk meg néhány helyen majd, 4 hétig
szobahőmérsékleten tároltuk, (ii) 3 napon keresztül UV fénynek tettük ki őket napi 3x 10
percig, ezután 4 hétig szobahőmérsékleten, majd 4°C-on sötétben, valamint (iii) lezárás
nélkül tároltuk a törzseket, ezt követően 3 hónapon keresztül hagytuk őket kiszáradni.
39
5. EREDMÉNYEK
5.1 A félszáraz alföldi területek endofiton gombái
5.1.1 Terepi minták mikroszkópos vizsgálata
A terepen gyűjtött különböző inváziós és őshonos növények festett gyökér-
preparátumainak mikroszkópos vizsgálata során minden esetben találtunk DSE gombákra
jellemző mikroszkleróciumokat, sötéten pigmentált és kéken festődő szeptált hifákat,
továbbá legtöbbször AM gombák általi kolonizációt is megfigyeltünk a gyökerekben.
5.1.2 Az izoláltumok
Az alföldi félszáraz homokterületek DSE közösségének megismeréséhez közel 200
gyökérmintát vettünk fel a három félszáraz homokterület őshonos és inváziós növényeiről. A
felszín-sterilizált gyökerekből 296 törzset izoláltunk, melyek közül 241 ITS régióját
határoztuk meg (ezek közül korábban 43 izolátum gyűjtése és azonosítása történt meg
(Pintye és Kovács 2006)).
A 241 izolátum az ITS szekvenciáik alapján 7 nagyobb (tíznél több izolátum) és 34
kisebb csoportba rendeződtek (5. ábra, F3. táblázat). A csak néhány (<8) izolátum által
reprezentált kisebb csoportok kizárólag őshonos, vagy inváziós növényekről kerültek elő,
míg a nagyobb törzsszámú csoportok őshonos és inváziós növények gyökerét is
kolonizálták. Egy kivételével minden izolátum az aszkuszos gombákhoz tartozott. Ennek
ITS szekvenciája az Auricularia nemzetségbe (Basidiomycota, Auriculariales) tartozó
gombákéval mutatott hasonlóságot, azonban a törzs egy idő után nem volt fenntartható
táptalajon és elvesztettük.
5.2 Az inokulációs tesztek eredményei
Számos tanulmány használja azt az egyszerű meghatározást, hogy endofitonnak
nevezzük azokat a gombákat, melyeket felszínsterilizált egészséges gyökérből izolálhatunk
(Porras-Alfaro és Bayman 2011). Munkánk során azonban csak egésszéges növények
felszínsterilizált gyökeréből izolált, majd in vitro inokulácios kísérletekben a gyökereket
kolonizáló és mikroszkleróciumot képző, a növényben látható károsodást nem okozó
izolátumokat valamint ezekkel egy csoportba tartozó izolátumokat tekintettük DSE-nek.
Az in vitro inokulációs tesztekhez 59 izolátumot választottunk ki, melyek 41 csoportot
reprezentáltak. Ezek közül 16 izolátummal korábban végezték el az in vitro kísérleteket
(Pintye és Kovács 2006). A nagyobb csoportok esetén több izolátummal végeztük a
40
kísérleteket. Az egészségesnek látszó póréhagymák 8-9 hét után fejlett gyökérzettel és 3–4
levéllel rendelkeztek. Kilenc izolátumnak volt egyértelmű negatív hatása a növényekre, ezek
4–5 héten belül elpusztultak. Huszonegy izolátum esetében az inokulált növények nem
különböztek a kontroll növényektől, azonban gyökereiket nem kolonizálták. 29 izolátum
esetében figyeltünk meg az egészségesnek látszó póréhagymák gyökerében gombák általi
kolonizációt. A 14 csoportot reprezentáló 29 izolátum mindegyike intracelluláris hifákkal
kolonizálta a gyökereket és mikroszkleróciumokat képzett. A póréhagymák gyökereit
kolonizáló hifák a legtöbb esetben nem voltak pigmentáltak és anilin kékkel jól festődtek,
valamint kéken festődő és erősen pigmentált mikroszkleróciumokat is megfigyeltünk. Az
egy csoportba tartozó, inokulumként használt izolátumok minden esetben hasonló
kolonizációt mutattak. Az in vitro kísérletek eredményeként tehát 14 csoportot tekintettünk
DSE-nek.
A két leggyakoribb, általunk nem DSE gombának tekintett csoportot ismert és szélesen
elterjedt patogének, az Ilyonectria macrodidyma (25. csoport) és Fusarium oxysporum (27.
csoport) alkották (5. ábra). A többi nem DSE csoportba is sok esetben patogén gombák
tartoztak. Fontos hangsúlyoznunk, hogy az in vitro kísérleti rendszereinkben használt, de az
általunk felállított DSE kritériumoknak nem megfelelő izolátumok lehetséges, hogy DSE
gombák, csak a kísérleti körülményeink között nem bizonyultak annak.
5.3 Az azonosított DSE gombák
Az összes izolátum által alkotott 41 csoportból 14, a 241 izolátumból pedig 142
bizonyult DSE gombának. Így a DSE csoportok az összes csoport ~35%-át, a DSE
izolátumok pedig az összes izolátum közel 60%-át reprezentálták. A 14 DSE csoportot a
dolgozatban ezen túl DSE-1–DSE-14 csoportoknak nevezzük (5. ábra, F3. táblázat).
A filogenetikai elemzések alapján összes DSE gomba az aszkuszos gombák különböző
rendjeibe tartozott. A Pleosporales (7 csoport), Helotiales (2 csoport), Hypocreales (2
csoport), Eurotiales (1 csoport), Xylariales (1 csoport) és a Glomerellales rendbe (1 csoport).
Néhány DSE csoportot faj és nemzetség szinten, másokat csak magasabb taxonómiai szinten
lehetett meghatározni (F4. táblázat). Több DSE csoport (DSE-2, -4, -5, -12) esetében sem az
ITS, sem az LSU szekvenciák nem mutattak hasonlóságot a GenBank-ban lévő
szekvenciákkal (F4. táblázat). A DSE gombák ITS szekvenciáinak BLAST elemzésénél a
hasonló szekvenciák eltérő éghajlati övek és területek növényeinek gyökeréből vagy a
talajból származtak.
41
REF001 (DSE-1)
REF002 (DSE-1 , X)
REF003 (DSE-1)
REF004 (DSE-1)
REF005 (DSE-1)
REF006 (DSE-1)
REF007 (DSE-1)
REF008 (DSE-1)
REF009 (DSE-1)
REF010 (DSE-1)
REF011 (DSE-1)
REF012 (DSE-1)
REF013 (DSE-1)
REF014 (DSE-1)
REF015 (DSE-1)
REF016 (DSE-1)
REF017 (DSE-1)
REF018 (DSE-1)
REF019 (DSE-1)
REF020 (DSE-1)
REF021 (DSE-1)
REF022 (DSE-1)
REF023 (DSE-1)
REF024 (DSE-1)
REF025 (DSE-1 , X)
REF026 (DSE-1)
REF027 (DSE-1)
REF028 (DSE-1)
REF029 (DSE-1)
REF030 (DSE-1)
REF031 (DSE-1)
REF032 (DSE-1)
REF033 (DSE-1)
REF034 (DSE-1)
REF035 (DSE-1)
REF036 (DSE-1)
REF037 (DSE-1 , X)
REF038 (DSE-1)
REF039 (DSE-1 , X)
REF040 (DSE-1)
REF041 (DSE-1)
REF042 (DSE-1)
REF043 (DSE-1)
REF044 (DSE-1)
REF045 (1, X)
REF046 (2, X)
REF047 (3, X)
REF048 (4)
REF049 (4, X)
REF050 (5, X)
REF051 (DSE-2)
REF052 (DSE-2)
REF053 (DSE-2)
REF054 (DSE-2)
REF055 (DSE-2 , X)
REF056 (DSE-2)
REF057 (DSE-2)
REF058 (DSE-2 , X)
REF059 (DSE-2)
REF060 (DSE-2)
REF061 (DSE-2)
REF062 (DSE-3)
REF063 (DSE-3)
REF064 (DSE-3)
REF065 (DSE-3)
REF066 (DSE-3)
REF067 (DSE-3)
REF068 (DSE-3)
REF069 (DSE-3)
REF070 (DSE-3)
REF071 (DSE-3)
REF072 (DSE-3)
REF073 (DSE-3)
REF074 (DSE-3)
REF075 (DSE-3)
REF076 (DSE-3)
REF077 (DSE-3)
REF078 (DSE-3 , X)
REF079 (DSE-3)
REF080 (DSE-3)
REF081 (DSE-3)
REF082 (DSE-3)
REF083 (DSE-3)
REF084 (DSE-3 , X)
REF085 (DSE-3)
REF086 (DSE-3)
REF087 (DSE-3)
REF088 (DSE-3 , X)
REF089 (DSE-3)
REF090 (DSE-3)
REF091 (DSE-3)
REF092 (DSE-3)
REF093 (DSE-3)
REF094 (DSE-3)
REF095 (DSE-3)
REF096 (DSE-3 , X)
REF097 (DSE-3)
REF098 (DSE-3)
REF099 (DSE-4)
REF100 (DSE-4)
REF101 (DSE-4 , X)
REF102 (6)
REF103 (6, X)
REF104 (DSE-5 , X)
REF105 (DSE-5)
REF106 (DSE-6 , X)
REF107 (DSE-6)
REF108 (DSE-6 , X)
REF109 (DSE-6 , X)
REF110 (DSE-6)
REF111 (7 , X)
REF112 (8, X)
REF113 (9)
REF114 (9)
REF115 (9, X)
REF116 (9)
REF117 (9)
REF118 (10)
REF119 (10)
REF120 (10)
REF121 (10, X)
REF122 (10)
REF123 (DSE-7 , X)
REF124 (DSE-7)
REF125 (DSE-7)
REF126 (DSE-7)
REF127 (DSE-7)
REF128 (DSE-7 , X)
REF129 (DSE-7)
REF130 (DSE-7 X)
REF131 (DSE-7)
REF132 (DSE-7 , X)
REF133 (DSE-7)
REF134 (DSE-7)
REF135 (DSE-7)
REF136 (DSE-7)
REF137 (DSE-7)
REF138 (DSE-7)
REF139 (DSE-7)
REF140 (DSE-7 , X)
REF141 (11, X)
REF142 (12, X)
REF143 (DSE-8 , X)
REF144 (DSE-8 , X)
REF145 (DSE-8)
REF146 (DSE-9)
REF147 (DSE-9)
REF148 (DSE-9 , X)
REF149 (DSE-9)
REF150 (DSE-9 , X)
REF151 (DSE-9)
REF152 (DSE-9)
REF153 (DSE-9)
REF154 (DSE-10 , X)
REF155 (DSE-10)
REF156 (DSE-10)
REF157 (13, X)
REF158 (DSE-11 , X)
REF159 (14, X)
REF160 (14)
REF161 (14)
REF162 (14)
REF163 (15, X)
REF164 (16, X)
REF165 (DSE-12 , X)
REF166 (DSE-13)
REF167 (DSE-13)
REF168 (DSE-13 , X)
REF169 (17, X)
REF170 (18, X)
REF171 (19, X)
REF172 (20, X)
REF173 (21, X)
REF174 (22, X)
REF175 (23, X)
REF176 (24, X)
REF177 (25)
REF178 (25)
REF179 (25)
REF180 (25)
REF181 (25, X)
REF182 (25)
REF183 (25)
REF184 (25)
REF185 (25)
REF186 (25)
REF187 (25)
REF188 (25)
REF189 (25)
REF190 (25)
REF191 (25)
REF192 (25)
REF193 (25)
REF194 (25)
REF195 (25)
REF196 (25)
REF197 (25)
REF198 (25)
REF199 (25)
REF200 (25)
REF201 (25, X)
REF202 (25)
REF203 (26, X)
REF204 (26)
REF205 (26)
REF206 (26, X)
REF207 (26)
REF208 (26)
REF209 (DSE-14)
REF210 (DSE-14 , X)
REF211 (DSE-14)
REF212 (27, X)
REF213 (27)
REF214 (27, X)
REF215 (27)
REF216 (27)
REF217 (27)
REF218 (27)
REF219 (27)
REF220 (27)
REF221 (27)
REF222 (27)
REF223 (27)
REF224 (27)
REF225 (27)
REF226 (27)
REF227 (27)
REF228 (27)
REF229 (27)
REF230 (27)
REF232 (27)
REF232 (27)
REF233 (27)
REF234 (27)
REF235 (27)
REF236 (27)
REF237 (27)
REF238 (27)
REF239 (27)
REF240 (27)
REF241 (27)
0.02
78
76
81
72
84
99
71
9796
87
77
99
99
83
91
99
99
99
91
99
99
99
99
90
99
99
86
81
97
98
99
97
98
95
73
99
99
89
91
74
99
99
99
99
99
9699
95
99
98
97
99
99
99
82
99
72
REF001 (DSE-1)
REF002 (DSE-1 , X)
REF003 (DSE-1)
REF004 (DSE-1)
REF005 (DSE-1)
REF006 (DSE-1)
REF007 (DSE-1)
REF008 (DSE-1)
REF009 (DSE-1)
REF010 (DSE-1)
REF011 (DSE-1)
REF012 (DSE-1)
REF013 (DSE-1)
REF014 (DSE-1)
REF015 (DSE-1)
REF016 (DSE-1)
REF017 (DSE-1)
REF018 (DSE-1)
REF019 (DSE-1)
REF020 (DSE-1)
REF021 (DSE-1)
REF022 (DSE-1)
REF023 (DSE-1)
REF024 (DSE-1)
REF025 (DSE-1 , X)
REF026 (DSE-1)
REF027 (DSE-1)
REF028 (DSE-1)
REF029 (DSE-1)
REF030 (DSE-1)
REF031 (DSE-1)
REF032 (DSE-1)
REF033 (DSE-1)
REF034 (DSE-1)
REF035 (DSE-1)
REF036 (DSE-1)
REF037 (DSE-1 , X)
REF038 (DSE-1)
REF039 (DSE-1 , X)
REF040 (DSE-1)
REF041 (DSE-1)
REF042 (DSE-1)
REF043 (DSE-1)
REF044 (DSE-1)
REF045 (1, X)
REF046 (2, X)
REF047 (3, X)
REF048 (4)
REF049 (4, X)
REF050 (5, X)
REF051 (DSE-2)
REF052 (DSE-2)
REF053 (DSE-2)
REF054 (DSE-2)
REF055 (DSE-2 , X)
REF056 (DSE-2)
REF057 (DSE-2)
REF058 (DSE-2 , X)
REF059 (DSE-2)
REF060 (DSE-2)
REF061 (DSE-2)
REF062 (DSE-3)
REF063 (DSE-3)
REF064 (DSE-3)
REF065 (DSE-3)
REF066 (DSE-3)
REF067 (DSE-3)
REF068 (DSE-3)
REF069 (DSE-3)
REF070 (DSE-3)
REF071 (DSE-3)
REF072 (DSE-3)
REF073 (DSE-3)
REF074 (DSE-3)
REF075 (DSE-3)
REF076 (DSE-3)
REF077 (DSE-3)
REF078 (DSE-3 , X)
REF079 (DSE-3)
REF080 (DSE-3)
REF081 (DSE-3)
REF082 (DSE-3)
REF083 (DSE-3)
REF084 (DSE-3 , X)
REF085 (DSE-3)
REF086 (DSE-3)
REF087 (DSE-3)
REF088 (DSE-3 , X)
REF089 (DSE-3)
REF090 (DSE-3)
REF091 (DSE-3)
REF092 (DSE-3)
REF093 (DSE-3)
REF094 (DSE-3)
REF095 (DSE-3)
REF096 (DSE-3 , X)
REF097 (DSE-3)
REF098 (DSE-3)
REF099 (DSE-4)
REF100 (DSE-4)
REF101 (DSE-4 , X)
REF102 (6)
REF103 (6, X)
REF104 (DSE-5 , X)
REF105 (DSE-5)
REF106 (DSE-6 , X)
REF107 (DSE-6)
REF108 (DSE-6 , X)
REF109 (DSE-6 , X)
REF110 (DSE-6)
REF111 (7 , X)
REF112 (8, X)
REF113 (9)
REF114 (9)
REF115 (9, X)
REF116 (9)
REF117 (9)
REF118 (10)
REF119 (10)
REF120 (10)
REF121 (10, X)
REF122 (10)
REF123 (DSE-7 , X)
REF124 (DSE-7)
REF125 (DSE-7)
REF126 (DSE-7)
REF127 (DSE-7)
REF128 (DSE-7 , X)
REF129 (DSE-7)
REF130 (DSE-7 X)
REF131 (DSE-7)
REF132 (DSE-7 , X)
REF133 (DSE-7)
REF134 (DSE-7)
REF135 (DSE-7)
REF136 (DSE-7)
REF137 (DSE-7)
REF138 (DSE-7)
REF139 (DSE-7)
REF140 (DSE-7 , X)
REF141 (11, X)
REF142 (12, X)
REF143 (DSE-8 , X)
REF144 (DSE-8 , X)
REF145 (DSE-8)
REF146 (DSE-9)
REF147 (DSE-9)
REF148 (DSE-9 , X)
REF149 (DSE-9)
REF150 (DSE-9 , X)
REF151 (DSE-9)
REF152 (DSE-9)
REF153 (DSE-9)
REF154 (DSE-10 , X)
REF155 (DSE-10)
REF156 (DSE-10)
REF157 (13, X)
REF158 (DSE-11 , X)
REF159 (14, X)
REF160 (14)
REF161 (14)
REF162 (14)
REF163 (15, X)
REF164 (16, X)
REF165 (DSE-12 , X)
REF166 (DSE-13)
REF167 (DSE-13)
REF168 (DSE-13 , X)
REF169 (17, X)
REF170 (18, X)
REF171 (19, X)
REF172 (20, X)
REF173 (21, X)
REF174 (22, X)
REF175 (23, X)
REF176 (24, X)
REF177 (25)
REF178 (25)
REF179 (25)
REF180 (25)
REF181 (25, X)
REF182 (25)
REF183 (25)
REF184 (25)
REF185 (25)
REF186 (25)
REF187 (25)
REF188 (25)
REF189 (25)
REF190 (25)
REF191 (25)
REF192 (25)
REF193 (25)
REF194 (25)
REF195 (25)
REF196 (25)
REF197 (25)
REF198 (25)
REF199 (25)
REF200 (25)
REF201 (25, X)
REF202 (25)
REF203 (26, X)
REF204 (26)
REF205 (26)
REF206 (26, X)
REF207 (26)
REF208 (26)
REF209 (DSE-14)
REF210 (DSE-14 , X)
REF211 (DSE-14)
REF212 (27, X)
REF213 (27)
REF214 (27, X)
REF215 (27)
REF216 (27)
REF217 (27)
REF218 (27)
REF219 (27)
REF220 (27)
REF221 (27)
REF222 (27)
REF223 (27)
REF224 (27)
REF225 (27)
REF226 (27)
REF227 (27)
REF228 (27)
REF229 (27)
REF230 (27)
REF232 (27)
REF232 (27)
REF233 (27)
REF234 (27)
REF235 (27)
REF236 (27)
REF237 (27)
REF238 (27)
REF239 (27)
REF240 (27)
REF241 (27)
0.02
78
76
81
72
84
99
71
9796
87
77
99
99
83
91
99
99
99
91
99
99
99
99
90
99
99
86
81
97
98
99
97
98
95
73
99
99
89
91
74
99
99
99
99
99
9699
95
99
98
97
99
99
99
82
99
72
5. ábra Az őshonos (O) és inváziós (▲) növényekről gyűjtött 241 izolátum ITS szekvenciái alapján MEGA 4
programmal készített Minimum Evolution fa, mely Maximum Composite Likelihood model-t alkalmazva készült a
gap-ek páronkénti ignorálásával. A csoportok nevei zárójelben szerepelnek, és jelöltük (X) az inokulációs
kísérletekben használt törzseket. A bootstrap értékek (≥ 70) százalékként szerepelnek. A mérce 100 karakteren 2
változásnak megfelelő ághosszat jelöl.
**
*
*
42
REF001 (DSE-1)
REF002 (DSE-1 , X)
REF003 (DSE-1)
REF004 (DSE-1)
REF005 (DSE-1)
REF006 (DSE-1)
REF007 (DSE-1)
REF008 (DSE-1)
REF009 (DSE-1)
REF010 (DSE-1)
REF011 (DSE-1)
REF012 (DSE-1)
REF013 (DSE-1)
REF014 (DSE-1)
REF015 (DSE-1)
REF016 (DSE-1)
REF017 (DSE-1)
REF018 (DSE-1)
REF019 (DSE-1)
REF020 (DSE-1)
REF021 (DSE-1)
REF022 (DSE-1)
REF023 (DSE-1)
REF024 (DSE-1)
REF025 (DSE-1 , X)
REF026 (DSE-1)
REF027 (DSE-1)
REF028 (DSE-1)
REF029 (DSE-1)
REF030 (DSE-1)
REF031 (DSE-1)
REF032 (DSE-1)
REF033 (DSE-1)
REF034 (DSE-1)
REF035 (DSE-1)
REF036 (DSE-1)
REF037 (DSE-1 , X)
REF038 (DSE-1)
REF039 (DSE-1 , X)
REF040 (DSE-1)
REF041 (DSE-1)
REF042 (DSE-1)
REF043 (DSE-1)
REF044 (DSE-1)
REF045 (1, X)
REF046 (2, X)
REF047 (3, X)
REF048 (4)
REF049 (4, X)
REF050 (5, X)
REF051 (DSE-2)
REF052 (DSE-2)
REF053 (DSE-2)
REF054 (DSE-2)
REF055 (DSE-2 , X)
REF056 (DSE-2)
REF057 (DSE-2)
REF058 (DSE-2 , X)
REF059 (DSE-2)
REF060 (DSE-2)
REF061 (DSE-2)
REF062 (DSE-3)
REF063 (DSE-3)
REF064 (DSE-3)
REF065 (DSE-3)
REF066 (DSE-3)
REF067 (DSE-3)
REF068 (DSE-3)
REF069 (DSE-3)
REF070 (DSE-3)
REF071 (DSE-3)
REF072 (DSE-3)
REF073 (DSE-3)
REF074 (DSE-3)
REF075 (DSE-3)
REF076 (DSE-3)
REF077 (DSE-3)
REF078 (DSE-3 , X)
REF079 (DSE-3)
REF080 (DSE-3)
REF081 (DSE-3)
REF082 (DSE-3)
REF083 (DSE-3)
REF084 (DSE-3 , X)
REF085 (DSE-3)
REF086 (DSE-3)
REF087 (DSE-3)
REF088 (DSE-3 , X)
REF089 (DSE-3)
REF090 (DSE-3)
REF091 (DSE-3)
REF092 (DSE-3)
REF093 (DSE-3)
REF094 (DSE-3)
REF095 (DSE-3)
REF096 (DSE-3 , X)
REF097 (DSE-3)
REF098 (DSE-3)
REF099 (DSE-4)
REF100 (DSE-4)
REF101 (DSE-4 , X)
REF102 (6)
REF103 (6, X)
REF104 (DSE-5 , X)
REF105 (DSE-5)
REF106 (DSE-6 , X)
REF107 (DSE-6)
REF108 (DSE-6 , X)
REF109 (DSE-6 , X)
REF110 (DSE-6)
REF111 (7 , X)
REF112 (8, X)
REF113 (9)
REF114 (9)
REF115 (9, X)
REF116 (9)
REF117 (9)
REF118 (10)
REF119 (10)
REF120 (10)
REF121 (10, X)
REF122 (10)
REF123 (DSE-7 , X)
REF124 (DSE-7)
REF125 (DSE-7)
REF126 (DSE-7)
REF127 (DSE-7)
REF128 (DSE-7 , X)
REF129 (DSE-7)
REF130 (DSE-7 X)
REF131 (DSE-7)
REF132 (DSE-7 , X)
REF133 (DSE-7)
REF134 (DSE-7)
REF135 (DSE-7)
REF136 (DSE-7)
REF137 (DSE-7)
REF138 (DSE-7)
REF139 (DSE-7)
REF140 (DSE-7 , X)
REF141 (11, X)
REF142 (12, X)
REF143 (DSE-8 , X)
REF144 (DSE-8 , X)
REF145 (DSE-8)
REF146 (DSE-9)
REF147 (DSE-9)
REF148 (DSE-9 , X)
REF149 (DSE-9)
REF150 (DSE-9 , X)
REF151 (DSE-9)
REF152 (DSE-9)
REF153 (DSE-9)
REF154 (DSE-10 , X)
REF155 (DSE-10)
REF156 (DSE-10)
REF157 (13, X)
REF158 (DSE-11 , X)
REF159 (14, X)
REF160 (14)
REF161 (14)
REF162 (14)
REF163 (15, X)
REF164 (16, X)
REF165 (DSE-12 , X)
REF166 (DSE-13)
REF167 (DSE-13)
REF168 (DSE-13 , X)
REF169 (17, X)
REF170 (18, X)
REF171 (19, X)
REF172 (20, X)
REF173 (21, X)
REF174 (22, X)
REF175 (23, X)
REF176 (24, X)
REF177 (25)
REF178 (25)
REF179 (25)
REF180 (25)
REF181 (25, X)
REF182 (25)
REF183 (25)
REF184 (25)
REF185 (25)
REF186 (25)
REF187 (25)
REF188 (25)
REF189 (25)
REF190 (25)
REF191 (25)
REF192 (25)
REF193 (25)
REF194 (25)
REF195 (25)
REF196 (25)
REF197 (25)
REF198 (25)
REF199 (25)
REF200 (25)
REF201 (25, X)
REF202 (25)
REF203 (26, X)
REF204 (26)
REF205 (26)
REF206 (26, X)
REF207 (26)
REF208 (26)
REF209 (DSE-14)
REF210 (DSE-14 , X)
REF211 (DSE-14)
REF212 (27, X)
REF213 (27)
REF214 (27, X)
REF215 (27)
REF216 (27)
REF217 (27)
REF218 (27)
REF219 (27)
REF220 (27)
REF221 (27)
REF222 (27)
REF223 (27)
REF224 (27)
REF225 (27)
REF226 (27)
REF227 (27)
REF228 (27)
REF229 (27)
REF230 (27)
REF232 (27)
REF232 (27)
REF233 (27)
REF234 (27)
REF235 (27)
REF236 (27)
REF237 (27)
REF238 (27)
REF239 (27)
REF240 (27)
REF241 (27)
0.02
78
76
81
72
84
99
71
9796
87
77
99
99
83
91
99
99
99
91
99
99
99
99
90
99
99
86
81
97
98
99
97
98
95
73
99
99
89
91
74
99
99
99
99
99
9699
95
99
98
97
99
99
99
82
99
72
REF001 (DSE-1)
REF002 (DSE-1 , X)
REF003 (DSE-1)
REF004 (DSE-1)
REF005 (DSE-1)
REF006 (DSE-1)
REF007 (DSE-1)
REF008 (DSE-1)
REF009 (DSE-1)
REF010 (DSE-1)
REF011 (DSE-1)
REF012 (DSE-1)
REF013 (DSE-1)
REF014 (DSE-1)
REF015 (DSE-1)
REF016 (DSE-1)
REF017 (DSE-1)
REF018 (DSE-1)
REF019 (DSE-1)
REF020 (DSE-1)
REF021 (DSE-1)
REF022 (DSE-1)
REF023 (DSE-1)
REF024 (DSE-1)
REF025 (DSE-1 , X)
REF026 (DSE-1)
REF027 (DSE-1)
REF028 (DSE-1)
REF029 (DSE-1)
REF030 (DSE-1)
REF031 (DSE-1)
REF032 (DSE-1)
REF033 (DSE-1)
REF034 (DSE-1)
REF035 (DSE-1)
REF036 (DSE-1)
REF037 (DSE-1 , X)
REF038 (DSE-1)
REF039 (DSE-1 , X)
REF040 (DSE-1)
REF041 (DSE-1)
REF042 (DSE-1)
REF043 (DSE-1)
REF044 (DSE-1)
REF045 (1, X)
REF046 (2, X)
REF047 (3, X)
REF048 (4)
REF049 (4, X)
REF050 (5, X)
REF051 (DSE-2)
REF052 (DSE-2)
REF053 (DSE-2)
REF054 (DSE-2)
REF055 (DSE-2 , X)
REF056 (DSE-2)
REF057 (DSE-2)
REF058 (DSE-2 , X)
REF059 (DSE-2)
REF060 (DSE-2)
REF061 (DSE-2)
REF062 (DSE-3)
REF063 (DSE-3)
REF064 (DSE-3)
REF065 (DSE-3)
REF066 (DSE-3)
REF067 (DSE-3)
REF068 (DSE-3)
REF069 (DSE-3)
REF070 (DSE-3)
REF071 (DSE-3)
REF072 (DSE-3)
REF073 (DSE-3)
REF074 (DSE-3)
REF075 (DSE-3)
REF076 (DSE-3)
REF077 (DSE-3)
REF078 (DSE-3 , X)
REF079 (DSE-3)
REF080 (DSE-3)
REF081 (DSE-3)
REF082 (DSE-3)
REF083 (DSE-3)
REF084 (DSE-3 , X)
REF085 (DSE-3)
REF086 (DSE-3)
REF087 (DSE-3)
REF088 (DSE-3 , X)
REF089 (DSE-3)
REF090 (DSE-3)
REF091 (DSE-3)
REF092 (DSE-3)
REF093 (DSE-3)
REF094 (DSE-3)
REF095 (DSE-3)
REF096 (DSE-3 , X)
REF097 (DSE-3)
REF098 (DSE-3)
REF099 (DSE-4)
REF100 (DSE-4)
REF101 (DSE-4 , X)
REF102 (6)
REF103 (6, X)
REF104 (DSE-5 , X)
REF105 (DSE-5)
REF106 (DSE-6 , X)
REF107 (DSE-6)
REF108 (DSE-6 , X)
REF109 (DSE-6 , X)
REF110 (DSE-6)
REF111 (7 , X)
REF112 (8, X)
REF113 (9)
REF114 (9)
REF115 (9, X)
REF116 (9)
REF117 (9)
REF118 (10)
REF119 (10)
REF120 (10)
REF121 (10, X)
REF122 (10)
REF123 (DSE-7 , X)
REF124 (DSE-7)
REF125 (DSE-7)
REF126 (DSE-7)
REF127 (DSE-7)
REF128 (DSE-7 , X)
REF129 (DSE-7)
REF130 (DSE-7 X)
REF131 (DSE-7)
REF132 (DSE-7 , X)
REF133 (DSE-7)
REF134 (DSE-7)
REF135 (DSE-7)
REF136 (DSE-7)
REF137 (DSE-7)
REF138 (DSE-7)
REF139 (DSE-7)
REF140 (DSE-7 , X)
REF141 (11, X)
REF142 (12, X)
REF143 (DSE-8 , X)
REF144 (DSE-8 , X)
REF145 (DSE-8)
REF146 (DSE-9)
REF147 (DSE-9)
REF148 (DSE-9 , X)
REF149 (DSE-9)
REF150 (DSE-9 , X)
REF151 (DSE-9)
REF152 (DSE-9)
REF153 (DSE-9)
REF154 (DSE-10 , X)
REF155 (DSE-10)
REF156 (DSE-10)
REF157 (13, X)
REF158 (DSE-11 , X)
REF159 (14, X)
REF160 (14)
REF161 (14)
REF162 (14)
REF163 (15, X)
REF164 (16, X)
REF165 (DSE-12 , X)
REF166 (DSE-13)
REF167 (DSE-13)
REF168 (DSE-13 , X)
REF169 (17, X)
REF170 (18, X)
REF171 (19, X)
REF172 (20, X)
REF173 (21, X)
REF174 (22, X)
REF175 (23, X)
REF176 (24, X)
REF177 (25)
REF178 (25)
REF179 (25)
REF180 (25)
REF181 (25, X)
REF182 (25)
REF183 (25)
REF184 (25)
REF185 (25)
REF186 (25)
REF187 (25)
REF188 (25)
REF189 (25)
REF190 (25)
REF191 (25)
REF192 (25)
REF193 (25)
REF194 (25)
REF195 (25)
REF196 (25)
REF197 (25)
REF198 (25)
REF199 (25)
REF200 (25)
REF201 (25, X)
REF202 (25)
REF203 (26, X)
REF204 (26)
REF205 (26)
REF206 (26, X)
REF207 (26)
REF208 (26)
REF209 (DSE-14)
REF210 (DSE-14 , X)
REF211 (DSE-14)
REF212 (27, X)
REF213 (27)
REF214 (27, X)
REF215 (27)
REF216 (27)
REF217 (27)
REF218 (27)
REF219 (27)
REF220 (27)
REF221 (27)
REF222 (27)
REF223 (27)
REF224 (27)
REF225 (27)
REF226 (27)
REF227 (27)
REF228 (27)
REF229 (27)
REF230 (27)
REF232 (27)
REF232 (27)
REF233 (27)
REF234 (27)
REF235 (27)
REF236 (27)
REF237 (27)
REF238 (27)
REF239 (27)
REF240 (27)
REF241 (27)
0.02
78
76
81
72
84
99
71
9796
87
77
99
99
83
91
99
99
99
91
99
99
99
99
90
99
99
86
81
97
98
99
97
98
95
73
99
99
89
91
74
99
99
99
99
99
9699
95
99
98
97
99
99
99
82
99
72
**
5. ábra Folytatás.
***
***
A
B
B )
43
5.3.1 A tizennégy DSE csoport
Az inokulációs kísérletekkel bizonyíthatóan DSE gombának tekintett izolátumokat az
aszkuszos gombák számos gyökérkolonizáló endofitont is magában foglaló rendjeibe
tartoztak. A DSE törzseink ITS és LSU szekvenciájuk alapján a következő rendekbe
tartoztak: Helotiales (DSE-1,2), Pleosporales (DSE-3,4,5,6,7,8,9,10), Xylariales (DSE-11),
Eurotiales (DSE-12), Glomerellales (DSE-13) és Hypocreales (DSE-14).
A legtöbb izolátum (44) a DSE-1 csoprotba tartozott, ITS szekvenciáik a Cadophora
nemzetségbe tartozó fajokéval mutattak hasonlóságot és a BLAST találatok fák gyökeréből,
talajból és gyümölcsökről is származtak. A DSE-1 csoport amellett, hogy egyértelműen egy
leszármazási vonalat reprezentál, az elemzéseink alapján két alcsoportra bontható
(REF001–REF038 és REF039–REF044, 5. ábra)
A másik Helotiales rendbe tartozó csoport a DSE-2 volt, melybe 12 törzs tartozott.
Az adatbázisok hasonló szekvenciái legtöbb esetben nem azonosított nemzetségként vagy
fajként voltak megnevezve. Volt ektomikorrhizát és erikoid mikorrhizát képző gombának
nevezett találat is.
A második legnagyobb (37 izolátum) csoportot (DSE-3) a BLAST találatok alapján,
kétséget kizáróan Rhizopycnis vagum (Pleosporales) izolátumok alkották, melyek több
növényfaj gyökereiről származtak.
A DSE-4 csoport három izolátumot tartalmazott, melyek ITS és LSU szekvenciái
annyira különböztek a leghasonlóbb BLAST találatoktól is, hogy még család szintű
azonosításuk sem volt lehetséges. A csoporttal később részletesebben foglalkozunk.
A DSE-5 csoportba két izolátum tartozott, a BLAST vizsgálatok alapján
egyértelműen az Alternaria nemzetségébe tartoztak.
A DSE-6 csoportot alkotó izolátumok ITS szekvenciái teljes egyezést mutattak száraz
területek különböző növényeinek gyökereiről származó gomba szekvenciákkal. Volt olyan
találat is (Setophoma sacchari), mely az általában szárazabb helyekről származó adatokkal
szemben nedves élőhelyekre jellemző pelyhes selyemperje (Holcus lanatus) gyökeréből
származott (Sánchez-Márquez 2008).
A DSE-7 csoport annak ellenére, hogy rendkívül változatos telepmorfológiát mutató
és egymástól eltérő ITS szekvenciával rendelkező izolátumokat foglalt magában,
egyértelműen egy leszármazási vonalat képviselt (5. ábra). Taxonómiai azonosítása még
család szinten sem sikerült, annak ellenére, hogy a GenBankban számos ide tartozó, csak
44
szekvenciaként létező találat szerepelt. Ezek a szekvenciák kivétel nélkül több kontinens
száraz és félszáraz füves területek fűféléinek gyökeréből és az ottani talajból származtak. E
csoport részletesen az 5.7 alfejezetben kerül tárgyalásra.
A DSE-8 csoportot három izolátum alkotta, és bár a telepmorfológiák és szekvenciák
alapján is látszott, hogy valószínűleg ezek két alcsoportot reprezentálnak, mivel viszonylag
kis eltérés volt az ITS szekvenciák között és a BLAST találatok is hasonló eredményt
adtak, egy csoportként kezeltük őket. Ezt a csoportot a Periconia macrospinosa két
izolátuma (REF144 és REF145), és egy ezekhez hasonló izolátum alkotta (REF143).
A DSE-9 csoportba tartozó 8 izolátum őshonos növényekről került elő, melyek közt
fás és lágyszárú kétszikűek és fűfélék is voltak. A BLAST találatok alapján
megállapíthatjuk, hogy a csoportot az Embellisia nemzetségbe tartozó izolátumok alkotják.
A DSE-10 csoportot a Curvularia nemzetségbe sorolható három izolátum alkotta,
melyeket fás szárú növényekről izoláltunk és hasonló BLAST találataik száraz területek
talajából és gyökerekből származtak.
A DSE-11 csoportot egy Microdochium nemzetségbe (Xylariales) tartozó izolátum
alkotta, mely szekvenciái száraz és félszáraz területek talajából és gyökerekről származó
szekvenciákkal mutattak hasonlóságot.
A DSE-12 csoportot egy izolátum alkotta, melynek ITS szekvenciájától még a
legnagyobb hasonlóságot mutató szekvenciák is jelentősen különböztek. Ezek közt (pl.
Aspergillus spp., Chaetosartorya spp., Thermoascus crustaceus) nem voltak
törzsgyűjteményben elhelyezett, publikált, vagy biztosan jól meghatározott törzsek
szekvenciái, így ezek alapján sem feltétlenül következtethetünk a rendszertani helyzetükre.
A DSE-13 csoportot három törzs alkotta, melyek a Plectosphaerella nemzetségbe, és
valószínűleg a P. cucumerina fajhoz tartoztak.
A DSE-14 csoportot a széles körben elterjedt, talajban és növényekben dominánsan
jelenlévő és legtöbbször növényi patogénként ismert Fusarium nemzetségbe tartozó 3
izolátum alkotta.
A különböző DSE csoportokba tartozó izolátumok telepmorfológiája és növekedési
jellemzői egymásétól jól láthatóan különböztek, az egy csoportba tartozó törzseknél a
legtöbb esetben ezek a jellemzők megegyezetek. Ez alól a DSE-7 és DSE-8 csoportok
voltak kivételek, melyek részletes tárgyalására a 5.7. fejezetben kerül sor.
45
5.3.2 Gazda és terület specificitás, szezonalitás és inváziós növányek
A terület specificitás és szezonalitás vizsgálatokhoz 48 DSE gombának bizonyuló
izolátumot gyűjtöttünk a jelölt közönséges borókákról a három területen, 3 évszakban. Az
izolátumok egy kivételével a DSE-1, DSE-2 és DSE-3 csoportokba tartoztak. A DSE-1
csoportba mindhárom területről és mindhárom évszakban gyűjtött izolátumok tartoztak, míg
a DSE-2 csoport két területről származó (Fülöpháza, Tatárszentgyörgy) és mindhárom
évszakban izolált törzseket foglalt magában. A DSE-3 csoportba két területről (Fülöpháza,
Tatárszentgyörgy) és két évszakban (tavasz, nyár) gyűjtött izolátumok tartoztak. Egyik DSE
csoport sem tartalmazott csak egy területről származó vagy csak egy évszakban gyűjtőtt
izolátumokat.
A gyakori DSE csoportok őshonos és inváziós növényekről izolált törzseket egyaránt
magukban foglaltak. Az egy izolátum által reprezentált (szingleton) DSE csoportok mellett
(DSE-11, DSE-12) a kisebb csoportok izolátumai csak inváziós (DSE-5, DSE-13 és DSE-
14) vagy csak őshonos növényekről (DSE-4 és DSE-8) származtak. A DSE-9 csoportba
tartozó 8 izolátum csak őshonos növényekről és egy területről került elő. A szingleton
csoportok mellett a DSE-4, DSE-5 és a DSE-8 csoport izolátumai származtak csak egy
évszakból vagy egy területről, a DSE-10 csak egy évszakban, a DSE-6 és DSE-9 pedig csak
egy területről került elő (F3. táblázat).
5.4 DSE csoportok ISSR vizsgálatának eredményei
Az félszáraz területeken végzett DSE gombák kompozicionális diverzitás
vizsgálatának eredményeként megkaptuk melyek a terület gyakori, domináns és generalista
DSE csoportjait. Ezek közül választottunk ki hármat (DSE-1, DSE-3 és DSE-7), melyek
izolátumai közötti genetikai variabilitást vizsgáltuk.
5.4.1 A kiválasztott DSE csoportok
A DSE-1 (Cadophora sp.) csoportba tartozott a legtöbb izolátum. Ezek ITS régiója
viszonylag nagy heterogenitást mutatott, azonban számos izolátum szekvenciái
megegyeztek. Az ITS alapján két, egyértelműen elkülönülő alcsoportba sorolódtak a törzsek
(REF001–REF038 és REF039–REF044). A legtöbb ide tartozó törzs bórókáról származott és
megegyező telepmorfológiával rendelkezett.
46
A DSE-3 (Rhizopycnis vagum) csoportba tartozott a második legtöbb izolátum, melyek
több gazdanövényről kerültek elő, és egy, az ITS alapján szinte teljesen homogén csoportot
alkottak. Habár az ITS alapján két alcsoportot alkottak az izolátumok, a két alcsoportba
teljesen azonos ITS régióval rendelkező izolátumok tartoztak és a csoportotok csupán 1
nukleotidban különböztek. Az izolátumok telepmorfológiája ez esetben is teljesen azonos
volt.
A DSE-7 (Pleosporales sp.) csoport volt a harmadik legnagyobb izolátumszámmal
rendelkező DSE csoport. Az izolátumok, annak ellenére, hogy voltak azonos ITS
szekvenciával rendelkező alcsoportok, összességében nagymértékű heterogenitást mutattak,
és szinte minden telep morfológiája, növekedési jellemzője különbözött. Érdekesség, hogy
az ITS amplikonok gélelektroforézisét követően a gélképeken még az azonos ITS régióval
rendelkező izolátumok amplikonjai is eltértek, mivel számos esetben az ITS1F primer az
SSU 3’ végétől a megszokottnál távolabb kötött be, jóval nagyobb amplikont eredményezve.
5.4.2 A DSE-1 és DSE-7 izolátumok célzott gyűjtése és a specifikus PCR
A DSE-3 csoport esetén relatíve sok izolátum állt rendelkezésünkre, melyek számos
különböző gazdanövényről származtak és nagyon kis eltérés volt az ITS szekvenciáik közt.
Emiatt ebben az esetben nem gyűjtöttünk további izolátumokat. Ezért a kevesebb
gazdanövényfajról származó, az ITS régiókban nagyobb változatosságot mutató DSE-1
csoport és a nagy ITS különbségekkel és változatos telepmorfológiával rendelkező DSE-7
csoport esetében gyűjtöttünk további izolátumokat.
A kiválasztott csoportok törzseire tervezett specifikus primereket használtuk a gyors
azonosításhoz: DSE-1: DSE1F: 5’ AGT CGT CGA ACC TCT CGG AGA A 3’, DSE1R: 5’
GAC AGG CAC CGC CAC TGA TT 3’. Amplifikált szakasz mérete: ~350bp. DSE-7:
DSE7F: 5’ GTT GTT TCC TCG GCA GGT C 3’, DSE7R: 5’ ACG ACC GCT GCC AAT
ACC 3’. Amplifikált szakasz mérete: ~330bp.
A tervezett primerekkel összeállított specifikus PCR kidolgozását a két csoport
meglévő összes izolátumán és az ezekkel közeli rokonságot mutató, azonban más csoportba
tartozó izolátumokon teszteltük.
A DSE-1 (Cadophora sp.) és DSE-7 csoportokra specifikus PCR-ek segítségével
összesen további 13 DSE-1 (F3. táblázat) és 19 DSE-7 törzset (F2. táblázat) izoláltunk. Az
újonnan gyűjtött izolátumok ITS régióját meghatároztuk, és a szekvenciák kivétel nélkül
megerősítették az izolátomok két kiválasztott csoportba tartozását. Nem volt olyan izolátum,
47
ami pozitív reakciót adott a specifikus PCR során és az ITS szekvenálás alapján nem a két
csoportba tartozott volna, valamint a két csoporthoz közeli csoportok izolátumainak
tesztelése során sem tapasztaltunk pozitív reakciót. Ezek alapján elmondható, hogy a DSE-1
és DSE-7 csoportokra tervezett diagnosztikai primerek specifikus PCR-t adtak, és lehetővé
teszik a gyors és célzott izolátumgyűjtést, azonosítást.
5.4.3 ISSR primerek és PCR-ek eredményei
Az (AAT)6 és (AT)8 primereket az előzetes tesztelések során elvetettük, mivel a
legtöbb esetben nem kaptunk pozitív reakciót, a (ACG)6 és (AGC)6 primerekkel végzett
ISSR PCR esetében pedig az ISSR profilok nehezen kiértékelhető mintázatokat mutattak. Az
(AAC)6, (AAG)6, (AGG)6, (ATC)6, (CCG)6, (AC)8, (AG)9 primerekkel beállított ISSR PCR
profilok beállításával (F1. táblázat) minden esetben értékelhető, 200 és 2000 bp
mérettartományban jól látható és elkülönülő sávokat tartalmazó ISSR mintázatokat kaptunk.
Munkánk során hét primerrel és összesen 111 (55 DSE-1, 25 DSE-3 és 31 DSE-7) izolátum
DNS kivonatával végeztünk hét ISSR PCR-t a kapott mintázatok kiértékelése alapján
létrehozott és összesített bináris adatsorokból képeztünk dendrogramot (6–8. ábra).
5.4.4 Az ISSR profilok eredményei
A DSE-1 csoport esetében a hét ISSR profil alapján készített UPGMA fán jól látható,
hogy az ITS régió alapján azonos törzsek is elkülönültek egymástól, sőt négy izolátum
kivételével (REF021–REF024) nincs két olyan izolátum, melynek az összes vizsgált ISSR
mintázata megegyezne (6. ábra). Az ITS régió alapján elkülönülő B alcsoport (6. ábra)
izolátumai a REF042 kivételével ISSR profiljaik alapján is együtt helyezkedtek el.
Általánosságban véve az izolátumok alcsoportokon belüli elhelyezkedése eltérő volt az ITS
alapú csoportosulásukhoz képest (6. ábra). Az ISSR mintázatok alapján az elrendeződés nem
mutatott összefüggéseket sem az izolátumok gyűjtési dátumával, sem a gyűjtési évszakkal,
sem a származási területtel, sem az eltérő gazdanövényekkel.
A DSE-3 csoport esetén sem tapasztaltunk összefüggéseket az izolátumok
csoportosulása és a gyűjtési dátum és évszak, származási terület és gazdanövény fajok között
sem. Ebben az esetben is elkülönült az ITS alapján létrejövő két alcsoport (A és B), melyek
izolátumainak ITS szekvenciái egyetlen nukleotid különbségben tértek el. Az ISSR profilok
elemzésével jóval finomabb felbontást tapasztaltunk. Kilenc izolátumot nem számítva
(REF066–REF068, REF095–REF098 és REF089–REF090) a legtöbb esetben lehetővé vált
az azonos ITS régióval rendelkező izolátumok elkülönítése (7. ábra).
48
a b
6. ábra (a) A DSE-1 (Cadophora sp.) csoport izolátumainak ITS alapú Minimum Evolution (ME) fája, mely
Maximum Composite Likelihood model-t alkalmazva készült a gap-ek páronkénti ignorálásával. A bootstrap
értékek (≥ 70) százalékként szerepelnek. A mérce 100 karakteren 2 változásnak megfelelő ághosszat jelöl. (b) A
DSE-1 csoport izolátumainak ISSR profilja alapján készítétett UPGMA dendrogram. Az ITS szekvenciák alapján
létrejövő alcsoportokat jelöltük (A és B). A mérce a karakterek alapján kapott eltéréseket jelöli 10%-onként.
B
A
B
A
B
A
A
49
7. ábra A DSE-3 (Rhizopycnis vagum) csoport izolátumainak ISSR profilja alapján készítétett
UPGMA dendrogram. Jelöltük a két alcsoportot (A és B) melyek ITS szekvenciái alcsoportonként
azonosak voltak, de a csoportok egy nukleotid különbségben eltértek. Nem lett volna informatív egy
ITS alapú ME fa. A mérce a karakterek alapján kapott eltéréseket jelöli 10%-onként.
B
A
A DSE-7 csoport esetében sem tapasztaltunk korrelációt a már említett vizsgált
tényezőkkel. Ebben az esetben is néhány szekvencia eltérő pozíciójától eltekintve
megkaptuk az ITS alapján elkülönülő hat nagyobb alcsoportot (A, B, C, D, E, F) (7. ábra).
A legtöbb izolátumot tartalmazó „A” alcsoport egyértelműen elvált az ISSR profil alapján
is a többi alcsoporttól, de míg az ITS régiói ezeknek az izolátumoknak sok esetben
azonosak voltak, az UPGMA fán jól látható, hogy két kivétellel (REF025-REF026) minden
izolátum egyedi ISSR mintázattal rendelkezett. A kisebb alcsoportok esetében általánosan
nagyobb különbségeket kaptunk az ISSR alapján, és a hosszú ágakkal rendelkező taxonok
nem pontosan olyan rokonságot tükröztek az UPGMA fán, mint amilyet az ITS fa alapján
vártunk. Ezért a kisebb alcsoportok esetében (B–F) elmondható, hogy egyértelműen
elkülönülnek az „A” csoporttól, és mind az alcsoportok egymástól, mind pedig saját
izolátumaik is jelentősen különböznek.
50
pl_28
pl_33
pl_29
pl_34
ref_137
pl_23
ref_137
ref_139
ref_136
pl_04
pl_24
pl_25
pl_26
pl_27
pl_22
ref_138
pl_30
pl_02
ref_132
pl_01
ref_133
pl_06
ref_127
ref_128
pl_31
ref_124
pl_03
ref_129
ref_130
pl_32
ref_131
95
95
89
82
85
99
0.002
8. ábra (a) A DSE-7 csoport izolátumainak ITS alapú Minimum Evolution (ME) fája, mely Maximum
Composite Likelihood model-t alkalmazva készült a gap-ek páronkénti ignorálásával. A bootstrap értékek (≥
70) százalékként szerepelnek. A mérce 100 karakteren 2 változásnak megfelelő ághosszat jelöl. (b) A DSE-7
csoport izolátumainak ISSR profilja alapján készítétett UPGMA dendrogram. Az ITS szekvenciák alapján
létrejövő alcsoportokat jelöltük (A, B, C, D, E és F). A mérce a karakterek alapján kapott eltéréseket jelöli 10%-
onként.
b a
D
C
B E
B
B
C
A A
D
E F
F
A DSE-7 csoport izolátumainak ISSR vizsgálata esetében kaptuk a legnagyobb
távolságokat az izolátumok között, melyből arra következtethettünk, hogy egy komplex és
heterogén csoportról van szó, mely több fajt is magában foglalhat.
Elmondható, hogy mindhárom csoport esetében néhány kivételtől eltekintve, a
törzsek egyedi ISSR profillal rendelkeztek, mely lehetővé teheti a törzs szintű azonosítást
ezzel a módszerrel.
51
a b
c d
9. ábra FISH próbával jelölt gyökérkolonizáló gombák kukorica gyökerében. a. Cadophora sp. (DSE1049)
intracelluláris rövid tagú elágazó (balra) és „felfújódott” hifái (jobbra). b. A Cadophora sp.
mikroszkleróciumai a kortex sejtekben. c, d. Rhizophagus intraradices és Cadophora sp. (DSE1049) jelölése
kukorica gyökérmetszeten a GintrLSU01_af488 és CadoLSU01_af546 próbákat alkalmazva. Zöld színnel
látszik (Alexa Fluor 488) a Rhizophagus, a Cadophora sp. pedig narancssárga (Alexa Fluor 546). c. R.
intraradices intercelluláris hifái és sejten belüli Cadophora sp. képletek, d. AMF vezikulum és DSE
intracelluláris szeptált hifák. Mérce =10 μm. A 9. b, c, d ábrák Vági és mtsai (2014) által publikált képek.
5.5 Az in planta FISH eredményei
A kifejlesztett és beállított protokoll szerint eljárva specifikusan tudtunk jelölni a
gyökéren belüli DSE-gomba struktúrákat (9. ábra). A kukorica gyökerében a sejtfalak
autofluoreszcenciája csak kismértékben zavarta a detektálást. A konfokális mikroszkópos
vizsgálatoknak köszönhetően kijelenthetjük, hogy a Cadophora sp. az epidermisz és kortex
sejtjeit egyaránt kolonizálta és mindkét sejttípusban képzett mikroszkleróciumot (9.b. ábra),
azonban a központi szövethengerben nem volt megtalálható.
52
Mintáinkban intra- és intercelluláris hifákat is megfigyeltünk. A sejteket kolonizáló
hifák morfológiájukat tekintve különböztek egymástól és alapvetően kétféle hifát figyeltünk
meg. Egyik esetben sűrűn elágazó és rövid tagokkal rendelkező hifákat figyeltünk meg a
gyökérsejtekben (9. a. ábra), máskor pedig „moniliform” struktúrákat. Néhány esetben
„átmeneti”, kissé teltebb tagokkal rendelkező hifák is előfordultak.
A Cadophora sp. izolátumra specifikus, és az AMF specifikus próbákat együtt
alkalmazva is specifikusan festették meg a különböző gombák által képzett struktúrákat (9.
c, d. ábra). A különböző AM struktúráktól (hifák, vezikulum) jelölődésük alapján
egyértelműen elkülönültek a Cadophora sp. által képzett hifák és mikroszkleróciumok (9.
a, b. ábra).
5.6 Az ultrastruktura vizsgálatok eredményei
A Cadophora törzs (DSE1049) kolonizációjának ultrastruktura vizsgálata során a
gyökérszakaszok legyűjtését és fixálását követően nem figyeltünk meg egyértelmű
kolonizációt a különböző „kolonizációs idejű” gyökérszakaszok esetén sem
sztereomikroszkóppal, sem fénymikroszkóppal. A minták OsO4-os kontrasztosítása során
sem volt látható kolonizáció egyik fixált mintánk esetében sem, így a beágyazás a
gyökérszakaszok véletlenszerű kiválasztásával történt. A különböző „kolonizációs idejű”
gyökérszakaszok félvékony metszetein csak a hat hetes gyökérszakaszokban volt
megfigyelhető kismértékű, hifák általi kolonizáció. Ezért munkánk során a minták
összehasonlítása helyett a legidősebb és a hifák által leghosszabb ideje elért
gyökérszakaszokat vizsgáltuk alaposabban.
A hat hetes gyökérszakaszok TEM vizsgálata során néhány gyökérszakaszban
megfigyeltünk kolonizációt, ezek ultrastrukturájáról felvételeket készítettünk. Annak
ellenére, hogy csak néhány gyökérrészen volt kolonizáció, a növényi sejtek felszínén,
valamint élő és nekrotikus növényi sejtekben is sikerült hifákat megfigyelnünk. A
nekrotizálódott növényi sejtekben a hifák körül a legtöbb esetben egy, valószínűleg a
gombák által kiválasztott fibrilláris anyag volt látható (10. a, b. ábra). Ezt az anyagot
általában kondenzálódott növényi citoplazma vette körül (10. b. ábra). Több esetben is
másodlagos sejtfalvastagodásokat figyeltünk meg a hifák közelében lévő növényi
sejtekben.
53
10. ábra Cadophora sp. (DSE1049) izolátummal inokulált póréhagyma gyökerek hifák által hat hete elért
szakaszairól készült TEM felvételek a, b: Nektrotizált növényi sejtekben futó gombafonalak hossz- illetve
keresztmetszetei. CCP: kondenzált növényi citoplazma, FCP: gomba citoplazma, FM: fibrilláris anyag, N:
gomba sejtmag, NPC: nekrotizált növényi sejt, S: szeptum, V: gomba vakuoluma, WB: Woronin-test,
fekete nyílhegy: gomba sejtmembrán, fekete kettős nyílhegy: gomba sejtfal, fehér nyílhegy: vakuolum
membrán, fehér kettős nyílhegy: növényi sejtfal. Mérce: a = 500 nm; b = 2 µm. Dr. Bóka Károly felvételei.
Megfigyeltünk teljesen ép citoplazmával rendelkező növényi sejtben futó hifákat is
(11. a, b. ábra). Itt a hifa és a növényi sejt citoplazmáját is a saját ép sejtmembránja
határolta (11. b. ábra). Mind a gomba, mind a növényi sejtmembrán esetében membrán
betűrődések voltak láthatók. A hifa körüli növényi sejtmembránt nem határolta növényi
sejtfal, és a gomba sejtfala és a növényi plazmamembrán között egy kevésbé elektrondenz
laza mátrix anyag volt megfigyelhető (11. b. ábra).
b a
54
11. ábra Cadophora sp. (DSE1049) izolátummal inokulált póréhagyma gyökerek hifák által hat hete
elért szakaszairól készült TEM felvételek. a, b: Növényi sejtet kolonizáló intracelluláris hifa két
nagyítással készült keresztmetszeti képe. FCP: gomba citoplazma, M: mitokondrium, N: gomba
sejtmag, P: peroxiszóma, PCP: növény citoplazma, PP: polifoszfát szemcsék, PV: növényi sejt
vakuolum, V: gomba vakuolum, *: membrán betűrődés/vezikulum, fekete nyílhegy: gomba
sejtmembrán, fekete kettős nyílhegy: gomba sejtfal, fehér nyílhegy: növényi sejt membrán, fehér
kettős nyílhegy: mátrix anyag. Mérce: a, d = 500 nm; b, c = 2 µm. Dr. Bóka Károly felvételei.
a
b
55
5.7 A taxonómiai vizsgálatok eredményei
A DSE közösség vizsgálatát követően három Pleosporales rendbe tartozó, de ennél
pontosabban nem meghatározható DSE csoport taxonómiai vizsgálatát végeztük el. A
munkákhoz a rendkívül változatos, és a harmadik legnagyobb izolátumszámmal rendelkező
DSE-7 csoportot választottuk, melyhez az ISSR vizsgálatokhoz gyűjtött, további 19
izolátummal rendelkeztünk. Ezek mellé az ismert, adatbázisokban elhelyezett és az általunk
meghatározott többi izolátum szekvenciáitól is nagyban különböző DSE-4 csoportot
választottuk ki taxonómiai vizsgálatokhoz. Harmadik vizsgálandó csoportként a DSE-8A
alcsoport lett kijelölve, mivel a két Periconia macrospinosa izolátumtól (REF144 és
REF145, DSE-8B alcsoport, 5. ábra) valószínűleg elkülönülő harmadik izolátum (REF143,
DSE-8A alcsoport) külön taxont képviselhet. A korábban, az ISSR vizsgálatokhoz
szükséges izolálátumgyűjtés során sikerült ezzel az izolátummal egy leszármazási vonalat
alkotó törzset (DSE-8/A), valamint egy további P. macrospinosa (DSE-8/B) izolátumot
gyűjtenünk. Így két izolátumunk ált rendelkezésre a DSE-8A alcsoport taxonómiai
vizsgálatához. Az újonnan izolált P. macrospinosa-t referenciaként használtuk a csoport
vizsgálatakor. A taxonómiai munkához használt törzseket a 16. ábra és az F2. táblázat
mutatja.
Munkánk során összesen 40 izolátumot vizsgáltunk (34 DSE-7 izolátum, 3 DSE-4, 2
DSE-8A és 1 DSE-8B (Periconia macrospinosa)), és ezek ITS, LSU, SSU, ACT és CAL
régióit, a DSE-7 csoport esetén még két további régiót (TEF és TUB) határoztuk meg (F2.
táblázat). A DSE-7/9 izolátum esetén csak az ITS állt rendelkezésünkre, a DSE-7/10 és a
DSE-7/29 izolátumoknál pedig a TEF illetve a CAL régiókat nem sikerült meghatározni
(F2. táblázat). Izolátumainkat elhelyeztük a CBS Fungal Biodiversity Centre
gyűjteményébe (CBS 135627–CBS 135664, CBS 135760–CBS 135761, F2. táblázat), és
ezentúl a CBS számok alapján nevezzük meg a korábban izolált törzsinket is.
5.7.1 Az izolátumok spóraképzése
Annak ellenére, hogy számos táptalajon és különböző kezeléssel próbáltunk
spóraképzést indukálni, csak néhány törzs esetében figyeltünk meg termőtesteket. Ezeket
SNA táptalajra helyezett sterilizált csalán szár darabokra oltott törzsek képezték
szobahőmérsékleten az inokulálást követő 3-4. héten (12. ábra). Csak a DSE-7 csoport több
izolátuma esetén figyeltünk meg ilyen képleteket, a DSE-4 és DSE-8 csoportok esetében
nem tapasztaltunk hasonlót. A DSE-7 csoport több izolátuma képzett sötétbarna,
56
12. ábra Darksidea fajok aszkuszai és aszkospórái. A–E: Darksidea zeta (CBS 135640). A, B: termőtest;
C, D: aszkuszok; e: aszkospórák. f–j: Darksidea alpha (CBS 135650); F,G: termőtest; H, I; aszkuszok; J:
aszkospórák. Mérce: A, B = 200 µm, F, G = 180 um, minden más = 10 µm. Dr. Perdo W. Crous felvételei,
Knapp és mtsai (2015) által publikált ábra.
gömbölyded termőtesteket aszkuszokkal és aszkospórákkal. Az izolátumok többségét
tartalmazó első (pl. CBS 135650, CBS 135652, CBS 135660), valamint második (CBS
135637), harmadik (CBS 135634) és hatodik alcsoport (CBS 135640) esetében figyeltünk
meg termőtesteket (12. ábara). A fénymikroszkópos vizsgálatok során megfigyeltük, hogy a
képletet létrehozó törzsek egy kivételével 180–250µm átmérőjű, gömb alakú ivaros
termőtestet hoztak létre, melyekben 4–6 spórát tartalmazó aszkuszok voltak. A CBS
135634 törzs által képzett képlet, bár hasonló színű, alakú és méretű volt a többi törzs által
képzettekhez, azonban ezek oszciólummal rendelkező, steril, majdnem gömb alakú
piknídium-szerű struktúrák voltak.
A törzsek egyszeri alkalommal képeztek termőtesteket, és bár azonos körülmények
között többször megismételtük kísérletet, soha többé nem sikerült újra indukálni ezeket a
struktúrákat.
57
5.7.2 Molekuláris taxonómiai eredmények
A „rend-szintű” filogenetikai vizsgálatok során (13. ábra) mindhárom kiválasztott
DSE csoport a Pleosporales rend Massarineae alrendjébe illeszkedett. A DSE-4 csoport a
Morosphaeriaceae család bazális csoportjaként, míg a DSE-8B csoport a Massarinaceae
családhoz közeli erősen támogatott incertae sedis kládba került a Massarina igniaria (CBS
845.96), Noosia bankssiae (CPC 17282) és a Periconia macrospinosa (DSE-8A, CBS
135663) törzsekkel együtt. A DSE-7 csoport reprezentatív szekvenciái egyértelműen a
Lentitheciaceae családba illeszkedtek és egy leszármazási vonalat alkottak a Tingoldiago
graminicola testvércsoportjaként.
A család-szintű filogenetikai vizsgálatok során (14. ábra) a DSE-7 csoport izolátumai
szintén egy leszármazási vonalat alkottak a Tingoldiago graminicola törzsekkel.
Izolátumaink egy nagyobb csoportot alkottak a Keissleriella és Lentithecium nemzetségek
több fajával és a Pleurophoma pleurospora törzseivel. A család típusfaja, a Lentithecium
fluviatile külön leszármazási vonalat képviselt a családon belül, míg a L. arundinaceum és a
Stagonospora macropycnidia, valamint a két bambuszon előforduló faj, a Katumotoa
bambusicola és az Ophiosphaerella sasicola is külön alkládokat alkottak.
A DSE-7 izolátumok a csoporton belüli elhelyezkedésük vizsgálatánál különálló és
sokszor erősen támogatott alcsoportokat alkottak (15. ábra). Egy klád tartalmazta az
izolátumok többségét (23 izolátum), ezek nagy heterogenitást mutattak. A második klád
három izolátumot tartalmazott, és testvércsoportja volt a szintén három kládot tartalmazó
harmadik kládnak. A negyedik kládba ugyancsak három izolátum illeszkedett, és ennek a
testvércsoportja egy szingleton csoport volt egy izolátummal. A hatodik kládot szintén egy
izolátum alkotta, mely az összes DSE-7 izolátum testvércsoportjaként helyezkedett el (15.
ábra). A DSE-7 csoport ISSR módszerrel végzett csoporton belüli genetikati variabilitás
vizsgálata során megkaptuk körülbelül azokat a csoportokat (8. ábra), melyek az öt
variábilisabbnak mondható lókusz elemzésével is kialakultak (15. ábra). Ez esetben is
nagyobb felbontást tapasztaltunk és az izolátumok csoportokon belüli elhelyezkedései
többször eltérőek voltak. Az egy csoportba tartozó izolátumok morfológiai és biológiai
jellemzői is sokszor különböztek.
Eredményeink alapján a három DSE csoport három új nemzetséget reprezentál a
Pleosporales rend Massarineae alrendjében.
58
Keissleriella genistae strain CBS 113798
Pleurophoma pleurospora CBS 116668
Lentithecium fluviatile strain CBS 123090
Morosphaeria velataspora isolate BCC 17059
Pyrenophora phaeocomes DAOM 222769
Kirschsteiniothelia elaterascus strain A22 11B
Leptosphaerulina australis CBS 317.83
Phoma radicina CBS 111.79
Kirschsteiniothelia elaterascus HKUCC 7769
Corynespora olivacea strain CBS 484.77
Phoma betae CBS 109410
Cochliobolus sativus DAOM 226212
Aquilomyces patris (CBS 135662)
Lentithecium aquaticum CBS 123099
Morosphaeria ramunculicola BCC 18405
Neophaeosphaeria filamentosa CBS 102202
Phoma herbarum CBS 276.37
Lentithecium lineare voucher IFRD 2008
Leptosphaeria calvescens strain CBS 193.87
Dothidotthia aspera strain CPC 12933
Keissleriella cladophila strain CBS 104.55b
Helicascus nypae strain BCC 36752
Phaeosphaeria caricis CBS 120249
Phoma glomerata CBS 528.66
Didymella exigua CBS 183.55
Trematosphaeria pertusa CBS 122371
Ascochyta pisi CBS 126.54
Massarina igniaria CBS 845.96
Melanomma rhododendri ANM 73
Corynespora olivacea CBS 114450
Leptosphaeria biglobosa CBS 303.51
Phaeosphaeria eustoma CBS 573.86
Massarina cisti strain CBS 266.62
Melanomma pulvis-pyrius SMH 3291
Pleospora herbarum CBS 191.86
Arthopyrenia salicis 1994 Coppins
Stagonospora macropycnidia CBS 114202
Loratospora aestuarii JK 5535B
Phoma complanata CBS 268.92
Aquilomyces patris (CBS 135661)
Pyrenophora triticirepentis OSC 100066
Roussoella hysterioides CBS 125434
Phoma heteromorphospora CBS 115.96
Periconia macrospinosa (CBS 135663)
Phoma exigua CBS 431.74
Pithomyces valparadisiacus culture collection CBS 113339
Julella avicenniae BCC 20173
Phaeodothis winteri CBS 182.58
Chaetosphaeronema hispidulum CBS 216.75
Aquilomyces patris (CBS 135760)
Melanomma pulvis-pyrius strain CBS 124080
Paraconiothyrium minitans CBS 122788
Tingoldiago graminicola strain KH 68
Cucurbitaria berberidis strain CBS 394.84
Pleomassaria siparia CBS 279 74
Pleospora ambigua CBS 113979
Roussoellopsis sp. MAFF 239638
Saccothecium sepincola CBS 278.32
Darksidea beta (CBS 135637)
Pleurophoma pleurospora CBS 130329
Tingoldiago graminicola strain KH 155
Massarina eburnea CBS 473.64
Roussoella pustulans MAFF 239637
Setomelanomma holmii CBS 110217
Asteromassaria pulchra CBS 124082
Phaeosphaeria avenaria DAOM 226215
Phaeosphaeria brevispora MAFF 239276
Darksidea zeta (CBS 135640)
Tingoldiago graminicola strain KH 891
Phaeosphaeria luctuosa CBS 308.79
Lentithecium arundinaceum CBS 619.86
Didymocrea sadasivanii CBS 438.65
Darksidea epsilon (CBS135658)
Flavomyces fulophazii (CBS 135761)
Phoma zeae-maydis CBS 588 69
Karstenula rhodostoma CBS 690.94
Darksidea alpha (CBS 135650)
Dothidotthia symphoricarpi strain CPC 12929
Phaeosphaeria brevispora NBRC 106240
Lentithecium arundinaceum strain CBS 123131
Trematosphaeria pertusa strain CBS 122368
Flavomyces fulophazii (CBS 135664)
Pyrenochaeta nobilis CBS 407.76
Byssothecium circinans CBS 675.92
Phaeosphaeria elongata strain CBS 120250
Julella avicenniae BCC 18422
Helicascus nypae strain BCC 36751
Kalmusia scabrispora MAFF 239517
Letendraea helminthicola CBS 884.85
Phoma bryoniae CBS 133.96
Wettsteinina lacustris CBS 618.86
Setosphaeria monoceras AY016368
Letendraea padouk CBS 485.70
Cochliobolus heterostrophus CBS 134.39
Morosphaeria velataspora isolate BCC 17058
Montagnula opulenta CBS 168.34
Kalmusia scabrispora NBRC 106237
Monascostroma innumerosum CBS 345.50
Alternaria alternata CBS 916.96
Ophiosphaerella herpotricha CBS 620.86
Leptosphearia maculans DAOM 229267
Lentithecium fluviatile CBS 122367
Ophiosphaerella sasicola MAFF 239644
Keissleriella rara CBS 118429
Camarosporium quaternatum CBS 483.95
Neottiosporina paspali CBS 331.37
Roussoella hysterioides MAFF 239636
Noosia banksiae culture collection CPC 17282
Leptosphaerulina argentinensis CBS 569.94
Splanchonema platani CBS 221.37
Melanomma pulvis-pyrius CBS 371 75
Leptosphaeria dryadis CBS 643.86
Katumotoa bambusicola MAFF 239641
Bimuria novaezelandiae CBS 107.79
Entodesmium rude CBS 650.86
Falciformispora lignatilis BCC 21117
Arthopyrenia salicis CBS 368 94
Pyrenochaeta unguishominis strain CBS 378.92
Phaeosphaeriopsis musae CBS 120026
Leptosphaeria doliolum CBS 505.75
Keissleriella cladophila CBS 104.55a
Monotosporella tuberculata CBS 256 84
Phaeosphaeria ammophilae CBS 114595
Morosphaeria ramunculicola strain JK 5304B
94
-
100
100
100
99
100
100
100
100
100
100
91
95/ -
100
99
98
-
100
100
100
100
100
93
100
82
100
89
100
100
99/ -
96/ -
94
-
100
100
96/ -
100
-
99
-
97/ -
100
98
-
97
-
100
99
100
100
100
100
99
92
100
100
100
100
94/ -
99
97
100
100
100
98
100
100
99
-
100
82
100
75
100
95
96
-
100
94
98
-
93/ -
99/100
94
82
99
72
100
87
100
73
100
100
100
94
97
-
100
99
100
100
100
100
100
100
91
-
100
99
100
100
100
97
100
100
100/83 98
84
99
77
95/86
2/3//
Falciformispora lignatilis BCC 21118
Halomassarina thalassiae JK 5262DHalomassarina thalassiae isolate BCC 17055
2/3//
Pleosporineae
Massarineae
Didymellaceae
Leptosphaeriaceae
Phaeosphaeriaceae
Cucurbitariaceae
Pleosporaceae
Dothidotthiaceae
Trematosphaeriaceae
Montagnulaceae
Lentitheciaceae
Morosphaeriaceae
Flavomyces
Massarinaceae
Melanommataceae /
Pleomassariaceae
Julellaceae
Massariaceae?
-
70
-
80
-
87
-
71
-
70
- /75
-
92
- /80
-
96
- /97
Aquilomyces
Darksidea
13. ábra A három sötét szeptált endofioton nemzetség (pirossal jelölve), a Darksidea, az Aquilomyces, a
Flavomyces és Dothydeomycetes osztály reprezentatív szekvenciái alapján készült filogenetikai fa.
Részletek a következő oldalon.
59
0.2
Lindgomyces breviappendiculata HHUF 28193Lindgomyces ingoldianus ATCC 200398
Dothiora cannabinae CBS 737.71
Lophiostoma caulium CBS 623.86
Zasmidium cellare CBS 146.36
Triplosphaeria maxima MAFF 239682
Phaeocryptopus gaeumannii CBS 267.37
Gloniopsis praelonga CBS 112415
Psiloglonium clavisporum CBS 123338
Stylodothis puccinioides CBS 193.58
Lophiostoma crenatum CBS 629.86
Teratosphaeria suberosa CPC 11032
Pseudotetraploa curviappendiculata KT 2558
Westerdykella cylindrica CBS 454.72
Preussia funiculata CBS 659.74
Teratosphaeria associata CBS 112224
Aigialus grandis 2Q
Mycosphaerella marksii CBS 110942
Mytilinidion tortile EB 0377
Hysterium angustatum CBS 123334
Lophiostoma compressum IFRD 2014
Mytilinidion andinense CBS 123562
Dothistroma septosporum CBS 112498
Diplodia mutila CBS 431.82
Westerdykella angulata CBS 610.74
Lindgomyces rotundatus HHUF 27999
Spencermartinsia viticola CBS 117009
Teratosphaeria cryptica CBS 110975
Dothidea sambuci DAOM 231303
Lophiostoma alpigenum GKM 1091b
Mycosphaerella punctiformis CBS 113265
Opegrapha dolomitica DUKE 0047528
Mycosphaerella endophytica CBS 114662
Dothidea insculpta CBS 189.58
Lophium mytilinum CBS 269.34
Phaeocryptopus nudus CBS 268.37
Ramichloridium cerophilum CBS 103.59
Saccharata proteae CBS 115206
Hysterobrevium mori GKM 1013
Mytilinidion acicola EB 0349
Massariosphaeria grandispora CBS 613.86
Oedohysterium insidens CBS 238.34
Tetraplosphaeria nagasakiensis KT 1682
Dothidea hippophaes CBS 188.58
Aigialus rhizophorae strain BCC 33573
Botryosphaeria dothidea CBS 115476
Friedmanniomyces simplex CBS 116775
Preussia terricola DAOM 230091
Pseudocercospora vitis CPC 11595
Gloniopsis subrugosa CBS 123346
Delphinella strobiligena CBS 735.71
Verrucisporota daviesiae CBS 116002
Rimora mangrovei JK 5246A
Batcheloromyces proteae CBS 110696
Otthia spiraeae CBS 114124
Cercospora beticola CBS 116456
Mytilinidion scolecosporum CBS 305.34
Macrophomina phaseolina CBS 227 33
Psiloglonium araucanum CBS 112412
Teratosphaeria stellenboschiana CBS 116428
Westerdykella ornata CBS 379.55
Lophium elegans EB 0366
Mycosphaerella heimii CBS 110682
Guignardia citricarpa CBS 102374
Mytilinidion mytilinellum CBS 303.34
Lophiostoma arundinis CBS 621.86
Mytilinidion californicum EB 0385
Oedohysterium sinense CBS 123345
Aureobasidium pullulans CBS 584.75
Pseudotetraploa curviappendiculata MAFF 239495
Lophiostoma scabridisporum strain BCC 22835
Mytilinidion resinicola CBS 304.34
Massaria anomia CBS 591.78
Aigialus grandis JK 5244A
Preussia lignicola CBS 264.69
Hysterium barrianum ANM 1495
Catenulostroma elginense CBS 111030
Macrovalsaria megalospora 178149
Aulographina pinorum CBS 174.90
Sydowia polyspora CBS 116.29
Kabatiella caulivora CBS 242.64
Aigialus parvus A6
Hysterobrevium smilacis CBS 114601
Gloniopsis arciformis GKM L166ARhytidhysteron rufulum CBS 306.38
Bagnisiella examinans CBS 551.66
Sporormiella minima CBS 524.50
Schismatomma decolorans DUKE 0047570
Neofusicoccum ribis CBS 115475
Teratosphaeria fibrillosa CBS 121707
Mycosphaerella graminicola CBS 115943
Catenulostroma abietis CBS 459.93
Botryosphaeria tsugae CBS 418.64
Dothiora ellyptica CBS 736.71
Columnosphaeria fagi CBS 171.93
Kirschsteiniothelia maritima CBS 221.60
97
76
100
87
91
-
98
-
94
-
100
90
98/86
100
100
100
99
100
100
100
85
100
100
99
73
100
100
100
76
100
-
100
100
100
98
100/9897/75
100
99
100
83
99
70
100
97
100
99 100
90
100
97
100
98
90
-
100
79
100
100
100
100
100
98
100
75
100
100
100
-
100
76
100
100
100
-
100
93
100
100
100
92
100
100
99
80
100
100
100
91
99
-
100
100
100/ -
100
93
100
100
100
96
100
98
100
99
99
-
100
98
100
95
100
100
100
100
96
-
100
100
100
100
100
98
100
86
100
100
100
100
100
100
98
-
100
77
1/2//
Pleosporales Lindgomycetaceae
Sporomiaceae
Lophiostomataceae
Tetraplosphaeriaceae
Mycosphaerellaceae
Botryosphaeriales
Hysteriales
Aigialaceae
Dothideales
Teratosphaeriales
Mytilinidiales
-
74
13. ábra folytatása A három sötét szeptált endofioton nemzetség (pirossal jelölve), a Darksidea, az Aquilomyces,
a Flavomyces és a Dothydeomycetes osztály reprezentatív szekvenciái a Bayes analízis alapján készült
filogenetikai fán (50%-os többségi-szabály konszenzus), mely három lókusz (LSU, SSU, TEF) kombinált
adatsora bayes elemzésével készült. Az ágak fölött a Bayes analízis során kapott, posterior valószínűségi értékek
százalékként szerepelnek (≥90), míg az ágak alatt a 70%-nál nagyobb RAxML bootstrap értékek találhatók. A
színezett háttér a családot vagy a rendet jelzi ahova a törzsek besorolhatók. A külcsoport a Schismatomma
decolorans (DUKE 0047570) volt. Knapp és mtsai (2015) által publikált ábra. A mérce 100 karakteren 2
változásnak megfelelő ághosszat jelöl.
60
14. ábra A Lentitheciaceae családba tartozó fajok és a Darksidea nemzetség reprezentatív szekvenciái
(vastagítva) a Bayes analízis alapján készült filogenetikai fán (50%-os többségi-szabály konszenzus), mely három
lókusz (LSU, SSU, TEF) kombinált adatsora bayes elemzésével készült. Az ágak fölött a Bayes analízis során
kapott, posterior valószínűségi értékek százalékként szerepelnek (≥90), míg az ágak alatt a 70%-nál nagyobb
RAxML bootstrap értékek találhatók. A külcsoport a Massarina eburnea (CBS 47364) volt. Knapp és mtsai
(2015) által publikált ábra. A mérce 100 karakteren 2 változásnak megfelelő ághosszat jelöl.
Darksidea alpha (CBS 135660)
Darksidea alpha (CBS 135628)
Darksidea alpha (CBS 135650)
Darksidea alpha(CBS 135652)
Darksidea alpha (CBS 135631)
Darksidea gamma (CBS 135634)
Darksidea beta (CBS 135637)
Darksidea delta (CBS 135638)
Darksidea epsilon (CBS 135658)
Darksidea zeta (CBS 135640)
Tingoldiago graminicola strain KH 155
Tingoldiago graminicola strain KH 68
Tingoldiago graminicola strain KH 891
Lentithecium aquaticum CBS 123099
Pleurophoma pleurospora CBS 116668
Lentithecium lineare voucher IFRD
Keissleriella rara CBS 118429
Pleurophoma pleurospora CBS 130329
Keissleriella genistae strain CBS 113798
Keissleriella cladophila strain CBS 104.55b
Keissleriella cladophila CBS 104.55a
Lentithecium fluviatile CBS 122367
Lentithecium fluviatile strain CBS 123090
undescribed CBS strain 193.87
Ophiosphaerella sasicola MAFF 239644
Katumotoa bambusicola MAFF 239641
Stagonospora macropycnidia CBS 114202
Lentithecium arundinaceum strain CBS 123131
Lentithecium arundinaceum CBS 619.86
Wettsteinina lacustris CBS 618.86
Neottiosporina paspali CBS 331.37
Massarina eburnea CBS 473.64
100
77
100
100
84
76
100
100
100/9991/ -
99/72
99/71
100
100
100
100
96
95
98
-
99
98100
97
94/86
100
89
100
100
0.2
Darksidea
61
DSE7/30 (CBS 135656)
DSE7/28 (CBS 135654)
DSE7/29 (CBS 135655)
DSE7/33 (CBS 135659)
DSE7/34 (CBS 135660)
DSE7/5 (CBS 135631)
DSE7/6 (CBS 135632)
DSE7/16 (CBS 135642)
DSE7/17 (CBS 135643)
DSE7/19 (CBS 135645)
DSE7/18 (CBS 135644)
DSE7/22 (CBS 135648)
DSE7/23 (CBS 135649)
DSE7/24 (CBS 135650)
DSE7/27 (CBS 135653)
DSE7/26 (CBS 135652)
DSE7/25 (CBS 135651)
DSE7/20 (CBS 135646)
DSE7/4 (CBS 135630)
DSE7/1 (CBS 135627)
DSE7/2 (CBS 135628)
DSE7/15 (CBS 135641)
DSE7/21 (CBS 135647)
DSE7/3 (CBS 135629)
DSE7/12 (CBS 135638)
DSE7/13 (CBS 135639)
DSE7/32 (CBS 135658)
DSE7/14 (CBS 135640)
DSE4/100 (CBS 135760)
96/ -
- /70
98/ -
100
100
100/98
100/99
100/100
100/86
98/100
98
84
99
99
99/78
100
99
98
96
0.02
1/2
96/74
100
99
100
100
DSE7/10 (CBS 135636)
DSE7/11 (CBS 135637)
DSE7/31 (CBS 135657)
DSE7/7 (CBS 135633)
DSE7/8 (CBS 135634)
D. alpha
D. gamma
D. zeta
D. epsilon
D. delta
D. beta
- /77
15. ábra A hat Darksidea faj izolátumainak szekvenciái a Bayes analízis alapján készült filogenetikai
fán (50%-os többségi-szabály konszenzus), mely öt lókusz (ITS ACT, TUB, TEF, CAL) kombinált
adatsora Bayes elemzésével készült. Az ágak fölött a Bayes analízis során kapott, posterior
valószínűségi értékek százalékként szerepelnek (≥90), míg az ágak alatt a 70%-nál nagyobb RAxML
bootstrap értékek találhatók. A külcsoport az Aquilomyces patris (CBS 135760) volt. Knapp és mtsai
(2015) által publikált ábra. A mérce 100 bázispárra jutó 2 változásnak megfelelő ághosszat jelöl.
62
5.7.3 A három új nemzetség és az új fajok taxonómiai leírása
Ebben a fejezetben a DSE-4 és DSE-8A csoportok izolátumai (16. ábra) által reprezentált
két monospecifikus nemzetség, valamint a DSE-7 csoport által alkotott nemzetség és ebbe
tartozó hat faj (16. ábra) leírását mutatjuk be. A taxonok hivatalos leírását Knapp és mtsai
(2015) közölték és jelen dolgozatban a taxonok diagnózisát nem fordítottuk le, ez eredeti
(angol) nyelven szerepel.
Aquilomyces patris D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, gen. & spec. nov.
MycoBank MB810756 (nemzetség); MB810757 (faj);
Angol diagnózis. Aquilomyces patris differs from its closest phylogenetic neighbour, Morosphaeria
ramunculicola (BCC 18405) by unique fixed alleles in the LSU and SSU loci based on alignments of the
separate loci deposited in TreeBASE as study S16626: LSU positions: 129 (T), 139 (A), 145 (C), 232 (T), 335
(C), 349 (C), 355 (A), 357 (T), 369 (A), 382 (T), 422 (G), 478 (G), 550 (T), 661 (C), 662 (T), 669 (T); SSU
positions: 24 (C), 70 (T), 71 (C), 72 (C), 79 (C), 80 (T), 295 (G), 1002 (C), 1094 (C), 1123 (C).
Telep morfológia. A telepek 24°C-on 4 hét alatt borítják be a Petri-csészét mindkét
táptalajon. MMN táptalajon a telepek bolyhosak, sötétbarnás-szürkéstől a sötétbarnáig
füstszürkések, élesen elhatárolható marginális zónával. MEA táptalajon a telepek kevésbé
bolyhosak, sötétbarnás-szürkéstől a sötétbarnáig változhatnak, füstszürke marginális
zónával.
Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Populus alba gyökér,
Július 2005, G.M. Kovács & A. Pintye (holotípus: CBS 135661 törzs metabolikusan inaktív
állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22895 = CBS 135661 = DSE-4/099 = REF099); (CPC
22896 = CBS 135760 = DSE-4/100 = REF100); (CPC 22897 = CBS 135662 = DSE-4/101 =
REF101).
Etimológia: Az erősen pigmentált hifáknak és a telepnek megfelelően (aquilus = sötét
színű), és Knapp G. Dániel édesapjának emlékére és tiszteletére (patris = apa).
Megjegyzések. Az Aquilomyces patris izolátumai fehérnyár (Populus alba) gyökeréből
származnak a fülőpházi homokpusztagyepről.
Flavomyces fulophazii D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, gen. & spec. nov.
MycoBank MB810758 (nemzetség); MB810759 (faj);
Angol diagnózis. Flavomyces fulophazii is a fungal root endophyte. Flavomyces fulophazii (CBS 135761)
differs from its closest phylogenetic neighbour, Massarina igniaria (CBS 84596) by unique fixed alleles in
the LSU and SSU loci based on alignments of the separate loci deposited in TreeBASE as study S16626: LSU
positions: 38 (C), 48 (A), 65 (T), 74 (C), 78 (G), 84 (C), 146 (deletion), 147 (T), 174 (C), 435 (C), 456–481
(insertion), 490 (C), 624 (G), 630 (C), 658–672 (insertion), 860 (C), 862 (G), 864 (A); SSU positions: 22 (C),
63
26 (G), 34 (G), 39 (G), 71 (T), 294 (C), 408–834 (insertion), 890 (A), 971 (G), 1011 (C), 1028 (A), 1050 (G),
1081(A), 1082 (T), 1083 (A), 1084 (G), 1090 (G).
Telep morfológia. A telepek 24°C-on 4 hét alatt borítják be a Petri-csészét mindkét
táptalajon. MMN esetén a telepek táptalajba süllyedtek, fehéres-sárgástól sötét-sárgáig
változhatnak és diffúz élénksárga pigmentet választanak ki a táptalajba, mely tulajdonság
eltűnhet egy idő után. MEA táptalajon a telepek táptalajba süllyedtek, fehérek és kissé
bolyhosak.
Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Festuca vaginata
gyökér, Július 2012, E. Zajta & D.G. Knapp (holotípus: CBS 135761 törzs metabolikusan
inaktív állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22900 = CBS 135761 = DSE-8/S); Fülöpháza, N
46°52’E 19°25’, Festuca vaginata gyökér, Július 2005, G.M. Kovács & A. Pintye (CPC
22899 = CBS 135644 = DSE-8/143 = REF143).
Etimológia. A táptalajt jellegzetesen élénksárgára színező tulajdonságára (sárga = flavo) és
a gyűjtési helyre (Fülöpháza, Magyarország) utalva.
Megjegyzések. Az Flavomyces izolátumai mind magyar csenkesz (Festuca vaginata)
gyökeréből származnak a fülőpházi homokpusztagyepről.
Darksidea D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, gen. nov. MycoBank MB810760;
Angol diagnózis. Ascomata globose, brown; ostiole not seen; wall of 3–4 layers of brown textura
angularis, surface of textura epidermoidea. Pseudoparaphyses intermingled among asci, hyaline, septate,
hyphal, anastomosing. Asci bitunicate, clavate to ellipsoid, with weakly developed apical chamber, stipitate,
4–6-spored. Ascospores multiseriate in asci, hyaline, guttulate, aseptate, thick-walled, ellipsoid. The genus
Darksidea contains root endophytic fungi associated almost exclusively with grasses in arid and semiarid
areas. Darksidea isolates can be collected from surface-sterilised roots and can be cultured and maintained on
general media. Using the primer pairs DSE7F / DSE7R (this study), an approximately 300-bp-long partial ITS
region of fungi belonging to the genus Darksidea can be amplified by PCR.
Típus faj. Darksidea alpha D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, sp. nov.
Megjegyzések. Darksidea fajok telep morfológiája rendkívül változatos. A forma, a
növekedési jellemzők, a szín, exudátumok és diffúz pigmentek megléte változhat egy faj
izolátumai között (16. ábra). A telepek általában sterilek. Az izolátumok Festuca vaginata,
Stipa borysthenica, Bromus tectorum, Fumana procumbens és Ailanthus altissima
felszínsterilizált gyökeiről lettek gyűjtve. Nem tenyésztett Darksidea fajok szekvenciái
Stipa hymenoides (Hawkes és mtsai 2006), Bouteloua gracilis (pl. Green és mtsai 2008),
Sporobolus cryptandrus (pl. Herrera és mtsai 2011a), Stipa grandis (Su és mtsai 2010) és
Ammophila arenaria (Sánchez-Márquez és mtsai 2008) földalatti szöveteiből valamint
félszáraz füves területek talajából (pl. Porras-Alfaro és mtsai 2011) is előkerültek.
64
Darksidea fajok szekvenciái legalább 3 kontinens félszáraz területeinek domináns fűféléiből
előkerültek (Porras-Alfaro és mtsai 2008, Su és mtsai 2010).
Etimológia. A „sötét oldal” nyomán, ami a pigmentált hifákkal rendelkező sötét szeptált
endofitonokra és ezek kevéssé ismert tulajdonságaira utal.
Darksidea alpha D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, sp. nov. MycoBank
MB810761;
Angol diagnózis Ascomata globose, brown, up to 180 µm diam; ostiole not seen; wall of 3–4 layers of
textura angularis, 5–10 µm diam, surface of textura epidermoidea. Pseudoparaphyses intermingled among
asci, hyaline, septate, hyphal, anastomosing, 2–3 µm diam. Asci bitunicate, clavate, with weakly developed
apical chamber, stipitate, 60–80 40–45 µm, 4–6-spored. Ascospores multiseriate in asci, hyaline, guttulate,
aseptate, thick-walled, ellipsoid, 18–30 12–17 µm. Darksidea alpha is a fungal root endophyte. Darksidea
alpha (CBS 135650) differs from Tingoldiago graminicola (KH 68) by unique fixed alleles in the LSU and
SSU loci based on alignments of the separate loci deposited in TreeBASE as study S16626: LSU positions: 30
(A); SSU positions: 442 (C), 467 (C), 555 (C), 649 (C), 675 (C), 742 (G), 743 (A), 815 (T), 816 (T).
Telep morfológia. MMN és MEA táptalajon a telepek lehetnek fehéres sárgásak (pl. CBS
135645 és CBS 135646), sötét-szürkék (pl. CBS 135630 és CBS 135643) vagy
halványbarnák (pl. CBS 135653). A telepek lehetnek lassú (pl. CBS 135631 és CBS
135632 nem érték el a Petri-csésze szélét 12 hét alatt 24°C-on) vagy gyors növekedésűek
(pl. CBS 135627 és CBS 135628 két hét alatt benőtte a Petri-csészét 24°C-on), laposak egy
határozott telepszegélyel és kevés légmicéliummal (pl. CBS 135643 és CBS 135650), vagy
bolyhosak, táptalajba süllyedt marginális zónával (pl. CBS 135655). A telepek többsége
festi a táptalajt halványsárga színtől a narancs-barnán át a mélyvörösig (pl. CBS 135631,
CBS 135643, CBS 135647 és CBS 135650). Két törzs vöröses kristályokat választott ki a
táptalajba (CBS 135631 és CBS 135632), míg mások exudátumokat a telepen (pl. CBS
135654 és CBS 135655).
Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Festuca vaginata
gyökér, Július 2012, D.G. Knapp & E. Zajta (holotípus: CBS 135650 törzs metabolikusan
inaktív állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22884 = CBS 135650 = DSE-7/24); (CPC
22862 = CBS 135628 = DSE-7/2); (CPC 22882 = CBS 135648 = DSE-7/22); (CPC 22883
= CBS 135649 = DSE-7/23); (CPC 22885 = CBS 135651 = DSE-7/25); (CPC 22886 =
CBS 135652 = DSE-7/26); (CPC 22887 = CBS 135653 = DSE-7/27); (CPC 22888 = CBS
135654 = DSE-7/28); (CPC 22889 = CBS 135655 = DSE-7/29); (CPC 22890 = CBS
135656 = DSE-7/30); September 2010, D.G. Knapp (CPC 22865 = CBS 135631 = DSE-
7/5); (CPC 22866 = CBS 135632 = DSE-7/6); Július 2005, G.M. Kovács & A. Pintye (CPC
22876 = CBS 135642 = DSE-7/16 = REF133); (CPC 22878 = CBS 135644 = DSE-7/18 =
65
REF136); (CPC 22880 = CBS 135646 = DSE-7/20 = REF138); (CPC 22881 = CBS
135647 = DSE-7/21 = REF139); Stipa borysthenica gyökér, Július 2012, D.G.Knapp & E.
Zajta (CPC 22864 = CBS 135630 = DSE-7/4); Május 2005, G.M. Kovács & A. Pintye
(CPC 22877 = CBS 135643 = DSE-7/17 = REF135); (CPC 22879 = CBS 135645 = DSE-
7/19 = REF137); Július 2012, D.G.Knapp & E. Zajta (CPC 22893 = CBS 135659 = DSE-
7/33); (CPC 22894 = CBS 135660 = DSE-7/34); Bromus tectorum gyökér, Június 2012,
(CPC 22861 = CBS 135627 = DSE-7/1); Tatárszentgyörgy, N 47°03.5' E 19°24.3',
Ailanthus altissima gyökér, Július 2008, D.G. Knapp (CPC 22875 = CBS 135641 = DSE-
7/15 = REF132).
Etimológia. A görög ábécé egymást követő betűinek megfelelően.
Megjegyzések. Termőtestet több törzsénél figyeltük meg szobahőmérsékleten inkubált,
SNA táptalajra helyezett klávozott csalán szár darabokra oltott tenyészeteknél 3-4 héttel az
inokulálást követően.
Darksidea beta D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, sp. nov. MycoBank
MB810762;
Angol diagnózis. Ascomata globose, brown, up to 250 µm diam; ostiole not seen; wall of 3–4 layers of
textura angularis, 5–10 µm diam, surface of textura epidermoidea. Pseudoparaphyses intermingled among
asci, hyaline, septate, hyphal, anastomosing, 4–5 µm diam. Asci bitunicate, ellipsoid, with weakly developed
apical chamber, stipitate, 50–90 35–50 µm, 4–6-spored. Ascospores multiseriate in asci, hyaline, guttulate,
aseptate, thick-walled, ellipsoid, 23–30 14–19 µm. Darksidea beta is a fungal root endophyte. Darksidea
beta (CBS 135637) differs from D. alpha (CBS 135650) by unique fixed alleles in the ITS, ACT and TEF loci
based on alignments of the separate loci deposited in TreeBASE as study S16626: ITS positions: 102 (T), 263
(T), 607 (A), 614 (deletion); ACT positions: 292 (T), 400 (C), 553 (T); TEF positions: 201 (T), 414 (A).
Telep morfológia. A telepek 24°C-on 4 hét alatt borítják be a Petri-csészét mindkét
táptalajon. MMN esetében a telepek hamuszürkéstől halvány barna színig változhatnak
világosbarna besüllyedt marginális zónával, és gyér légmicéliummmal. MEA táptalajon
hamuszürkéstől zöldes-szürke színig változhatnak a telepek, világosbarna besüllyedt
marginális zónával és exudátumokkal.
Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Festuca vaginata
gyökér, Július 2005, G.M. Kovács & A. Pintye (holotípus: CBS 135637 törzs metabolikusan
inaktív állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22871 = CBS 135637 = DSE-7/11 = REF128);
(CPC 22870 = CBS 135636 = DSE-7/10 = REF127); Július 2012, D.G. Knapp & E. Zajta
(CPC 22891 = CBS 135657 = DSE-7/31).
Etimológia. A görög ábécé egymást követő betűinek megfelelően.
66
Megjegyzések. Termőtestetet figyeltük meg a CBS 135637 törzs esetében
szobahőmérsékleten inkubált, SNA táptalajra helyezett klávozott csalán szár darabokra
oltott tenyészeteknél 3-4 héttel az inokulálást követően.
Darksidea gamma D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, sp. nov. MycoBank
MB810763;
Angol diagnózis. Forming sterile, erumpent, subglobose, brown pycnidial-like sporocarps with a central
ostiole. Ascomata globose, brown, up to 200 µm diam; ostiole not seen; wall of 3–4 layers of textura
angularis, 5–10 µm diam, surface of textura epidermoidea. Pseudoparaphyses intermingled among asci,
hyaline, septate, hyphal, anastomosing, 2–3 µm diam. Asci bitunicate, clavate, with weakly developed apical
chamber, stipitate, 60–80 20–30 µm, 4–6-spored. Ascospores multiseriate in asci, hyaline, granular to
guttulate, aseptate, thick-walled, ellipsoid, 14–25 9–14 µm. Darksidea gamma is a fungal root endophyte.
Darksidea gamma (CBS 135634) differs from D. alpha (CBS 135650) by unique fixed alleles in the ITS,
ACT and TEF loci based on alignments of the separate loci deposited in TreeBASE as study S16626: ITS
positions: 104 (T), 224 (T), 498 (T), 595 (G), 601 (deletion); ACT positions: 72 (G), 134 (T), 140 (T), 161
(deletion), 164 (C), 616 (T); TEF positions: 8 (C), 113 (A), 150 (T), 619 (T), 688 (T).
Telep morfológia. A telepek mindkét táptalajon 24°C-on 2-3 hét alatt borítják be a Petri-
csészét. MMN táptalajon hamuszürkéstől zöldes-szürkéig változhatnak a telepek,
világosbarna besüllyedt marginális zónával és gyér légmicéliummal. MEA táptalajon
hamuszürkéstől zöldes-szürke színig változhatnak a telepek, jelentős mennyiségű
légmicéliummal és koncentrikusan megjelenő exudátum cseppekkel.
Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Festuca vaginata
gyökér, Július 2005, G.M. Kovács & A. Pintye (holotípus: CBS 135634 törzs metabolikusan
inaktív állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22868 = CBS 135634 = DSE-7/8 = REF124);
CPC 22867 = CBS 135633 = DSE-7/7 = REF123); CPC 22869 = CBS 135635 = DSE-7/9 =
REF125.
Etimológia. A görög ábécé egymást követő betűinek megfelelően.
Megjegyzések. Termőtesteket figyeltük meg a CBS 135634 törzs esetében
szobahőmérsékleten inkubált, SNA táptalajra helyezett klávozott csalán szár darabokra
oltott tenyészeteknél 3-4 héttel az inokulálást követően.
Darksidea delta D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, sp. nov. MycoBank
MB810764;
Angol diagnózis. Darksidea delta is a fungal root endophyte. Darksidea delta (CBS 135638) differs from
D. alpha (CBS 135650) by unique fixed alleles in the ITS, ACT, TEF, and CAL loci based on alignments of
the separate loci deposited in TreeBASE as study S16626: ITS positions: 238 (T), 281 (A), 465 (C); ACT
positions: 200 (T), 337 (C), 547 (T); TEF positions: 38 (C), 39 (G), 40 (A), 230 (T), 404 (T); CAL positions:
142 (A), 256 (T), 633 (T).
67
Telep morfológia. A telepek MMN táptalajon 24°C-on 3-5 hét alatt borítják be a Petri-
csészét. MMN táptalajon hamuszürkéstől halvány-barna színig változhatnak a telepek,
jelentős mennyiségű légmicéliummal és koncentrikusan megjelenő exudátum cseppekkel.
A telepek MEA táptalajon 24°C-on 6 hét alatt borítják be a Petri-csészét. Itt hamuszürkéstől
kezdve a sárgáson át fehér színig változhatnak a telepek, éles marginális zónával, gyér
légmicéliummal és néha exudátum cseppekkel.
Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Festuca vaginata
gyökér, Július 2005, G.M. Kovács & A. Pintye (holotípus: CBS 135638 törzs metabolikusan
inaktív állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22872 = CBS 135638 = DSE-7/12 = REF129);
Június 2012, D.G. Knapp & E. Zajta (CPC 22863 = CBS 135629 = DSE-7/3); Fumana
procumbens gyökér, Június 2008, D.G. Knapp (CPC 22873 = CBS 135639 = DSE-7/13 =
REF130).
Etimológia. A görög ábécé egymást követő betűinek megfelelően.
Megjegyzések. Termőtestet figyeltük meg a CBS 135629 törzs esetében
szobahőmérsékleten inkubált, SNA táptalajra helyezett klávozott csalán szár darabokra
oltott tenyészeteknél 3-4 héttel az inokulálást követően, bár ezek sterilek voltak
Darksidea epsilon D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, sp. nov. MycoBank
MB810765;
Angol diagnózis. Darksidea epsilon is a fungal root endophyte. Darksidea epsilon (CBS 135658) differs
from D. alpha (CBS 135650) by unique fixed alleles in the ITS, ACT, TUB and CAL loci based on
alignments of the separate loci deposited in TreeBASE as study S16626: ITS positions: 86 (T), 289 (T); ACT
positions: 108 (A), 189 (T), 322 (T), 406 (G); TUB positions: 37 (T), 402 (G); CAL positions: 56 (deletion),
57 (deletion), 461 (A), 579 (T).
Telep morfológia. A telepek MMN táptalajon 24°C-on 3 hét alatt borítják be a Petri-
csészét. MMN táptalajon zöldes-szürkéstől barnáig változhatnak a telepek, jelentős
mennyiségű légmicéliummal, halvány barna marginális zónával és exudátum cseppekkel a
telep közepénél. A telepek MEA táptalajon 24°C-on 6 hét alatt borítják be a Petri-csészét.
Itt sárgás-fehérek a telepek, gyér légmicéliummal és exudátum cseppekkel a telep
közepénél.
Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Stipa borysthenica
gyökér, Július 2012, E. Zajta & D.G. Knapp (holotípus: CBS 135658 törzs metabolikusan
inaktív állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22892 = CBS 135658 = DSE-7/32).
Etimológia. A görög ábécé egymást követő betűinek megfelelően.
68
Megjegyzések. A CBS 135658 törzs steril maradt.
Darksidea zeta D.G. Knapp, Kovács, Groenewald & Crous, sp. nov. — MycoBank
MB810766;
Angol diagnózis. Ascomata globose, brown, erumpent, up to 200 µm diam; ostiole not seen; wall of 3–4
layers of textura angularis, 5–10 µm diam, surface of textura epidermoidea. Pseudoparaphyses intermingled
among asci, hyaline, septate, hyphal, anastomosing, 2–3 µm diam. Asci bitunicate, ellipsoid, with weakly
developed apical chamber, stipitate, 60–80 40–50 µm, 4–6-spored. Ascospores multiseriate in asci, hyaline,
guttulate, aseptate, thick-walled, ellipsoid, 19–30 12–15 µm. Darksidea zeta is a fungal root endophyte.
Darksidea zeta (CBS 135640) differs from D. alpha (CBS 135650) by unique fixed alleles in the ITS, ACT,
TUB, TEF, and CAL loci based on alignments of the separate loci deposited in TreeBASE as study S16626:
ITS positions: 173 (G), 220 (C), 246 (deletion), 256 (T), 604 (A); ACT positions: 42 (T), 94 (C), 156 (C), 161
(C), 166–168 (deletion), 173 (T), 183 (G), 185 (T), 186 (C), 250 (T), 253 (A), 525 (T), 577 (T); TUB
positions: 63 (T), 81 (T), 246 (C), 276 (T), 282 (T); TEF positions: 10 (C), 153 (G), 194 (T), 202 (G), 230
(G), 269 (C), 362 (T), 409 (G), 622 (T), 835 (T), 877 (C); CAL positions: 107 (T), 167 (G), 258 (G), 307 (C),
431 (G).
Telep morfológia. A telepek MMN táptalajon 24°C-on 4-5 hét alatt borítják be a Petri-
csészét. Itt a telepek barnás-szürkések gyér légmicéliummal, halvány barna besüllyedt
marginális zónával és exudátum cseppekkel a telep közepe felé. A telepek MEA táptalajon
24°C-on 2 hét alatt borítják be a Petri-csészét. Itt fehéres-füstszürkék a telepek, közepes
mennyiségű légmicéliummal és koncentrikusan megjelenő exudátum cseppekkel.
Felhasznált törzsek. MAGYARORSZÁG, Fülöpháza, N 46°52’ E 19°25’, Festuca vaginata
gyökér, Július 2005, G.M. Kovács & A. Pintye (holotípus: CBS 135640 törzs metabolikusan
inaktív állaptban tartva, törzs ex-típus CPC 22874 = CBS 135640 = DSE-7/14 = REF131).
Etimológia. A görög ábécé egymást követő betűinek megfelelően
Megjegyzések. Termőtesteket figyeltük meg a CBS 135640 törzs esetében
szobahőmérsékleten inkubált, SNA táptalajra helyezett klávozott csalán szár darabokra
oltott tenyészeteknél 3-4 héttel az inokulálást követően.
69
16. ábra A három új nemzetség és a P. macrospinosa izolátumai MMN táptalajon. a–w: Darksidea alpha;
x–ac: Darksidea beta; ad–ag: Darksidea gamma; ah: Darksidea delta; ai–ak: Aquilomyces patris; al–am:
Flavomyces fulophazii; an: Periconia macrospinosa. Knapp és mtsai (2015) által publikált ábra.
70
6. DISZKUSSZIÓ
6.1 Alföldi félszáraz területek DSE gombái
6.1.1 A terepi gyökerek kolonizációja
A duna-tisza közi homokgyepek, különösen a mintavételi területeinkre is jellemző
nyílt gyepek, néhol félsivatagi tulajdonságokkal rendelkező félszáraz terüleket
reprezentálnak (Fekete és mtsai 2002). Ezeken a területeken már végeztek
gyökérkolonizáló gombákra irányuló vizsgálatokat, például mikorrhizáltsági
státuszvizsgálatot, mely során jelentős mértékű DSE gomba kolonizációt írtak le a
növények gyökerében (Kovács és Szigetvári 2002). A világon több különböző száraz-
félszáraz területen végeztek vizsgálatokat gyökérasszociált gombák esetében (pl. Mandyam
és Jumpponen 2005, Herrera és mtsai 2010, Fracchia és mtsai 2011) és úgy tűnik ezeken a
területeken általánosan gyakori gyökérkolonizálók a DSE gombák.
A fülöpházi homokterületeken végzett mikorrhizáltsági státuszvizsgálat során
(Kovács és Szigetvári 2002) az általunk is vizsgált növényfajok közül a selyemkóró,
ürömlevelű parlagfű és a közönséges boróka esetében nem találtak, a közönséges napvirág,
naprózsa, apró lucerna és a bálványfa gyökerében megfigyeltek DSE struktúrákat. Egy
másik alföldi élőhelyen, a kunfehértói területeken végzett vizsgálat során szeptált endogén
hifákat figyeltek meg az ürömlevelű parlagfű gyökerében, azonban mikroszkleróciumot
nem találtak (Kovács és Bagi 2001).
A terepen gyűjtött gyökerek vizsgálatakor sok esetben figyeltünk meg DSE és AM
gombák általi együttes kolonizációt. Ez a megfigyelés összhangban van számos más
tanulmányban leírtakkal, miszerint a DSE gombák és más mikorrhizaképző gombák a
gyökeret egyidejűleg kolonizálhatják (pl. Jumpponen és Trappe 1998a, Kovács és
Szigetvári 2002, Postma és mtsai 2007).
A mintázott homokgyepeken a bálványfa, selyemkóró és a parlagfű rendkívül fontos
és veszélyes, nem csak ökológiai, hanem gazdasági problémákat is okozó, területre betörő
növények (Bagi 2004, Udvardy 2004, Szigetvári és Benkő 2004). Korábban csak a
bálványfa és a parlagfű esetében figyeltek meg DSE kolonizációt ezeken a területeken
(Kovács és Bagi 2001, Kovács és Szigetvári 2002), azonban munkánk során mindhárom
inváziós növénynél megfigyeltünk sötéten pigmentált szeptált hifákat és
mikroszkleróciumokat a gyökérben.
71
6.1.2 A DSE csoportok
Munkánk során csak azokat az izolátumokat tekintettük DSE gombának, amelyek,
vagy melyekkel egy csoportban lévő izolátumok in vitro inokulációs tesztjeink során a
kolonizálta a gyökereket, képzett mikroszkleróciumot és nem volt negatív hatással a
gazdanövényre. Ez azért fontos, mert a molekuláris diverzitási vizsgálatok esetében sokszor
a gyűjtött szekvenciák deponálásakor csak az adatbázisokban lévő adatokkal való
összevetés alapján jelölik meg a gombák stratégiáját (pl. ha ezek gyökérből származó
aszkuszos gomba szekvenciák, akkor endofitonnak vagy mikorrhiza képzőnek nevezhetik)
anélkül, hogy azt funkcionális vizsgálatokkal ellenőriznék (Brundrett 2009).
Habár nem is volt célunk kvantitatív kérdések megválaszolására alkalmas mintavétel,
az összesen 41 gomba csoport és a 14 DSE csoport (5. ábra, F2táblázat) törzsszámbeli
eloszlása hasonló volt más endofitonokkal foglalkozó tanulmányban leírtakéhoz (Sánchez-
Márquez és mtsai 2010). Az izolátumok többsége néhány nagyobb csoportba tartozott,
melyeket a terület RAF közösségének domináns vagy általános tagjainak nevezhetünk, és
21 csoportot egy izolátum reprezentált. Annak ellenére, ha egy DSE csoport vizsgálataink
során alacsony izolátumszámmal volt reprezentálva, nem jelenthetjük ki bizonyosan, hogy
valóban nem gyakori a területen. Ugyanis ezek az eredmények nagyban függenek a
vizsgálati módszerektől (pl. különböző táptalajok használata). Az izolálás alapú technikák
mellett egyre több molekuláris diverzitást vizsgáló munka jelenik meg, melyekben gomba-
specifikus primerekkel azonosítják a gyökerekhez asszociált gomba közösségek tagjait (pl.
Herrera és mtsai 2010). Például a molekuláris módszerekkel észak-amerikai füves
területeken végzett diverzitásvizsgálatok során általában bazídiumos gomba szekvenciák is
előkerültek, mint gyakori tagjai a RAF közösségnek (pl. Porras-Alfaro és mtsai 2008,
Khidir és mtsai 2010). Habár ettől eltérő területeken végeztük vizsgálatainkat, az
izolálásaink során számos aszkuszos gomba csoportot azonosítottunk, melyek az észak-
amerikai füves területeken is jelen voltak, azonban csak egy bazídiumos gombát sikerült
izolálnunk, így arra következtethetünk, hogy az izoláláson alapuló módszerek
alulreprezentálhatják a bazídiumos gombákat az aszkuszos gombákkal szemben.
A DSE törzsek ITS szekvenciáinak BLAST vizsgálata során a legtöbb esetben
találtunk ezekkel nagyfokú hasonlóságot mutató szekvenciákat. Ezek a GenBank találatok
(F4. táblázat) nagyrészt több földrész (Észak-Amerika, Dél-Amerika, Ázsia, Európa) száraz
és alpesi területeiről és általában talajmintákból vagy gyökerekből származtak (pl. Schadt
és mtsai 2001, Khidir és mtsai 2010, Porras-Alfaro és mtsai 2008.
72
A DSE-1 izolátumok a Cadophora nemzetségbe tartoztak, mely széles körben
elterjedt, általános gyökérkolonizáló gombákat foglal magába, többek között a C.
finlandica és C. orchidicola fajokat, melyeket számos tanulmányban vizsgáltak (pl. Wilcox
és Wang 1987, Fernando és Currah 1996, Jumpponen és Trappe 1998a, Andrade-Linares és
mtsai 2011). Szekvenciáinkkal a legnagyobb egyezést mutató BLAST találatok a C. luteo-
olivacea szekvenciái voltak, melyek legtöbbször kiwi és szőlő ültetvényeken izolált
patogén gombákból származtak (pl. Spadaro és mtsai 2010). Az általunk izolált Cadophora
csoport (DSE-1) az ITS és az LSU szekvenciák filogenetikai elemzése alapján valóban a C.
luteo-olivacea fajjal mutat egyértelmű, közelebbi rokonságot, azonban külön leszármazási
vonalakat reprezentálnak. Észak-amerikai félszáraz füves területekről is izoláltak DSE
törzseket, amiket a GenBank-ban szereplő szekvenciák alapján C. luteo-olivacea-ként
azonosítottak (Kageyama és mtsai 2008). Ezek valószínűleg a DSE-1 csoporthoz tartoznak,
azonban e szekvenciák nem lettek deponálva és publikálva, így nem tudtuk összevetni a
sajátjainkkal. Érdekesség, hogy a GenBank-ban csak a DSE-1 csoport esetében találtunk
DSE gombaként deponált hasonló szekvenciát, melyet egy alpesi növényből Schadt és
mtsai (2001) izoláltak, ami valószínűleg C. orchidicola lehetett.
A második legnagyobb csoportot (DSE-3) az irodalomban legtöbbször a dinnyefélék
patogénjeként azonosított, azonban DSE gombaként is ismert Rhizopycnis vagum
izolátumok alkották (Farr és mtsai 1998). Számos, ebbe a csoportba illeszkedő szekvencia
különböző területről és gazdanövényről származott, például mediterrán nyitvatermő és
kétszikű növényekről (Girlanda és mtsai 2002) vagy nedves szubtrópusi területek egyszikű
növényéről (Xu és mtsai 2008) (F4. táblázat). Néhány tanulmány patogénként írja le a R.
vagum-ot. Köztük Armengol és mtsai (2003) a R. vagum patogenitását vizsgálta különböző
növényekről és területekről származó izolátumokkal, és bár csak kis mértékben, de
patogénnek bizonyultak az izolátumok a sárgadinnyével összeállított kísérletekben. A R.
vagum patogénként viselkedett több, szintén dinnyefélékkel végzett kísérletek során (Farr
és mtsai 1998, Westphal és mtsai 2011). Az, hogy munkánk során nem voltak egyértelmű
negatív hatással a kísérleti növényekre, azzal is magyarázható, hogy az endofitonok a
különböző kísérleti körülmények, és a dinnyeféléktől teljesen eltérő gazdanövény miatt
„endofiton életszakaszban” maradhattak, de további magyarázat lehet a konspecifikus
izolátumok esetleges funkcionális eltérése is.
A DSE-8 csoport egyik leszármazási vonalát biztosan alkotó P. macrospinosa egy
széles körben elterjedt DSE gomba, melyet eddig fűfélék gyökeréből mutattak ki. Általában
73
nehezen megfigyelhető hialin hifákkal kolonizálja a gyökereket, azonban legtöbb esetben
pigmentált, vastag falú mikroszkleróciumot hoz létre (Barrow és Aaltonen 2001, Mandyam
és Jumpponen 2008). Mandyam és mtsai (2010, 2012) három különböző P. macrospinosa
izolátumot használt kolonizációs kisérletekhez, melyben 5 pázsitfű és 6 kétszikű lágyszárú
növényfajra gyakorolt hatását vizsgálták, és az eredmények egyfajta trendet mutattak. A
gombák erősebb hatással voltak a fűfélékre, mint más növényekre. Ez alapján arra
következtethetünk, hogy a P. macrospinosa funkcionális szempontok alapján is a
fűfélékhez asszociált endofiton.
A 8 izolátummal reprezentált DSE-9 csoport is az észak-amerikai félszáraz és füves
területek RAF közösségének tagja (Green és mtsai 2008, Porras-Alfaro és mtsai 2008), de
teljesen más területek növényeiből is előkerült már, például antarktiszi mohákról (Bradner
és mtsai 2000). Az Embellisia nemzetség tisztázatlan taxonómiája miatt, izolátumaink faj
szintű azonosítását nem tudtuk elvégezni.
A DSE-10 csoportot alkotó Curvularia nemzetséget a bevezetésben is külön
említettük, mivel e nemzetség egy törzsével végezték Redman és mtsai (2002) kísérleteiket,
melyek során amellett, hogy a pigmentált hifákkal rendelkező endofiton gomba növelte a
hőforrásnál élő növény hőmérsékleti stressztűrését, a gombának is szüksége volt a
gazdanövényre az optimumnál magasabb hőmérsékleten való túléléshez. A DSE-10
csoportba tartozó izolátumaink szekvenciái azonban egyértelműen különböztek a Redman
és mtsai (2002) által izolált Curvularia törzstől.
A DSE-11 csoport izolátuma ITS szekvenciája alapján egyezést mutatott Kansas
(USA) félszáraz füves területein izolált törzsekkel, melyeket növényre gyakorolt hatás
vizsgálatokhoz és enzim aktivitás tesztekhez használtak (Mandyam és mtsai 2010, 2012).
Munkánk során csak egy Xylariales (Sordariomycetes) rendbe tartozó izolátumot
gyűjtöttünk annak ellenére, hogy ez a csoport a gyökérendofitonok közösségeiben
egyébként sok esetben dominánsan van jelen (pl. Porras-Alfaro és Bayman 2011, Porras-
Alfaro és mtsai 2011).
A DSE-14 csoportot Fusarium nemzetségbe tartozó izolátumok alkották. E
legtöbbször növényi patogénként ismert nemzetség izolátumait azonban sokszor lehet
egészséges növények egészséges gyökeréből izolálni és szekvencia szinten is kimutatni
(Khidir és mtsai 2010), és több tanulmány számol be endofiton Fusarium törzsekről is (pl.
Phan és mtsai 2004, Paparu és mtsai 2006). Az izolátumainkéval teljesen megegyező ITS
74
szekvenciák ismét észak-amerikai prérik növényeinek gyökeréről is előkerültek, mint RAF
(Khidir és mtsai 2010, Herrera és mtsai 2010), mely arra enged következtetni, hogy sokkal
szélesebb körben lehetnek jelen nem-patogén Fusarium törzsek.
6.1.3 A DSE-k gazda- és területspecificitása és szezonalitása
Az irodalomban néhány tanulmány alapján arra következtethetünk, hogy a DSE
gombák széles gazda-spektrumú gyökérkolonizáló gombák (pl. Jumpponen és Trappe
1998a, Mandyam és mtsai 2012). Ennek ellenére idáig csak kevés munka foglalkozott a
terület-, gazda- és szövetspecificicitás illetve a szezonalitás vizsgálatával. Herrera és mtsai
(2010) különböző észak-amerikai félszáraz területeken vizsgálták a gyökérasszociált gomba
közösséget fűfélékben, és csak néhány esetben találtak gyökérasszociált gomba
szekvenciákat a gyökéren kívül, más szervekben. Ugyanebben a tanulmányban a több
területen vizsgált RAF közösség néhány tagja csak néhány vagy egy területhez volt
köthető, azonban a gyökérkolonizáló gombák domináns csoportjai általánosak voltak az
összes területen. Szintén észak-amerikai félszáraz területek RAF közösségének
vizsgálatakor hasonló eredményeket mutató munkájukban, Khidir és mtsai (2010) arra a
következtetésre jutott, hogy a domináns gyökérkolonizáló gombacsoportok megegyeznek
az Észak-amerikai félszáraz területeken.
Munkánk során nem csak fűfélékről, hanem a területek őshonos és inváziós
növényeiről is gyűjtöttünk izoláltumokat. A gyakori DSE gombák közül csak az Embellisia
sp. (DSE-9) volt az, ami csak őshonos növényekről került elő. Eredményeink alapján
elmondhatjuk, hogy a leggyakoribb DSE gombák generalisták, azonban jóval több adatra
lenne szükség ahhoz, hogy egyed- és ökoszisztéma szinten és több megközelítésben
értelmezhető legyen a gazda specificitás kérdésköre (Poulin és mtsai 2011).
Mandyam és mtsai (2010, 2012) több Periconia izolátumot vizsgáltak és
eredményeik alapján valószínűsítették a DSE gombák széles gazda spektrumát. Mandyam
és mtsai (2012) több növényfajon végzett inokulációs kísérleteik során a fűfajok
gyökerében nagyobb mértékű DSE gomba kolonizációt figyeltek meg, és arra a
következtetésre jutottak, hogy a DSE izolátumok fűfélék esetében „nagyobb
kompatibilitással” rendelkeznek, mint más növények esetében. Ezt a következtetést és az
eredményeket is kritikusan kell kezelnünk, mivel ezek az izolátumok kizárólag füvekről
lettek gyűjtve és lehet, hogy más növényekről gyűjtött DSE izolátumoknál ez nem
mutatkozna.
75
A DSE gombák szezonalitását több tanulmányban vizsgálták (Mandyam és
Jumpponen 2008 és az itt idézett irodalom), azonban ezekben a DSE gombák általi
kolonizációt figyelték terepi mintákban, nem pedig a közösségek dinamikájára fókuszáltak.
A DSE közösség domináns csoportjaiban az izolátumok legalább két különböző évszakban
lettek gyűjtve, így elmondhatjuk, hogy nem tapasztaltunk szezonalitást. Azonban, hogy
ennél közelebb kerüljünk a DSE gombák évszakhoz köthető funkcionális és diverzitásbeli
dinamikájához számos további, ezt a kérdéskört középpontba helyező vizsgálatra van
szükség.
A talaj mikrobiális közösségének az inváziós növényekre és terjedési sikerükre
gyakorolt hatását már számos tanulmány igazolta (pl. Richardson és mtsai 2000, Callaway
és mtsai 2004), és a mikorrhizaképző gombák általi kolonizáció hatását is többször
vizsgálták ilyen kontextusban (Pringle és mtsai 2009). Ennek ellenére nem ismerünk olyan
tanulmányt, melyben inváziós növényeket kolonizáló DSE gombákat vizsgáltak. A
selyemkóró és a parlagfű DSE általi kolonizációját vizsgálták már eredeti élőhelyükön,
észak-amerikai területeken. Itt mindkettő gyökerei kolonizáltak voltak, és a selyemkórót
még kísérletes rendszerekben is sikeresen inokulálták Periconia-val (Mandyam és mtsai
2012).
Munkánk során a domináns és gyakori DSE csoportok az őshonos és inváziós
növények gyökeréről is előkerültek, ami alátámasztja azt a hipotézist, hogy ezek a gombák
generalista és széles gazdaspektrumú gyökérkolonizálók. Mivel a DSE gombák gyakoriak
és fontos szerepük lehet a növények kitett élőhelyeken való túlélésében, ezek a gombák
talán az inváziós növények terjedési sikerességéhez is hozzájárulhatnak.
6.1.4 A DSE közösség vizsgálatának konklúziói
Khidir és mtsai (2010) számos tanulmány eredménye alapján azt a hipotézist
fogalmazta meg, hogy „Észak-Amerika száraz területein a fűfélék gyökerében a gomba
közösségek főbb csoportjai megegyeznek”. Ezt a hipotézist saját eredményeink alapján
kibővíthettük, nagyobb léptékben nézve elmondhatjuk, hogy általánosan a (fél)száraz füves
területek növényeiben a DSE közösség domináns tagjai megegyeznek, habár ennek
bizonyítására globális, a kontinensek félszáraz területeinek átfogó RAF / DSE vizsgálata
szükséges. Eddig már számos tanulmány kiemelte (pl. Mandyam és Jumpponen 2005,
Mandyam és mtsai 2010, Porras-Alfaro és Bayman 2011) a DSE gombák
ökoszisztémákban való jelenlétének és funkcióinak megértésének fontosságát, melyhez
76
átfogó diverzitás vizsgálatok, további inokulációs kísérletek és rendszerbiológiai
megözelítések lehetnek szükségesek (Porras-Alfaro és Bayman 2011).
Munkánk során azonosított összes nagy létszámú DSE csoport generalistának
tekinthető, mivel őshonos és inváziós növényekről is előkerültek, valamint nem mutattak
sem terület specificitást, sem szezonalitást. Továbbá a domináns DSE csoportok
szekvenciái nagy hasonlóságot mutattak több éghajlati övből és területről származó
gyökérkolonizáló gombákéival, mely ugyancsak megerősíti ezek generalista életmódját. Így
a félszáraz homokterületekről gyűjtött izolátumaink olyan kísérleteknél és vizsgálatoknál
lehetnek használhatók, melyek segíthetnek megérteni a fél(száraz) területeken és akár más
életközösségekben jelenlévő DSE közösség funkcióját.
6.2 A 3 DSE csoport izolátumainak ISSR vizsgálata
Mindhárom kiválasztott csoport esetén (DSE-1, DSE-3 és DSE-7) nagyobb
különbségeket tapasztaltunk ISSR vizsgálattal a csoportok izolátumai között, mint amilyet
az ITS szekvenciák vizsgálatával kaptunk (6–8. ábra).
A szakirodalomban több esetben írnak le a DSE-1 csoportba tartozó vagy ahhoz
nagyon közel álló Cadophora luteo-olivacea törzseket, melyek egyes növényekfajok
patogénkjeiként ismertek (pl. Prodi és mtsai 2008, Spadaro és mtsai 2010), de más
növények esetében, más területeken tünetmentesen kolonizálják a gyökereket (pl.
Kageyama és mtsai 2008).
A DSE-3 csoport esetén is hasonló megfigyeléseket találhatunk. Számos
tanulmányban patogénként említették a Rhizopycnis vagum-ot (pl. Farr és mtsai 1998,
Westphal és mtsai 2011), más esetekben pedig endofitonként írnak róla (pl. Girlanda és
mtsai 2002). Számos különböző területről, gazdáról származó patogén vagy endofitonként
megnevezett törzs ISSR vizsgálatával ezek talán elkülöníthetőek lennének, mivel a gomba
izolátumok nagymértékű csoporton belüli variabilitása összefügghet az esetleges
funkcionális, kolonizációs és más biológiai különbségekkel. Alaniz és mtsai (2009)
munkájában például, egy patogén gomba (Cylindrocarpon macrodidymum) nagyobb
virulenciával rendelkező törzsei az ISSR mintázatok alapján váltak elkülöníthetővé a
kevésbé virulensektől.
A DSE-7 csoport esetében az 5.7 fejezetben ismertetett taxónomiai vizsgálat során
megállapítottuk, hogy legalább hat fajhoz tartoznak izolátumaink. A korábban elvégzett
ISSR vizsgálatok ugyanezt a mintázatot mutatták, azonban jóval nagyobb izolátumok
77
közötti különbségekkel mint a másik két DSE csoport esetében, mely alapján már látszott,
hogy valószínűleg nem egy fajról van szó.
Eredményeink összhangban vannak a tudomásunk szerint egyetlen, DSE gombákat
ISSR mintázatok alapján vizsgáló tanulmány eredményeivel. Grünig és mtsai (2001)
munkájuk során a PAC komplexbe tartozó nem sporuláló és egy sporuláló faj 14-14 törzsét
vizsgálták, és a két taxon, valamint a törzsek specifikus elkülönítéséhez használtak ISSR-
PCR-t. Mind a 28 törzs esetében specifikus mintázatot kaptak, és az izoenzim vizsgálatok
során kapott alcsoportok is megegyeztek az ISSR alapján kapottakkal. Az izolátumok
esetükben sem mutattak korrelációt a gyűjtési területtel és a gazdanövényekkel. Az
elsődlegesen a mérsékelt övi erdős területeken domináns DSE csoportként jelen lévő PAC
(Queloz és mtsai 2011) és munkánk során félszáraz füves területek három gyakori DSE
csoportjának ISSR vizsgálata alapján elmondható, hogy ezekre a DSE gombákra jellemző a
nagymértékű fajon belüli genetikai variabilitás, és az alcsoportok nem korrelálnak az oda
tartozó izolátumok geográfiai és gazdanövény szerinti származásával.
Habár nem tapasztaltunk korrelációt a vizsgált paraméterekkel a három kiválasztott
DSE csoport esetében sem, fontos eredmény, hogy az ISSR vizsgálattal nagyfokú
csoporton belüli variabilitást tudtunk kimutatni, még megegyező ITS régióval rendelkező
törzsek esetében is. Viszonylag könnyen találhatunk egy adott izolátumra specifikus sávot
az ISSR profilban, mely lehetővé teszi egy izolátum specifikus azonosítását például a
specifikus sáv meghatározásával és az erre tervezett SCAR (Sequenced Characterized
Amplified Region) markerek fejlesztésével.
Az izolátum-specifikus markerek konspecifikus, de eltérő izolátumok elkülönítését
teszik lehetővé, így a két izolátummal külön-külön és együtt inokulált növény-kísérletek
eredményeként akár az is kiderülhet, hogy ez a nagymértékű variabilitás az izolátumok
közötti esetleges funkcionális eltérések mögött állhat, mely összefüggésbe hozható az
ökoszisztémákban betöltött szerepükkel.
6.3 Az in planta FISH
Az elmúlt években egyre több tanulmány foglalkozik a gyökérendofiton gombák
gyökéren belüli fluoreszcens jel detektálásán alapuló módszerekkel, melyek során vagy
fluoreszcens sejtfalfestékek (pl. WGA, wheat germ agglutinin) használatával (pl. Andrade-
Linares és mtsai 2011, Lahrmann és mtsai 2013), vagy különböző GFP transzformáns
78
törzsekkel dolgoznak (pl. Maciá-Vicente és mtsai 2009, Behie és mtsai 2012, Su és mtsai
2013). Nemrég Rath és mtsai (2014) közöltek egy módszertani tanulmányt, melyben több
gomba-növény interakció különböző módon való fluoreszcens jelölését és ezek konfokális
mikroszkópos detektálását mutatják be részletesen. Ezek a módszerek jól alkalmazhatók
olyan kísérleti rendszerekben, ahol nem cél a különböző gombák elkülönítése. Az általunk
kidolgozott, a 4.5 fejezetben leírt FISH protokoll alapján specifikusan jelölhetünk két
különböző gombát egy gyökérszakaszon, mely lehetővé teszi számos további kérdés
tisztázását.
A Cadophora sp. a központi szövethengerben nem volt megtalálható, amit néhány
megfigyelés során egyes DSE gombáknál már megállapítottak és ezeket patogénnek is
nevezték (pl. Su és mtsai 2013). Több esetben megfigyeltünk már más tanulmányokban
néhány gyökérkolonizáló gomba esetén is leírt, „moniliform” struktúrákat (pl. Gutiérrez és
mtsai 2003, Uma és mtsai 2010, Klymiuk és mtsai 2013), amiket „felfújódott” kevésbé
elágazó hifatagok tömege alkotott (9. a ábra). A két eltérő intracelluláris struktúra
lehetséges, hogy képződő mikroszkleróciumok két különböző ontogenetikus stádiumát
mutathatja. Ezt valószínűsítheti, hogy nem találtunk olyan sejtet, ahol a „moniliform”
struktúra nem töltötte volna ki nagyrészt vagy teljesen a sejtet. Néhány esetben meg is
figyeltünk kissé teltebb tagokkal rendelkező hifákat is. Lahrmann és mtsai (2013)
munkájuk során megfigyelték, hogy egy növény akár egymás melletti gyökérsejtjeit az
endofiton Piriformospora indica különböző morfológiájú hifái kolonizálnak. Az élő
sejtekben jelenlévő, vastagabb hifákból álló tömegből kiinduló vékonyabb hifák
elpusztították a környező növénysejteket. A vastagabb hifákat kizárólag élő sejtekben
figyeltek meg, a vékony hifákat pedig nekrotizálódó vagy teljesen halott sejtekben
(Lahrmann és mtsai 2013).
Az egyértelműen mutualista arbuszkuláris mikorrhiza képző gombák által kolonizált
gyökér részek élő szövetek jelenlétét is bizonyítják, mivel az obligát biotróf AM gomba
hifák sejtbe való bejutásának bonyolult, kétoldalú folyamatához az élő növényi sejt is
szükséges (pl. Parniske 2008, Oldroyd 2013). Ez azért lehet érdekes, mert bár a DSE által
kolonizált sejtek állapotáról nem mondhatunk semmit, azonban elmondható, hogy több
esetben a mikroszkleróciumokat és hifákat tartalmazó sejtet határoló sejtek élő sejtek,
valamint hogy a vizsgált szakaszok sem halott részei a gyökérzetnek.
Legjobb tudomásunk szerint egy tanulmányban végeztek sikeres FISH jelölést
gyökéren belüli gombákra, mely során egy májmoha gametofitonját kolonizáló
79
arbuszkuláris mikorrhizákat és a gombákhoz asszociált baktériumokat jelölték specifikus
fluoreszcens próbákkal (Desirò és mtsai 2012). A munkában nem esik szó a sejtfalak
autofluoreszcenciája okozta problémákról, sem a két jelölt organizmus specifikus
jelölésének nehézségeiről. Azonban fontos különbség, hogy a vizsgálatuk során csak a
baktériumok gombák melletti jelenlétének vizsgálatára alkalmas, vékony
keresztmetszeteket készítettek parafomaldehides fixálást követően a májmoha telepből,
melynek sejtjei egészen különböznek az edényes növényekétől, és a sejtfaluk szerkezete
valamint a sejtfalanyagok összetétele is különbözhet (Popper és Fry 2003). A jelölések
specificitását pedig valószínűleg az, hogy két teljesen eltérő organizmust (gombát és
baktériumot) vizsgáltak, már önmamagában magyarázhatja.
Munkánk során egy olyan RNS FISH protokollt adaptáltunk, amely alkalmas lehet a
gyökereket kolonizáló, akár több DSE gomba egyidejű specifikus detektálására és
lokalizációjára. A riboszómális RNS-hez hibridizáló próbák segítségével akár terepi
mintákban tudjuk specifikusan detektálni életképes gyökérkolonizáló gombákat, köztük az
esetleges látens módon jelenlévő patogén gombákat, így a kifejlesztett módszer gazdasági
szempontokból is fontos lehet.
6.4 A Cadophora sp. kolonizációjának TEM vizsgálata
Egy gyökérszakaszt kolonizáló gombák gyökéren belüli ultrastruktura vizsgálatához a
minta megfelelő gyökérszakaszának kiválasztása a DSE gombák esetében nem mindig
egyszerű, mivel a kolonizációs képességükben különbözhetnek egy egyébként jól
kolonizáló gombafaj eltérő törzsei (Mandyam és Jumpponen 2012), valamint a kolonizáció
a gazdanövénytől és a körülményektől is függhet (Mandyam és Jumpponen 2012). És bár a
minták kontrasztozásakor a magas lipid-tartalmú gomba struktúrák láthatóvá válnak és
fénymikroszkóp alatt ki lehet jelölni célzottan gyökérszakaszokat a beágyazáshoz (Kovács
és mtsai 2003), esetünkben ez nem nyújtott segítséget.
A Cadophora sp. izolátummal inokulált póréhagyma gyökerének ultrastruktura
vizsgálata során, annak ellenére, hogy mintáink csak egy kolonizációs időpontból
származtak, érdekes eredményeket kaptunk, melyek több kérdésre választ adhatnak.
A kísérleteink során használt kísérleti rendszer és az alkalmazott növény és gomba
fajok is eltérnek az eddigi tanulmányokban vizsgáltaktól. Egyszikű növények DSE
kolonizációjának ultrastruktúrális jellemzőiről legjobb tudomásunk szerint csak csak Yu és
80
mtsai (2001) és Zimmermann és Peterson (2007) számoltak be. Utóbbi számunkra kevésbé
érdekes, mert egy Phialocephala fortinii-vel inokulált terresztris orchidea csírázását és
fejlődését vizsgálták. Yu és mtsai (2001), tanulmányukban Asparagus officinalis
gyökerében vizsgálták a P. fortinii általi kolonizációt.
Vizsgálataink során néhány, a hifák környezetében lévő növényi sejt esetében
papillák jelenléte volt megfigyelhető a növényi sejtfalon. Ez a sejtfal anyag appozíció egy
általános jelenség a növények patogének elleni védekezésében (pl. Hückelhoven 2007).
Eddig nem írtak le hasonló struktúrákat DSE gombák esetében, azonban a növényi sejtbe
penetráló hifákról Currah és mtsai (1993) azt írták a P. fortinii esetében, hogy az
általánosnál vékonyabb hifákkal történik a betörés és itt a növényi sejtfalban nem történik
látható változás, mely következtetéseik szerint enzimatikus sejtfalbontásra utalhat. A
szintén P. fortinii által kolonizált Arabidopsis thaliana gyökérben sem tapasztalták a sejtfal
anyagok appozícióját a hifa közelében (Peterson és mtsai 2008).
Vizsgálataink során számos esetben jól megfigyeltő volt az intracelluláris hifák körül
a mátrix anyag és a kondenzálódott növényi citoplazma (10. a,b ábra), melyet számos
tanulmányban megemlítenek. Currah és mtsai (1993) és Yu és mtsai (2001) a növényi
sejtbe behatoló hifa körül elektrondenz anyagok jelenlétét írták le, Peterson és mtsai (2008)
és Yonezawa és mtsai (2004) vizsgálataik során a hifákat fibrilláris anyag vette körül. Ezt, a
több különböző kísérlet során megfigyelt elektrondenz fibrilláris anyagot Peterson és mtsai
(2008) csak kondenzált citoplazmának valószínűsítik, melyet ez eredményeink is
megerősítenek.
Élő, teljesen ép citoplazmával rendelkező növényi sejtben is sikerült hifát
megfigyelnünk (11. a ábra). A növényi sejten belül a gomba sejtfalat egy laza mátrixanyag
választotta el a növényi sejtmembrántól és növényi sejtfal nem volt megfigyelhető (11. a,b
ábra). Ezek alapján elmondhatjuk, hogy legjobb tudomásunk szerint először figyeltünk meg
perifungális membránt egy DSE gomba gyökérkolonizációja esetében. Számos
tanulmányban említik meg külön a perifungális membrán hiányát (pl. Currah és mtsai 1993,
O’Dell és mtsai 1993, Abdellatif és mtsai 2009). Yu és mtsai (2001) sem a cortex sejtekbe,
sem az epidermisz sejtekbe behatoló hifák körül nem figyeltek meg perifungális membránt,
és hozzájuk hasonlóan más ultrastrukturális tanulmányban sem detektálták ezt (pl. Cameron
1998, Jumpponen és Trappe 1998b, Yonezawa és mtsai 2004, Peterson és mtsai 2008). A
korábban megfigyelt kolonizációhoz köthető ultrastrukturális változások és jellegek (pl.
nincs perifungális membrán és nyilván nincs mátrix anyag a növényi sejt és a gomba
81
membránja között) alapján azt valószínűsítették, hogy a gyökérendofiton és a gazdanövény
viszonya inkább tekinthető egy nekrotróf-patogén kapcsolatnak (Peterson és mtsai 2008),
mivel az eddigi tanulmányok során a kolonizált növényi sejtek citoplazmája nekrotikus
vagy degradált volt, és nem figyeltek meg élő sejtet kolonizáló hifákat sem.
Mivel a gomba és növényi sejtmembránon is sokszor megfigyelhetőek voltak
membrán betűrődések/vezikulumok (11. a,b ábra), feltételezhetjük, hogy jelentős endo- és
exocitotikus folyamatok zajlanak mindkét sejt esetében. A mátrix anyag jelenléte is érdekes
lehet, mivel az arbuszkuláris mikorrhizák esetében fontos szerepet játszik a gomba és
növényi citoplazma közötti mátrix anyagnak az anyagcsere kapcsolatban (Smith és Read
2008), és nem kizárt, hogy a DSE gomba növény interakciókban is lehet szerepe.
A perifungális membrán jelenlétére több magyarázat is lehetséges, kezdve a
kísérletben használt organizmusokon és kísérleti rendszereken keresztül egy adott tényleges
mutualista kapcsolat meglétéig, az azonban bizonyosan elmondható, hogy a kapcsolatnak
van egy biotróf stádiuma. Lehetséges az is, hogy a kolonizáció még csak kezdeti
szakaszban volt, és ez nem eredményezett látható degradációt a növényi sejtben.
Habár ultrastruktura vizsgálataink eredményei sok kérdést vethetnek fel a DSE
gombák kolonizációjáról, így életközösségekben betöltött funkciójukról is, azonban a
jelenségek tisztázásához és alaposabb megismeréséhez számos további vizsgálatok
szükségesek.
6.5 A leírt DSE taxonok
Taxonómiai vizsgálataink során a nemzetségek és fajok leírását a megfelelő és
konzekvens morfológiai karakterek mellett a DNS szekvenciák az adott taxonra jellemző és
egyedülálló karakterei alapján végeztük. Új taxonok DNS szekvencia alapú leírása annak
ellenére, hogy számos tanulmányban alkalmazzák (pl. Browne és mtsai 2013, Gomes és
mtsai 2013) nem általánosan bevett. Azonban olyan esetekben, ahol nem állnak
rendelkezésünkre megbízható morfológiai karakterek, ezen leírási mód alkalmazása
szükségszerű.
Annak ellenére, hogy egyre több tanulmány foglalkozik a gyökérasszociált gomba
közösségek szerkezetének vizsgálatával (pl. Porras-Alfaro és mtsai 2011, Herrera és mtsai
2012) vagy új DSE fajok leírásával (pl. Walsh és mtsai 2014), még így sem több mint 20-
82
25 pontosan leírt DSE fajról tudunk (pl. Kageyama és mtsai 2008, Andrade-Linares és
Franken 2013).
Mindhárom, általunk leírt nemzetség a Pleosporales rend Massarineae alcsaládjába
illeszkedett (13. ábra), amely főként szaprotróf vízi és szárazföldi gombákat foglal magába
(Zhang és mtsai 2012). A DSE-7 csoport egy új nemzetséget és hat fajt (15. ábra)
reprezentált, a DSE-4 izolátumai egy monospecifikus nemzetséget alkottak és a DSE-8B
csoport szintén egy új nemzetséget reprezentált.
6.5.1 Az új DSE nemzetségek elhelyezkedése
A Darksidea nemzetség a molekuláris eredményeink alapján a Lentitheciaceae
(Zhang és mtsai 2009) családba tartozik, azonban mind az aszkospórák tulajdonságai
alapján, mind a száraz élőhelyekhez való asszociáció alapján elkülönül a család
többszörösen szeptált aszkospórájú és legtöbbször nedves vagy vizes élőhelyeken
előforduló fajaitól (Zhang és mtsai 2012). A Lentitheciaceae családba a Tingoldiago
graminicola testvércsoportjaként illeszkedtek (14. ábra). A Darksidea fajok
telepmorfológiája rendkívül változatos lehet (16. ábra).
Az Aquilomyces patris a Morosphaeriaceae (Suetrong és mtsai 2009) családba került
egy új bazális csoportot alkotva a Heliascus, Kirschsteiniothelia, Morosphaeria,
Pithomyces nemzetségek és az Asteromassaria pulchra mellett, melyek elsősorban
tengerben és más vízi/vízes élőhelyeken előforduló gombák (Suetrong és mtsai 2009) (11.
ábra). Az Aquilomyces patris telepei sötétszürkések, nemzetségnevüket is erről kapták (9.
ábra).
A Flavomyces fulophazii egy erősen támogatott, de különálló „incertae sedis” kládot
alkotott az eddig Massarinaceae családba sorolt Massarina igniaria, Periconia
macrospinosa és Noosia banksiae fajokkal. Ez a klád azonban nem képzett monofiletikus
csoportot a Massarinaceae család további fajaival, melyek közé a család típusfaja
(Massarina eburnea) is tartozott. Korábbi elemzések során a most F. fulophazii-val egy
kládba tartozó M. igniaria a Massarinaceae család bazális elágazását alkotta (Zhang és
mtsai 2009, 2012), azonban elemzéseink során használt további taxonok és más lókuszok
vizsgálata megváltoztatták a csoport helyzetét (13. ábra). A F. fulophazii telepei
élénksárgára színezik a táptalajokat, azonban ez a gomba festési képessége a fenntartás
során egy idő után eltűnhet (16. ábra).
83
6.5.2 A Darksidea nemzetségbe tartozó más szekvenciák/izolátumok
Már évekkel a Darksidea nemzetség leírása előtt számos, e nemzetség fajainak ITS
szekvenciájával megegyező/hasonló GenBankban elhelyezett és lepublikált szekvenciát
ismertünk. Mindegyik szekvencia száraz és félszáraz füves területről került elő diverzitás
vizsgálatoknál, elsősorban nem tenyésztett gombából származó szekvenciaként.
Legjobb tudomásunk szerint az első, Darksidea fajokkal jelentős mértékű
hasonlóságot mutató ITS szekvenciát Hawkes és mtsai (2006) helyezték el a GenBankba,
melyet Stipa hymenoides gyökeréből mutatták ki Utah (USA) félszáraz füves területeiről,
majd Sánchez-Márquez és mtsai (2008) Ammophila arenaria rizómájából izolált egy ide
tartozó törzset Galicia (Spanyolország) északi részén elterülő homokterületeken. Green és
mtsai (2008) mutatott ki több ITS szekvenciát, melyet Új Mexikó (USA) félszáraz füves
területeken dominánáló fűféle (Bouteloua gracilis) gyökerét övező talajból határoztak meg,
majd Porras-Alfaro és mtsai (2011) ugyanezen a területen végzett talajközösség vizsgálatok
során további Darksidea szekvenciákat mutatott ki. Ezt megelőzően a B. gracilis
gyökérasszociált gomba közösségének vizsgálatát végző tanulmány során Porras-Alfaro és
mtsai (2008) egy a „RAF közösségben domináló, Pleosporales rendbe tartozó új DSE
csoportról” írt, melyet „A csoport”-nak nevezett és benne két alcsoportot különített el („B
és C alcsoportok”). Az ITS szekvenciák sajátjainkéval való összehasonlítása alapján a „B
alcsoport” egyértelműen együtt csoportosult a Darksidea nemzetséggel. Khidir és mtsai
(2010) szintén gyűjtött ITS szekvenciákat, melyek az előbb említett „B alcsoport”-ba
tartoztak, és ezt a csoportot Camara és mtsai (2001) által leírt Paraphaeospheria fajokkal
való rokonsága alapján Paraphaeospheria sp.-nek nevezte. Ez a megnevezés, melyet
később Herrera és mtsai (2010) is használtak, biztosan nem megfelelő, mivel a
Paraphaeospheria nemzetség egyértelműen a Montagnulaceae családva tartozik (Zhang és
mtsai 2009, Verkley és mtsai 2014). A B. gracilis RAF közösségének egy területi grádiens
mentén való vizsgálata során a közösségek állandó és általános tagjaként említették a most
Darksidea nemzetségbe tartozó gombákat (Herrera és mtsai 2010). E nemzetség szintén
előkerült emlősök ürülékéből két különböző füves területen is (Herrera és mtsai 2011a),
valamint egy másik fűféle, a Sporobolus cryptandrus gyökeréről is (Herrera és mtsai
2011b). A nemzetség előfordul az eurázsiai sztyepp öv nyugati szélén (a dolgozatban
ismertetett izolátumok) és a keleti régióiban is (Su és mtsai 2010). Su és mtsai (2010) a
belső mongóliai plató félszáraz sztyepp zónájában izolált Stipa grandis gyökeréről 3
törzset, melyek a Darksidea alpha fajjal mutattak nagy hasonlóságot.
84
A fent felsorolak és saját adataink alapján elmondhatjuk, hogy a Darksidea
nemzetség domináns tagja a félszáraz területek DSE közösségeinek világszerte.
6.5.3 Ivaros alak és spóraképzés a DSE gombáknál
Izolátumaink spóraképzésének indukálására irányuló munkáink során egyszer sikerült
termőtesteket megfigyelnünk csalán száron (12. ábra), és az egyszer már működő kísérleti
körülmények többszöri ismétlésének ellenére, a törzsek nem képeztek több hasonló
struktúrát. Elmondhatjuk, hogy legjobb tudásunk szerint a DSE gombák esetén először
sikerült ivaros alakot megfigyelnünk, és több esetben az ivaros termőtestekben aszkuszok
és aszkospórák is jelen voltak (12. ábra). Ez fontos eredmény lehet, mivel a DSE gombák
ivartalan gombák (Jumpponen és Trappe 1998a), melyeknél még a konídiumképzés is a
legtöbb esetben csak extrém körülmények hatására indul meg (pl. Wang és Wilcox 1985,
Grünig és mtsai 2009).
Néhány tanulmányban a szerzők feltételezték, hogy néhány DSE gombának lehet
vagy lehetett ivaros állapota (Grünig és mtsai 2009). Zaffarano és mtsai (2011) 19 PAC faj
több ezer izolátumának ivaros folyamatokban szerepet játszó, párosodási típust
meghatározó (mating type, MAT) lókuszainak vizsgálata alapján is azt feltételezték, hogy
kriptikus ivaros folyamatok rendszeresen jelen vannak, vagy lehettek, a vizsgált DSE
gombáknál. Habár populációgenetikai tanulmányok, genom vizsgálatok és a MAT
lokuszok tulajdonságai az ivaros alak jelenlétét bizonyítják (pl. Zaffarano és mtsai 2011),
ivaros alak megfigyelése és indukálása ezidáig nem járt eredménnyel a DSE gombák
esetében. Termőtestképzést célzó kísérletek során PAC fajoknál nem figyeltek meg ivaros
alakot, azonban a PAC egy közeli rokona, a Phaeomollisia piceae esetében megfigyeltek
steril termőtestet (Grünig és mtsai 2009), mely hasonlított egy Currah és mtsai (1993) által
Acephala fajnál (UAMH 6816) megfigyelt, spórákat szintén nem tartalmazó termőtesthez.
Nem tudunk a Darksidea fajok mellett egy DSE gombáról sem, amelynél spórákat
tartalmazó termőtestek képződését leírták volna. A gyakori Darksidea fajok, például a D.
alpha törzseinek bizonyított ivaros spóra képzési képessége és vizsgálatokban való
alkalmazása segíthet jobban megérteni a gyökérkolonizáló endofiton gombák
életközösségekben való széles elterjedését és általános előfordulását.
85
7. ÖSSZEFOGLALÁS
A dolgozatban bemutatott munka során alföldi félszáraz területek növényeinek
gyökerét kolonizáló DSE gombákat vizsgáltuk. (1) Célul tűztük ki a vizsgált homokterület
DSE közösségének kompozicionális diverzitás vizsgálatát, és az őshonos és inváziós
növényeket mintázva megtalálni a generalista, gyakori és domináns DSE csoportokat.
Kérdésünk volt még, hogy mutatnak-e a DSE gombák szezonalitást vagy terület
specificitást. (2) Inter Sample Sequence Repeat (ISSR) módszerrel teveztük vizsgálni, hogy
konspecifikus DSE izolátumok elkülöníthetők-e egyes tulajdonságaik alapján. (3) Célunk
volt egy fluoreszcens festési módszer fejlesztése mely lehetővé teszi bizonyos DSE gombák
gyökéren belüli specifikus jelölését, valamint (4) információkat szerezni egy DSE gomba
gyökérkolonizációjáról ultrastruktura (TEM) vizsgálatokkal. (5) Terveztük még a munkánk
során előkerülő azonosítatlan DSE gombák taxonómiai vizsgálatát.
(1) A DSE közösség vizsgálatánál összesen 14 DSE csoportot azonosítottunk és
azonosítottuk a közösség domináns generalista csoportjait. Nem tapasztaltunk sem
szezonalitást, sem terület specificitást. Észak-amerikai félszáraz területek gyökérkolonizáló
gomba közösségével való jelentős hasonlóság alapján elmondhatjuk, hogy (fél)száraz füves
területek növényeiben az DSE közösség általánosan megegyezik.
(2) Az ISSR módszerrel vizsgált DSE csoportok izolátumai nem voltak
elkülöníthetők gyűjtési helyük, idejük és gazdanövényeik alapján sem, azonban nagyfokú
csoporton belüli variabilitást tudtunk kimutatni. Ez lehetővé teszi a különböző
konspecifikus törzsek specifikus azonosítását.
(3) Sikerült olyan fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) módszert adaptálnunk,
mely lehetővé tette DSE gombák specifikus jelölését a gyökéren belül, így két különböző
gomba által kolonizált gyökérben is ezek elkülöníthetővé váltak az egyidejű jelöléssel.
(4) Az ultrastruktura vizsgálatok során elsőként figyeltünk meg élő növényi sejtben
DSE hifát, és az ehhez kapcsolódó sejttani változásokat. A gomba- és a növényi sejt között
egy laza mátrix anyagot figyeltünk meg, és először azonosítottuk a biotróf kapcsolatokra
jellemző perifungális membránt a gyökerek DSE kolonizációja esetében.
(5) Munkánk során előkerült három DSE csoport taxonómiai vizsgálata során három
új nemzetséget és nyolc fajt írtunk le, melyek a Pleosporales rend Massarineae alrendjébe
illeszkednek.
(6) A polifázikus taxonómiai munka során először sikerült a DSE gombáknál ivaros
alakot indukálnunk, az ivaros termőtestekben aszkuszokat és aszkospórákat megfigyelnünk.
86
8. SUMMARY
In this study, we investigated dark septate endophytes originating from semiarid areas
of the Great Hungarian Plain. The main objectives of this work were (1) to study the
compositional diversity of DSE fungi colonizing the plants of semiarid sandy areas and to
identify the generalist, dominant and frequent members of the community by comparing
DSE community of indigenous and invasive plants. We aimed to test the area specificity
and the seasonality as well. Our further aims were (2) to investigate whether conspecific
isolates can be differentiated using Inter Sample Sequence Repeat (ISSR) method, (3) to
adapt a fluorescent method for specific detection and visualization of fungal endophytes in
the root, (4) to gain information on ultrastructural features of DSE colonization using TEM
and (5) to describe unidentified DSE lineages revealed in our investigations.
(1) More than 200 samples were taken from native and invasive plants of the three
sites. According to the analyses of 296 ITS sequences obtained from 241 isolates, isolates
clustered into 41 groups and found that 14 of these were DSE. The generalist and dominant
DSE groups were identified, neither area specificity nor seasonality were found. According
to the significant similarities with root associated fungal community of semi arid regions of
North America we may extend this statement by hypothesizing that plants of semiarid
grasslands share common dominant DSE fungal community.
(2) Isolates of assigned DSE groups could not be differentiated based on sampling
area, sampling date or host plant using ISSR, however high variability were found among
the isolates that enables specific identification of conspecific strains.
(3) An rRNA fluorescent in situ hybridization (FISH) method was adapted for
specific labeling of fungal endophytes in root for the first time enabling simultaneous
specific detection of different fungi colonizing the same root.
(4) In this study, we reported DSE hypha in living plant cell and related cellular
changes for the first time examined by TEM. A loose matrix material were found between
the fungal and plant cell and we observed for the first time perifungal membrane that
known to be specific to biotrophic interactions.
(5) Based on the results of taxonomic work of three unindentified DSE groups,
isolates were found to represent three novel genera with eight novel species within the
suborder Massarineae in the order Pleosporales.
(6) In our study, we managed for the first time to induce DSE to form their sexual
morphs, where asci and ascopsores could be detected in the sporocarps.
87
9. IRODALOMJEGYZÉK
Abdellatif L, Bouzid S, Kaminskyj S, Vujanovic V. 2009. Endophytic hyphal
compartmentalization is required for successful symbiotic Ascomycota association with
root cells. Mycological Research 113: 782–791.
Addy HD, Piercey MM, Currah RS. 2005. Microfungal endophytes in roots. Canadian
Journal of Botany 83: 1–13.
Alaniz S, Armengol J, León M, García-Jiménez J, Abad-Campos P. 2009. Analysis of
genetic and virulence diversity of Cylindrocarpon liriodendri and C. macrodidymum
associated with black foot disease of grapevine. Mycological Research 113: 16–23.
Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. 1990. Basic local alignment search
tool. Journal of Molecular Biology 215: 403–10.
Andrade-Linares DR, Franken P. 2013. Fungal endophytes in plant roots: taxonomy,
colonization patterns, and functions. In: Aroca R. (eds) Symbiotic endophytes, Soil biology,
Springer-Verlag, Berlin 37: 311–334.
Andrade-Linares DR, Grosch R, Franken P, Karl HR, Kost G, Restrepo S, de Garcia MC,
Maximova E. 2011. Colonization of roots of cultivated Solanum lycopersicum by dark
septate and other ascomycetous endophytes. Mycologia 103: 710–721.
Armengol J, Vicent A, Martínez-Culebras P, Bruton BD, García-Jiménez J. 2003.
Identification, occurrence and pathogenicity of Rhizopycnis vagum on muskmelon in Spain.
Plant Pathology 52: 68–73.
Arnold AE, Lutzoni F. 2007. Diversity and host range of foliar fungal endophytes: are
tropical leaves biodiversity hotspots? Ecology 88: 541–549.
Arnold AE, Maynard Z, Gilbert GS, Coley PD, Kursar TA. 2000. Are tropical fungal
endophytes hyperdiverse? Ecology Letters 3: 267–274.
Bacon CW, Porter JK, Robbins JD, Luttrell ES. 1977. Epichloë typhina from toxic tall
fescue grasses. Applied and Environmental Microbiology 34: 76–81.
Bacon CW, White JF. 2000. Microbial Endophytes. Marcel Dekker, Inc., New York.
Bagi I. 2004. Selyemkóró. In: In: Mihály B, Botta-Dukát Z. (eds) Biológiai inváziók
Magyarországon. Özönnövények. Budapest: TermészetBÚVÁR Alapítvány Kiadó 319–
336.
Barrow JR, Aaltonen RE. 2001. Evaluation of the internal colonization of Atriplex
canescens (Pursh) Nutt. roots by dark septate fungi and the influence of host physiological
activity. Mycorrhiza 11: 199–205.
Baschien C, Manz W, Neu TR, Marvanová L, Szewzyk U. 2008. In Situ detection of
freshwater fungi in an alpine stream by new taxon-specific fluorescence in situ
hybridization probes. Applied and Environmental Microbiology 74: 6427–6436.
88
Behie SW, Zelisko PM, Bidochka MJ. 2012. Endophytic insect–parasitic fungi translocate
nitrogen directly from insects to plants. Science 336: 1576–1577.
Bell AA, Wheeler MH. 1986. Biosynthesis and functions of fungal melanins. Annual
Reviews of Phytopathology 24: 411–451.
Belnap J, Phillips S L, Sherrod S, Moldenke A. 2005. Soil biota can change after exotic
plant invasion: does this affect ecosystem processes? Ecology 86: 3007–3017.
Bergero R, Harrier LA, Franken P. 2003. Reporter genes: applications to the study of
arbuscular mycorrhizal (AM) fungi and their symbiotic interactions with plant roots. Plant
and Soil 255: 143–155.
Bornet B, Antoine E, Françoise S, Marcaillou-Le Baut C. 2005. Development of sequence
characterized amplified region markers from inter simple sequence repeat fingerprints for
the molecular detection of toxic phytoplankton Alexandrium catenella (Dinophyceae) and
Pseudo-nitzschia delicatissima (Bacillariophyceae) from French coastal waters. Journal of
Phycology 41: 704–711.
Bornet B, Branchard M. 2001. Nonanchored inter simple sequence repeat (issr) markers:
reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant Molecular Biology
Reporter 19: 209–215.
Bradner JR, Sidhu RK, Yee B, Skotnicki ML, Selkirk PM, Nevalainen KMH. 2000. A new
microfungal isolate, Embellisia sp., associated with the Antarctic moss Bryum argenteum.
Polar Biology. 23: 730–732.
Browne AGP, Fisher MC, Henk DA. 2013. Species-specific PCR to describe local-scale
distribution of four cryptic species in the Penicillium chrysogenum complex. Fungal
Ecology 6: 419–429.
Brundrett MC. 2002. Co-evolution of roots and mycorrhizas of land plants. New
Phytologist 154: 275–304
Brundrett MC. 2009. Mycorrhizal associations and other means of nutrition of vascular
plants: understanding the global diversity of host plants by resolving conflicting
information and developing reliable means of diagnosis. Plant and Soil 320: 37–77.
Caldwell BA, Jumpponen A, Trappe JM. 2000. Utilization of major detrital substrates by
dark-septate root endophytes. Mycologia 92: 230–232.
Callaway RM, Thelen GC, Rodriguez A, Holben WE. 2004. Soil biota and exotic plant
invasion. Nature 427: 731–733.
Camara MPS, Palm ME, Berkum P van, Stewart EL. 2001. Systematics of
Paraphaeosphaeria: a molecular and morphological approach. Mycological Research 105:
41–56.
Cameron SL. 1998. Colonization of Populus tremuloides seedlings by the fungus
phialocephala fortinii in the presence of the ectomycorrhizal fungus Thelephora terrestris.
Aspen Bibliography 1315.
89
Carbone I, Kohn LM. 1999. A method for designing primer sets for speciation studies in
filamentous ascomycetes. Mycologia 91: 553–556.
Carlson AL, Justo A, Hibbett DS. 2015. Species delimitation in Trametes: a comparison of
ITS, RPB1, RPB2 and TEF1 gene phylogenies. Mycologia (in press).
Cázares E, Trappe JM, Jumpponen A. 2005. Mycorrhiza-plant colonization patterns on a
subalpine glacier forefront as a model system of primary succession. Mycorrhiza 15: 405–
416.
Cheplick GP, Faeth SH. 2009. Ecology and Evolution of the Grass Endophyte Symbiosis.
New York, Oxford.
Clay K, Schardl C. 2002. Evolutionary origins and ecological consequences of endophyte
symbiosis with grasses. The American Naturalist 160: 99–127.
Crous PW, Groenewald JZ, Risede J-M, Hywel-Jones NL. 2004. Calonectria species and
their Cylindrocladium anamorphs: species with sphaeropedunculate vesicles. Studies in
Mycology 50: 415–429.
Crous PW, Verkley GJM, Groenewald JZ, Samson RA (eds). 2009. Fungal Biodiversity.
CBS Laboratory Manual Series, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The
Netherlands 1: 1–269.
Currah RS, Tsuneda A, Murakami S. 1993. Morphology and ecology of Phialocephala
fortinii in roots of Rhododendron brachycarpum. Canadian Journal of Botany 71: 1071–
1078.
Czymmek KJ, Bourett TM, Howard RJ. 2005. Fluorescent protein probes in fungi. In:
Savidge T, Pothoulakis C. (eds) Methods in Microbiology. Microbial Imaging Elsevier:
Amsterdam 34: 27–62.
Daims H, Stoecker K, Wagner M. 2005. Fluorescence in situ hybridization for the detection
of prokaryotes. In: Osborn AM, Smith CJ. (eds) Molecular Microbial Ecology Taylor &
Francis Group, New York 213–239.
Day MJ, Hall JC, Currah RS. 2012. Phialide arrangement and character evolution in the
helotialean anamorph genera Cadophora and Phialocephala. Mycologia 104: 371–381.
Desiro A, Naumann M, Epis S, Novero M, Bandi C, Genre A, Bonfante P. 2013.
Mollicutes-related endobacteria thrive insideliverwort-associated arbuscular mycorrhizal
fungi. Environmental Microbiology 73: 132–144.
Diagne N, Escoute J, Lartaud M, Verdeil JL, Franche C, Kane A, Bogusz D, Diouf D,
Duponnois R, Svistoonoff S. 2011. Uvitex2B: a rapid and efficient stain for detection of
arbuscular mycorrhizal fungi within plant roots. Mycorrhiza 21: 315–321.
Dickson S, Kolesik P. 1999. Visualisation of mycorrhizal fungal structures and
quantification of their surface area and volume using laser scanning confocal microscopy.
Mycorrhiza 9: 205–213.
90
Diene O, Wang W, Narisawa K. 2013. Pseudosigmoidea ibarakiensis sp. nov., a dark
septate endophytic fungus from a cedar forest in Ibaraki, Japan. Microbes and
Environments 28: 381–387.
Dreyer B, Morte A, Pérez-Gilabert M, Honrubia M. 2006. Autofluorescence detection of
arbuscular mycorrhizal fungal structures in palm roots: an underestimated experimental
method. Mycological Research 110: 887–897.
Faeth SH, Fagan WF. 2002. Fungal endophytes: common host plant symbionts but
uncommon mutualists. Integrative and Comparative Biology 42: 360–68.
Farr DF, Miller ME, Bruton BD. 1998. Rhizopycnis vagum gen. et sp. nov., a new
coelomycetous fungus from roots of melons and sugarcane. Mycologia 90: 290–296.
Fekete G, Molnár Z, Kun A, Botta-Dukát Z. 2002. On the structure of the Hungarian forest
steppe: grasslands on sand. Acta Zoologica Academica Scientia Hungarica 48: 137–150.
Felsenstein J. 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap.
Evolution 39: 783–791.
Fernando AA, Currah RS. 1996. A comparative study of the effects of the root endophytes
Leptodontidium orchidicola and Phialocephala fortinii (Fungi Imperfecti) on the growth of
some subalpine plants in culture. Canadian Journal of Botany 74: 1071–1078.
Filatov DA. 2002. ProSeq: a software for preparation and evolutionary analysis of DNA
sequence data sets. Molecular Ecology Notes 2: 621–624.
Fitzpatrick DA, Logue ME, Stajich JE, Butler G. 2006. A fungal phylogeny based on 42
complete genomes derived from supertree and combined gene analysis. BMC Evolutionary
Biology 6: 99.
Fracchia S, Krapovickas L, Aranda-Rickert A, Valentinuzzi VS. 2011. Dispersal of
arbuscular mycorrhizal fungi and dark septate endophytes by Ctenomys cf. knighti
(Rodentia) in the northern Monte Desert of Argentina. Journal of Arid Environments 75:
1016–1023.
Galagan JE, Henn MR, Ma L-J, Cuomo CA, Birren B. 2005. Genomics of the fungal
kingdom: Insights into eukaryotic biology. Genome Research 15: 1620–1631.
Garbary DJ, Macdonald KA. 1995. The Ascophyllum polysiphonia Mycosphaerlla
symbiosis. 4. Mutualism in the Ascophyllum mycosphaerella interaction. Botanica Marina
38: 221–225.
Gardes M, Bruns TD. 1993. ITS primers with enhanced specifity for Basidiomycetes –
application to the identification of mycorrhizae and rusts. Molecular Ecolology 2: 113–118.
Geiser DM, Klich M, Frisvad J, Peterson S, Varga J, Samson R. 2007.The current status of
species recognition and identification in Aspergillus. Studies in Mycology 59: 1–10.
Girlanda M, Ghignone S, Luppi AM. 2002. Diversity of sterile root-associated fungi of two
mediterranean plants. New Phytologist 155: 481–498.
91
Glass NL, Donaldson G. 1995. Development of primer sets designed for use with PCR to
amplify conserved genes from filamentous ascomycetes. Applied and Environmental
Microbiology 61: 1323–1330.
Gomes RR, Glienke C, Videira SIR, Lombard L, Groenewald JZ, Crous PW. 2013.
Diaporthe: a genus of endophytic, saprobic and plant pathogenic fungi. Persoonia 31: 1–
41.
Green LE, Porras-Alfaro A, Sinsabaugh RL. 2008. Translocation of nitrogen and carbon
integrates biotic crust and grass production in desert grassland. Journal of Ecology 96:
1076–1085.
Groenewald JZ, Nakashima C, Nishikawa J, Shin H-D, Park J-H, Jama AN, Groenewald
M, Braun U, Crous PW. 2013. Species concepts in Cercospora: spotting the weeds among
the roses. Studies in Mycology 75: 115–170.
Grünig CR, Queloz V, Duò A, Sieber TN. 2009. Phylogeny of Phaeomollisia piceae gen.
sp. nov.: a dark, septate, conifer-needle endophyte and its relationships to Phialocephala
and Acephala. Mycological Research 113: 207–221.
Grünig CR, Queloz V, Sieber TN, Holdenrieder O. 2008. Dark septate endophytes (DSE)
of the Phialocephala fortinii s.l. – Acephala applanata species complex in tree roots:
classification, population biology, and ecology. Canadian Journal of Botany 86: 1355–
1369.
Grünig CR, Sieber TN, Holdenrieder O. 2001. Characterisation of dark septate endophytic
fungi (DSE) using inter-simple-sequence-repeat-anchored polymerase chain reaction
(ISSR-PCR) amplification. Mycological Research 105: 24–32.
Grünig CR, Sieber TN, Rogers SO, Holdenrieder O. 2002. Spatial distribution of dark
septate endophytes in a confined forest plot. Mycological Research 106: 832–840.
Gutiérrez A, Morte A, Honrubia M. 2003. Morphological characterization of the
mycorrhiza formed by Helianthemum almeriense Pau with Terfezia claveryi Chatin and
Picoa lefebvrei (Pat.) Maire. Mycorrhiza 13: 299–307.
Harrington TC, McNew D. 2003. Phylogenetic analysis places the Phialophora-like
anamorph genus Cadophora in the Helotiales. Mycotaxon 87: 141–151.
Haselwandter K, Read DJ. 1982. The significance of root-fungus association in two Carex
species of high-alpine plant communities. Oecologia 53: 352–354.
Hawkes CV, Belnap J, D’Antonio C, Firestone MK. 2006. Arbuscular mycorrhizal
assemblages in native plant roots change in the presence of invasive exotic grasses. Plant
and Soil 281: 369–380.
Hawkes CV, Wren IF, Herman DJ, Firestone MK. 2005. Plant invasion alters nitrogen
cycling by modifying the soil nitrifying community. Ecology Letters 8: 976–985.
Herrera J, Khidir HH, Eudy DM, Porras-Alfaro A, Natvig DO, Sinsabaugh RL. 2010.
Shifting fungal endophyte communities colonize Bouteloua gracilis: effect of host tissue
and geographical distribution. Mycologia 102: 1012–1026.
92
Herrera J, Ravin Poudel, Khidir HH. 2011a. Molecular characterization of coprophilous
fungal communities reveals sequences related to root-associated fungal endophytes
Microbial Ecology 61: 239–244.
Herrera J, Poudel R, Nebel KA, Collins SL. 2011b. Precipitation increases the abundance
of some groups of root-associated fungal endophytes in a semiarid grassland. Ecosphere
2:art50.
Hibbett DS, Ohman A, Kirk PM. 2009. Fungal ecology catches fire. New Phytologist 184:
279–282.
Hirsch G, Braun U. 1992. Communities of parasitic microfungi. In: Winterhoff W. (eds)
Handbook of Vegetation Science, Fungi in Vegetation Science. Dordrecht, The
Netherlands: Kluwer Academic Publishers 19: 225–250.
Hoch HC, Galvani CD, Szarowski DH, Turner JN. 2005. Two new fluorescent dyes
applicable for visualization of fungal cell walls. Mycologia 97: 580–588.
Hood ME, Shew HD. 1996. Applications of KOH-aniline blue fluorescence in the study of
plant-fungal interactions. Phytopathology 86: 704–708.
Hoog GS de, Gerrits van den Ende AHG. 1998. Molecular diagnostics of clinical strains of
filamentous Basidiomycetes. Mycoses 41: 183–189.
Huelsenbeck JP, Ronquist F. 2001. MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees.
Bioinformatics 17: 754–755.
Hückelhoven R. 2007. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and
susceptibility. Annual Reviews of Phytopathology 45: 101–127.
Hyde KD, Soytong K. 2008. The fungal endophyte dilemma. Fungal Diversity 33: 163–
173.
Jones MD, Forn I, Gadelha C, Egan MJ, Bass D, Massana R, Richards TA. 2011.
Discovery of novel intermediate forms redefines the fungal tree of life. Nature 474: 200–
203.
Jumpponen A, Trappe JM. 1998a. Dark septate endophytes: a review of facultative
biotrophic root-colonizing fungi. New Phytologist 140: 295–310.
Jumpponen A, Trappe JM. 1998b. Performance of Pinus contorta inoculated with two
strains of root endophytic fungus, Phialocephala fortinii: effects of synthesis system and
glucose concentration. Canadian Journal of Botany 76: 1205–1213.
Jumpponen, A. 2001. Dark septate endophytes – are they mycorrhizal? Mycorrhiza. 11:
207–211.
Junker C, Draeger S, Schulz B. 2012. A fine line – endophytes or pathogens in Arabidopsis
thaliana. Fungal Ecology 5: 657–662.
Kageyama SA, Mandyam KG, Jumpponen A. 2008. Diversity, function and potential
applications of root-associated endophytes, In: Mycorrhiza: state of the art genetics and
93
molecular biology, eco-function, biotechnology, eco-physiology, structure and
systematics. Springer, Berlin and Heidelberg, Germany 29–57.
Katoh K, Toh H. 2008. Improved accuracy of multiple ncRNA alignment by incorporating
structural information into a MAFFT-based framework. BMC Bioinformatics 9: 212.
Khidir HH, Eudy DM, Porras-Alfaro A, Herrera J, Natvig DO, Sinsabaugh RL. 2010. A
general suite of fungal endophytes dominate the roots of two dominant grasses in a
semiarid grassland. Journal of Arid Environments 74: 35–42.
Kiss L. 2012. Limits of nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer (ITS) sequences
as species barcodes for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 109:
E1811.
Klymiuk AA, Taylor TN, Taylor EL. 2013. Paleomycology of the Princeton Chert II. Dark-
septate fungi in the aquatic angiosperm Eorhiza arnoldii indicate a diverse assemblage of
root-colonizing fungi during the Eocene. Mycologia 105: 1100–1109.
Kovács GM. 2008. Magyarországi növények mikorrhizáltsági vizsgálatainak
összefoglalása. Mit mondhatnak ezek az adatok? Kitaibelia 8: 62–73.
Kovács GM, Bagi I. 2001. Mycorrhizal status of a mixed deciduous forest from the Great
Hungarian Plain with special emphasis on the potential mycorrhizal partners of Terfezia
terfezioides (Matt.) Trappe. Phyton 41: 161–168.
Kovács GM, Szigetvári C. 2002. Mycorrhizae and other root-associated fungal structures of
the plants of a sandy grassland on the Great Hungarian Plain. Phyton 42: 211–223.
Kovács GM, Kottke I, Oberwinkler F. 2003. Light and electron microscopic study on the
mycorrhizae of sporophytes of Botrychium virginianum – arbuscular structures resembling
fossil forms. Plant Biology 5: 574–580.
Kovács GM, Jankovics T, Kiss L. 2011. Variation in the nrDNA ITS sequences of some
powdery mildew species: Do routine molecular identification procedures hide valuable
information? European Journal of Plant Pathology 131: 135–141.
Kovács-Láng E, Kröel-Dulay GY, Kertész M, Fekete G, Mika J, Dobi-Wantuch I, Rédei T,
Rajkai K, Hahn I, Bartha S. 2000. Changes in the composition of sand grasslands along a
climatic gradient in Hungary and implications for climate change. Phytocoenologia 30:
385–407.
Krings M, Taylor TN, Hass H, Kerp H, Dotzler N, Hermsen EJ. 2007. Fungal endophytes
in a 400-million-yr-old land plant: infection pathways, spatial distribution, and host
responses. New Phytologist 174: 648–57.
Lahrmann U, Ding Y, Banhara A, Rath M, Hajirezaei MR, Döhlemann S, von Wirén N,
Parniske M, Zuccaro A. 2013 Host-related metabolic cues affect colonization strategies of a
root endophyte. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 110: 13965–13970.
Lim S, Notley-McRobb L, Lim M, Carter DA. 2004. A comparison of the nature and
abundance of microsatellites in 14 fungal genomes. Fungal Genetics and Biology 41:
1025–1036.
94
Lorang JM, Tuori RP, Martinez JP, Sawyer TL, Redman RS, Rollins JA, Wolpert TJ,
Johnson KB, Rodriguez RJ, Dickman MB, Ciuffetti LM . 2001. Green fluorescent protein
is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology 67: 1987–1994.
Lundberg DS, Lebeis SL, Paredes SH, Yourstone S, Gehring J, Malfatti S, Tremblay J,
Engelbrektson A, Kunin V, del Rio TG, Edgar RC, Eickhorst T, Ley RE, Hugenholtz P,
Tringe SG, Dangl JL. 2012. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.
Nature 488: 86–90.
Macia-Vicente JG, Jansson HB, Talbot NJ, Lopez-Llorca LV. 2009. Real-time PCR
quantification and live-cell imaging of endophytic colonization of barley (Hordeum
vulgare) roots by Fusarium equiseti and Pochonia chlamydosporia. New Phytologist 182:
213–228
Mandyam K, Fox C, Jumpponen A. 2012. Septate endophyte colonization and host
responses of grasses and forbs native to a tall grass prairie. Mycorrhiza 22: 109–119.
Mandyam K, Jumpponen A. 2005. Seeking the elusive function of root-colonising dark
septate endophytic fungi. Studies in Mycology 53: 173–189.
Mandyam K, Jumpponen A. 2008. Seasonal and temporal dynamics os arbuscular
mycorrhizal and dark septate endophytic fungi in a tallgrass prairie ecosystem are
minimally affected by nitrogen enrichment. Mycorrhiza 18: 145–155.
Mandyam K, Loughin T, Jumpponen A. 2010. Isolation and morphological and metabolic
characterization of common endophytes in annually burned tallgrass prairie. Mycologia
102: 813–821.
Marx DH. 1969. The influence of ectotrophic mycorrhizal fungi on the resistance of pine
roots to pathogenic infection. I. Antagonism of mycorrhizal fungi to root pathogenic
infection fungi and soil bacteria. Phytopathology 59: 153–163.
Mayerhofer MS, Kernaghan G, Harper KA. 2013. The effects of fungal root endophytes on
plant growth: a meta-analysis. Mycorrhiza 23: 119–128.
McLellan CA, Turbyville TJ, Wijeratne EMK, Kerschen A, Vierling E, Queitsch C,
Whitesell L, Gunatilaka LAA. 2007. A rhizosphere fungus enhances Arabidopsis
thermotolerance through production of an HSP90 inhibitor1. Plant Physiology 145: 174–
182.
Moora M, Berger S, Davison J, Öpik M, Bommarco R, Bruelheide H, Kühn I, Kunin WE,
Metsis M, Rortais A, Vanatoa A, Vanatoa E, Stout JC, Truusa M, Westphal C, Zobel M,
Walther GR. 2011. Alien plants associate with widespread generalist arbuscular
mycorrhizal fungal taxa: evidence from a continental-scale study using massively parallel
454-sequencing. Journal of Biogeography 38: 1305–1317.
Mucciarelli M, Scannerini S, Bertea C, Maffei M. 2003. In vitro and in vivo peppermint
(Mentha piperita) growth promotion by nonmycorrhizal fungal colonization. New
Phytologist 158: 579–591.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 155: 473–497.
95
Münzenberger B, Bubner B, Wöllecke J, Sieber TN, Bauer R, Fladung M, Hüttl RF. 2009.
The ectomycorrhizal morphotype Pinirhiza sclerotia is formed by Acephala
macrosclerotiorum sp. nov., a close relative of Phialocephala fortinii. Mycorrhiza 19:
4813–492.
Nagy LG, Kocsubé S, Csana Z, Kovács GM, Petkovits T, Vágvölgyi C, Papp T. 2012. Re-
mind the gap! Insertion–deletion data reveal neglected phylogenetic potential of the nuclear
ribosomal internal transcribed spacer (ITS) of fungi. PLoS ONE 7: e49794.
Nagy LG, Ohm RA, Kovács GM et al. 2014. Latent homology and convergent regulatory
evolution underlies the repeated emergence of yeasts. Nature Communications 5: 4471.
Narisawa K, Chen M, Hashiba T, Tsuneda A. 2003. Ultrastructural study on interaction
between a sterile, white endophytic fungus and eggplant roots. Journal of General Plant
Pathology 69: 292–296.
Narisawa K, Kawamata H, Currah RS, Hashiba T. 2002. Suppression of Verticillium wilt in
eggplant by some fungal root endophytes. European Journal of Plant Pathology 108: 103–
109.
Nei M, Li W. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of
restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 76:
5269–5273.
Newsham KK. 2011. A meta-analysis of plant responses to dark septate root endophytes.
New Phytologist 190: 783–793.
Nilsson RH, Kristiansson E, Ryberg M, Hallenberg N, Larsson KH. 2008. Intraspecific ITS
variability in the Kingdom Fungi as expressed in the international sequence databases and
its implications for molecular species identification. Evolutionary Bioinformatics Online 4:
193–201.
Nylander JA, Wilgenbusch JC, Warren DL, Swofford DL. 2008. AWTY (are we there
yet?): A system for graphical exploration of MCMC convergence in Bayesian phylogenetic
inference. Bioinformatics 24: 581–583.
O’Dell TE, Massicotte HB, Trappe JM. 1993. Root colonization of Lupinus latifolius
Agardh. and Pinus contorta Dougl. by Phialocephala fortinii Wang & Wilcox. New
Phytologist 124: 93–100.
Ohki T, Masuya H, Yonezawa M, Usuki F, Narisawa K, Hashiba T. 2002. Colonization
process of the root endophytic fungus Heteroconium chaetospira in roots of Chinese
cabbage. Mycoscience 43: 191–194.
Oldroyd GED. 2013. Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial
symbiotic associations in plants. Nature Reviews Microbiology 11: 252–263.
Olsson PA, Eriksen BE, Dahlberg A. 2004. Colonization by arbuscular mycorrhizal and
fine endophytic fungi in herbaceous vegetation in the Canadian High Arctic. Canadian
Journal of Botany 82: 1547–1556.
96
Otero JT, Ackerman JD, Bayman P. 2004. Differences in mycorrhizal preferences between
two tropical orchids. Molecular Ecology 13: 2393–2404.
Paparu P, Dubois T, Gold C, Niere B, Adipala E, Coyne D. 2006. Colonisation pattern of
nonpathogenic Fusarium oxysporum, a potential biological control agent, in roots and
rhizomes of tissue cultured Musa plantlets. Annals of Applied Biology 149: 1–8.
Parniske M. 2008. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses. Nature
Reviews Microbiology 6: 763–775.
Peterson RL, Wagg C, Pautler M. 2008. Associations between microfungal endophytes and
roots: do structural features indicate function? Botany 86: 445–456.
Petrini O. 1991. Fungal endophytes of tree leaves. In: Andrews JH. & Hirano SS. (eds)
Microbial Ecology of Leaves. Springer-Verlag, New York 179–197.
Phan HT, Burgess LW, Summerell BA, Bullock S, Liew ECY, et al. 2004. Gibberella
gaditjirrii (Fusarium gaditjirrii) sp. nov., a new species from tropical grasses in Australia.
Studies in Mycology 50: 261–272.
Pintye A, Kovács GM. 2006. Isolation and characterisation of root colonizing endophytic
fungi from a semi-arid grassland of the Great Hungarian Plain. Annual Meeting of the
Hungarian Society for Microbiology, Abstracts, Acta Microbiologica et Immunologica
Hungarica 53: 333.
Popper ZA, Fry SC. 2003 Primary cell wall composition of bryophytes and charophytes.
Annals of Botany 91: 1–12.
Porras-Alfaro A, Bayman P. 2011. Hidden fungi, emergent properties: Endophytes and
microbiomes. Annual Review of Phytopathology 49: 291–315.
Porras-Alfaro A, Herrera J, Natvig DO, Lipinski K, Sinsabaugh RL. 2011. Diversity and
distribution patterns of soil fungal communities in a semiarid grassland. Mycologia 103:
10–21.
Porras-Alfaro A, Herrera J, Sinsabaugh RL, Odenbach KJ, Lowrey T, Natvig DO. 2008.
Novel root fungal consortium associated with a dominant desert grass. Applied and
Environmental Microbiology 74: 1308–1315.
Posada D. 2008. jModelTest: Phylogenetic Model Averaging. Molecular Biology and
Evolution 25: 1253–1256.
Postma JWM, Olsson PA, Falkengren-Grerup U. 2007. Root colonization by arbuscular
mycorrhizal, fine endophytic and dark septate fungi across a pH gradient in acid beech
forests. Soil Biology and Biochemistry 39: 400–408.
Poulin R, Krasnov BR, Mouillot D. 2011. Host specificity in phylogenetic and geographic
space. Trends in Parasitology 27: 355–361.
Pringle A, Bever JD, Gardes M, Parrent JL, Rillig MC, Klironomos JN. 2009. Mycorrhizal
symbioses and plant invasions. Annual Reviews of Ecology Evolution and Systematics 40:
699–715.
97
Prodi A, Sandalo S, Tonti S, Nipoti P, Pisi A. 2008. Phialophora-like fungi associated with
kiwifruit elephantiasis. Journal of Plant Pathology 90: 487–494.
Promputtha I, Lumyong S, Dhanasekaran V, McKenzie EHC, Hyde KD, Jeewon RA. 2007
Phylogenetic evaluation of whether endophytes become saprotrophs at host senescence.
Microbial Ecology 53: 579–90.
Quaedvlieg W, Binder M, Groenewald JZ, Summerell BA, Carnegie AJ, Burgess TI, Crous
PW. 2014. Introducing the consolidated species concept to resolve species in the
Teratosphaeriaceae. Persoonia 33: 1–40.
Quaedvlieg W, Kema GHJ, Groenewald JZ, Verkley GJM, Seifbarghi S, et al. 2011.
Zymoseptoria gen. nov.: a new genus to accommodate Septoria-like species occurring on
graminicolous hosts. Persoonia 26: 57–69.
Queloz V, Sieber TN, Holdenrieder O, McDonald BA, Grünig CR. 2011. No
biogeographical pattern for a root-associated fungal species complex. Global Ecology and
Biogeography 20: 16–169.
Rath M, Grolig F, Haueisen J, Imhof S. 2014. Combining microtomy and confocal laser
scanningmicroscopy for structural analyses of plant–fungus associations. Mycorrhiza 24:
293–300.
Read DJ, Haselwandter K. 1981. Observations on the mycorrhizal status of some alpine
plant communities. New Phytologist 88: 341–352.
Reddy MP, Sarla N, Siddiq EA. 2002. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism
and its application in plant breeding. Euphytica 128: 9–17.
Redman R S, Sheehan KB, Stout RG, Rodriguez JR, Henson JM. 2002. Thermotolerance
generated by plant/fungal symbiosis. Science 298: 1581.
Redman RS, Dunigan DD, Rodriguez RJ. 2001. Fungal symbiosis from mutualism to
parasitism: who controls the outcome, host or invader? New Phytologist 151: 705–716.
Rehner SA, Samuels GJ. 1994. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from
nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Mycological Research 98: 625–634.
Reininger V, Grünig CR, Sieber TN. 2012. Host species and strain combination determine
growth reduction of spruce and birch seedlings colonized by rootassociated dark septate
endophytes. Environmental Microbiology 14: 1064–1076.
Remy W, Taylor TN, Hass H, Kerp H. 1994. Four hundred-million-year-old vesicular
arbuscular mycorrhizae. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 91: 11841–
11843.
Reynolds ES. 1963. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in
electron microscopy. Journal of Cell Biology 17: 208–212.
Rice AV, Currah RS. 2002. New perspectives on the niche and holomorph of the
myxotrichoid hyphomycete, Oidiodendron maius. Mycological Research 106: 1463–1467.
98
Richardson DM, Allsopp N, D'Antonio CM, Milton SJ, Rejmanek M. 2000. Plant invasions
– the role of mutualisms. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society 75:
65–93.
Robinson CH. 2001. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytologist 151:
341–353.
Rodriguez R, White J, Arnold A, Redman R. 2009. Fungal endophytes: diversity and
functional roles. New Phytologist 182: 314–330.
Rodriguez RJ, Henson J, Van Volkenburgh E, Hoy M, Wright L, Beckwith F, Kim Y,
Redman RS. 2008. Stress tolerance in plants via habitat-adapted symbiosis. International
Society of Microbial Ecology 2: 404–416.
Ronquist F, Huelsenbeck JP. 2003. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under
mixed models. Bioinformatics 19: 1572–1574.
Rudgers J, Mattingly W, Koslow J. 2005. Mutualistic fungus promotes plant invasion into
diverse communities. Oecologia 144: 463–471.
Saikkonen K, Faeth SH, Helander M, Sullivan TJ. 1998. Fungal endophytes: A continuum
of interactions with host plants. Annual Review of Ecology Evolution and Systematics 29:
319–343.
Sánchez Márquez S, Bills GF, Domínguez Acuna L, Zabalgogeazcoa I. 2010. Endophytic
mycobiota of leaves and roots of the grass Holcus lanatus. Fungal Diversity 41: 115–123.
Sánchez Márquez S, Bills GF, Zabalgogeazcoa I. 2008. Diversity and structure of the
fungal endophytic assemblages from two sympatric coastal grasses. Fungal Diversity 33:
87–100.
Schadt CW, Mullen RB, Schmidt SK. 2001. Isolation and phylogenetic identification of a
dark-septate fungus associated with the alpine plant Ranunculus adoneus. New Phytologist
150: 747–755.
Schardl CL, Leuchtmann A, Spiering MJ. 2004. Symbioses of grasses with seedborne
fungal endophytes. Annual Reviews of Plant Biology 55: 315–340.
Schoch CL, Crous PW, Groenewald JZ, Boehm EWA, Burgess TI et al. 2009. A class-wide
phylogenetic assessment of Dothideomycetes. Studies in Mycology 64: 1–15.
Schoch CL, Seifert KA, Huhndorf S, Robert V, Spouge JL, Levesque CA, Chen W and
Fungal Barcoding Consortium. 2012. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS)
region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy
of Sciences USA 109: 6241–6246.
Schulz B, Boyle C. 2005. The endophytic continuum. Mycological Research 109: 661–686.
Schulz B, Römmert AK, Dammann U, Aust HJ, Strack D. 1999. The endophyte-host
interaction: a balanced antagonism? Mycological Research 103: 1275–1283.
99
Séjalon-Delmas N, Magnier A, Douds DD, Bécard G. 1998. Cytoplasmic autofluorescence
of an arbuscular mycorrhizal fungus Gigaspora gigantea and nondestructive fungal
observations in planta. Mycologia 90: 921–926.
Sieber TN, Grünig CR. 2006. Biodiversity of fungal root-endophyte communities and
populations in particular of the dark septate endophyte Phialocephala fortinii. In: Schulz B,
Boyle C, Sieber TN. (eds) Microbial Root Endophytes. Springer, Berlin 107–132.
Sieber TN, Grünig CR. 2013. Fungal root endophytes. In: Wasel Y, Eshel A, Kafkafi U.
(eds) Plant roots: the hidden half, 3rd ed, Marcel Dekker, New York 38: 1–49.
Silvestro D, Michalak I. 2012. raxmlGUI: A graphical front-end for RAxML. Organisms
Diversity & Evolution 12: 335–337.
Smith SE, Read DJ. 2008. Mycorrhizal symbiosis. Academic Press, Cambridge.
Spadaro D, Galliano A, Pellegrino C, Gilardi G, Garibaldi A, Gullino ML. 2010. Dry
matter and mineral composition, together with commercial storage practices, influence the
development of skin pitting caused by Cadophora luteo-olivacea on kiwifruit ‘Hayward’.
Journal of Plant Pathology 92: 339–346.
Spatafora JW, Sung G-H, Sung J-M, Hywel-Jones NL, White JFJ. 2007. Phylogenetic
evidence for an animal pathogen origin of ergot and the grass endophytes. Molecular
Ecology 16: 1701–1711.
Staden R, Beal KF, Bonfield JK. 2000. The Staden package, 1998. Methods in Molecular
Biology 132: 115–130.
Stone JK, Bacon CW, White JF. 2000. An overview of endophytic microbes: endophytism
defined. In: Bacon CW, White JF. (eds) Microbial endophytes. Dekker, New York 3–30.
Stoyke G, Currah RS. 1993. Resynthesis in pure culture of a common subalpine fungus-
root association using Phialocephala fortinii and Menziesia ferruginea (Ericaceae). Arctic
and Alpine Research 25: 189–193.
Su YY, Guo LD, Hyde KD. 2010. Response of endophytic fungi of Stipa grandis to
experimental plant function group removal in Inner Mongolia steppe, China. Fungal
Diversity 43: 93–101.
Su ZZ, Mao LJ, Li N, Feng XX, Yuan ZL, Wang LW, Lin FC, Zhang CL. 2013. Evidence
for biotrophic lifestyle and biocontrol potential of dark septate endophyte Harpophora
oryzae to rice blast disease. PLoS ONE 8. e61332.
Suetrong S, Schoch CL, Spatafora JW, Kohlmeyer J, Volkmann- Kohlmeyer B, et al. 2009.
Molecular systematics of the marine Dothideomycetes. Studies in Mycology 64: 155–173.
Szigetvári C, Benkő Z. 2004. Parlagfű. In: Mihály B, Botta-Dukát Z. (eds) Biológiai
inváziók Magyarországon. Özönnövények. Budapest: TermészetBÚVÁR Alapítvány Kiadó
337–370.
Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, and Kumar S. 2011. MEGA5:
Molecular Evolutionary Genetics Analysis using maximum likelihood, evolutionary
100
distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731–
2739.
Tejesvi MV, Mahesh B, Nalini MS, Prakash HS, Kini KR, Subbiah V, Shetty HS. 2005.
Endophytic fungal assemblages from inner bark and twig of Terminalia arjunia W. & A.
(Combretaceae). World Journal of Microbiology and Biotechnology 21: 1535–1540.
Tellenbach C, Grünig CR, Sieber TN. 2011. Negative effects on survival and performance
of Norway spruce seedlings colonized by dark septate root endophytes are primarily
isolate-dependent. Environmental Microbiology 13: 2508–2517.
Trappe JM. 1996. What is a mycorrhiza? In: Azcon-Aguilar C, Barrea J-M. (eds)
Mycorrhiza in integrated systems–from genes to plant development. Proceedings of the 4th
European Symposium on Mycorrhizae, EC Report EUR 16728, Luxembourg 3–6.
Treu R, Laursen GA, Stephenson SL, Landolt JC, Densmore R. 1996. Mycorrhizae from
Denali National Park and Preserve, Alaska. Mycorrhiza 6: 21–29.
Trouvelot S, van Tuinen D, Hijri M, Gianinazzi-Perason V. 1999. Visualization of
ribosomal DNA loci in spore interphasic nuclei of glomalean fungi by fluorescence in situ
hybridization. Mycorrhiza 8: 203–206.
Tsuneda A, Wang W, Tsuneda I, Currah RS. 2009. Endomembrane system of aspen root
cells plays a key role in defense against a common fungal root endophyte, Cryptosporiopsis
radicicola. Mycologia 101: 182–189.
Udvardy L. 2004. Bálványfa. In: Mihály B, Botta-Dukát Z. (eds) Biológiai inváziók
Magyarországon. Özönnövények. Budapest: TermészetBÚVÁR Alapítvány Kiadó 143–
160.
Uma GE, Muthukumar T, Sathiyadash K, Muniappan V. 2010. Mycorrhizal and dark
septate fungal associations in gingers and spiral gingers. Botany 88: 500–511.
Upson R, Read DJ, Newsham KK. 2009. Nitrogen form influences the response of
Deschampsia antarctica to dark septate root endophytes. Mycorrhiza 20: 1–11.
Usuki F, Narisawa K. 2007. A mutualistic symbiosis between a dark septate endophytic
fungus, Heteroconium chaetospira, and a nonmycorrhizal plant, Chinese cabbage.
Mycologia 99: 175–84.
van de Peer Y, de Wachter Y. 1994. TREECON for Windows: a software package for the
construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment.
Computer Applications in the Biosciences 10: 569–70.
Vandenkoornhuyse P, Baldauf SL, Leyval C, Straczec J, Young JPW. 2002. Extensive
fungal diversity in plant roots. Science 295: 2051
Várallyai Gy. 1993. Soils in the region between the rivers Danube and Tisza (Hungary). In:
Szujkó-Lacza J, Kováts D. (eds) The Flora of the Kiskunság National Park. Magyar
Természettudományi Múzeum, Budapest 21–42.
101
Verkley GJM, Dukik K, Renfurm R, Göker M, Stielow JB. 2014. Novel genera and species
of Coniothyrium-like fungi in Montagnulaceae (Ascomycota). Persoonia 32: 25–51.
Verma S, Varma A, Rexer K-H, Hassel A, Kost G, Sarabhoy A, Bisen P, Bütehorn B,
Franken P. 1998. Piriformospora indica, gen. et sp. nov., a new root-colonizing fungus.
Mycologia 90: 896–903.
Vierheilig H, Schweiger P, Brundrett M. 2005. An overview of methods for the detection
and observation of arbuscular mycorrhizal fungi in roots. Physiologia Plantarum 125: 393–
404.
Vilgalys R, Hester M. 1990. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically
amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of Bacteriology 172:
4238–4246.
Voigt K, Wöstemeyer J. 2000. Reliable amplification of actin genes facilitates deep-level
phylogeny. Microbiological Research 155: 179–195.
Wagner M, Haider S. 2012. New trends in fluorescence in situ hybridization for
identification and functional analyses of microbes. Current Opinion in Biotechnology 23:
96–102.
Waller F, Achatz B, Baltruschat H, Fodor J, Becker K, Fischer M et al. 2005. The
endophytic fungus Piriformospora indica reprograms barley to salt-stress tolerance, disease
resistance, and higher yield. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 102:
13386–13391.
Walsh E, Luo J, Zhang N. 2014. Acidomelania panicicola gen. et. sp. nov. from
switchgrass roots in acidic New Jersey Pine Barrens. Mycologia 106: 856–864.
Wang CJK, Wilcox HE. 1985. New species of ectendomycorrhizal and pseudomycorrhizal
fungi: Phialophora finlandia, Chloridium paucisporum, and Phialocephala fortinii.
Mycologia 77: 951–958.
Weising K, Nybom H, Wolff K, Kahl G. (eds) 2005. DNA Fingerprinting in Plants.
Principles, Methods, and Applications, 2nd ed, CRC Press, Taylor & Francis Group, USA.
Westphal A, Xing L, Goodwin SB. 2011 Mature watermelon vine decline: Suppression
with fumigants of a soil-borne problem and association with Rhizopycnis vagum. Crop
Protection 30: 111–117.
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor JW. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal
ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ.
(eds) PCR Protocols: A guide to methods and applications, Academic Press Inc., New York
315–322.
Wilcox HE, Wang CJK. 1987. Mycorrhizal and pathological associations of dematiaceous
fungi in roots of 7-month-old tree seedlings. Canadian Journal of Forest Research 17:
884–889.
Wilson D. 1995. Endophyte: the evolution of a term, and clarification of its use and
definition. Oikos 73: 274–76.
102
Xu L, Zhou L, Zhao J, Li J, Li X, Wang J. 2008. Fungal endophytes from Dioscorea
zingiberensis rhizomes and their antibacterial activity. Letters in Applied Microbiology 46:
68–72.
Yonezawa M, Takahashi J, Hashiba T, Usuki F. Narisawa K. 2004. Anatomical study on
the interaction between the root endophytic fungus Heteroconium chaetospira and Chinese
cabbage. Mycoscience 45: 367–371.
Young ND, Healy J. 2003. GapCoder automates the use of indel characters in phylogenetic
analysis. BMC Bioinformatics 4: 6.
Yu T, Nassuth A, Peterson RL. 2001. Characterization of the interaction between the dark
septate fungus Phialocephala fortini and Asparagus officinalis roots. Canadian Journal of
Microbiology 47: 741–753.
Zaffarano PL, Queloz V, Duò A, Grünig CR. 2011. Sex in the PAC: A hidden affair in dark
septate endophytes? BMC Evolutionary Biology 11: 282.
Zhang Y, Crous PW, Schoch CL, Hyde KD. 2012. Pleosporales. Fungal diversity 53: 1–
221.
Zhang Y, Schoch CL, Fournier J, Crous PW, De Gruyter J, Woudenberg JHC, Hirayama K,
Tanaka K, Pointing SB, Spatafora JW, Hyde KD 2009. Multi-locus phylogeny of
Pleosporales: a taxonomic, ecological and evolutionary re-evaluation. Studies in Mycology
64: 85–102.
Zhang YH, Zhuang WY. 2004. Phylogenetic relationships of some members in the genus
Hymenoscyphus (Ascomycetes, Helotiales). Nova Hedwigia 78: 475–484.
Zimmerman E, Peterson RL. 2007. Effect of a dark septate fungal endophyte on seed
germination and protocorm development in a terrestrial orchid. Symbiosis 43: 45–52.
Zuccaro A, Lahrmann U, Güldener U, Langen G, Pfiffi S. et al. 2011. Endophytic life
strategies decoded by genome and transcriptome analyses of the mutualistic root symbiont
Piriformospora indica. PLoS Pathogens 7: e1002290.
103
10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Első sorban szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Kovács M.
Gábornak, munkámban nyújtott rengeteg segítségért, a tanácsokért, építő kritikákért,
odafigyelésért, végtelen türelméért, lelkiismeretes témavezetéséért, és akinek gondolatai,
támogatása és tanácsai nem csak a szakmai, hanem a mindennapi életben is nagy
segítségemre voltak.
Köszönöm Prof. Böddi Béla tanszékvezetőnek, hogy munkámat az ELTE
Növényszervezettani Tanszékén végezhettem, valamint a tanszék minden tagjának, hogy
kellemes körülmények között tudtam dolgozni.
Köszönetek szeretnék mondani Dr. Vági Pálnak a munkáim során – különösen a
különböző mikroszkópós vizsgálatokban – nyújtott rengeteg segítségért, valamint
köszönöm Dr. Bóka Károlynak és Gergely Csillának az elektronmikroszkópos munkákban
nyújtott segítséget, Dózsainé Kerekes Piroskának pedig a technikai segítséget.
Szeretnék köszönetet mondani a mikológia (men(s)aa) csoport minden jelenlegi és
volt tagjának – Balázs K Tímea, Lukács F Alena, Németh B Julianna, Dr. Pintye
Alexandra, Seress Diána, Gáspár K Bence, Németh Z. Márk, Zajta Erik – hogy egy ilyen
fantasztikus légkörben végezhettem és végezhetem munkámat.
Dr. Pintye Alexandrának külön köszönöm, hogy a bevezetett a DSE gombák
vizsgálatának technikai részleteibe, és Neki valamint Dr. Bereczki Zsoltnak az ISSR
vizsgálatban nyújtott segítségüket.
Köszönöm Prof. Pedro W. Crous-nak és Dr. Ewald Groenewald-nak segítségüket,
tanácsaikat és hogy a CBS Fungal Biodiversity Centerben végezhettem taxonómiai munkák
jelentős részét, valamint szeretnék köszönetet mondani a CBS Evolutionary
Phytopathology csoport minden tagjának, hogy minden szempontból fantasztikus
körülmények között dolgozhattam.
Köszönöm családomnak és barátaimnak, hogy támogatták a pályámat, mellettem
álltak, segítettek és nem utolsó sorban nagyban segítették szakmai fejlődésemet.
A dolgozatban szereplő kutatásokat az OTKA K27727 és a K109102 támogatta. A
FEMS ösztöndíj támogatása nyújtott lehetőséget, hogy taxonómiai munkáim egy részét
Hollandiában a CBS Fungal Biodiversity Centerben végezhettem.
Köszönöm apukámnak, Knapp Gábornak, hogy megismertett a természettudományos
világgal és gondolkodásmóddal. Ezért az Ő tiszteletére és emlékére ajánlom ezt a
dolgozatot.
104
11. FÜGGELÉK
A DSE közösség csoportjainak azonosításához az ITS és LSU régiókat határoztuk
meg, és az amplifikálásához az F.1.a táblázatban szereplő reakcióelegyeket használtuk. Az
elegyet 20 µl végtérfogatban mértük össze és a reakciók profilja a következő volt: 3 m 94 oC-on, ezután 35 ciklus 30 s denaturáció 94
oC-on, denaturáció 30 s annealing 52
oC-on, 90
s extenzió 72 oC-on. A ciklusok után 10 m végső extenzió következett 72
oC-on.
A DSE-4, DSE-7 és DSE-8 csoportok taxonómiai vizsgálatához az ITS, LSU, SSU,
ACT, TUB, CAL és TEF régiókat határoztuk meg, és az amplifikálásához az F.1.b
táblázatban szereplő reakcióelegyeket használtuk. Az elegyet 12,5 µl végtérfogatban
mértük össze, és a reakciók profilja a következő volt: Az ITS és LSU valamint az SSU
régiók esetén; 5 m denaturáció 94 oC-on, ezután 35 ciklus 30 s denaturáció 94
oC-on, 50 s
annealing 48 o
C-on, 2 m extenzió 72 o
C-on. A ciklusok után 7 m végső extenzió következett
72 o
C-on; Az aktin és tubulin gének esetében 5 m denaturáció 94 oC-on, ezután 35 ciklus 30
s denaturáció 94 o
C-on, 50 s annealing 55 (ACT) illetve 22 o
C-on (TUB), 1 m extenzió 72
oC-on. A ciklusok után 7 m végső extenzió következett 72
oC-on.
A CAL és TEF régiók esetében touch-down PCR-t végeztünk: 5 m denaturáció 94 oC-on, ezután összesen 40 ciklus 30 s denaturáció 94
oC-on, 50 s annealing 65
oC-ról 60
oC-
ra csökkentve 16 ciklus alatt (CAL) illetve 58 o
C-ról 52 o
C-ra csökkentve 10 ciklus alatt
(TEF), 2 m extenzió 72 oC-on. A ciklusok után 7 m végső extenzió következett 72
oC-on.
F.1 a táblázat. Az izolátumok meghatározásához használt PCR reakcióelegyek
Összetevők Összetevők mennyisége (µl)
ITS LSU
Target DNS 1,00 1,00
H2O 10,00 10,00 MgCl2 (Fermentas, 25 mM) 2,00 2,00 (NH4)2SO4 puffer (Fermentas) 2,00 2,00
dNTP (Fermentas, 2 mM) 2,00 2,00 F primer (Sigma, 10 µM) 1,00 1,00 R primer (Sigma, 10 µM) 1,00 1,00 LC Taq (Fermentas 1U/µl) 1,00 1,00
F.1 b táblázat. A taxonómiai vizsgálatokhoz használt PCR reakcióelegyek
Összetevők Összetevők mennyisége (µl)
TUB CAL TEF ACT ITS LSU SSU
target DNS 1,00 3,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
H2O 7,77 5,26 7,45 8,65 7,06 7,06 6,25 MgCl2 (BioLine, 25 mM) 0,75 1,26 1,00 0,50 1,26 1,26 1,00 Puffer (BioLine) 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 2,50
dNTP (Fermentas, 2 mM) 0,50 0,50 0,50 0,50 0,70 0,70 0,50 F primer (10µM, Sigma, 10 µM) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 R primer (10µM, Sigma, 10 µM) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 BioTaq (BioLine, 5 U/µl) 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,05 DMSO (Sigma) 0,63 0,00 0,70 0,00 0,63 0,63 0,70
105
Az ISSR-PCR-ekhez az F.1.c táblázatban szereplő reakcióelegyeket használtuk. Az elegyet
10 µl végtérfogatban mértük össze, és a reakciók profilja a következő volt: 5 m denaturáció
94 oC-on, ezután 35 ciklus 40 s denaturáció 94
oC-on, 30 s annealing a primereknek
megfelelő hőmérsékleteken [42 o
C-on az (AAG)6, (AAC)6, (ATC)6 és (AG)9, 40 o
C-on az
(AC)8, 56 o
C-on az (AGG)6] illetve 84 o
C-on a (CCG)6], 60 s extenzió 72 o
C-on. A ciklusok
után 10 m végső extenzió következett 72 oC-on.
A kiválsztott DSE-1 és DSE-7 csoportokba tartozó izolátumok célzott gyűjtésekor a
diagnosztikai PCR-ekhez az F.1.d táblázatban szereplő reakcióelegyeket használtuk. Az
elegyet 10 µl végtérfogatban mértük össze és a reakciók profilja a következő volt: 5 m
denaturáció 94 oC-on, ezután 35 ciklus 30 s denaturáció 94
oC-on, 30 s annealing 60
oC-on
(DSE-1) illetve 55 o
C-on (DSE-7), 40 s extenzió 72 o
C-on. A ciklusok után 5 m végső
extenzió következett 72 oC-on.
F.1 c táblázat. Az ISSR PCR-ekhez használt reakcióelegy
Összetevők Összetevők mennyisége (µl)
Target DNS 0,50
H2O 6,40
DreamTaq puffer (Fermentas) 1,00 dNTP (Fermentas, 2 mM) 1,00 primer (Sigma, 10 µM) 1,00 DreamTaq (Fermentas 5 U/µl) 0,10
F.1 d táblázat. A diagnosztikai PCR-ekhez használt reakcióelegy
Összetevők Összetevők mennyisége (µl)
Target DNS 0,50
H2O 6,40 DreamTaq puffer (Fermentas) 1,00 dNTP (Fermentas, 2 mM) 1,00 F primer (Sigma, 10 µM) 0,50 R primer (Sigma, 10 µM) 0,50 DreamTaq (Fermentas 5 U/µl) 0,10
106
ITS: internal transcribed spacer; LSU: 28S RNS nagy alegysége; SSU: 18S RNS kis alegysége; ACT: aktin; TUB: béta-tubulin; CAL:
kalmodulin; TEF: transzlációs elongációs faktor 1-alfa. CBS: CBS Fungal Biodiversity Centre, Utrecht, Hollandia
F2. táblázat A taxonómiai munkákhoz használt 40 DSE izolátum adatai
CBS szám
törzs szám
gazdanövény REF szám
ITS LSU SSU ACT TUB CAL TEF
135627 dse-7 / 1 Bromus tectorum - KP183966 KP184005 KP184044 KP184093 KP184192 KP184122 KP184160
135628 dse-7 / 2 Festuca vaginata - KP183965 KP184035 KP184054 KP184083 KP184193 KP184123 KP184161
135629 dse-7 / 3 Festuca vaginata - KP183980 KP184006 KP184067 KP184106 KP184194 KP184144 KP184183
135630 dse-7 / 4 Stipa borysthenica - KP183987 KP184032 KP184058 KP184090 KP184195 KP184126 KP184162
135631 dse-7 / 5 Festuca vaginata - KP183968 KP184033 KP184051 KP184101 KP184196 KP184142 KP184180
135632 dse-7 / 6 Festuca vaginata - KP183969 KP184034 KP184052 KP184103 KP184197 KP184143 KP184181
135633 dse-7 / 7 Festuca vaginata REF123 KP183984 KP184031 KP184072 KP184110 KP184198 KP184149 KP184187
135634 dse-7 / 8 Festuca vaginata REF124 KP183985 KP184028 KP184073 KP184111 KP184199 KP184151 KP184188
135635 dse-7 / 9 Festuca vaginata REF125 KP183986 – – – – – –
135636 dse-7 / 10 Festuca vaginata REF127 KP183976 KP184008 KP184076 KP184114 KP184200 KP184152 –
135637 dse-7 / 11 Festuca vaginata REF128 KP183978 KP184023 KP184074 KP184112 KP184201 KP184153 KP184189
135638 dse-7 / 12 Festuca vaginata REF129 KP183981 KP184024 KP184069 KP184107 KP184202 KP184145 KP184184
135639 dse-7 / 13 Fumana procumbens REF130 KP183982 KP184027 KP184068 KP184108 KP184203 KP184146 KP184185
135640 dse-7 / 14 Festuca vaginata REF131 KP183979 KP184013 KP184071 KP184115 KP184204 KP184148 KP184191
135641 dse-7 / 15 Ailanthus altissima REF132 KP183970 KP184037 KP184055 KP184086 KP184205 KP184124 KP184163
135642 dse-7 / 16 Festuca vaginata REF133 KP183967 KP184026 KP184053 KP184097 KP184206 KP184141 KP184182
135643 dse-7 / 17 Stipa borysthenica REF135 KP183988 KP184022 KP184048 KP184091 KP184207 KP184139 KP184171
135644 dse-7 / 18 Festuca vaginata REF136 KP183989 KP184030 KP184059 KP184100 KP184208 KP184127 KP184179
135645 dse-7 / 19 Stipa borysthenica REF137 KP183990 KP184036 KP184060 KP184092 KP184209 KP184140 KP184172
135646 dse-7 / 20 Festuca vaginata REF138 KP183994 KP184015 KP184066 KP184084 KP184210 KP184128 KP184164
135647 dse-7 / 21 Festuca vaginata REF139 KP183997 KP184018 KP184061 KP184094 KP184211 KP184125 KP184175
135648 dse-7 / 22 Festuca vaginata - KP183993 KP184016 KP184062 KP184104 KP184212 KP184129 KP184165
135649 dse-7 / 23 Festuca vaginata - KP183991 KP184025 KP184063 KP184105 KP184213 KP184130 KP184170
135650 dse-7 / 24 Festuca vaginata - KP183998 KP184019 KP184049 KP184102 KP184214 KP184131 KP184166
135651 dse-7 / 25 Festuca vaginata - KP183996 KP184017 KP184064 KP184087 KP184215 KP184132 KP184167
135652 dse-7 / 26 Festuca vaginata - KP183992 KP184020 KP184050 KP184089 KP184216 KP184133 KP184168
135653 dse-7 / 27 Festuca vaginata - KP183995 KP184021 KP184065 KP184085 KP184217 KP184134 KP184169
135654 dse-7 / 28 Festuca vaginata - KP183972 KP184010 KP184045 KP184095 KP184218 KP184135 KP184176
135655 dse-7 / 29 Festuca vaginata - KP183975 KP184011 KP184046 KP184096 KP184219 – KP184177
135656 dse-7 / 30 Festuca vaginata - KP183971 KP184007 KP184047 KP184088 KP184220 KP184136 KP184178
135657 dse-7 / 31 Festuca vaginata - KP183977 KP184009 KP184075 KP184113 KP184221 KP184150 KP184190
135658 dse-7 / 32 Stipa borysthenica - KP183983 KP184029 KP184070 KP184109 KP184222 KP184147 KP184186
135659 dse-7 / 33 Stipa borysthenica - KP183973 KP184012 KP184056 KP184098 KP184223 KP184137 KP184173
135660 dse-7 / 34 Stipa borysthenica - KP183974 KP184014 KP184057 KP184099 KP184224 KP184138 KP184174
135661 dse-4 / 099 Populus alba REF099 KP184002 KP184041 KP184077 KP184119 – KP184154 –
135760 dse-4 / 100 Populus alba REF100 KP184004 KP184042 KP184078 KP184120 – KP184155 –
135662 dse-4 / 101 Populus alba REF101 KP184003 KP184043 KP184079 KP184121 – KP184156 –
135663 dse-8 / B Festuca vaginata - KP183999 KP184038 KP184080 KP184117 – KP184157 –
135664 dse-8 / 143 Festuca vaginata REF143 KP184000 KP184039 KP184081 KP184116 – KP184159 –
135761 dse-8 / S Festuca vaginata - KP184001 KP184040 KP184082 KP184118 – KP184158 –
107
F3. táblázat A 241 izolátum, valamint a célzottan gyűjtött Cadophora sp. izolátumok adatai
Izolátum Csoport GenBank
szám Gazdanövény Mintavételi terület
Gyűjtési
évszak
REF001 DSE-1 JN859221 Juniperus communis Bugac Nyár
REF002 DSE-1 JN859222 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz
REF003 DSE-1 JN859223 Helianthemum ovatum Fülöpháza Nyár
REF004 DSE-1 JN859224 Juniperus communis Bugac Nyár
REF005 DSE-1 JN859225 Juniperus communis Bugac Nyár
REF006 DSE-1 JN859226 Juniperus communis Bugac Nyár
REF007 DSE-1 JN859227 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár
REF008 DSE-1 JN859228 Juniperus communis Bugac Ősz
REF009 DSE-1 JN859229 Juniperus communis Fülöpháza Ősz
REF010 DSE-1 JN859230 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz
REF011 DSE-1 JN859231 Juniperus communis Fülöpháza Nyár
REF012 DSE-1 JN859232 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF013 DSE-1 JN859233 Helianthemum ovatum Fülöpháza Nyár
REF014 DSE-1 JN859234 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Ősz
REF015 DSE-1 JN859235 Juniperus communis Fülöpháza Ősz
REF016 DSE-1 JN859236 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz
REF017 DSE-1 JN859237 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF018 DSE-1 JN859238 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF019 DSE-1 JN859239 Juniperus communis Bugac Tavasz
REF020 DSE-1 JN859240 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF021 DSE-1 JN859241 Juniperus communis Bugac Ősz
REF022 DSE-1 JN859242 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Ősz
REF023 DSE-1 JN859243 Juniperus communis Fülöpháza Nyár
REF024 DSE-1 JN859244 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF025 DSE-1 JN859245 Juniperus communis Bugac Ősz
REF026 DSE-1 JN859246 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár
REF027 DSE-1 JN859247 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár
REF028 DSE-1 JN859248 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár
REF029 DSE-1 JN859249 Juniperus communis Fülöpháza Ősz
REF030 DSE-1 JN859250 Juniperus communis Fülöpháza Ősz
REF031 DSE-1 JN859251 Juniperus communis Bugac Tavasz
REF032 DSE-1 JN859252 Juniperus communis Bugac Tavasz
REF033 DSE-1 JN859253 Juniperus communis Bugac Tavasz
REF034 DSE-1 JN859254 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF035 DSE-1 JN859255 Juniperus communis Bugac Tavasz
REF036 DSE-1 JN859256 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF037* DSE-1 JN859257 Populus alba Fülöpháza Nyár
REF038 DSE-1 JN859258 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF039 DSE-1 JN859259 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF040 DSE-1 JN859260 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF041 DSE-1 JN859261 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF042* DSE-1 JN859262 Populus alba Fülöpháza Nyár
REF043 DSE-1 JN859263 Juniperus communis Fülöpháza Nyár
REF044 DSE-1 JN859264 Juniperus communis Fülöpháza Nyár
REF045 1 JN859265 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF046 2 JN859266 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz
REF047 3 JN859267 Helianthemum ovatum Fülöpháza Nyár
REF048 4 JN859268 Juniperus communis Bugac Ősz
REF049 4 JN859269 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz
REF050 5 JN859270 Juniperus communis Bugac Tavasz
REF051 DSE-2 JN859271 Festuca procumbens Fülöpháza Nyár
REF052 DSE-2 JN859272 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár
REF053 DSE-2 JN859273 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár
REF054 DSE-2 JN859274 Helianthemum ovatum Fülöpháza Tavasz
REF055 DSE-2 JN859275 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz
108
REF056 DSE-2 JN859276 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF057 DSE-2 JN859277 Juniperus communis Fülöpháza Nyár
REF058 DSE-2 JN859278 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár
REF059 DSE-2 JN859279 Juniperus communis Fülöpháza Nyár
REF060 DSE-2 JN859280 Juniperus communis Fülöpháza Ősz
REF061 DSE-2 JN859281 Festuca procumbens Fülöpháza Nyár
REF062 DSE-3 JN859282 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF063 DSE-3 JN859283 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF064* DSE-3 JN859284 Populus alba Fülöpháza Nyár
REF065 DSE-3 JN859285 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár
REF066 DSE-3 JN859286 Ambrosia artemisiifolia Fülöpháza Nyár
REF067 DSE-3 JN859287 Festuca procumbens Fülöpháza Nyár
REF068 DSE-3 JN859288 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF069 DSE-3 JN859289 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Ősz
REF070 DSE-3 JN859290 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF071* DSE-3 JN859291 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz
REF072* DSE-3 JN859292 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz
REF073 DSE-3 JN859293 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF074 DSE-3 JN859294 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF075 DSE-3 JN859295 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF076 DSE-3 JN859296 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF077 DSE-3 JN859297 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár
REF078 DSE-3 JN859298 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF079 DSE-3 JN859299 Ambrosia artemisiifolia Fülöpháza Nyár
REF080 DSE-3 JN859300 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF081 DSE-3 JN859301 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF082 DSE-3 JN859302 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF083* DSE-3 JN859303 Populus alba Fülöpháza Nyár
REF084* DSE-3 JN859304 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz
REF085 DSE-3 JN859305 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz
REF086 DSE-3 JN859306 Ambrosia artemisiifolia Tatárszentgyörgy Ősz
REF087 DSE-3 JN859307 Juniperus communis Fülöpháza Ősz
REF088 DSE-3 JN859308 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF089 DSE-3 JN859309 Ambrosia artemisiifolia Fülöpháza Nyár
REF090 DSE-3 JN859310 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF091 DSE-3 JN859311 Ambrosia artemisiifolia Tatárszentgyörgy Nyár
REF092 DSE-3 JN859312 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF093* DSE-3 JN859313 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz
REF094* DSE-3 JN859314 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz
REF095 DSE-3 JN859315 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár
REF096 DSE-3 JN859316 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF097 DSE-3 JN859317 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár
REF098 DSE-3 JN859318 Ambrosia artemisiifolia Tatárszentgyörgy Nyár
REF099* DSE-4 JN859319 Populus alba Fülöpháza Nyár
REF100* DSE-4 JN859320 Populus alba Fülöpháza Nyár
REF101* DSE-4 JN859321 Populus alba Fülöpháza Nyár
REF102 6 JN859322 Juniperus communis Bugac Nyár
REF103 6 JN859323 Juniperus communis Bugac Nyár
REF104 DSE-5 JN859324 Ambrosia artemisiifolia Tatárszentgyörgy Ősz
REF105 DSE-5 JN859325 Ambrosia artemisiifolia Tatárszentgyörgy Ősz
REF106* DSE-6 JN859326 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz
REF107 DSE-6 JN859327 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF108* DSE-6 JN859328 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz
REF109 DSE-6 JN859329 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF110 DSE-6 JN859330 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF111 7 JN859331 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár
REF112* 8 JN859332 Populus alba Fülöpháza Nyár
REF113 9 JN859333 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár
REF114 9 JN859334 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF115 9 JN859335 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz
109
REF116 9 JN859336 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF117 9 JN859337 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF118 10 JN859338 Helianthemum ovatum Fülöpháza Tavasz
REF119 10 JN859339 Helianthemum ovatum Fülöpháza Tavasz
REF120 10 JN859340 Festuca procumbens Fülöpháza Tavasz
REF121 10 JN859341 Festuca procumbens Fülöpháza Tavasz
REF122 10 JN859342 Festuca procumbens Fülöpháza Tavasz
REF123* DSE-7 JN859343 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF124* DSE-7 JN859344 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF125* DSE-7 JN859345 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF126* DSE-7 JN859346 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF127* DSE-7 JN859347 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF128* DSE-7 JN859348 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF129* DSE-7 JN859349 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF130 DSE-7 JN859350 Fumana procumbens Fülöpháza Nyár
REF131* DSE-7 JN859351 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF132 DSE-7 JN859352 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár
REF133* DSE-7 JN859353 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF134* DSE-7 JN859354 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF135* DSE-7 JN859355 Stipa borysthenica Fülöpháza Tavasz
REF136* DSE-7 JN859356 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF137* DSE-7 JN859357 Stipa borysthenica Fülöpháza Tavasz
REF138* DSE-7 JN859358 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF139* DSE-7 JN859359 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF140* DSE-7 JN859360 Stipa borysthenica Fülöpháza Tavasz
REF141* 11 JN859361 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF142 12 JN859362 Juniperus communis Bugac Ősz
REF143* DSE-8A JN859363 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF144* DSE-8B JN859364 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF145* DSE-8B JN859365 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF146 DSE-9 JN859366 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF147 DSE-9 JN859367 Fumana procumbens Fülöpháza Nyár
REF148 DSE-9 JN859368 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF149 DSE-9 JN859369 Fumana procumbens Fülöpháza Nyár
REF150* DSE-9 JN859370 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF151* DSE-9 JN859371 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF152* DSE-9 JN859372 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF153* DSE-9 JN859373 Festuca vaginata Fülöpháza Nyár
REF154 DSE-10 JN859374 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár
REF155 DSE-10 JN859375 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF156 DSE-10 JN859376 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár
REF157 13 JN859377 Festuca procumbens Fülöpháza Nyár
REF158 DSE-11 JN859378 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz
REF159 14 JN859379 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF160 14 JN859380 Juniperus communis Fülöpháza Nyár
REF161 14 JN859381 Juniperus communis Bugac Ősz
REF162 14 JN859382 Juniperus communis Bugac Tavasz
REF163 15 JN859383 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF164 16 JN859384 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár
REF165 DSE-12 JN859385 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF166 DSE-13 JN859386 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár
REF167 DSE-13 JN859387 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz
REF168 DSE-13 JN859388 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár
REF169 17 JN859389 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF170 18 JN859390 Juniperus communis Bugac Tavasz
REF171 19 JN859391 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF172 20 JN859392 Ambrosia artemisiifolia Tatárszentgyörgy Ősz
REF173 21 JN859393 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár
REF174 22 JN859394 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár
REF175 23 JN859395 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz
110
REF176 24 JN859396 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz
REF177 25 JN859397 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár
REF178 25 JN859398 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár
REF179 25 JN859399 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár
REF180 25 JN859400 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár
REF181* 25 JN859401 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz
REF182 25 JN859402 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Ősz
REF183 25 JN859403 Juniperus communis Bugac Ősz
REF184 25 JN859404 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Ősz
REF185 25 JN859405 Juniperus communis Bugac Ősz
REF186 25 JN859406 Juniperus communis Bugac Ősz
REF187 25 JN859407 Juniperus communis Bugac Ősz
REF188 25 JN859408 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz
REF189 25 JN859409 Juniperus communis Fülöpháza Ősz
REF190 25 JN859410 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz
REF191 25 JN859411 Juniperus communis Bugac Nyár
REF192 25 JN859412 Juniperus communis Bugac Nyár
REF193 25 JN859413 Juniperus communis Bugac Nyár
REF194 25 JN859414 Juniperus communis Bugac Nyár
REF195 25 JN859415 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár
REF196 25 JN859416 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár
REF197 25 JN859417 Juniperus communis Bugac Tavasz
REF198 25 JN859418 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz
REF199 25 JN859419 Juniperus communis Fülöpháza Tavasz
REF200 25 JN859420 Juniperus communis Bugac Tavasz
REF201 25 JN859421 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz
REF202 25 JN859422 Juniperus communis Bugac Tavasz
REF203* 26 JN859423 Populus alba Fülöpháza Nyár
REF204 26 JN859424 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Nyár
REF205 26 JN859425 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Ősz
REF206 26 JN859426 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF207 26 JN859427 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF208 26 JN859428 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF209 DSE-14 JN859429 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz
REF210 DSE-14 JN859430 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz
REF211 DSE-14 JN859431 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF212* 27 JN859432 Populus alba Fülöpháza Nyár
REF213* 27 JN859433 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz
REF214 27 JN859434 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz
REF215 27 JN859435 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF216 27 JN859436 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF217 27 JN859437 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF218 27 JN859438 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF219 27 JN859439 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár
REF220 27 JN859440 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Tavasz
REF221 27 JN859441 Helianthemum ovatum Fülöpháza Nyár
REF222 27 JN859442 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF223 27 JN859443 Ephedra distachya Fülöpháza Ősz
REF224 27 JN859444 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF225 27 JN859445 Asclepias syriaca Fülöpháza Nyár
REF226 27 JN859446 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF227 27 JN859447 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF228 27 JN859448 Ailanthus altissima Fülöpháza Nyár
REF229 27 JN859449 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár
REF230 27 JN859450 Juniperus communis Bugac Nyár
REF231 27 JN859451 Juniperus communis Bugac Nyár
REF232 27 JN859452 Juniperus communis Bugac Ősz
REF233 27 JN859453 Juniperus communis Bugac Ősz
REF234 27 JN859454 Juniperus communis Bugac Ősz
REF235 27 JN859455 Helianthemum ovatum Fülöpháza Nyár
111
REF236 27 JN859456 Populus alba Fülöpháza Nyár
REF237 27 JN859457 Juniperus communis Fülöpháza Nyár
REF238 27 JN859458 Juniperus communis Tatárszentgyörgy Nyár
REF239 27 JN859459 Ailanthus altissima Tatárszentgyörgy Ősz
REF240 27 JN859460 Medicago minima Fülöpháza Nyár
REF241 27 JN859461 Juniperus communis Bugac Nyár
c01 DSE-1 – Juniperus communis Fülöpháza Nyár
c05 DSE-1 – Juniperus communis Fülöpháza Ősz
c06 DSE-1 – Juniperus communis Fülöpháza Nyár
c08 DSE-1 – Juniperus communis Fülöpháza Nyár
c09 DSE-1 – Juniperus communis Fülöpháza Nyár
c11 DSE-1 – Juniperus communis Fülöpháza Nyár
c12 DSE-1 – Salix rosmarinifolia Fülöpháza Ősz
c13 DSE-1 – Ailanthus altissima Fülöpháza Tavasz
c14 DSE-1 – Populus alba Fülöpháza Tavasz
c15 DSE-1 – Populus alba Fülöpháza Tavasz
c16 DSE-1 – Juniperus communis Fülöpháza Nyár
* korábbi munkák során izolált és meghatározott törzsek
112
F4. táblázat A DSE csoportok reprezentáns izolátumainak legközelebbi BLAST találatai ( A BLAST keresés 2011. 11. 17-én történt)
DSE csoport Izolátum Legközelebbi GenBank szekvencia Származás / Gazdanövény Származási
Ország
Átfedés
(Coverage)
Hasonlóság
(Similarity)
1 REF025 u. mikorrhizás aszkuszos gomba (AY634148) H: Epipactis atrorubens, TT: mikorrhizált gyökérszakasz, ES Németország 100 99
Cadophora sp. (FJ666349) H: Populus tremuloides Kanada 99 98
Cadophora sp. (GU212389) IS: dobozcsomagoló anyag Antarktisz 100 97
Cadophora sp. (DQ317329) IS: Ross Sea régió Antarktisz 100 97
Cadophora luteo-olivacea is. (FJ486274) 100 97
u. Cadophora c. (EU517022) IS: talaj, ES Ausztria 97 98
Cadophora luteo-olivacea st. (DQ404348) IS: Actinidia deliciosa elszíneződött fatest Olaszország 100 96
Cadophora luteo-olivacea st. (GU128589) IS: alma gyümölcs Olaszország 100 96
Cadophora luteo-olivacea is. (GQ214536) 100 96
Cadophora luteo-olivacea st. (FJ430742) IS: talaj Csehország 100 96
u. aszkuszos gomba is. (AY833035) H: Cephalanthera damasonium, IS: orchid mikorrhiza, ES Franciaország 96 97
REF039 u. talaj gomba c. (EU490132) IS: szavanna-talaj (0 - 10 cm) Prosopis glandulosa alatt, ES USA: TX 98 97
Cadophora luteo-olivacea (HM116748) H: Actinidia deliciosa cv. Hayward Új Zéland 98 96
Cadophora luteo-olivacea st. (DQ404349) 97 97
Rhexocercosporidium sp. (DQ275614) H: Panax ginseng Kanada 97 96
u. talaj gomba c. (DQ420925) IS: talaj, ES USA: MN 97 96
u. Leptodontidium is. (FJ378720) H: Kobresia sp., ES Kína 97 96
dark septate endophyte (AF168783) H: Ranunculus adoneus USA: CO 99 95
u. aszkuszos gomba is. (DQ182423) IS: gazda gyökere, H: Cephalanthera longifolia, ES 97 96
Leptodontidium orchidicola st. (AF486133) H: Platanthera hyperborea 97 96
2 REF058 u. gomba c. (GQ921746) IS: talaj, ES Ausztralia 100 99
u. Helotiales c. (FJ197867) IS: talaj, ES Ausztria 95 99
u. gomba c. (EU292653) IS: talaj , ES USA: AK 100 97
u. Helotiales c. (GU327458) H: Epipactis helleborine, IS: mikorrhizált csemete, ES Csehország. 92 99
u. talaj gomba (GU083256) IS: talaj, ES USA: AK 100 97
u. gomba c. (FJ553784) IS: erdei talaj, ES Kanada 100 96
u. Helotiales is. (DQ182427) H: Cephalanthera longifolia, IS: gazdanövény gyökere, ES 100 96
Ericoid mikorrhiza gomba sp. (AY046400) IS: Quercus ilex Olaszország 99 96
u. aszkuszos gomba c. (FJ440888) IS: Pyrola sp. gyökere, ES USA: OR/CA 100 96
u. ektomikorrhizaképző gomba (Helotiales) is.
(EF644169)
IS: Populus tremula ektomikorrhizált gyökérvégei, TT: ektomikorrhiza
gombaköpeny, ES
Ausztria 97 96
u. ectomycorrhiza (Leohumicola verrucosa) c.
(DQ497978)
H: Tsuga heterophylla, IS: gyökér, ES Kanada 100 94
Leohumicola minima st. (AY706329) IS: vulkanikus hamu-talaj Chile 98 94
endofiton gomba sp. (EU686206) H: Scapania sp. Wales 100 94
3 REF078 endofiton gomba (AF373055) H: Rosmarinus officinalis, IS: gazdanövény endomikorrhizája Olaszország 100 99
endofiton gomba (AF373052) H: Pinus halepensis, IS: gazdanövény ektomikorrhizája Olaszország 100 99
u. endophytic gomba (AJ879648) IS: gyökérvégek, TT: ektomikorrhiza, ES Olaszország 100 99
u. endophytic gomba c. (FJ524327) IS: Oryza granulate gyökér endofiton, ES Kína 100 99
Rhizopycnis vagum is. (HQ610506) IS: fertőzött gyökér, H: Citrullus lanatus USA: IN 100 99
aszkuszos gomba sp. (HM208718) IS: gyökér, H: Rhododendron fortunei Kína 100 99
aszkuszos gomba sp. (AM944359) IS: Lycopersicum esculentum felszínsterilizált gyökér Kolumbia 100 99
endofiton gomba sp. (DQ459005) H: Dioscorea zingiberensis rizóma Kína 100 99
gomba sp. (HM208743) IS: gyökér, H: Rhododendron fortunei Kína 100 98
Rhizopycnis vagum (AF022786) Holotype culture
(TX951120)
IS: Cucumis melo var. cantalupensis USA: TX 100 98
Rhizopycnis sp. (DQ682600) H: Coffea arabica gyökér 97 99
endofiton gomba sp. (EU250374) IS: gazdanövény gyümölcse, H: Camptotheca acuminata 100 95
Pleosporales sp. (EU002891) IS: endofiton, H: Coffea arabica, ES USA: HI 100 95
endofiton gomba sp. (EU625406) IS: eperfa gyökér 96 98
Rhizopycnis sp. (FJ827623) IS: Coffea arabica endofiton Etiópia 93 99
aszkuszos gomba sp. (EF672295) H: Coffea arabica gyökér USA 92 99
Pleosporales sp. (FJ624263) H: mangrove 95 94
Rhizopycnis vagum st. (FJ582640) 100 93
4 REF101 Pithomyces valparadisiacus (EU552152) H: Protea lepidocarpodendron Délafrikai kt 60 85
u. gomba c. (GQ921741) IS: talaj, ES Ausztrália 42 100
u. gomba is. (GU564990) H: Populus tremula, ES Svédország 32 88
Coniothyrium sp. (GU062312) H: Alnus incana, IS: faanyag Lettország 43 100
u. gomba (FN397425) IS: T. melanosporum talaj, „kiégett terület”, ES Franciaország 43 100
u. aszkuszos gomba c. (FJ553168) IS:erdei talaj, ES Kanada 35 100
Coniothyrium fuckelii is. (FJ228185) H: Fraxinus excelsior Svédország 43 100
aszkuszos gomba sp. (AJ972833) Törökország 39 84
endofiton gomba (FN394698) H: Holcus lanatus Spanyolország 27 93
u. aszkuszos gomba c. (EU490122) IS: szavanna talaj (0 - 10 cm) Prosopis glandulosa alatt, ES USA 42 100
Saccharicola sp. (GU973718) IS: gyökérendofiton, H: cukorrépa Brazília 42 100
Coniothyrium fuckelii (AY904055) H: Rosa sp., TT: szár Mexikó 42 100
u. gomba (AM260897) IS: tőzeg, ES UK 43 100
5 REF104 Alternaria helianthi st. (DQ156343) India 100 90
Alternaria helianthi (AY154713) H: Helianthus annus (levelek) Irán 100 90
Alternaria leucanthemi st. (AF314586) 100 90
Alternaria leucanthemi st. (AY372684) Kína 99 90
Alternaria helianthi is. (HM449994) IS: magok, H: Helianthus annuus cv. Bhanu India 90 91
u. gomba c. (EU516993) IS: talaj, ES Ausztria 88 89
Leptosphaeria lindquistii is. (HM003206) H: Helianthus annuus, TT: micélium Kína 87 89
u. gomba c. (FJ237205) IS: hóborította alpesi talaj, ES Ausztria 93 88
Leptosphaeria maculans (M96663) 91 87
u. gomba c. (GU817175) H: Bistorta vivipara egyed, IS: gyökérzet Norvégia 93 87
113
Leptosphaeria sp. (DQ093683) IS: Pinus sylvestris pusztuló gyökér, ES Litvánia 96 86
6 REF106 u. aszkuszos gomba c. (EF154351) H: Fagopyrum esculentum gyökér, ES 100 100
u. aszkuszos gomba c. (HM162252) IS: fű gyökér, ES USA: TX 100 99
u. aszkuszos gomba c. (EU358787) H: Capsicum annuum, ES Mexikó 100 99
u. aszkuszos gomba c. (EU177123) H: Capsicum annuum, IS: gyökér Mexikó 100 99
u. talaj gomba c. (EU490117) IS: szavanna talaj (0 - 10 cm) Prosopis glandulosa alatt, ES USA TX 100 99
Alternaria sp. (HQ630996) H: Miscanthus giganteus USA: IL 100 98
Thielaviopsis basicola is. (GQ131878) IS: barack gyökér, TT: micélium Olaszország 94 99
Alternaria longissima is. (DQ865104) H: Linaria hegelmaieri Spanyolország 95 99
REF109 Setophoma sacchari (FN394730) H: Holcus lanatus Spanyolország 100 100
Hypocreales sp. (GQ923970) IS: Ojuelos, H: Bouteloua gracilis Mexikó 100 99
u. endofiton gomba c. (EF505610) H: Zea mays, IS: levelek, szár, magok ES USA 100 99
aszkuszos gomba sp. (EF672299) H: Coffea arabica Kolumbia 99 99
Setophoma sacchari (AB499793) H: Allium fistulosum Japán 98 99
endofiton gomba st. (FJ450016) 100 99
7 REF123 u. talaj gomba c. (EU480270) IS: talaj-kéreg, ES USA: NM 100 97
u. gyökérasszociált gomba c. (EU144602) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 100 97
gyökérasszociált gomba sp. (EU144366) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 100 96
u. gyökérasszociált gomba c. (FJ449545) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 96 96
REF128 u. talaj gomba c. (EU480184) IS: talaj-kéreg, ES USA: NM 99 97
u. gyökérasszociált gomba c. (EU144953) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 99 97
Pleosporales sp. (GQ923954) IS: füves területek, H: Bouteloua gracilis Kanada: SK 100 97
u. Pleosporales c. (GQ924050) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis USA: SD 99 97
gomba sp. (FJ449549) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 93 97
REF130 u. root-associated gomba c. (EU145013) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 100 97
u. root-associated gomba c. (FJ361958) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 100 97
gyökérasszociált gomba sp. (EU144367) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 100 97
u. talaj gomba c. (EU479732) IS: Bouteloua gracilis rizoszféra-talaj, ES USA: NM 100 97
REF132 u. gyökérasszociált gomba c. (FJ361994) IS: gyökér, H: Sporobolus cryptandrus, ES USA: NM 100 99
u. talaj gomba c. (EU480264) IS: talaj-kéreg, ES USA: NM 100 99
u. root-associated gomba c. (EU145010) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 100 99
u. Pleosporales c. (GQ924025) IS: gyökerek, Konza Préri, H: Bouteloua gracilis USA: KS 100 99
Pleosporales sp. (GQ923972) IS: Oujelos, H: Bouteloua gracilis Mexikó 100 96
REF140 u. gyökérasszociált gomba c. (EU144759) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 98 99
u. mikorrhizás gomba c. (AY929107) IS: gyökér; félszáraz füves területek, H: Stipa hymenoides, ES USA: UT 99 98
u. Pleosporales c. (HQ389473) IS: gyökér, H: Sporobolus cryptandrus, ES USA: NM 96 99
u. Pleosporales c. (GQ924053) IS: gyökerek, SNWR, H: Bouteloua gracilis USA: NM 96 99
8 REF144 Periconia macrospinosa st. (FJ536208) IS: C4 füvek gyökerei USA: KS 100 99
u. aszkuszos gomba c. (HM162309) IS: fű gyökér, ES USA: TX 100 99
u. Periconia c. (GU055658) IS: füves terület talaj Ausztria 99 89
Periconia macrospinosa (AJ246159) IS: Avena sativa cv. Gerald gyökér UK 95 100
Pleosporales sp. (GQ923975) IS: Ojuelos, H: Bouteloua gracilis Mexikó 95 99
u. talaj gomba c. (DQ420990) IS: talaj, ES USA: MN 100 97
Periconia sp. (HQ631028) H: Saccharum officinarum USA: LA 100 97
Periconia macrospinosa (FN393421) H: Holcus lanatus gyökér Spanyolország 92 99
u. gomba c. (HQ260291) IS: gyökér, H: Ericaceae, ES USA: AK 100 97
Massarina sp. (GQ141701) IS: barnarizs, H: rizs 93 98
Periconia sp. (HQ130695) H: Warburgia ugandensis 96 97
Massarina igniaria st. (EU715627) IS: branch, H: Taxus globosa Mexikó 93 97
u. gomba c. (GQ999275) IS: levegő minta, ES 100 94
Periconia macrospinosa st. (HQ328037) 93 97
Periconia sp. (FJ903341) IS: pusztuló faanyag, H: Picea abies Lettország 90 97
endofiton gomba sp. (EU685980) H: Cheilolejeunea sp. Peru 93 96
Massarina igniaria st. (GQ377480) H: Taxus globosa, IS: ágak Mexikó 91 97
Periconia macrospinosa (AM262349) H: Dactylis glomerata Spanyolország 81 100
endofiton gomba sp. (EU977233) H: Macairea thyrsiflora Peru 88 97
9 REF148 u. talaj gomba c. (EU480177) IS: talaj-kéreg, ES USA: NM 100 100
Embellisia sp. (AY345356) H: Hennediella heimii Antarktisz 100 99
u. gyökérasszociált gomba c. (FJ362231) IS: gyökér, H: Sporobolus cryptandrus, ES USA: NM 100 99
Embellisia astragali st. (FJ914716) 100 99
Embellisia sp. (AY864335) H: Hennediella heimii Antarktisz 100 99
Alternaria japonica (AY154703) H: Raphanus sativus (levelek) Iran 100 95
REF150 Embellisia sp. (AF212309) Antarktisz 100 99
u. talaj gomba c. (EU480175) IS: talaj-kéreg, ES USA: NM 100 99
u. gyökérasszociált gomba c. (EU144461) IS: gyökér, H: Bouteloua gracilis, ES USA: NM 96 99
Embellisia telluster st. (FJ357316) H: Oxytropis spp. USA: NM 97 99
Embellisia allii (AY278840) 96 99
Embellisia allii (AB477430) H: Allium sativum Kína 92 98
Pleospora papaveracea is. (DQ885386) H: Papaver somniferum Spanyolország 100 94
Chalastospora gossypii (FN868458) H: Pinus halepensis Spanyolország 100 92
10 REF154 u. gomba (FN397304) IS: Tuber melanosporum talaj, „kiégett terület”, ES Franciaország 100 100
Curvularia inaequalis (FM163616) IS: orrüregi váladék Olaszország 100 100
u. Ascomycota c. (HM161938) IS: fű gyökér, ES USA: TX 100 99
u. endophytic gomba c. (EF505555) H: Zea mays, IS: levelek, szár, magok, ES USA 99 100
Curvularia coicicola (AB453880) IS: Coicis lacryma-jobi L. Kína 100 99
Curvularia inaequalis st. (HM101095) 98 100
Curvularia inaequalis st. (AF120261) 98 99
u. ascomycete c. (EU489922) IS: szavanna talaj (0 - 10 cm) C4 fűvek alatt, ES USA 100 97
Curvularia inaequalis (AF313409) 100 97
u. talaj gomba c. (DQ420883) IS: talaj, ES USA: MN 100 97
Curvularia geniculata (AB245085) H: Agrostis stronifela Japán 99 97
Curvularia inaequalis st. (AY941256) 92 100
114
11 REF158 Microdochium bolleyi (AM502264) 100 100
Microdochium bolleyi st. (GU566298) IS: rizoszféra, H: Phalaris arundinacea Czech Rep. 100 100
Microdochium sp. (AJ279489) H: Phragmites australis gyökér Germany 100 100
Microdochium sp. (HQ630981) H: Miscanthus giganteus USA: IL 100 99
u. gomba (FN391313) IS: Tuber melanosporum talaj, „kiégett terület”, ES France 100 99
Xylariales sp. (EU755004) IS: talaj és repce gyökér, ES 100 99
u. endofiton gomba c. (EF505625) H: Zea mays, IS: levelek, szár, magok , ES USA 100 99
Microdochium sp. (FJ439588) IS: talaj UK 98 100
aszkuszos gomba sp. (AY243053) H: Ammophila arenaria, IS: növények USA: CA 96 99
Microdochium bolleyi (AM924150) H: Elymus farctus Spain 92 100
u. Xylariales c. (GQ924061) H: Bouteloua gracilis, IS: gyökér, ES USA: SD 92 99
Microdochium bolleyi is. (HM007082) IS: Stipa grandis, IS: gyökér China 90 99
Microdochium sp. (FJ536210) H: C4 füvek gyökere USA: KS 92 100
u. Xylariales c. (DQ317371) IS: Ross Sea régió, ES Antarctica 66 100
12 REF165 gomba sp. (HM036626) H: Pinus sylvestris, IS: gyökérvég Lithuania 83 99
Thermoascus crustaceus st. (EU021597) 99 87
Byssochlamys verrucosa (DQ073329) Australia 99 87
Thermoascus crustaceus (U18353) TT: micélium 99 87
Penicillium inflatum (AJ608959) Bulgaria 99 87
Penicillium inflatum st. (AF033393) 99 87
Thermoascus crustaceus st. (FJ389925) H: Parthenium argentatum USA 98 87
Aspergillus wenti is. (FJ537089) 95 88
Aspergillus wentii is. (EF652158) 95 88
Aspergillus dimorphicus (FR727119) IS: levélfelszín Czech Rep. 95 88
Aspergillus heteromorphus (AJ876879) IS: befertőződött kultúra Brazil 99 87
Talaromyces leycettanus st. (AF454080) 99 87
13 REF168 u. Plectosphaerella c. (GU327453) H: Epipactis helleborine, IS: mikorrhizált csemete, ES Czech Rep. 100 99
Phyllachoraceae sp. (EU755008) IS: talaj és repce gyökér, ES 100 99
u. gomba (FM875855) IS: biofilter, ES 100 99
Plectosphaerella sp. (FJ430715) Czech Rep. 100 99
u. aszkuszos gomba c. (AY615882) IS: rizoszféra, ES Nedherlands 100 99
u. aszkuszos gomba (AM901905) IS: háztartási por, ES Finland 98 99
u. gomba c. (GQ921802) IS: talaj, ES Australia 98 99
Plectosphaerella cucumerina st. (EF495236) IS: Paris polyphylla var. yunnanensis rizóma China 100 99
Plectosphaerella sp. (GQ407099) H: Musa acuminata, IS: gyökér, N: endofiton gomba Malaysia 100 98
Plectosphaerella cucumerina st. (DQ779781) IS: talaj 98 99
Plectosphaerella cucumerina (AJ492873) H: burgonya fonalféreg UK 100 98
Plectosphaerella cucumerina (FM178318) Australia 96 99
Plectosphaerella sp. (HQ008920) H: Arrabidaea candicans Ecuador 100 98
Plectosphaerella cucumerina (AB469880) H: Homo sapiens szaruhártya 100 98
Colletotrichum pisi st. (EU400150) 100 97
14 REF210 Fusarium sp. (HQ166538) H: Buxus sempervirens, IS: fertőzött levelek Switzerland 100 100
Hypocreales sp. (GQ923966) H: Bouteloua gracilis USA: SD 100 100
Fusarium acuminatum st. (HM068325) 100 100
Fusarium sp. (GU480954) H: búza, IS: szemek Mexico 100 100
Fusarium sp. (GQ505464) USA: TX 100 100
Fungal sp. (GQ866861) H: Spiranthes sinensis (Pers.) Ames China 100 100
u. gyökérasszociált gomba c. (FJ362249) H: Yucca glauca, IS: gyökér, ES USA: NM 100 100
Fusarium solani (AB470848) H: Larix gmelinii var. principis-rupprechtii China 100 100
Fusarium sp. (EU910079) H: Cicer arietinum 100 100
Fusarium tricinctum (FJ233196) H: kiwi gyümölcs China 100 100
Hypocreales sp. (EU754934) IS: talaj repce gyökér, ES 100 100
Gibberella avenacea is. (EU255801) 100 100
u. Fusarium c. (EU003042) H: alma csemete, IS: gyökér, ES 100 100
u. talajbeli gomba c. (DQ421028) IS: talaj, ES USA: MN 100 100
Fusarium tricinctum (AY188923) 100 100
endofiton gomba is. (EU167917) H: Picrorhiza kurrooa 99 100
u. Gibberella (FM178250) IS: víz, ES 100 99
Gibberella pulicaris st. (FJ481029) H: Populus sp., IS: gyökér 100 99
A DSE csoportok reprezentáns izolátumainak ITS szekvenciáival legnagyobb hasonlóságot mutató GenBank találatok. Rövidítések: nem tenyésztett (u, uncultured), klón (c, clone), izolátum (is, isolate), törzs
(st, strain), gazdanövény (H, Host), Izolálási hely (IS, Isolation Source), Szövet típus (TT, Tissue Type), Környezeti minta (ES,Environmental Sample)
115
12. PUBLIKÁCIÓS LISTA
A PhD-dolgozat témájához kapcsolódó publikációk:
Impakt faktorral rendelkező tudományos folyóiratban megjelent cikkek:
Knapp DG, Kovács GM, Zajta E, Groenewald JZ, Crous PW. 2015. Dark septate
endophytic pleosporalean genera from semiarid areas. Persoonia 35: 87-100. IF:
4,225
Vági P, Knapp DG, Kósa A, Seress D, Horváth A, Kovács GM. 2014. Simultaneous
specific in planta visualization of root-colonizing fungi using fluorescence in situ
hybridization (FISH). Mycorrhiza 24: 259–66. IF: 2,985
Knapp DG, Pintye A, Kovács GM. 2012. The dark side is not fastidious – dark septate
endophytic fungi of native and invasive plants of semiarid sandy areas. PLOS ONE 7:
e32570. IF: 3,730
Impakt faktorral nem rendelkező tudományos folyóiratban megjelent cikkek:
Knapp DG, Kovács GM. 2010. A Medicago minima gyökérendofiton gombáinak vizsgálata
a fülöpházi félszáraz homokterületen. Mikológiai Közlemények – Clusiana 49: 67–77.
Konferencia – összefoglalók:
Knapp DG, Kovács GM, Zajta E, Groenewald JZ, Crous PW. 2014. Alföldi félszáraz
területek új sötét szeptált endofiton (DSE) taxonjai. A Magyar Mikrobiológiai
Társaság 2014. évi Nagygyűlése, Keszthely. [előadás, legjobb előadó díj]
Kovács GM, Balázs TK, Blaszkowski J, Buscot B, Gáspár BK, Geml J, Knapp DG, Lukács
AF, Németh JB, Seress D, Wubet T. 2013. Looking for the generalists in a specific
environment: mycorrhizal and root-endophytic fungi of semiarid sandy areas. Power
of Microbes. Primosten, Horvátország. [előadás]
Knapp DG, Zajta E, Pintye A, Kovács GM. 2013. The dominant DSE lineages of semiarid
sandy areas of the Great Hungarian Plain - What can they point out? Endophytes for
plant protection: the state of the art, Berlin, Németország. [előadás]
Horváth ÁN, Seress D, Knapp DG, Vági P, Kovács GM. 2013. Fluoreszcens in situ
hibridizációs módszer optimalizálása növény-gomba kölcsönhatások vizsgálatára. A
Magyar Mikroszkópos Társaság Éves Konferenciája. Siófok. [előadás]
Knapp DG, Kovács GM. 2012. Félszáraz homokgyepek sötét szeptált endofiton gombáinak
ISSR (inter sample sequence repeat) vizsgálata. A Magyar Mikrobiológiai Társaság
2012. évi Nagygyűlése, Keszthely. [előadás, legjobb előadó díj]
Knapp DG, Pintye A, Kovács GM. 2012. Őshonos és inváziós növények gyökérendofiton
gombáinak vizsgálata alföldi félszáraz területeken. V. Magyar Mikológiai
Konferencia, Budapest. [előadás]
116
Knapp DG, Pintye A, Kovács GM. 2011. Study of dark septate endophytic fungi colonizing
invasive and indigenous plants on semiarid sandy areas. XVI. Congress of European
Mycologists (CEM), Halkidiki, Görögország. [előadás]
Knapp D, Kovács GM. 2009. Study of root colonizing dark septate endophytic fungi of
invasive and indigenous plants of semiarid sandy areas. Second Central European
Forum for Microbiology (CEFORM), Keszthely. [poszter, legjobb poszter díj]
Knapp D, Seress D, Kovács GM. 2009. Inváziós növények nempatogén gyökérkolonizáló
gombáinak vizsgálata félszáraz homokterületeken. VIII. Magyar Ökológiai
Kongresszus, Szeged. [poszter]
A PhD-dolgozat témájához nem kapcsolódó publikációk:
Impakt faktorral rendelkező tudományos folyóiratban megjelent cikkek:
Schoch CL, Seifert KA, Huhndorf S, Robert V, Spouge JL, Levesque CA, Chen W, and
Fungal Barcoding Consortium (…, Knapp DG, …, Kovács GM, …). 2012. Nuclear
ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode
marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 109: 6241–
6245. IF: 8,910
Konferencia – összefoglalók:
Németh JB, Knapp DG, Tamás L, Ohm RA, Lipzen A, Nolan M., Barry KW, Grigoriev IV,
Spatafora JW, Kovács GM. 2014. Szimbiózis ortológ gének vizsgálata gyökér
kolonizáló sötét szeptált endofiton gombákban. A Magyar Mikrobiológiai Társaság
2014. évi Nagygyűlése, Keszthely. [előadás]
Simon J, Knapp DG, Vági P, Lukács AF, Németh JB, Borsodi AK, Kovács GM. 2014.
Szimbionta baktériumok kimutatása és azonosítása félszáraz területen élő gyökér
endofita gombák esetében. A Magyar Mikrobiológiai Társaság 2014. évi
Nagygyűlése, Keszthely. [előadás]
Németh MZ, Bóka K, Kovács GM, Knapp DG, Seress D, Preininger É. 2014. Egy
endofiton gomba interakciója in vitro növényi rendszerekkel. A Magyar
Mikroszkópos Társaság Éves Konferenciája. Konferencia. Siófok. [előadás]
117