![Page 1: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/1.jpg)
konfokální mikroskopie
(CLSM)
Confocal
Laser
Scanning
Microscopy
![Page 2: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/2.jpg)
fluorescenční zobrazení jednoho bodu
vzorek
objektivová čočka
excitační světlo zobrazovací čočka
emitované světlo
problém je fluorescence emitovaná z nezaostřěné roviny na vzorku
kamera
![Page 3: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/3.jpg)
konfokální mikroskop
vzorek
objektivová čočka
excitační světlo zobrazovací čočka
emitované světlo
pinhole
detektor
systém se pohybuje po vzorku a excituje bod po bodu, z toho následně
vytváří celkový obraz
![Page 4: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/4.jpg)
CONFOCAL Laser Scanning Microscopy
CONFOCAL = conjugated focal plane
![Page 5: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/5.jpg)
CONFOCAL Laser Scanning Microscopy
![Page 6: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/6.jpg)
principy fluorescenčního snímání
široké „widefield“ osvětlení bodové „point“ osvětlení
![Page 7: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/7.jpg)
The Point Spread Function (PSF)
Z=0
Z=+2µm
Z=-2µm
2D PSF for different defocus
image bodového objektu
x
y
![Page 8: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/8.jpg)
Measured
x
z Calculated
The Point Spread Function (PSF)
Z=0
Z=+2µm
Z=-2µm
2D PSF for different defocus
image bodového objektu
x
y
3D PSF
![Page 9: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/9.jpg)
„out of focus“ signál rozostřuje výsledný obraz „out of focus“ signál je blokován
porovnání fluorescenční a konfokální mikroskopie
fluorescenční konfokální
![Page 10: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/10.jpg)
porovnání fluorescenční a konfokální mikroskopie
![Page 11: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/11.jpg)
porovnání fluorescenční a konfokální mikroskopie
![Page 12: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/12.jpg)
Confocal LASER Scanning Microscopy
![Page 13: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/13.jpg)
Confocal LASER Scanning Microscopy
![Page 14: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/14.jpg)
Confocal LASER Scanning Microscopy
![Page 15: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/15.jpg)
Confocal LASER Scanning Microscopy
![Page 16: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/16.jpg)
Confocal LASER Scanning Microscopy
![Page 17: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/17.jpg)
Confocal Laser SCANNING Microscopy
![Page 18: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/18.jpg)
galvano-skenovací zrcátko
Confocal Laser SCANNING Microscopy
![Page 19: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/19.jpg)
optické řezy a 3D rekonstrukce
x y
z
![Page 20: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/20.jpg)
x y
z
optické řezy a 3D rekonstrukce
![Page 21: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/21.jpg)
x y
z
=
optické řezy a 3D rekonstrukce
![Page 22: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/22.jpg)
Confocal Laser SCANNING Microscopy
![Page 23: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/23.jpg)
Confocal Laser SCANNING Microscopy
![Page 24: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/24.jpg)
Confocal Laser SCANNING Microscopy
![Page 25: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/25.jpg)
spektrální detekce fluorescenčního signálu
![Page 26: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/26.jpg)
spektrální detekce fluorescenčního signálu
![Page 27: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/27.jpg)
velice nízká úroveň šumu a dramatická amplifikace signálu (~1x10)
detekce a amplifikace fluorescenčního signálu
![Page 28: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/28.jpg)
multifunkční systém
Confocal Laser Scanning Microscopy
![Page 29: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/29.jpg)
multifunkční systém
Confocal Laser Scanning Microscopy
![Page 30: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/30.jpg)
„bleed‐through“ (prosvítání) při emisi
![Page 31: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/31.jpg)
porovnání fluorescenční a konfokální mikroskopie
![Page 32: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/32.jpg)
„bleed‐through“ (prosvítání) při emisi
![Page 33: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/33.jpg)
„bleed‐through“ (prosvítání) při emisi
![Page 34: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/34.jpg)
„bleed‐through“ (prosvítání) při emisi
![Page 35: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/35.jpg)
spektrální detekce při emisi
Detekce celého spektra prostřednictvím 32
kanálů na vzorku značeného DAPI a Alexa 488
![Page 36: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/36.jpg)
spektrální detekce a separace signálů
![Page 37: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/37.jpg)
spektrální detekce a separace signálů
![Page 38: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/38.jpg)
spektrální detekce a separace signálů
![Page 39: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/39.jpg)
3-D projekce dat – rekonstrukce objektu z optických řezů v
jednoduchém 2-D obraze
volume rendering – zobrazení 3-D dat z různých uhlů
pohledu
time-lapse data – zobrazení dat jako sekvence jednotlivých
optických řezů, nebo 2-D projekce
několika optických řezů v čase
základní funkce konfokální mikroskopie
![Page 40: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/40.jpg)
Optické řezy
![Page 41: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/41.jpg)
3D-rekonstrukce
![Page 42: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/42.jpg)
3D-rekonstrukce
![Page 43: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/43.jpg)
![Page 44: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/44.jpg)
![Page 45: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/45.jpg)
![Page 46: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/46.jpg)
Pokročilé analýzy
![Page 47: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/47.jpg)
Pokročilé analýzy
![Page 48: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/48.jpg)
Pokročilé analýzy
![Page 49: konfokální mikroskopie (CLSM)cr-hana.upol.cz/cellbiol/bilder/BRB/BRB3.pdf · 2017. 11. 28. · konfokální mikroskop vzorek objektivová čočka excitační světlo zobrazovací](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022071503/6123582883435417a1078ab2/html5/thumbnails/49.jpg)
Pokročilé analýzy